20 biomarcadores de contaminação ambiental em peixes e ostras de três estuários brasileiros e...
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FABOLA XOCHILT VALDEZ DOMINGOS
BIOMARCADORES DE CONTAMINAO AMBIENTAL
EM PEIXES E OSTRAS DE TRS ESTURIOS BRASILEIROS
E CINTICA DE DERIVADOS SOLVEIS DO PETRLEO
EM PEIXES Tese apresentada ao programa de Ps-Graduao em Biologia Celular e Molecular, Setor de Cincias Biolgicas da Universidade Federal do Paran, como requisito parcial para obteno do grau de Doutor em Cincias Biolgicas com rea de Concentrao em Biologia Celular e Molecular. Orientador: Prof. Dr. Ciro A. Oliveira Ribeiro Co-orientora: Profa. Dra. Helena C. Silva de Assis Colaborao: Dr. milien Pelletier Dr. Claude Rouleau
CURITIBA 2006
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Esta tese dedicada meus pais Ailton (in memoriam) e Maria Luisa e minha
filha Bianca por todo seu auxlio, incentivo e
dedicao incondicionais.
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AGRADECIMENTOS
Ao meu orientador Prof. Dr. Ciro Alberto de Oliveira Ribeiro a quem considero meu Pai
Cientfico, pelos 9 anos de orientao, confiana e apoio nos momentos difceis.
A minha Co-Orientadora Prof. Dr. Helena Cristina da Silva de Assis por sua orientao,
pacincia e confiana.
Aos meus Orientadores na Universit do Quebc a Rimouski Prof. Dr. Emilien Pelletier
(Institut des Sciences de la Mer de Rimouski - ISMER, Universit du Qubec Rimouski) e Dr.
Claude Rouleau (IML Institut Maurice Lamontagne), pela acolhida pessoal e profissional e por
sua contribuio significativa na minha formao durante os 7 meses em que estive no
Canad.
A meus pais Ailton (in memoriam) e Maria Luisa, sem seus ensinamentos, incentivo e
auxlio eu no estaria concludo esta tese.
A minha filha Bianca, por ter me privado de sua companhia em diversos momentos de
minha formao, por pacincia, motivao e esperana.
A minha famlia pelo incentivo, entusiasmo, e confiana.
A meus amigos, pessoas maravilhosas, com quem compartilho vitrias e tropeos.
A Manuela da Silva Dreyer, Nara Bobko, Patcia de Souza Diogo, Michele da Cunha
Torres, pelo auxlio na preparao das amostras.
Aos colegas do Laboratrio de Toxicologia Celular em especial a Francisco Filipak Neto
pelo auxlio imediato nas mais diversas tarefas, especialmente quelas relacionadas a
informtica.
A Gislaine Canuel, Stephane, Coraline, Isabelle Desbiens pelo auxlio na preparao dos
experimentos, coleta de amostras e manuseio de equipamentos.
A Irene Sloss, Gustavo, Antnio Curtosi, Emilie Doussantouse e Stephane pela calorosa
acolhida no Canad e auxlio nos mais diversos momentos.
Ao Centro de Estudos do Mar CEM, professores Henry Louis Spach, Paulo Lana e suas
equipes pela disponibilidade e auxlio logstico nas coletas realizadas em Paranagu.
A todos os pesquisadores e suas respectivas equipes pelo auxlio nas coletas e no
processamento inicial das amostras nas universidades: UFPE, UFRPE e UFES.
Ao Programa de Ps-Graduao em Biologia Celular e Molecular da UFPR.
A Marlene Camargo, por sua ateno e eficincia.
Aos professores desta academia especialmente Cloris Faraco, Clia Franco, Marco
Randi, Lus Fernando Favaro, Slvio Sanches Veiga, Stnio que tanto contriburam para a minha
formao.
A finalmente a UFPR, instituio na qual passei grande parte dos ltimos 11 anos de
minha vida.
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Ao PROJETO RECOS INSTITUTO DO MILNIO Ministrio da Cincia e Tecnolgia pelo
financiamneto do projeto (www.mileniodomar.org.br).
Ao Centro de Microscopia Eletrnica (CME) UFPR, especialmente a Regina, Rosngela,
Srgio e Matilde.
A CAPES pela bolsa de doutorado no pas e pela bolsa sanduche no exterior.
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O que seria da cincia sem a curiosidade?
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SUMRIO LISTA DE FIGURAS..................................................................................................................................vii LISTA DE TABELAS..................................................................................................................................viii RESUMO..................................................................................................................................................ix ABSTRACT................................................................................................................................................x INTRODUO GERAL ............................................................................................................................ 1 1. CONTAMINAO EM AMBIENTES AQUTICOS .............................................................................. 1 1.1. METAIS PESADOS ..................................................................................................................................2 1.2. HIDROCARBONETOS POLICCLICOS AROMTICOS ........................................................................3 1.3. PESTICIDAS ORGANOCLORADOS ......................................................................................................5 1.4. PESTICIDAS ORGANOFOSFORADOS E CARBAMATOS.....................................................................7 1.5. ORGANOESTANHOS: TRIBUTIL-ESTANHO (TBT) E DIBUTIL-ESTANHO (DBT) .....................................7 2. PEIXES E MOLUSCOS COMO BIOINDICADORES DE QUALIDADE AMBIENTAL.............................. 10 3. BIOMONITORAMENTO..................................................................................................................... 12 4. BIOMARCADORES ........................................................................................................................... 14 5. CINTICA DE CONTAMINANTES EM ORGANISMOS AQUTICOS COMO FERRAMENTA PRVIA A ESTUDOS DE BIOMONITORAMENTO.................................................................................................... 16 CAPTULO I: BIOMARCADORES DE CONTAMINAO AMBIENTAL EM PEIXES NOS ESTURIOS BRASILEIROS DE PARANAGU (PR), PIRAQU-A (ES) E ITAMARAC (PE)....................................18 I. 1. INTRODUO................................................................................................................................ 19 I.2. MATERIAIS E MTODOS ................................................................................................................. 21 I.2.1. ESPCIES BIOINDICADORAS ...........................................................................................................21 I.2.2. REAS DE ESTUDO E ESTRATGIA AMOSTRAL................................................................................21 I.2.2.1. Itamarac - Complexo Estuarino Canal de Santa Cruz - PE.................................................23 I.2.2.2. Piraqu - Sistema Estuarino dos rios PiraquAu e Piraqu-Mirim - ES .............................24 I.2.2.3. Paran - Complexo Estuarino Baa de Paranagu.................................................................25 I.2.3. PROCEDIMENTOS INICIAIS ..............................................................................................................26 I.2.4. BIOMARCADORES SOMTICOS .....................................................................................................26 I.2.5. BIOMARCADORES MORFOLGICOS.............................................................................................27 I.2.5.1. Avaliao Histopatolgica .........................................................................................................27 I.2.5.2. Microscopia Eletrnica de Transmisso ...................................................................................28 I.2.5.3. Microscopia Eletrnica de Varredura.......................................................................................28 I.2.6. BIOMARCADOR BIOQUMICO - AVALIAO DA COLINESTERASE ...........................................28 I.2.7. TRATAMENTO ESTATSTICO DOS DADOS........................................................................................29 I.3. RESULTADOS .........................................................................................................................................30 I.3.1. INDICES SOMTICOS........................................................................................................................30 I.3.2. HISTOPATOLOGIA DE BRNQUIAS .................................................................................................32 I.3.3. HISTOPATOLOGIA DE FGADO .......................................................................................................32 I.3.4. ATIVIDADE DA COLINESTERASE ......................................................................................................37 I.4. DISCUSSO .................................................................................................................................... 38 CAPTULO II: BIOMARCADORES DE CONTAMINAO AMBIENTAL EM OSTRAS NOS ESTURIOS BRASILEIROS DE PARANAGU (PR), PIRAQU-A (ES) E ITAMARAC (PE)........................ ........... 45 II. 1. INTRODUO............................................................................................................................... 46 II.2. MATERIAIS E MTODOS ................................................................................................................ 48 II.2.1. ESPCIE BIOINDICADORA...............................................................................................................48 II.2.2. REAS DE ESTUDO E ESTRATGIA AMOSTRAL..............................................................................48 II.2.2.1. Itamarac - Complexo Estuarino Canal de Santa Cruz - PE................................................50 II.2.2.2. Piraqu - Sistema Estuarino dos rios PiraquAu e Piraqu-Mirim - ES ............................51 II.2.2.3. Paran - Complexo Estuarino Baa de Paranagu................................................................52 II.2.3. PROCEDIMENTOS INICIAIS..............................................................................................................53 II.2.4. BIOMARCADOR SOMTICO..........................................................................................................54II.2.5. BIOMARCADORES MORFOLGICOS ...........................................................................................54
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II.2.5.1.Avaliao Histopatolgica .........................................................................................................54 II.2.5.2. Microscopia Eletrnica de Transmisso .................................................................................55 II.2.5.3. Microscopia Eletrnica de Varredura.....................................................................................55 II.2.6. BIOMARCADOR BIOQUMICO - AVALIAO DA COLINESTERASE..........................................55 II.2.7. TRATAMENTO ESTATSTICO DOS DADOS ......................................................................................56 II. 3. RESULTADOS................................................................................................................................. 57 II.3.1. PARMETROS FSICO-QUMICOS DA GUA................................................................................57 II.3.2. NDICE SOMTICO ..........................................................................................................................57 II.3.3. HISTOPATOLOGIA.........................................................................................................................59 II.3.3.1. Leses Detectadas ......................................................................................................................59 II.3.3.2. Ocorrncia de Leses ................................................................................................................63 II.3.4. ATIVIDADE DA COLINESTERASE .....................................................................................................65 II. 4. DISCUSSO .................................................................................................................................. 66
