2 bs ekspresi gen
TRANSCRIPT
-
7/22/2019 2 BS Ekspresi Gen
1/66
Ekspresi gen
(DNA RNAProtein)
-
7/22/2019 2 BS Ekspresi Gen
2/66
Struktur DNA Ujung 5 rantai
ikatan fosfodiester
Basa-basa
Ujung 3 rantai
Ujung 5 rantai
Ikatan hidrogen Ujung 3 rantai
-
7/22/2019 2 BS Ekspresi Gen
3/66
-
7/22/2019 2 BS Ekspresi Gen
4/66
-
7/22/2019 2 BS Ekspresi Gen
5/66
Ekspresi gen
Penyimpananinformasi
Penggunaaninformasi
Urutan nukleotida gen Urutan nontemplate strand
-
7/22/2019 2 BS Ekspresi Gen
6/66
-
7/22/2019 2 BS Ekspresi Gen
7/66
7
Sintesis RNA
-
7/22/2019 2 BS Ekspresi Gen
8/66
8
RNA polimerase
Holoenzim : RNA polimerasedengan subunit yang lengkap
Core-enzyme:RNApolimerase tanpasubunit
http://www.rockefeller.edu/labheads/darst/images/holo.htmhttp://www.rockefeller.edu/labheads/darst/images/2cores.htm -
7/22/2019 2 BS Ekspresi Gen
9/66
-
7/22/2019 2 BS Ekspresi Gen
10/66
Inisiasi transkripsi (2)
Kedua untai DNA terpisah
Sintesis RNA dimulai
Setelah ~ 10 nt, faktor lepas
-
7/22/2019 2 BS Ekspresi Gen
11/66
Terminasi
transkripsi
RNA pol mencapai
terminator RNA pol lepas
-
7/22/2019 2 BS Ekspresi Gen
12/66Figure 6-13 Molecular Biology of the Cell( Garland Science 2008)
-
7/22/2019 2 BS Ekspresi Gen
13/66
-
7/22/2019 2 BS Ekspresi Gen
14/66
14
Faktor sigma bakteri
Holoenzim RNA polimerase bakteri
2
Faktor digunakan untuk mengekspresisekelompok gen secara serentak
Faktor
Berperan mengenali promoter dari gen Terdapat beberapa macam faktor sigma
Masing-masing mengenali promoter yang
berbeda
-
7/22/2019 2 BS Ekspresi Gen
15/66
15
Faktor sigma alternatif
Kejutan panas pada E. coli
Suhu naik, protein heat shock (hsp) disintesis (17 protein)
Promoter 70(standard) TTGAA(16-18).TATAAT
Promoter 32(hsp) T-C-C-C TTGAA(13-15)CCCAT-T-
Sporulasi pada Bacillus subtilis
Kondisi lingkungan tidak menguntungkan, terjadi sporulasi
Gen-gen untuk pertumbuhan vegetatif inaktif Gen-gen untuk pembentukan spora menjadi aktif akibat
aktifnya faktor-faktor sigma baru
-
7/22/2019 2 BS Ekspresi Gen
16/66
16
Terminasi transkripsi
Ada dua jenis terminasi
Terminasi yang tidak tergantung Rho
(Rho-independent) Terminasi yang tergantung Rho (Rho-
dependent)
Rho adalah protein yang berperandalam proses terminasi transkripsi gen-gen E. colidan Phagenya
-
7/22/2019 2 BS Ekspresi Gen
17/66
17
Terminasi yang tidak tergantungRho (Rho-independent)
Mekanisme terminasi membutuhkanstruktur hairpin dan diikuti dengan
poly(A) Struktur hairpin diduga merupakan
faktor yang dapat menarik RNA keluar
dan ikatan antara A-U (DNA-RNA)yang lemah dapat lepas
-
7/22/2019 2 BS Ekspresi Gen
18/66
-
7/22/2019 2 BS Ekspresi Gen
19/66
19
Model terminasi transkripsitergantung rho
Rho merupakan protein dengan6 subunit yang memilikiaktivitas ATPase sehingga Rho
dapat bergerak 5
3 Ketika RNA Pol sampai pada
terminator Sintesis RNA berhenti (ketika
hairpin disintesis)
Rho tiba di RNA pol Rho melepaskan RNA dari
hibrid DNA-RNA denganaktivitas helikase yangdimilikinya
-
7/22/2019 2 BS Ekspresi Gen
20/66
-
7/22/2019 2 BS Ekspresi Gen
21/66
21
Ekspresi gen dari promoter yangkuat dan dapat diregulasi
Transkripsi merupakan titik kontrol yang paling penting
Dikontrol oleh promoter dari gen
Dua sifat penting dari promoter
Kuat
Afinitas tinggi terhadap RNA polimerase
Ikatan kuat - sering ditranskripsi
Ikatan lemah - RNA polimerase lepas
tidak ada transkripsi
Dapat diregulasi
Kapan gen diekspresi dapat dikontrol
gunakan induser / ko-represor
-
7/22/2019 2 BS Ekspresi Gen
22/66
22
Promoter yang penting dalambioteknologi
lac(atau lacUV5)
trp
tac (atau trc)
pLdari fag l
gen 10dari fag T7
-
7/22/2019 2 BS Ekspresi Gen
23/66
-
7/22/2019 2 BS Ekspresi Gen
24/66
-
7/22/2019 2 BS Ekspresi Gen
25/66
25
Promoter tacdan trc
Hibrid dari promoter lacdan trp
daerah -35 dari trp
daerah -10 dari lac terpisah 16 pb = promoter tac
terpisah 17 bp = promoter trc
3x lebih kuat dari trp 10x lebih kuat dari lac
-
7/22/2019 2 BS Ekspresi Gen
26/66
-
7/22/2019 2 BS Ekspresi Gen
27/66
-
7/22/2019 2 BS Ekspresi Gen
28/66
-
7/22/2019 2 BS Ekspresi Gen
29/66
-
7/22/2019 2 BS Ekspresi Gen
30/66
30
Promoter gen 10 fag T7
prolac Gen RNA PolT7
prog10 Gen target
Protein
target
InduserRNA PolT7
T7 RNA Pol
-
7/22/2019 2 BS Ekspresi Gen
31/66
-
7/22/2019 2 BS Ekspresi Gen
32/66
32
Promoter bocor Beberapa promoter tidak diinaktifkan secara tuntasmasih ada
ekspresi yang rendah
Disebut bocor (LEAKY)
Dapat disebabkan oleh mutasi pada represor atau urutan DNAoperator atau faktor lain
Dapat disebabkan oleh jumlah kopi promoter vs. Gen represor
Gen pada plasmid multikopi dikontrol oleh represor yang dikodeoleh satu kopi gen pada kromosom
Untuk promoter lacmultikopi yang bocor
Letakkan di dalam sel dengan mutasi lacIq
lacIqmerupakan mutasi pada promoter gen lacI
Menyebabkan produksi protein represor Lac I yang tinggi akibat
peningkatan transkripsi
-
7/22/2019 2 BS Ekspresi Gen
33/66
-
7/22/2019 2 BS Ekspresi Gen
34/66
Yang mempengaruhi kekuatanpromoter
Sequence
Daerah -10:
Daerah -35:
Spacerantara daerah -10 dengan daerah -35:
Daerah -20 s/d -13 promoter lac yang kaya GCdiganti dengan sequence yang kaya AT,transkripsi meningkat 8 x
34
-
7/22/2019 2 BS Ekspresi Gen
35/66
-
7/22/2019 2 BS Ekspresi Gen
36/66
36
Prosestranslasi
Inisiasimemerlukan:
Subunit ribosomyang bebas
Faktor inisiasi
-
7/22/2019 2 BS Ekspresi Gen
37/66
E i i il tRNA i t t
-
7/22/2019 2 BS Ekspresi Gen
38/66
3838Figure 6-58 Molecular Biology of the Cell( Garland Science 2008)
Enzim aminoasil-tRNA sintetasemempunyai sisi pengikatan
spesifik untuk asam amino dantRNA
-
7/22/2019 2 BS Ekspresi Gen
39/66
-
7/22/2019 2 BS Ekspresi Gen
40/66
-
7/22/2019 2 BS Ekspresi Gen
41/66
41
Faktor pelepasan
Prokariot RF1 : UAA, UAG
RF2 : UAA, UGA RF3 : protein pengikat GTP yang membantu