CAPTULO III: CINTICA DE DERIVADOS DE PETRLEO EM Fundulus heteroclitus E Salvelinus alpinus APS EXPOSIO HDRICA........................................................................................ ........... 73 III.1. INTRODUO............................................................................................................................... 74 III.2. MATERIAIS E MTODOS ............................................................................................................... 75 III.2.1. ESPCIES BIOINDICADORAS........................................................................................................75 III.2.1. EXPERIMENTO COM RADIOISTOPOS.......................................................................................76 III.2.1.2. Autoradiografia (WBARG Whole-body Autoradiography)............................................77 III.2.2. SIMULAO DE DERRAMAMENTO DE PETRLEO....................................................................77 III.2.2.1.Anlise de HPAs na gua ........................................................................................................ 79 III.2.2.2.Anlise de HPAs na bile ........................................................................................................... 80 III.3. RESULTADOS................................................................................................................................. 81 III.3.1. Experimento com radioistopos................................................................................................81 III.3.1.1. Anlise Qualitativa................................................................................................................... 81 III.3.1.2. Anlise Quantitativa................................................................................................................ 83 III.3.2. SIMULAO DE DERRAMAMENTO DE PETRLEO....................................................................84 III.3.2.1.Anlise de HPAs na gua ........................................................................................................ 85 III.3.2.2. Anlise de HPAs na bile .......................................................................................................... 86 III.4. DISCUSSO .................................................................................................................................. 87 CONSIDERAES FINAIS .................................................................................................................... 91 CONCLUSES ...................................................................................................................................... 93 REFERNCIAS BIBLIOGRFICAS .......................................................................................................... 94
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LISTA DE FIGURAS
CAPTULO I Figura 1. Localizao geogrfica dos pontos referncia (R) e contaminado (C) nas trs regies
estuarinas avaliadas na costa brasileira...................................................................................23 Figura 2. ndice hepatossomtico (IHS), e fator de condio (FC) de peixes coletados em trs
esturios brasileiros.......................................................................................................................31 Figura 3. Histopatologia de brnquias de peixes das reas
estuarinas avaliadas....................................................................................................................34 Figura 4. ndice histopatolgico de leses branquiais de indivduos coletados nas reas estuarinas
estudadas.....................................................................................................................................34 Figura 5. Histopatologia de fgado em indivduos coletados nas reas estuarinas
avaliadas...................................................................................................................................35 Figura 6. ndice histopatolgico de leses hepticas de indivduos coletados nas reas
estuarinas estudadas...................................................................................................................37 Figura 7. Ocorrncia de centros de melanomacrfagos (CMM) e melanomacrfagos livres (MM)
no fgado de indivduos coletados nas reas estuarinas estudadas....................................37 Figura 8. Atividade da colinesterase no msculo de indivduos coletados nas reas
estuarinas estudadas...................................................................................................................36 CAPTULO II Figura 1. Localizao geogrfica dos pontos referncia (R) e contaminados (C1 e C2) nas trs
regies estuarinas avaliadas na costa brasileira.....................................................................48 Figura 2. ndice de condio (IC) de Crassostrea rhizophora coletada no inverno e vero em trs
esturios brasileiros......................................................................................................................57 Figura 3. Leses histopatolgicas observadas nas brnquias de
Crassostrea rhizophorae.............................................................................................................57 Figura 4. Organizao ultraestrutural e leses detectadas nos filamentos branquiais de
Crassostrea rhizophorae..........................................................................................................59 Figura 5. Microscopia eletrnica de varredura das brnquias de
Crassostrea rhizophorae.............................................................................................................60 Figura 6. Ocorrncia comparativa de leses histopatolgicas nas brnquias de Crassostrea
rhizophorae entre trs regies estuarinas da costa brasileira.............................................62 CAPTULO III Figura 1. Recipiente de conteno de petrleo.....................................................................................48 Figura 2. Autoradiogramas de Fundulus heteroclitus aps exposio de 24h. ..................................79 Figura 3. ndice de concentrao (IC) de Naftaleno, Naftol e Fenantreno em Fundulus heteroclitus
durante 21 dias de experimento...............................................................................................81 Figura 4. Eliminao de Naftaleno, Naftol e Fenantreno durante o perodo de depurao em
Fundulus heteroclitus durante 21 dias de experimento..........................................................81 Figura 5. Presena de HPAs na gua durante o experimento de simulao de derramamento de
petrleo em Salvelinus alpinus...................................................................................................82 Figura 6. Cromatogramas de bile obtidos por HPLC-FL. ........................................................................83
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LISTA DE TABELAS
CAPTULO I Tabela 1. Exemplos de fatores de importncia utilizados no clculo do ndice de leses segundo
Bernet et al. (1999)....................................................................................................................27 Tabela 2. Parmetros fsico-qumicos da gua nos trs esturios avaliados.......................................30 Tabela 3. Parmetros fsico-qumicos da gua nos trs esturios avaliados. .....................................30 CAPTULO II Tabela 1. Parmetros fsico-qumicos da gua nos trs esturios avaliados. .....................................56 Tabela 2. Alteraes histopatolgicas relacionadas a exposio contaminantes observadas por
alguns autores nas brnquias de bivalves................................................................................66 CAPTULO III Tabela 1. Caractersticas dos contaminantes testados..........................................................................74 Tabela 2. Estimativa da concentrao de HPAs metilados em amostras provenientes da
simulao de derramamento de petrleo...........................................................................83
Tabela 3. Caractersticas dos metablitos naftol, fenantrol e pirenol..................................................83
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RESUMO
Ambientes aquticos, particularmente regies estuarinas, constituem o destino final de diversos tipos de contaminantes. Este estudo apresenta duas abordagens diferentes: a avaliao comparativa de biomarcadores em trs regies estuarinas brasileiras e avaliao da cintica de derivados do petrleo atravs de bioensaios. Para o biomonitoramento dos esturios de Paranagu (PR), Piraqu (ES) e Itamarac (PE) foram utilizados trs organismos bioindicadores: peixes (Cathorops spixii e Lutjanus synagris) e ostras (Crassostrea rizophorae). Biomarcadores somticos, histopatolgicos (brnquias e fgado) e bioqumico (atividade da acetilcolinesterase) foram avaliados em ambas as espcies. Diferenas nos ndices somticos e atividade da colinesterase, bem como a ocorrncia de leses histopatolgicas foram detectadas nos peixes. As ostras apresentaram ndices de condio e atividade da colinesterase similar entre as reas avaliadas, alm disso, leses histopatolgicas foram observadas nestes organismos. Em todas as reas amostradas os peixes apresentaram diferenas no fator de condio, nas leses histopatolgicas hepticas e branquiais, bem como na atividade da colinesterase nos diferentes pontos de coleta. A avaliao cintica e toxicolgica de derivados de petrleo foi realizada atravs de dois experimentos (1) exposio a derivados de petrleo (naftaleno, naftol e fenantreno) marcados com 14C e (2) simulao de derramamento de petrleo. Atravs do experimento (1) foi possvel observar a cintica dos compostos avaliados na espcie de peixe Fundulus heteroclitus. Os principais rgos alvo destes compostos foram vescula biliar, intestino e fgado. Atravs da simulao de derramamento de petrleo foi possvel detectar a presena de derivados de HPAs na gua atravs de espectofotometria e de HPLC-FL, porm estes compostos no foram detectados na bile de Salvelinus alpinus atravs da anlise ao HPLC-FL. Os resultados obtidos nos esturios brasileiros revelam que todas as reas avaliadas esto impactadas, bem como a importncia da abordagem de mltiplos biomarcadores em estudos de biomonitoramento. Os estudos relativos cintica contribuem para uma melhor compreenso dos mecanismos de disperso, biocumulao e distribuio de HPAs leves em peixes.
Palavras-chave: atividade da acetilcolinesterase, biomarcadores, biomonitoramento, cintica de derivados de petrleo, fenantreno, hidrocarbonetos policclicos aromticos, histopatologia, naftaleno, naftol.
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ABSTRACT
Aquatic environments, particularly estuarine regions, receive a expressive load of contaminants. This study presents two different approaches: a comparative biomarker evaluation in three Brazilian estuarine areas and a kinetic evaluation of petroleum derivatives through bioassays. The biomonitoring of Paranagu (PR), Piraqu (ES) and Itamarac (PE) estuaries were carried out on three bioindicator species: fishes (Cathorops spxii and Lutjanus synagris) and oysters (Crassostrea rizophorae). Somatic, histopathologic (gills and liver) and biochemical biomarkers (cholinesterase activity) were evaluated on these species. Differences on somatic indexes and cholinesterase activity as well as the occurrence of histopathologic lesions were detected on fishes. Oysters presented somatic indexes and cholinesterase activity values similar between evaluated areas, besides that, histopathologic lesions were observed on these organisms. Fishes presented differences on condition factor, histopathologic lesions on liver and gills, as well on cholinesterase activity. In order to evaluate the kinetic parameters of petroleum derivatives two experiments were done: (1) a waterborne exposition to selected petroleum derivatives (naphthalene, naphtol and phenantrene) radiollabeled with 14C and (2) a simulation of an oil spill. The results of the first experiment showed that the main target organs for naphthalene, naphtol and phenantrene in Fundulus heteroclitus, were gall blader, intestine and liver. The presence of petroleum derivatives was detected on the aquaria water trhough spectophotometry and HPLC-FL after the oil spill simulation. However these compounds were not detected on the bile of evaluated animals anlysed through HPLC-FL. The results obtained on the Brazilian estuaries suggest that all evaluated areas are impacted, as well the relevance of a multibiomarker approach on biomonitoring studies. The kinetic results contribute to a better understanding of dispersion, bioaccumulation and distribution of light PAHs on fishes.
Key-words: acetilcholinesterase activity, biomarkers, biomonitoring, histopathology, kinetic of petroleum derivatives, naphtalene, naphtol, phenentrene, polycyclic aromatic hidrocarbons.
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INTRODUO GERAL
1. CONTAMINAO EM AMBIENTES AQUTICOS
Os ecossistemas aquticos so considerados receptores finais de
contaminantes liberados no ambiente, estando susceptveis a ao de
contaminantes areos, que chegam aos corpos dgua por deposio
atmosfrica e contaminantes terrestres que atingem os ambientes aquticos
atravs do escoamento destes pelas chuvas.
Os esturios so ambientes aquticos de transio entre ecossistemas
dulccolas e marinhos. So regies parcialmente fechadas nas quais a gua do
mar bastante diluda pelo aporte de gua doce do continente (Thurman e
Trujillo, 1999). As regies estuarinas so extremamente importantes do ponto de
vista biolgico, pois apresentam alta riqueza de espcies e podem ser
consideradas como berrio para diversas espcies marinhas, tanto pela
proteo quanto pela grande disponibilidade de nutrientes (Thurman e Trujillo,
1999).
Situados em regies costeiras, os esturios freqentemente encontram-se
localizados em reas de grande atividade antropognica, sendo, portanto
susceptveis aos impactos decorrentes destas atividades. As principais fontes de
impacto ambiental em esturios seriam o escoamento de esgoto proveniente de
reas urbanas, a liberao de diversos produtos qumicos (orgnicos e
inorgnicos) pela atividade industrial, a agricultura e o fluxo de embarcaes,
atividade a partir da qual podem ocorrer vazamentos acidentais de petrleo e
derivados, combustveis e outros produtos transportados por via martima (Kennish,
1991).