pengikatan RF1 & RF2 ke ribosom
-
7/22/2019 2 BS Ekspresi Gen
42/66
42
Kodon
Urutan kodon pada mRNA Tidak tumpang tindih
Tidak ada loncatan Kodon terdiri dari tiga nukleotida
Kodon degenerate
Satu asam amino dapat dikode oleh lebihdari satu kodon
Kode genetik hampir universal
-
7/22/2019 2 BS Ekspresi Gen
43/66
4343
Figure 6-50 Molecular Biology of the Cell( Garland Science 2008)
Kode genetika
-
7/22/2019 2 BS Ekspresi Gen
44/66
44
Start kodon bakteri
> 90% = ATG
Bisa juga: TTG, GTG, CTG (semua mirip ATGdan mengkode fmet)
Untuk memastikan bahwa kodon di atas adalahstart kodon, cari urutan yang mirip denganSD/rbs (AGGAGGA) ~ 7 sampai 13 nt sebelahhulunya GTAACGAGGATAATGGAATG
http://depts.washington.edu/agro/genomes/students/stanstart.htm, 17-08-10)
http://depts.washington.edu/agro/genomes/students/stanstart.htmhttp://depts.washington.edu/agro/genomes/students/stanstart.htm -
7/22/2019 2 BS Ekspresi Gen
45/66
-
7/22/2019 2 BS Ekspresi Gen
46/66
4646
Figure 6-51 Molecular Biology of the Cell( Garland Science 2008)
Tiga macam kerangka baca pada
mRNA
-
7/22/2019 2 BS Ekspresi Gen
47/66
47
Kontrol ekspresi gen
Operon, atenuasi, perubahan faktorsigma
Vektor ekspresi pada E.coli
-
7/22/2019 2 BS Ekspresi Gen
48/66
48
Kontrol ekspresi gen dapatterjadi pada tahap:
Transkripsi
Stabilitas mRNA
Pemrosesan mRNA pada eukariot
Translasi
-
7/22/2019 2 BS Ekspresi Gen
49/66
49
Kontrol ekspresi gen bakteri
pada tahap transkripsi
Operon
protein represor dan aktivator
Atenuator Transkripsi dapat terhenti lebih awal akibat adanya
atenuator (terminator) di sebelah hulu (5) gen
Faktor sigma alternatif
Beberapa kondisi lingkungan memerlukanperubahan pola ekspresi gen secara keseluruhan
-
7/22/2019 2 BS Ekspresi Gen
50/66
50
Operon
Gen-gen yang diperlukan untuk fungsi tertentuakan diekspresi bersamaan
Operon Regulasi transkripsi sekelompok gen pada prokariota
Dari satu promoter akan ditranskripsi satu mRNA yangmengandung > 1 gen (polycistronic)
Contoh Operon lac: Gen-gen untuk penggunaan laktosa
Operon trp: Gen-gen untuk sintesis triptofan
-
7/22/2019 2 BS Ekspresi Gen
51/66
51
Komponen suatu operon
Trans acting (gen, tidak harus ada dalam DNA yang sama) Gen struktural
Gen yang mengkode protein/RNA
Gen regulator Gen struktural yang mengkode protein yang meregulasi ekspresi gen lain Terikat pada DNA pada sisi spesifik Represor: protein regulator yang bila terikat pada DNA, tidak terjadi
transkripsi Aktivator: protein regulator yang harus terikat pada DNA agar dapat
terjadi transkripsi
Cis acting (elemen genetik, harus ada dalam DNA yangsama) Promoter: Tempat pengikatan RNA polimerase Terminator: Tempat terminasi transkripsi Operator: Tempat pengikatan represor
-
7/22/2019 2 BS Ekspresi Gen
52/66
52
Kontrol
positifdannegatif
-
7/22/2019 2 BS Ekspresi Gen
53/66
53
Operon lac
Kontrol negatif
Represor lac
menghambat operonapabila tidak adalaktosa
Kontrol positif
Aktivator lacmengaktifkan operonapabila tidak adaglukosa
Ada glukosa dan laktosa dalam
medium pertumbuhan
Kontrol negatif operon lac
-
7/22/2019 2 BS Ekspresi Gen
54/66
54
Kontrol negatif operon lac
-
7/22/2019 2 BS Ekspresi Gen
55/66
55
Kontrol positif pada operon lac
Diatur oleh catabolite activator protein(CAP) bersama cAMP
[cAMP] turun bila ada glukosa
Operon lac: aktivator
-
7/22/2019 2 BS Ekspresi Gen
56/66
56
Operon lac: aktivator
Kontrol positif: bila aktivator terikat DNA, baru terjadi
transkripsi Tidak ada glukosa ATP menjadi cAMPcAMP terikat CAP
(catabolite activator protein) CAP terikat DNA transkripsi
Ada glukosa CAP tidak dapat terikat DNA tidak terjadi
transkripsi
P ik t L I d
-
7/22/2019 2 BS Ekspresi Gen
57/66
57
Pengikatan represor LacI padaoperator lac
Operator berbentuk palindrom (pengulangan terbalik) Ada > 1 operator
Afinitas dengan represor tinggi
O1 = -7 s/d +29 (axis simetri +11) Afinitas dengan represor rendah (pseudo-operator)
O2 = +410; O3 = -83)
Masing-masing dimer represor terikat pada 1 operator Tingkat represi dipengaruhi oleh jumlah operator
Tidak ada O2 atau O3 : represi menurun 2-4 x Tidak ada O2 dan O3 : represi menurun 100 x
Pengikatan represor pada operator Memperkuat pengikatan RNA pol (kompleks tertutup) Mencegah RNA pol menginisiasi transkripsi Represor lepas, transkripsi langsung dimulai (kompleks terbuka)
-
7/22/2019 2 BS Ekspresi Gen
58/66
58
Operator lac
Operator = palindrom
Pengaruh ketiga operator
-
7/22/2019 2 BS Ekspresi Gen
59/66
59
Represi =rasioaktivitas -galaktosi-dasedengan dantanpa
induser
Pengaruh ketiga operatorterhadap represor
-
7/22/2019 2 BS Ekspresi Gen
60/66
60
Regulasi operon lac
-
7/22/2019 2 BS Ekspresi Gen
61/66
61
Operon triptofan E. coli
Promoter trp Dikontrol oleh
represor trp- ko-represor (triptofan) represor yang disintesis dalam bentuk tidak
berfungsi kompleks represor-ko-represor dapat berfungsi
Hanya represor Gen diekspresi
Represor + Gen tidak diekspresi
ko-represor (trp)
-
7/22/2019 2 BS Ekspresi Gen
62/66
62
-
7/22/2019 2 BS Ekspresi Gen
63/66
63
-
7/22/2019 2 BS Ekspresi Gen
64/66
Kontrol translasi
Ribosome Binding Site (RBS)
RBS Kuat: interaksi kuat dengan ribosom,
lebih sering ditranslasi RBS lemah: interaksi lemah dengan ribosom,
lebih jarang ditranslasi
Fungsi rbs dipengaruhi juga oleh sequencegen
bila terbentuk struktur sekunder antara gendengan rbs, gen tidak akan ditranslasi
64
-
7/22/2019 2 BS Ekspresi Gen
65/66
RBS calculator
Menentukan perbedaan energibebas antara struktur sekunder
mRNA dengan mRNA yang telahterikat ribosom
Korelasi antara hasil prediksi
dengan hasil observasi belumcukup tinggi
65
-
7/22/2019 2 BS Ekspresi Gen
66/66
Pustaka
Alberts, B., Johnson, A., Lewis, J., Raff,M., Roberts, K. & Walter P. (2008)Molecular Biology of the Cell, 5th ed.,
Garland Science, N.Y.