Atravs das diversas fontes acima citadas, os poluentes mais comumente
encontrados em esturios so: metais pesados (em especial os compostos
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organoestanhos); hidrocarbonetos policclicos aromticos (HPAs); pesticidas como
bifenilas policloradas(PCBs), organoclorados (OC) e organofosforados; dioxinas e
furanos; detergentes e outros componentes do esgoto urbano e da ocupao
humana.
1.1. METAIS PESADOS
Os metais pesados correspondem a um grupo de elementos qumicos que
apresenta massa atmica variando entre 63,54 a 200,59 (Viarengo, 1989). A
maioria dos metais pesados apresenta potencial txico comprovado, ou seja,
so capazes de induzir efeitos deletrios aos organismos vivos expostos (Dallinger
e Raimbow, 1993). Alguns metais pesados como ferro, cobre, zinco e cobalto, so
considerados elementos essenciais aos processos biolgicos, mas podem ser
txicos quando em concentraes mais elevadas (Kennish, 1991; Heath, 1995).
A atividade industrial de minerao, processamento de metais e gerao
de despejos industriais e domsticos vem contribuindo para o aumento da
concentrao de diversos metais pesados nos ambientes naturais (Abel, 1989).
Os organismos vivos podem bioacumular metais pesados, incorporando-os na
cadeia trfica e atingindo grande parte dos diferentes estratos que constituem os
ecossistemas aquticos (Viarengo, 1989).
Experimentos agudos com peixes atravs de estudos de laboratrio
mostraram que o mercrio capaz de induzir alteraes branquiais como a
fuso de lamelas secundrias nas espcies Trichomycterus zonatus e Salvelinus
alpinus (Oliveira Ribeiro et al., 1996; Oliveira Ribeiro et al., 2000). No entanto
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existem relatos de que outros metais pesados, como o chumbo, tambm podem
afetar a estrutura das brnquias em peixes (Alves Costa, 2001).
Alteraes hepticas em peixes expostos a metais tambm foram
relatadas em nosso grupo de pesquisa. reas de necrose, danos nucleares e
morte celular foram relatados por Rabitto et al (2005) em Hoplias malabaricus
aps exposio crnica a chumbo inorgnico. Oliveira Ribeiro et al. (2002)
observaram desorganizao citoplasmtica e reas de necrose aps exposio
trfica ao metil-mercrio.
1.2. HIDROCARBONETOS POLICCLICOS AROMTICOS
Os hidrocarbonetos policclicos aromticos (HPAs), so compostos
orgnicos que apresentam dois ou mais anis carbnicos fundidos. Alguns HPAs
como o benzo[a]pireno, so formados atravs da combusto incompleta de
compostos orgnicos e subseqente recombinao com outras partculas
orgnicas, constituindo portanto uma fonte importante destes compostos
(Harvey,1991).
HPAs podem ser introduzidos naturalmente no ambiente atravs de
queimadas de florestas, pastagens e atividades vulcnicas. Como fontes
antropognicas de HPAs possvel destacar: descargas e derramamentos de
petrleo, gerao de energia eltrica, esgotos urbanos e industriais, incinerao
de lixo e madeira, aquecimento de casas alm da produo de carvo e asfalto
(Albers, 1995).
A presena de HPAs em ambientes aquticos contaminados pode ser
detectada tanto nos componentes biticos quanto nos componentes abiticos
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do ecossistema. Mamferos, aves, peixes e vrios macroinvertebrados so
capazes de metabolizar os hidrocarbonetos ingeridos, porm, organismos que
vivem muito prximos fonte de contaminao ou que no possuem sistemas
de detoxificao bem desenvolvidos, como os bivalves, tendem a bioacumular
estes compostos mais intensamente (Albers, 1995).
Em invertebrados tem-se registrado que os HPAs so capazes de causar a
induo de danos celulares, presena de tumores, prejuzos na reproduo,
reduo das taxas de crescimento e desenvolvimento, e em casos de
contaminao muito severa, a morte dos organismos (Hsu e Deng, 1996 e Ueno
et al, 1995). Alm dos efeitos descritos, em peixes os HPAs freqentemente esto
associados a mutaes, malformaes, tumores e cncer (Collier et al. 1998), e
ainda a alteraes fisiolgicas e morfolgicas nos rins e fgado, hiperplasia nas
brnquias e eroso em nadadeiras observadas por Hsu e Deng (1996).
Dados mostram que os hidrocarbonetos derivados do petrleo provocam
danos estruturais nas lamelas respiratrias das brnquias (DiMichele e Taylor, 1978;
Engelhardt et al., 1981; Poirier et al.,1989; Correa e Garcia, 1990; Prasad, 1991,
Nero et al., 2006), comprometendo as trocas gasosas do organismo com o meio
e resultando em hipxia, sendo esta a principal causa de morte em massa de
peixes. Alm disso, Spiers et al. (1996) identificaram leses hiperplsicas em
clulas mucosas e de cloreto nas brnquias de peixes expostos a HPAs.
Hidrocarbonetos podem se acumular em ovos de peixes e so
transferidos para as larvas aps a ecloso dos ovos (Goksoyr et al., 1991). Spiers et
al. (1996) observaram necroses mltiplas e um varivel nmero de macrfagos e
linfcitos no fgado de organismos expostos em um derramamento de petrleo
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no canal de Santa Brbara. Segundo estudos de diversos autores os
hidrocarbonetos provenientes do petrleo elevam as concentraes de cortisol
no plasma (Di Michele eTaylor, 1978; Levitan e Taylor, 1979; Engelhardt et al., 1981;
Leloup-Hatey e Hardy, 1985). O aumento na concentrao deste hormnio
deprime a funo da tireide (Redding et al., 1986; Brown et al., 1991), podendo
apresentar como conseqncia alteraes no comportamento reprodutivo e
alimentar dos organismos expostos.
Estudos recentes realizados em nosso laboratrio mostraram que a frao
solvel do petrleo capaz de causar inibio na atividade da
acetilcolinesterase (AChE) em Astyanax sp aps exposio aguda, bem como
vrias das leses mencionadas acima (Akaishi et al., 2004).
1.3. PESTICIDAS ORGANOCLORADOS
Aps a Segunda Guerra Mundial, ocorreu um sbito aumento no uso dos
inseticidas. Logo aps o seu uso comeou-se a observar que tais compostos eram
encontrados com freqncia no ambiente natural, principalmente em
organismos que no constituam seu alvo inicial. Sua toxicidade, persistncia e
caractersticas lipoflicas, causavam o acmulo de resduos em tecidos,
mortalidade, efeitos na reproduo e declnio de populaes selvagens. Estudos
sobre os efeitos de pesticidas em peixes tiveram incio logo aps a introduo do
DDT (dimetil-difenil-tricloroetano) em 1943 (Blus,1995).
Alm da vasta utilizao na agricultura, como pesticidas, outros
organoclorados (PCBs - bifenilas policloradas, DDT, dioxinas e furanos),
principalmente os PCBs tm sido extensivamente utilizados nas indstrias
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eletrnicas, manufatura de adesivos, aditivos de leo hidrulico, tintas, extintores,
plsticos e em copiadoras de papel (Tam e Yao, 2002).
Assim como os HPAs, vrios dos compostos organoclorados pertencem a
classe dos poluentes orgnicos persistentes (POPs), os quais so compostos que
apresentam resistncia degradao e, portanto, encontram-se por perodos
de tempo prolongados no ambiente (Ali e Sreekrishnan, 2001; Fillman et al., 2002).
Os POPs podem ser transportados por longas distncias, pois tem sido detectados
em amostras biolgicas coletadas em locais distantes das fontes de
contaminao (Simonich e Hites, 1995 apud Vives e Grimalt, 2002) e podem
participar de diversos ciclos biogeoqumicos sem sofrerem degradao (Vives e
Grimalt, 2002).
Por sua toxicidade e persistncia no ambiente, os POPs tem sido o alvo
principal de atuao dos rgos de proteo ambiental no Canad (Canadian
Environmental Protection) e Estados Unidos (United States Protection Agency -
EPA) (Ali e Sreekrishnan, 2001). Os POPs, por serem de difcil degradao, tendem
a se concentrar no ambiente e serem bioacumulados pelos organismos vivos
afetando a sade dos ecossistemas e da mesma forma colocando em risco a
sade humana (Fillman et al., 2002). Os compostos organoclorados persistem por
longos perodos no ambiente, com isso atuam cronicamente sobre os organismos
vivos sendo capazes de induzir alteraes genticas nos organismos expostos,
podendo levar a alteraes congnitas e neoplasias diversas (Ali e Sreekrishnan,
2001). Sendo assim, estes compostos esto associados a graves efeitos
ambientais, atuando sobre uma ampla variedade de espcies e atingindo todos
os nveis trficos (Blus,1995). A exposio a organoclorados tem sido associada ao
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declnio de populaes de animais marinhos (Tanabe et al,. 1994 apud Fillman et
al., 2002).
1.4. PESTICIDAS ORGANOFOSFORADOS E CARBAMATOS
Os organofosforados e carbamatos so pesticidas que tem sido utilizados
no controle de insetos e outros invertebrados (Hill, 1995). Esta classe de pesticidas
rapidamente metabolizada ou excretada pela maioria dos organismos vivos,
no havendo bioconcentrao nas cadeias trficas. Portanto, os
organofosforados e carbamatos apresentam um tempo relativamente curto de
permanncia no ambiente. Esses fatores, associados sua eficincia tem
favorecido a substituio dos organoclorados pelos organofosforados e
carbamatos.
Os organismos podem ser afetados pelos organofosforados e carbamatos
atravs do contato direto, que pode ocorrer na aplicao do pesticida, na
ingesto de gua, solo, presas ou alimentos contaminados. Vrios estudos
mostram que organismos aquticos expostos organofosforados e carbamatos
afetam a atividade das colinesterases (De la Torre et al., 2002; Rofriguez-Fuentes e
Gold-Bouchot, 2000; Tortelli et al., 2006).
1.5. ORGANOESTANHOS: TRIBUTIL-ESTANHO (TBT) E DIBUTIL-ESTANHO (DBT)
O TBT (tributil-estanho) um composto organometlico que tem sido
amplamente utilizado como biocida em tintas de embarcaes desde a
dcada de 70, e talvez seja o agente qumico mais txico que tem sido
introduzido deliberadamente nos ecossistemas aquticos (Pelletier, 1995). Alm
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disso, este composto utilizado tambm na indstria de PVC como estabilizador,
na proteo de madeira contra fungos e bactrias, como agente desinfetante e
como pesticida na agricultura. Apesar de regulamentado o uso do TBT em vrios
pases, a contaminao ainda persiste em nveis txicos crnicos, havendo
registros da presena deste composto nos organismos aquticos e sedimento
(Fent e Hunn, 1995).
Em vrios animais (como mamferos, peixes e invertebrados) foi
demonstrado que o TBT metabolizado em produtos intermedirios hidroxilados
como o dibutil-estanho (DBT) e monobutil-estanho (MBT) (Fent, 1996).
Experimentos in vivo e in vitro tm demonstrado que xenobiontes como o TBT
podem inibir o sistema enzimtico citocromo P450 em peixes, atravs da
inativao de algumas enzimas deste complexo, alterando-as e inibindo o seu
funcionamento (Fent e Stegman, 1993; Fent e BucheliI, 1994). Desta forma, o TBT
pode alterar tanto o seu prprio metabolismo quanto o de outros poluentes que
so biotransformados pelo sistema P450. Alm disso pode interferir em outras vias
metablicas do organismo como a biosntese de hormnios, processo do qual
este complexo multienzimtico participa (Pdros et al., 2000).
Segundo Fent e Meier (1992), a presena de TBT na gua leva a um alto
ndice de mortalidade de larvas de Phoxinus phoxinus, alm de deformao no
eixo do corpo, paralisia e presena de olhos opacos. Tambm foi observado
nesta mesma espcie degenerao na pele, msculo esqueltico, rim e epitlio
da crnea, com algumas clulas apresentando vacuolizao do citoplasma e
picnose. Dados recentes e ainda no publicados pelo nosso grupo, mostram que
o TBT quando dissolvido na gua, leva mortalidade de 100% da populao de
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alevinos de Phaloceros caudimaculatus, em concentraes consideradas
subletais para outros organismos de clima nrdico. Estes resultados mostram que
alevinos de Phaloceros caudimaculatus so mais sensveis do que peixes de clima
temperado. A sensibilidade e suscetibilidade mais acentuada em organismos
tropicais do que nrdicos foi demonstrada no estudo realizado por Oliveira
Ribeiro et al. 2000, neste trabalho a espcie brasileira Trichomycterus zonatus foi
capaz de acumular maiores concentraes de Hg do que espcie nrdica
Salvelinus alpinus em condies experimentais similares. Estes resultados reforam
ainda mais o argumento de que a legislao referente a nveis mximos
permissveis da presena de contaminantes na gua deveria ser estabelecida a
partir de resultados obtidos com espcies nativas, dados esses que ainda so
escassos na literatura.
Trabalhos desenvolvidos no nosso laboratrio demonstraram ainda que
exemplares de Salvelinus alpinus submetidos a injees intraperitoneais de 0,3 mg
TBT/kg apresentaram necroses hepticas e alteraes na organizao da
cromatina em hepatcitos (Valdez Domingos, 1999). A presena de necroses
associada exposio ao TBT tambm foi relatada por outros autores (Holm et
al., 1991; Schwaiger et al., 1992; Ueno et al., 1994 e Ueno et al., 1995 e Oliveira
Ribeiro et al, 2002), evidenciando este tipo de alterao como um importante
elemento na identificao do potencial txico do TBT em fgado de peixes. O
fgado um importante rgo-alvo para o TBT e seus derivados, onde a ao
deletria deste composto pode comprometer as condies de vida do
organismo tanto pela importncia do rgo, quanto pela gravidade das
alteraes diagnosticadas.
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Dada sua toxicidade faz-se necessria a quantificao e discusso dos
nveis de TBT e DBT na costa brasileira, bem como estudos para diagnosticar de
forma mais ampla seus reais efeitos sobre os organismos aquticos tropicais
brasileiros. A utilizao de espcies nativas nestes estudos, mesmo quando
realizados em condies de laboratrio, constituem dados importantes
auxiliando na escolha de espcies bioindicadoras em estudos de
biomonitoramento e diagnstico de reas impactadas por estes contaminantes.
Diante das mltiplas fontes de impacto antropognico sobre as regies
costeiras, principalmente nas reas estuarinas, faz-se necessrio o
desenvolvimento e a padronizao de metodologias e de biomarcadores que
possam contribuir para a avaliao e diagnstico dos impactos a que esto
sujeitas estas regies no Brasil.
2. PEIXES E MOLUSCOS COMO BIOINDICADORES DE QUALIDADE AMBIENTAL
Bioindicadores so espcies de organismos vivos cujas caractersticas
favorecem sua utilizao na avaliao da sade de um determinado
ecossistema. Alguns fatores devem ser considerados na escolha de espcies
bioindicadoras em estudos de biomonitoramento: (1) a espcie deve ser
representativa da rea de estudo; (2) deve possuir hbito preferencialmente
sedentrio ou de baixa mobilidade, constituindo assim populaes fixas a fim de
que sua exposio aos contaminantes possa refletir as condies da regio em
estudo (Radtke, 1979); (3) os organismos bioindicadores devem ser de fcil
identificao e coleta em todas as estaes do ano; (4) o tamanho do animal
um fator importante, pois deve possibilitar a obteno de material biolgico
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suficiente para garantir a realizao das anlises propostas no estudo (Stewart e
Malley, 1997); e (5) o nvel trfico da espcie a ser utilizada tambm deve ser
avaliado, pois espcies que ocupam nveis trficos superiores geralmente so
mais representativas, uma vez que podem fornecer informaes relacionadas
aos fenmenos de bioacumulao e biomagnificao (Oliveira Ribeiro et al.,
1999; Vives e Grimalt ,2002).
A utilizao de espcies de vertebrados e de invertebrados em um mesmo
estudo de biomonitoramento ambiental gera resultados que possibilitam uma
anlise mais ampla das condies de impacto do ambiente, visto que existem
diferenas na fisiologia e complexidade de respostas que estes organismos
podem apresentar. Desta forma o uso de um nmero variado de biomarcadores
como avaliaes somticas, moleculares, bioqumicas, genticas, imunolgicas
e morfolgicas torna o estudo mais representativo. No entanto, dependendo do
biomarcador selecionado, os protocolos para estes parmetros diferem,
podendo ser especficos para grandes grupos taxonmicos ou mesmo para
famlias, gneros e espcies, fazendo-se necessria uma padronizao prvia
dos protocolos antes do incio das amostragens definitivas.
Peixes e moluscos apresentam vrias das caractersticas acima citadas e
tm sido considerados excelentes bioindicadores. Estes organismos vm sendo
amplamente utilizados em estudos de toxicologia e monitoramento ambiental, na
avaliao da sade dos ecossistemas aquticos tanto com relao presena
quanto aos efeitos de poluentes (Carajaville et al., 2000; Silva et al., 2001; Nasci et
al., 2002; Svrdh, 2003; Amado et al., 2003 e 2006; Joyeux et al., 2004; Medeiros et
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al., 2005; Oliveira Ribeiro et al., 2005; Binelli et al., 2006; Rabitto et al., 2005; Nigro et
al., 2006; Teles et al., 2006; Zanette et al., 2006).
3. BIOMONITORAMENTO
Atravs de programas de monitoramento possvel identificar e
acompanhar impactos antropognicos em determinadas reas ao longo do
tempo (Lange, 1996). Inicialmente os estudos de monitoramento enfocavam a
deteco de contaminantes no compartimento abitico de ambientes
aquticos (coluna dgua e sedimento) (Van der Oost et al., 1996; Rainbow et al.,
1995; Silva et al., 2001), posteriormente comeou-se a avaliar a presena de
xenobiontes nos componentes biticos desses contaminantes (Kehrig et al., 1998;
Schmitt et al., 1999; Watanabe et al., 1999). Alguns autores como Meyer et al.
(1998), Silva et al. (2001), Joyeux et al. (2004), Pereira e Kuch (2005) e Silva et al.
(2006) relatam a presena de contaminantes em guas costeiras brasileiras.
Estudos de biomonitoramento direcionados a deteco e avaliao de
efeitos em organismos vivos so bem mais recentes (Doran et al., 2001; Barreiro et
al., 2002; Nasci et al., 2002; Monteiro et al., 2005; Munteanu e Munteanu, 2006) e
vm sendo bastante utilizados em ambientes estuarinos e marinhos na Europa e
Amrica do Norte (Nasci et al., 2002; Petrovic et al., 2004; Munteanu and
Munteanu, 2006; Nigro et al., 2006). Na costa brasileira ainda so escassos os
dados relativos biomonitoramento, estes estudos foram recentemente inciados
e vm sendo realizados mais intensamente nos ltimos anos (Ventura et al., 2002;
Lemos et al., 2005; Martins et al., 2005; Amado et al., 2006; Camargo and
Martinez, 2006; Zanette et al., 2006), como o projeto RECOS financiado pelo
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Ministrio da Cincia e Tecnologia atravs do Instituto do Milnio, do qual faz
parte o presente trabalho.
O Projeto Instituto do Milnio - RECOS - Uso e Apropriao dos Recursos
Costeiros, um projeto amplo, aprovado pelo Ministrio da Cincia e Tecnologia
(Dez/2001), e financiado pelo Banco Mundial, no qual esto envolvidas diversas
instituies brasileiras: FURG, CECO (UFRGS); UNISUL, CLIMERH/EPAGRI (SC), UFSC,
UFPR, IAG (USP), UFFL, UFES, UFRPE, UFPE, UFMA, UFPA e Museu Goeldi.
Quatro grandes reas temticas constituram o Projeto Instituto do Milnio:
(1) Modelo Gerencial da Pesca, (2) Maricultura Sustentvel, (3) Monitoramento,
Modelagem, Eroso e Ocupao Costeira e (4) Qualidade Ambiental e
Biodiversidade. Na rea temtica Qualidade Ambiental e Biodiversidade do
Projeto Instituto do Milnio est inserido o programa Qualidade Ambiental
Biomarcadores, que realizou estudos em 5 regies da costa brasileira nos estados
do Par (PA), Pernambuco (PE), Esprito Santo (ES), Paran (PR) e Rio Grande do
Sul (RS).
O presente trabalho est inserido no programa acima citado, que objetivou
avaliar e comparar cinco diferentes regies da costa brasileira impactadas por
atividades antropognicas, atravs da utilizao de diferentes classes de
biomarcadores, bem como estabelecer e padronizar metodologias que possam
ser efetivamente aplicadas em estudos de biomonitoramento em regies
costeiras do Brasil.
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4. BIOMARCADORES
Biomarcadores so respostas bioqumicas, fisiolgicas ou parmetros
morfolgicos alterados, causados pela exposio de um organismo a um
determinado xenobionte (Melancon, 1995). Os biomarcadores tambm podem ser
definidos como alteraes biolgicas em nvel molecular, celular e fisiolgico, as
quais expressam a exposio e os efeitos txicos causados pelos poluentes (Walker
et al., 1996).
Alguns critrios devem ser avaliados na definio de biomarcadores a
serem utilizados em um estudo: especificidade, o biomarcador deve demonstrar
o efeito especfico de um determinado contaminante no funcionamento de um
determinado rgo alvo e/ou de estrutura vital; fcil reprodutibilidade
(metodologia e logstica acessvel) e ainda, clareza na interpretao dos
resultados, de forma que seja possvel diferenciar resultados devidos exposio
aos contaminantes de oscilaes fisiolgicas normais (Stegeman et al., 1992;
Bainy, 1993).
A utilizao de biomarcadores em estudos de toxicologia apresenta
vrias vantagens, pois permite: (1) detectar precocemente a existncia de
contaminao por substncias txicas biologicamente significativas, (2)
identificar espcies ou populaes em risco de contaminao, (3) avaliar a
magnitude da contaminao, e (4) determinar o grau de severidade dos efeitos
causados pelos contaminantes (Stegeman et al., 1992).
Segundo Oost et al. (2003), biomarcadores podem ser classificados como:
(1) Biomarcadores de efeito, constituem parmetros mensurveis em
compartimentos celulares que permitem inferir efeitos prejudiciais ou adversos
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aos organismos; como a induo das enzimas CYP1A1 e CYP1A2 do citocromo
P450 na presena de hidrocarbonetos policclicos aromticos. (2) Biomarcadores
de exposio, atravs dos quais possvel detectar e/ou quantificar a presena
do xenobionte, seus metablitos ou sua associao a componentes celulares ou
moleculares do organismo; como a deteco de metblitos na bile em animais
expostos a HPAs. H ainda biomarcadores inespecficos, que respondem a vrios
contaminantes e podem ser utilizados como indicadores gerais de exposio. Os
biomarcadores inespecficos, como avaliao de leses histopatolgicas e
ndices somticos, auxiliam na deteco da presena e efeito de xenobiontes
em ambientes aquticos, sendo altamente recomendada sua utilizao em
estudos de biomonitoramento ambiental e diagnstico de reas impactadas.
Neste estudo os biomarcadores sero classificados, segundo Adams et al (1989),
de acordo com nvel de organizao biolgica em biomarcadores somticos,
bioqumicos e morfolgicos.
A avaliao de contaminao de ambientes aquticos atravs de
biomarcadores tem sido bastante utilizada em estudos de biomonioramento,
porm a maioria dos estudos tem avaliado apenas um nico nvel de
organizao biolgica (Sturm et al., 1999; Coughlan et al., 2002; Lionetto et al,
2003; Galloway et al., 2004; Binelli et al., 2006; Zanette et al., 2006). A utilizao de
biomarcadores pertencentes a dois ou mais nveis de organizao biolgica
como realizado por Noaksson et al., 2005; Amado et al. 2006, Camargo e
Martinez (2006) e no presente estudo, possibilita a obteno de diferentes tipos
de respostas que podem ser comparadas e confrontadas. Este tipo de
abordagem proporciona um diagnstico mais preciso e confivel da situao da
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rea estudada e representa a tendncia atual em estudos de
biomonitoramento.
5. CINTICA DE CONTAMINANTES EM ORGANISMOS AQUTICOS COMO
FERRAMENTA PRVIA A ESTUDOS DE BIOMONITORAMENTO
Organismos aquticos so capazes de absorver, e bioacumular
contaminantes presentes na gua ou alimento (Akaishi et al. 2004).
Atravs da cintica de contaminantes possvel compreender as vias de
absoro e distribuio de contaminantes em organismos aquticos (Arukwe et
al., 1999; Rouleau et al., 1999; Inza et al., 2001; Fowler et al., 2004; Bianchini et al.,
2005; Edginton and Rouleau, 2005; Wood et al., 2002). Este tipo de estudo fornece
subsdios aos estudos de biomonitoramento, pois identifica de forma mais precisa
tecidos e rgos alvos.
A autoradiografia (WBARG - whole-body autoradiography) uma
metodologia que vem sendo muito utilizada em estudos de cintica, pois permite
quantificar e qualificar a presena e distribuio de contaminantes atravs de
organismos expostos a xenobiontes radioativamente marcados. A cintica de
alguns contaminantes como zinco, cdmio (Inza et al., 2001; Rouleau et al., 1998
e 2001; Fowler et al., 2004), mercrio (Rouleau et al., 1998 e 1999), mercrio
inorgnico e metilmercrio (Oliveira Ribeiro et al., 1999), prata (Wood et al., 2002;
Fowler et al., 2004; Bianchini et al., 2005), nonilfenol (Arukwe et al., 1999), tributil-
estanho (Rouleau et al., 1999 e 2003) e bifenilas policloradas (PCBs) (Fowler et al.,
2004) em peixes j foram avaliadas atravs de WBARG. No entanto h uma
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grande quantidade de contaminantes que ainda no tiveram seus potenciais de
absoro, bioacumulao e eliminao elucidados.
Esta tese foi estruturada em 3 captulos, os captulos I e II trazem os resultados
obtidos em um estudo de biomonitoramento em trs regies da costa brasileira
utlizando trs organismos biondicadores e um abordagem de mltiplos
biomarcadores, o captulo III traz uma abordagem cintica de alguns derivados
de baixa massa molecular de petrleo e tambm apresenta uma simulao de
derramamento de petrleo em laboratrio como uma nova abordagem para
estudo dos efeitos da frao solvel do petrleo na gua.
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CAPTULO I
BIOMARCADORES DE CONTAMINAO AMBIENTAL EM
PEIXES NOS ESTURIOS BRASILEIROS DE PARANAGU
(PR), PIRAQU-A (ES) E ITAMARAC (PE)
COLABORAO:
Patrcia de Souza Diogo
Michelle da Cunha Torres
Manuela Dreyer da Silva
Prof. Dra. Helena Cristina da Silva de Assis
Publicao relacionada:
Valdez Domingos, F.X.; Silva de Assis, H.C.; Silva, M.D.; Damian, R.C.; Almeida, A.I. M.; Cestari, M.M.; Randi, M.A.F.; Oliveira Ribeiro, C.A. Biomonitoring of Estuarine Areas in the Brazilian Coast: a Multi-Biomarker Approach. Manuscrito submetido a revista Ecotoxicology and Environmental Safety.
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I. 1. INTRODUO
Despejos urbanos, agrcolas e industriais representam as principais fontes de
contaminao em rios, esturios e oceanos (De la Torre et al. 2005; Nigro et al.
2006). Poluentes como hidrocarbonetos policclicos aromticos (HPAs), bifenilas
policloradas (PCBs), compostos organoclorados (OCs) e metais pesados esto
entre as principais classes de contaminantes que so frequentemente
encontrados nestes ecossistemas (Oliveira Ribeiro et al., 2005; Munteanu e
Munteanu, 2006; Nigro et al. 2006).
Para medir efeitos agudos e crnicos de contaminantes no ambiente
alguns parmetros como crescimento, fator de condio, ndice
gonadossomtico e hepatossomtico podem ser avaliados (Deviller et al., 2005;
Teles e Santos, 2006).
Leses histopatolgicas e alteraes em atividades enzimticas so alguns
dos efeitos relatados em estudos prvios em organismos aquticos em reas
impactadas (Akaishi et al., 2004; Mouchet et al. 2006). A ocorrncia de danos
celulares e teciduais em fgado e brnquias de peixes ambientalmente expostos
a HPAs, PCBs, metais pesados, esgoto, efluentes porturios e industriais tem sido
descrita por vrios autores (Stentiford et al., 2003; Norena-Barroso et al., 2004;
Oliveira Ribeiro et al., 2005). Alm desses efeitos, a avaliao da atividade da
colinesterase (Dellali et al., 2001; Tortelli et al., 2006; Quintaneiro et al. 2006)
representa um parmetro bastante utilizado em programas de monitoramento
ambiental.
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Estudos que avaliam o impacto das atividades humanas em reas costeiras
brasileiras tem aumentado recentemente principalmente nas regies sul e
sudeste (Joyeux et al., 2004; Medeiros et al., 2005; Pereira e Kuch, 2005; Lemos et
al., 2005; Martins et al., 2005; Amado et al., 2006; Camargo e Martinez, 2006; Silva
et al., 2006; Umbuzeiro et al., 2006; Zanette et al., 2006), mas no h registros de
estudos comparativos entre reas costeiras brasileiras nem investigaes que
utilizem diferentes classes de biomarcadores. Aqui no Brasil, assim como em outros
pases, os impactos ambientais em reas costeiras representam causa de
preocupao no que se refere aos efeitos de poluentes na sade dos organismos
aquticos e na qualidade dos alimentos de origem marinha e estuarina.
O Projeto Instituto do Milnio - RECOS - Uso e Apropriao dos Recursos
Costeiros (vide introduo geral) objetivou avaliar e comparar cinco diferentes
regies da costa brasileira impactadas por atividades antropognicas, atravs da
utilizao de diferentes classes de biomarcadores, bem como estabelecer e
padronizar metodologias que possam ser efetivamente aplicadas em estudos de
biomonitoramento em regies costeiras do Brasil.
O objetivo deste captulo foi avaliar comparativamente trs regies
estuarinas impactadas por ocupao humana devido liberao de efluentes
industriais e urbanos e tambm por atividades porturias que ocorrem ao longo
da costa brasileira, empregando-se diferentes classes de biomarcadores como
ndices somticos, histopatologia e neurotoxicidade em duas espcies de peixes.
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I.2. MATERIAIS E MTODOS
I.2.1. ESPCIES BIOINDICADORAS
O bagre amarelo, Cathorops spixii (Siluriformes, Ariidae) habita reas
costeiras marinhas, esturios, lagoas e desembocaduras de rios, podendo ser
encontrado at em guas hipersalinas. Esta espcie distribui-se desde Belize
(Amrica Central) at o sul do Brasil, podendo ser encontrado em profundidades
de at 50 m (Figueiredo e Menezes, 1978). Os adultos podem apresentar
comprimento total mximo de 30 centmetros (Fishbase, 2006). Esta espcie de
bagre abundante na Baa de Paranagu (Fvaro et al. 2005), e
economicamente importante na pesca artesanal da regio sul do Brasil. C. spixii
apresenta hbito carnvoro e utiliza invertebrados e pequenos peixes como itens
principais de sua dieta (Fishbase, 2006).
O vermelho arioco, Lutjanus synagris (Perciformes, Lutjanidae) apresenta
registros de ocorrncia desde o atlntico oeste (Carolina do Norte, USA) at o
sudeste do Brasil, incluindo o golfo do Mxico e o Caribe. Esta espcie pode
encontrar-se associada a diferentes tipos de substrato, desde reas de recifes de
coral at reas lodosas; alimenta-se em geral a noite de invertebrados
bentnicos e pequenos peixes e pode atingir at 60 cm de comprimento total na
fase adulta (Fishbase, 2005).
I.2.2. REAS DE ESTUDO E ESTRATGIA AMOSTRAL
O projeto foi desenvolvido em trs regies da costa brasileira: nos estados
de PE, ES e PR (Figura 1). As coletas foram realizadas atravs de rede de arrasto
pelos integrantes da rea temtica de Biodiversidade, pertencentes ao Projeto
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Instituto do Milnio RECOS, nas universidades envolvidas em cada regio (UFPR-
CEM em Paranagu, UFES em Piraqu-Au, UFPE e UFRPE em Itamarac).
Para as amostragens foram escolhidas duas reas em cada esturio (Figura
1). A rea contaminanda (C) representa a rea mais prxima as fontes de
impacto antrpico e rea referncia (R) constitui uma rea afastada da
influncia de atividades humanas. Em cada uma dessas reas foram coletados
dez indivduos de cada espcie nas duas estaes amostrais: inverno (agosto de
2003) e vero (fevereiro de 2004). Alguns parmetros fisico-qumicos (salinidade,
temperatura e pH) foram coletados durante as amostragens.
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Figura 1. Localizao geogrfica dos pontos referncia (R) e contaminado (C) nas trs regies estuarinas avaliadas na costa brasileira. Adaptado de Zanette et al. 2006.
I.2.2.1. Itamarac - Complexo Estuarino Canal de Santa Cruz - PE
A Baa de Itamarac onde est localizado o Complexo Estuarino Canal de
Santa Cruz (Figura 1) est situada no nordeste do Brasil, 40 km ao norte de Recife,
Pernambuco (734-755S; 3449-3452W, Meyer et al., 1998). Existem duas
estaes bem definidas na regio: a estao seca, compreendida entre
setembro a janeiro, e a estao chuvosa, que ocorre entre fevereiro e agosto. O
rio Botafogo o principal rio que desemboca no Canal de Santa Cruz, e segundo
Meyer et al. (1998), at 1991 recebeu grande aporte de mercrio proveniente de
uma fbrica de soda custica na regio (Cavalcanti, 2003).
Atualmente ainda existem fbricas de soda custica operando na regio
do canal de Santa Cruz, tambm h fbricas de cloro e papel bem como de
plantaes de cana-de-acar (Manuel de Jesus Flores Montes, membro da
UFPE e participante do Projeto do Milnio-RECOS, comunicao pessoal). Alm
do aporte de efluentes industriais e agrcolas muito provvel que esgotos
urbanos estejam chegando ao Canal de Santa Cruz.
O ponto C no Complexo Estuarino Canal de Santa Cruz localiza-se no rio
Botafogo (740047S; 3451486W). No rio Carrapicho, considerado isento de
impacto antropognico, foi determinanda a rea R (743042S; 3453383W). A
precipitao mdia mensal de chuvas em agosto permaneceu na faixa de 100 a
150mm enquanto que em fevereiro atingiu a faixa de 150 a 200mm (CPTEC,
2005).
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I.2.2.2. Piraqu - Sistema Estuarino dos rios PiraquAu e Piraqu-Mirim - ES
Situado no distrito de Santa Cruz em Aracruz, Esprito Santo encontra-se o
Sistema Estuarino dos rios PiraquAu e Piraqu-Mirim (Figura 1). Este esturio
apresenta 65 km de extenso e rea de 73,38 km2, estando apenas 2,25% de sua
rea protegida pela Reserva Biolgica de Manguezais dos rios Piraqua e
Piraqu-mirim (Luiz Fernando Loureiro Fernandes, membro da UFES e participante
do Projeto do Milnio-RECOS, comunicao pessoal). Segundo Luiz Fernando
Loureiro Fernandes (comunicao pessoal), o manguezal do rio Piraqu-mirim
avana aproximadamente 9 km em direo ao continente, enquanto o rio
Piraqua avana cerca de 13 km, representando o maior avano de mar
do Esprito Santo. As pocas de maior ocorrncia de precipitao esto
compreendidas entre outubro e maio nesta regio, no havendo estao seca
pronunciada na regio (Cuzzuol e Lima, 2003).
No municpio de Aracruz h uma indstria de fabricao de celulose de
fibra curta e branqueada de eucalipto (que utilizada como matria prima para
produo de papel) que reconhecida como a maior do mundo no gnero, e
que est em plena atividade desde 1978. Associado a esta indstria existe um
terminal porturio privativo especializado no transporte da celulose exportada,
que embarca 2 milhes de toneladas que vo para os Estados Unidos, Europa e
sia e 900 mil toneladas produzidas por outra indstria localizada em Minas
Gerais, que concentra suas vendas para o Japo e sia. Ainda nesta regio
existem indstrias de produo de perxido de hidrognio, metal-mecnicas e
eletrnicas (Prefeitura de Aracruz, 2005). Alm das atividades industriais existe
ainda atividade agrcola expressiva (IBGE, 2005) e aporte de esgoto da cidade
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de Aracruz. De acordo com as atividades acima descritas espera-se que os
principais contaminantes presentes no Sistema Estuarino dos rios Piraqua,
onde est localizada a rea C (1955'20,22"S; 4011'31,24"W), sejam metais,
organoclorados, pesticidas e esgoto domstico. O ponto R est situado no rio
Piraqu-mirim (1956'14,67"S; 4012'42,33"W).
I.2.2.3. Paran - Complexo Estuarino Baa de Paranagu
O Complexo Estuarino Baa de Paranagu (251634S; 481742W, Figura
1) constitui o maior esturio do Paran, estendendo-se aproximadamente 50 km
para o interior do continente (Kolm et al., 2002). s margens deste esturio
localiza-se a cidade de Paranagu, cuja populao estimada em mais de
140.000 pessoas (IBGE, 2005). Kolm et al. (2002), citam que a regio ainda no
possui tratamento de esgotos adequado, sendo a maior parte do esgoto urbano
lanado em dois rios da regio: Itiber e Embogua. Alm do esgoto urbano,
existe ainda o aporte de fertilizantes, pesticidas e efluentes industriais gerados
pelas atividades agropecurias e industriais da regio, respectivamente.
O Porto de Paranagu considerado o maior porto do Sul do Brasil e possui
expressiva participao na exportao de granis slidos, principalmente de
soja, na Amrica Latina. Em 2002 e 2003, os principais produtos exportados foram
gros e as principais importaes foram fertilizantes (Portos do Paran, 2005).
Alm de resduos dos produtos importados e exportados, a regio do porto est
diretamente exposta presena de combustveis devido ao fluxo de
embarcaes. As influncias antrpicas regionais sugerem a presena de metais,
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26
hidrocarbonetos, pesticidas e grande aporte orgnico no Complexo Estuarino
Baa de Paranagu.
No complexo Estuarino Baa de Paranagu o ponto C (2519430 S;
4829690 W) situa-se na regio prxima ao terminal de carga/descarga
porturia de fertilizantes de Paranagu (Fospar), onde h o aporte de efluentes
industriais, resduos de combustveis (devido ao intenso trfego de navios) e
resduos de mercadorias carregadas/descarregadas no Porto de Paranagu. O
ponto R est situado na Baa de Laranjeiras (2531271 S; 4829690 W; Figura1).
I.2.3. PROCEDIMENTOS INICIAIS
Imediatamente aps a coleta os peixes foram acondicionados em caixas
isotrmicas (contendo gua do local de captura) providas de aerao
constante e transportados ao laboratrio.
Os peixes foram anestesiados com cido-etil ster-3-aminobenzico (MS
222) 0,02% e as medidas de peso total (g), comprimento total (cm) e peso do
fgado foram tomadas, previamente disseco.
I.2.4. BIOMARCADORES SOMTICOS
Os fgados coletados foram pesados (P) e os ndices somticos calculados
segundo as seguintes frmulas: IHS = ndice hepatossomtico [(Pfgado/Ppeixe)] x 100
e o fator de condio, FC = Ppeixe /Cb, onde b o coeficiente angular da relao
peso-comprimento (C = comprimento total).
-
27
I.2.5. BIOMARCADORES MORFOLGICOS
I.2.5.1. Avaliao Histopatolgica
Fgado e brnquias dos animais coletados foram fixados em Alfac (Etanol,
formol e cido actico), desidratados e includos em Paraplast (Sigma). O ndice de leses utilizado na avaliao do material foi descrito por Bernet et al.
(1999), para a aplicao deste ndice necessrio atribuir um valor nmerico a
cada leso observada (0, 2, 4 ou 6), esse valor deve ser multiplicado por um valor
de fator de importncia apresentado por Bernet et al. (1999) e exemplificado na
tabela 1 (1, 2 ou 3), dessa forma obtido um ndice para cada tipo de leso em
cada rgo avaliado, todos os ndices de cada rgo so somados obtendo-se
assim um ndice por rgo. A ocorrncia de melanomacrfagos foi avaliada de
acordo com Rabitto et al. (2005), de acordo com esta metodologia centros de
melanomacrfagos e melanomacrfagos livres so contados em 15 campos de
cada lmina.
Tabela 1. Exemplos de fatores de importncia utilizados no clculo do ndice de leses segundo Bernet et al. (1999).
rgo
Leso Fator de Importncia Brnquias descolamento de epitlio 1
fuso de lamelas 2
hiperplasia 2
desorganizao de lamelas secundrias 1
neoplasias 2
Fgado Necrose 3
infiltraes de leuccitos 2
vacuolizao de hepatcitos 1
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I.2.5.2. Microscopia Eletrnica de Transmisso
As brnquias dos peixes e os fragmentos de fgado foram fixados em
Glutaraldedo 2,5%, Paraformaldedo 2%, CaCl2 2,5 mM, NaCl em tampo
cacodilato 0,1 M pH 7,2-7,4 por duas horas, emblocados em resina PoliEMBED 812
(Electron Microscopy Sciences) e analisados no microscpio eletrnico de transmisso (MET) JEOL 1200.
I.2.5.3. Microscopia Eletrnica de Varredura
As brnquias foram fixadas em 3% glutaraldedo, 0,1 M cacodilato de sdio,
pH 7,2 - 7,4 desidratadas com etanol (Merck) submetidas ao ponto crtico (CO2),
e observadas no microscpio eletrnico de varredura JEOL JSM-6360LV.
I.2.6. BIOMARCADOR BIOQUMICO - AVALIAO DA COLINESTERASE
Fragmentos de msculo branco sem pele e sem sangue foram coletados
da regio dorsal dos peixes e congelados. No laboratrio as amostras de msculo
foram homogenizadas (5% p/v) em tampo fosfato (0,05 M 4 C ) com 20% de glicerol pH 7,0 e centrifugados a 850 x g (4 C) por 15 min. O sobrenadante foi centrifugado novamente a 12.800 x g (4 C) por 15 min e utlizado como fonte de enzima. 9mM de iodeto de acetiltiocolina (AcSCh) foram utilizados na realizao
dos ensaios. A atividade colinestersica foi analisada de acordo com Ellman et al.
(1961), com adaptaes para microplaca, e a concentrao de protenas foi
determinada segundo o mtodo de Bradford (1976).
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I.2.7. TRATAMENTO ESTATSTICO DOS DADOS
Dois tipos de comparao foram realizadas. A avaliao de
contaminao foi feita atravs da comparao da rea contaminada e
referncia em cada esturio, exceto para Itamarac que foi comparada com a
rea de referncia de Paranagu. Comparaes sazonais tambm foram
realizadas em cada um dos esturios avaliados. Os dados de histopatologia
foram comparados atravs do teste Mann-Whitney. Os parmetros cinticos
enzimticos (Vmax e Km) foram estimados pela equao de Michaelis-Menten; e
a atividade enzimtica foi avaliada atravs de teste T de student. ndices
somticos e ocorrncia de melanomacrfagos foram avaliados atravs de teste
T. A correlao entre peso, comprimento dos peixes e atividade da colinesterase
foi analisado atravs da correlao de Pearson. O teste Kruskal-Wallis foi utilizado
nas comparaes sazonais (Zar, 1984). O nvel de significncia considerado foi de
0,05.
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I.3. RESULTADOS
Nos esturios de Paranagu e Itamarac foi coletada a espcie Cathorops
spixii, como esta espcie no ocorre no complexo estuarino Piraqu-A, foi
necessrio definir outro bioindicador para esta rea. Por apresentar hbito
alimentar carnvoro e ser abundante na rea de interesse, Lutjanus synagris foi a
espcie selecionada como bioindicadora para amostragem no complexo
estuarino Piraqu-A.
Os parmetros fsico-qumicos obtidos durante as amostragens so
apresentados na Tabela 2. Diferenas expressivas de temperatura entre vero e
inverno foram detectadas apenas em Paranagu. Itamarac apresenta uma
estao seca e uma estao chuvosa bem definida em fevereiro e agosto,
respectivamente.
Tabela 2. Parmetros fsico-qumicos da gua nos trs esturios avaliados.
reas Estudadas Pontos Inverno Vero
T (C) S (ppm) pH T (C) S (ppm) pH Itamarac Contaminado 28 21,7 7,8 29.9 13,7 8,1
Piraqu Referncia 23,9 35 6,1 29,7 20,8 10,1
Contaminado 24,1 33,5 7,1 28,7 17,6 11,3
Paranagu Referncia 20 25 8,0 28 20 8,2
Contaminado 22 23 7,9 28 17 8,4
T = Temperatura; S = Salinidade
I.3.1. INDICES SOMTICOS
Os ndices IHS e FC so apresentados na Tabela 3. Comparando-se as reas
referncia e contaminada de cada esturio durante o inverno ou vero
observou-se fator de condio similar nos indivduos entre as reas referncia (R)
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e contaminada (C) em Paranagu no inverno, enquanto o IHS apresentou
valores mais altos na rea contaminada no vero. Em Piraqu valores mais altos
no FC foram encontrados na rea contaminada durante o inverno. Tanto o IHS
quanto o CF foram similares em Piraqu durante o vero. Quando comparado
com a rea referncia de Paranagu os valores de IHS de Itamarac
apresentaram-se menores no inverno e maiores no vero.
Atravs de comparaes sazonais em cada esturio, foi observado que no
ponto R de Paranagu o IHS apresentou valores maiores no inverno e o FC foi
similar. Na rea referncia de Piraqu o FC foi maior no vero e o IHS no variou
sazonalmente. Todos os ndices apresentaram valores similares nas reas
Paranagu C e Piraqu C entre as estaes. Em Itamarac C o IHS foi mais alto
no vero enquanto o FC foi similar entre as estaes.
Figura 2. ndice hepatossomtico (IHS), e fator de condio (FC) de peixes coletados em trs esturios brasileiros, n=10. * Indica diferena entre referncia e contaminado, **indica dferena na mesma rea amostral entre inverno e vero (p
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I.3.2. HISTOPATOLOGIA DE BRNQUIAS
Descolamento de epitlio, fuso de lamelas, hiperplasia, desorganizao
de lamelas secundrias e neoplasias foram as leses mais relevantes observadas
nas brnquias (Figura 3). O descolamento de epitlio caracterizado pelo
descolamento de clulas epiteliais na lamela secundria (Figura 3C). reas de
fuso de lamelas esto frequentemente associadas com hipertrofia e
proliferao de clulas mucosas (Figura 3D). A fuso integral e parcial base das
lamelas secundrias identificada atravs de microscopia de luz foi confirmada
pela anlise ao MEV (Figura 3F e G).
As leses histopatolgicas nas brnquias apresentaram ocorrncia similar
entre os pontos R e C de Paranagu, Piraqu e Itamarac no inverno e em
Piraqu no vero (Figura 4). Os peixes coletados nas reas contaminadas de
Paranagu e Itamarac no vero que apresentaram ndices de leso menores
do que na rea referncia de Paranagu (Figura 4).
I.3.3. HISTOPATOLOGIA DE FGADO
Necroses, infiltraes de leuccitos e vacuolizao de hepatcitos foram
as leses mais expressivas identificadas no fgado das espcies estudadas (Figura
5). Proliferao do retculo endoplasmtico (Figura 5B) e a presena de
numerosos grnulos eltron densos nos hepatcitos (Figura 5C e E) foram
observados atravs de MET. As necroses observadas atravs de microscopia de
luz tambm foram visualizadas atravs de MET como focos de necrose (Figura 5D,
E, F). Na coleta de inverno os animais amostrados no ponto R de Paranagu
apresentaram ndice de leses hepticas maior que as reas C de Paranagu e
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33
Itamarac, enquanto a ocorrncia de leses hepticas foi similar entre os pontos
R e C em Piraqu (Figura 6). No vero os indivduos coletados em Paranagu
apresentaram ndices de leses similares entre os pontos R e C, enquanto em
Piraqu foi detectado maior ndice de leses no ponto R. As leses hepticas
detectadas nos animais coletados em Itamarac foram similares as do ponto R
de Paranagu no vero (Figura 6).
Melanomacrfagos (MM) podem ser visualizados como clulas
pigmentadas ou grupos de clulas pigmentadas que so denominados centros
de melanomacrfagos (CMM) em rgos como fgado, rim anterior e intestino de
peixes. Seu material granular apresenta colorao que oscila entre amarelo e
preto quando corado com hematoxilina e eosina. Os indivduos coletados no
esturio de Piraqu no apresentaram CMM nem MM hepticos em ambas as
reas amostradas (R e C). A ocorrncia de CMM foi similar entre os pontos R e C
nos indivduos amostrados em Paranagu tanto no inverno quanto no vero,
enquanto a ocorrncia de MM foi maior em Paranagu R apenas no inverno
(Figura 7). Itamarac apresentou valores menores de MMC e MM quando
comparadas com Paranagu R no inverno e ocorrncia de MM similar
Paranagu no vero (Figura 7).
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Figura 3. Histopatologia de brnquias de peixes das reas estuarinas avaliadas. (A) Estrutura normal das brnquias. (B) Dilatao de vasos nas extremidades das lamelas secundrias e inchao das clulas de cloreto. (C) Descolamento de epitlio nas lamelas secundrias. (D) Fuso de lamelas secundrias, hipertrofia e proliferao de clulas de muco (mc). (E) Estrutura normal das brnquias em MEV. Barra = 100m. (F) Fuso na base das lamelas secundrias. Barra = 100m. (G) Fuso completa de lamelas secundrias. Barra = 200m. pl= lamela primria, sl= lamela secundria, cc=clula de cloreto, el=descolamento de epitlio, f=fuso de lamelas secundrias. Barra A, B, C, D = 50m. Cathorops spixii: B, C, D, F; Lutijanus synagris: A, E, G.
Figura 4. ndice histopatolgico de leses branquiais de indivduos coletados nas reas estuarinas estudadas (medianas). Diferenas entre as reas estudadas so indicadas por letras (p
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Figura 5. Histopatologia de fgado em indivduos coletados nas reas estuarinas avaliadas. (A) Estrutura caracterstica do fgado. (B) Vacuolizao do citosol dos hepatcitos; (C) Presena de diversos grnulos eltron densos (g) e vacolos (seta) no citosol dos hepatcitos; (D) Desorganizao citoslica indicativa de necrose; (E) rea de necrose focal e presena de grnulos eltron densos; (F) Detalhe da desorganizao do citosol (setas); (G) Espao de Disse (d). Barra = 50m. Cathorops spixii: A, B, C, E, F; Lutijanus synagris: D, G.
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36
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37
I.3.4. ATIVIDADE DA COLINESTERASE
As espcies estudadas no apresentaram correlao entre os parmetros:
peso, comprimento e a atividade colinestersica nas reas avaliadas. A
atividade enzimtica foi mais alta nas reas C de Paranagu, Piraqu e
Itamarac quando comparadas com as respectivas reas R no inverno (Figura
8A). Durante o vero Piraqu e Paranagu apresentaram atividade da
colinesterase similar, enquanto Itamarac C apresentou maior atividade se
comparado com Paranagu R (Figura 8B). A atividade da colinesterase
apresentou-se mais elevada nos indivduos coletados no inverno se comparados
aos coletados no vero em todas as reas estudadas (Figura 8A e B).
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I.4. DISCUSSO
Estudos de biomonitoramento so geralmente focados em uma nica ou
em poucas reas de rios, esturios ou lagoas, a utilizao de biomarcadores
nestes estudos frequentemente restrita a uma ou poucas classes de
biomarcadores (Shailaja e Silva, 2003; Petrovic et al., 2004; de la Torre et al., 2005;
Oliveira Ribeiro et al., 2005; Munteanu e Munteanu, 2006; Nigro et al., 2006). Este
trabalho apresenta respostas de trs classes de biomarcadores (somticos,
histopatolgicos e bioqumicos) de trs diferentes reas estuarinas impactadas
por atividades humanas ao longo da costa brasileira.
Um dos parmetros de avaliao dos organismos neste estudo foi a
aplicao de ndices somticos, como utlizado por outros autores (Khan et al.
1994, Karels et al., 1998; Couillard et al., 1999; Oliveira Ribeiro et al., 2005). Segundo
Huuskonen e Lindstrom Seppa (1995) e Teles et al. (2006) IHS pode indicar estado
metablico alterado em peixes. Alguns estudos reportam que animais coletados
em reas contaminadas frequentemente apresentam aumento no IHS e
decrscimo no FC (Adams e Ryon, 1994; Karels et al., 1998; van der Oost et al.,
1996), um aumento no IHS foi observado na rea C de Paranagu durante o
vero, porm o FC permaneceu similar ao da rea referncia. Como Cathorops
spixii apresenta hbito alimentar carnvoro possvel que esteja ocorrendo
biomagnificao e bioacumulao de poluentes nesta espcie, estes fenmenos
poderiam estar associados aos altos valores IHS observados em Paranagu e
Itamarac durante o vero. Segundo Soimasuo et al. (1995), Felder et al. (1998) e
de la Torre et al. (2005), indivduos expostos a contaminantes podem apresentar
baixos valores de FC como tambm ndices similares entre os grupos avaliados,
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39
como foi observado neste trabalho em Paranagu em ambas estaes sazonais
e em Piraqu no vero. Incrementos no FC nos indivduos de Piraqu no inverno
podem ser atribudos a uma maior disponibilidade de alimento que ocorre nesta
estao, especialmente em ecossistemas tropicais (Townsend et al., 2006).
Leses histopatolgicas tem sido frequentemente descritas como
importantes ferramentas em estudos de biomonitoramento devido facilidade
de interpretao tanto em situaes de exposio aguda quanto crnica
(Wester et al., 1991; Couillard et al., 1999; Wester et al., 2002; Gl et al., 2004;
Oliveira Ribeiro et al., 2005). Assim como relatado neste trabalho, a ocorrncia de
leses branquiais e hepticas em animais expostos ambientalmente a
contaminantes tem sido reportada em organismos aquticos por outros autores
como Gl et al. (2004), Lyons et al. (2004), Norea-Barroso et al. (2004) e Oliveira
Ribeiro et al. (2005).
A presena de leses nas brnquias de peixes pode ser interpretada como
resultado de efeitos agudos de xenobiontes (Zodrow et al. 2004). Neste estudo a
ocorrncia de fuso de lamelas foi detectada em todas as reas avaliadas. A
ocorrncia de fuso lamelar j foi relacionada por alguns autores fontes de
contaminao especfica como: efluente de indstria de papel clorado
(Pacheco e Santos, 2002; Valdez Domingos, 2001), cobre (Arellano et al., 1999) e
efluente de esgoto com tratamento secundrio (Coutinho and Gokhale, 2000,
Valdez Domingos, 2001). O descolamento de epitlio observado neste estudo
tambm foi relatado por Arellano et al. (1999) e Fanta et al. (2003) em peixes
expostos a cobre e organofosforados, respectivamente. Tanto o descolamento
de epitlio quanto a fuso de lamelas aumenta a distncia entre as clulas
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epiteliais e os capilares sanguneos causando prejuzo nas trocas gasosas e
tambm pode levar distrbios na osmorregulao, mecanismos essenciais
sobrevivncia de peixes. A ocorrncia de proliferao nas clulas de muco
observada em indivduos de diferentes reas est relacionada a um mecanismo
de proteo em situaes de injria causada por contaminantes aquticos ou
respostas de estresse devido a exposies agudas e/ou crnicas, ocorre uma
maior secreo de muco nestas situaes a fim de minimizar o contato do tecido
afetado com a gua. Hipertrofia celular e tecidual podem ser indicativas de
disfuno celular e podem levar ao desenvolvimento de neoplasias em situao
de exposies crnicas a certos poluentes como HPAs, pesticidas clorados ou
PCBs (Ali e Sreekrishnan, 2001; Shailaja e Silva, 2003).
Devido aos processos de absoro e metabolizao as leses observadas
no fgado esto relacionadas exposio crnica a poluentes. A ocorrncia de
reas de necroses foi a leso heptica mais evidente neste estudo, este tipo de
leso tem sido registrada em peixes de reas impactadas por mltiplos
contaminantes (Simpson et al., 2000; Pacheco e Santos, 2002; Schmalz et al., 2002;
Marty et al., 2003; Stehr et al., 2003; Stentiford et al., 2003; Oliveira Ribeiro et al.,
2005). No presente trabalho a presena de necroses em indivduos das reas
referncia e contaminadas representa um indicativo de que os esturios esto
impactados, o que poderia ser confirmado atravs de anlises qumicas de biota,
gua e sedimento nestas reas. Este tipo de leso causa prejuzos funcionais e
estruturais no fgado de peixes (Stentiford et al., 2003), diminui a funcionalidade,
podendo causar a falncia do rgo e consequentemente afetar maiores nveis
de organizao biolgica (Rabitto et al., 2005). Embora a ocorrncia de reas
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41
necrticas no tenha correlao especfica com um determinado
contaminante, a ocorrncia de necrose tem sido frequentemente observada em
reas estuarinas associadas presena de contaminantes como HPAs (Stentiford
et al., 2003), pesticidas clorados (Oliveira Ribeiro et al. 2005), metais pesados
(Schmalz et al., 2002), organofosforados (Fanta et al., 2003), efluente de indstria
de papel clorado e cido dehidroabitico (Pacheco e Santos, 2002). A presena
de vesculas lipdicas observada no fgado de indivduos das reas estudadas
sugere um mecanismo de imobilizao de compostos lipoflicos como descrito
por Oliveira Ribeiro et al. (2005) em Anguilla anguilla ambientalmente exposta a
pesticidas clorados, HPAs e PCBs.
A incidncia de melanomacrfagos (CMM ou MM) no fgado e outros
tecidos est relacionada a um aumento na atividade fagoctica como resposta
imune a leses em indivduos expostos a contaminantes (Couillard et al., 1999;
Mondon et al., 2001; Oliveira Ribeiro et al., 2005; Rabitto et al., 2005). No presente
trabalho a ocorrncia de CMM ou MM no apresentou resultados expressivos
para o diagnstico das reas estudadas.
Embora as leses histopatolgicas no apresentem relao especfica com
os contaminantes este tipo de abordagem tem sido uma ferramenta bastante
utilizada em biomonitoramento na avaliao da qualidade da gua de reas
supostamente impactadas (Wester et al., 2002). As reas R e C de Paranagu,
Piraqu e Itamarac apresentaram ndices de leso branquial e heptico
similares durante o inverno e o vero, indicando que ambas as reas esto sendo
afetadas pela liberao de compostos qumicos nestes esturios em
conseqncia de atividades humanas.
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A atividade da colinesterase em peixes e outros organismos aquticos tem
sido utilizada globalmente como biomarcador de contaminao em peixes em
programas de monitoramento por diferentes grupos (Sturm et al., 1999; Monserrat
e Bianchini, 2001; Rodriguez-Fuentes e Gold-Bouchot, 2000; Monserrat et al., 2002;
Ventura et al., 2002; Corsi et al., 2003; Monteiro et al., 2005; Binelli et al. 2006; Tortelli
et al., 2006). A atividade da colinesterase representa um eficiente biomarcador
para detectar efeitos subletais de xenobiontes, principalmente organofosforados,
carbamatos e alguns metais pesados (Sturm et al., 1999; Monserrat e Bianchini,
2001; Silva de Assis et al. 2005; Rabitto et al, 2005), compostos que so reportados
na literatura como inibidores da colinesterase. Alm dos contaminantes acima
citados, hidrocarbonetos tambm podem alterar a atividade da colinesterase
em peixes, inibindo-a em diluies da frao solvel na gua de 15 e 33% na
espcie Astyanax sp. (Akaishi et al., 2004), porm os mecanismos de ao dos
hidrocarbonetos sobre a atividade da colinesterase ainda no foram
esclarecidos. No presente estudo uma maior atividade da colinesterase foi
observada na maioria das reas C estudadas durante o inverno. A induo da
atividade desta enzima foi tambm descrita em Puntius conchonius aps
exposio a endosulfano em msculo e fgado (Gill et al. 1990). O trabalho
realizado por Tortelli et al. (2006) nas mesmas reas de estudo mostrou que as
constantes de MichaelisMenten, Km e Vmax apresentaram diferentes padres
no crebro de C. spixii coletado nas reas R e C de Paranagu, neste trabalho os
autores sugerem que o complexo reversvel enzima-inibidor mais facilmente
formado em peixes coletados na rea C, enquanto a formao do complexo
irreversvel enzima-inibidor ocorre com maior facilidade nos animais das reas R.
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43
Embora no tenham sido realizados em amostras de msculo, estes resultados
poderiam ser atribudos como uma possvel hiptese para justificar os menores
valores de atividade da colinesterase observados nestas reas.
Dados que relacionam a atividade da acetilcolinesterase com variaes
de temperatura esto disponveis apenas para peixes, nestes estudos os autores
atribuem a temperatura como fator responsvel pelas diferenas sazonais
observadas na atividade enzimtica, apresentando de forma geral maiores
valores de atividade enzimtica nas estaes mais quentes e vice-versa
(Bocquen e Galgani, 1991; Kirby et al. 2000).
Os resultados apresentados sugerem que os maiores valores na atividade
da colinesterase observada nos espcimens das reas estudadas no inverno
possam estar relacionados a presena de compostos anticolinestersicos nas
reas R, ou de compostos indutores da colinesterase nas reas C. Acredita-se que
todos os resultados apresentados neste estudo estejam sendo influenciados por
contaminantes como metais pesados, hidrocarbonetos, pesticidas, os quais
infere-se que estejam presentes nas reas estudadas atravs da avaliao das
influncias antrpicas de cada esturio (item I.2.2.).
De acordo com os dados apresentados, as trs regies estuarinas esto
seriamente impactadas por atividades antropognicas. Entre os biomarcadores
utilizados a medida da atividade d