1959 studies in kernicterus the protein binding of bilirubin

8/13/2019 1959 Studies in Kernicterus the Protein Binding of Bilirubin

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STUDIES IN KERNICTERUS. I . THE PROTEIN BINDING OFBILIRUBIN *BY GERARD B . ODELL

F r o m t h e H a r r i e t L a n e Home o f T h e J o h n s H o p k i n s H o s p i t a l a n d f ro m t h e D e p a r t m e n t s o fP e d i a t r i c s , J o h n s H o p k i n s U n i v e r s i t y S c h o o l o f M e di c i n e a n d S i n a i H o s p i t a l o fB a l t i m o r e , B a l t i m o r e , M d .S u b m i t t e d f o r p u b l i c a t i o n O c t o b e r 1 4 , 1 9 5 8 ; a c c e p t e d J a n u a r y 1 5 , 1 9 5 9 )

T h e y e l l o w s t a i n i n g o f b a s a l g a n g l i a ( k e r n i c -t e r u s ) i n s o m e j a u n d i c e d n e w b o r n i n f a n t s h a sb e e n r e c o g n i z e d f o r m a n y y e a r s ( 1 ) . T h e a s -s o c i a t i o n b e t w e e n s e r u m b i l i r u b i n c o n c e n t r a t i o na n d k e r n i c t e r u s ( 2 , 3 ) , t h e i s o l a t i o n o f b i l i r u b i nf r o m k e r n i c t e r i c b r a i n s ( 4 , 5 ) , a n d t h e t o x i c e f f e c to f b i l i r u b i n i n v i t r o u p o n o x y g e n u p t a k e 6 a n do x i d a t i v e p h o s p h o r y l a t i o n 7 a r e f u r t h e r e v i -d e n c e o f a r e l a t i o n s h i p b e t w e e n b i l i r u b i n e m i a a n dk e r n i c t e r u s . P l a s m a c o n c e n t r a t i o n s o f b i l i r u b i ne x c e e d i n g 2 0 m g . p e r c e n t a r e c o n s i d e r e d l e v e l sa b o v e w h i c h k e r n i c t e r u s o c c u r s , a l t h o u g h manye x c e p t i o n s e x i s t ( 8 , 9 ) , p a r t i c u l a r l y i n t h e p r e -m a t u r e i n f a n t ( 1 0 ) . O f p a r t i c u l a r i m p o r t a n c ew a s t h e o b s e r v a t i o n 1 1 t h a t k e r n i c t e r u s o c c u r -r e d m o r e f r e q u e n t l y i n p r e m a t u r e i n f a n t s g i v e ns u l f i s o x a z o l e t h a n i n c o n t r o l i n f a n t s d e s p i t e l o w e rp l a s m a b i l i r u b i n c o n c e n t r a t i o n s ( 1 2 ) . A n i m a ls t u d i e s h a v e c o n f i r m e d t h e s e f i n d i n g s ( 1 3 ) . B e -c a u s e k e r n i c t e r u s c a n o c c u r a t b i l i r u b i n c o n c e n -t r a t i o n s c o n s i d e r a b l y b e l o w 2 0 m g . p e r c e n t a n df a i l t o o c c u r a t h i g h e r c o n c e n t r a t i o n s , a s t u d y o ff a c t o r s c o n t r o l l i n g d i s t r i b u t i o n o f b i l i r u b i n s e e m e di n d i c a t e d . 'T h e b i n d i n g o f b i l i r u b i n t o s e r u m p r o t e i n s h a sb e e n d e m o n s t r a t e d b y m a n y t e c h n i q u e s 1 4 - 2 0 .I n v i t r o s e p a r a t i o n o f b i l i r u b i n b y u l t r a f i l t r a t i o nf r o m s e r u m p r o t e i n i n d e t e c t a b l e a m o u n t s h a sb e e n s i n g u l a r l y u n s u c c e s s f u l ( 2 0 - 2 5 ) . B i l i r u b i nd i d n o t a p p e a r i n u l t r a f i l t r a t e s o f p l a s m a u n l e s st h e c o n c e n t r a t i o n s w e r e g r e a t e r t h a n 8 0 m g . p e rc e n t ( 2 2 , 2 5 ) . H o w e v e r , b i l i r u b i n g a i n s a c c e s s t oc e l l c y t o p l a s m a t c o n s i d e r a b l y l o w e r c o n c e n t r a -t i o n s i n v i v o , a n d p r o b a b l y h a s t o d i s s o c i a t e f r o m

* T h e s e s t u d i e s h a v e b e e n s u p p o r t e d b y a g r a n t H 2 7 2 7f r o m T h e N a t i o n a l H e a r t I n s t i t u t e o f t h e N a t i o n a l I n -s t i t u t e o f H e a l t h , U n i t e d S t a t e s P u b l i c H e a l t h S e r v i c e ,a n d g i f t s f r o m t h e P i e r c e B u t l e r F u n d f o r t h e S t u d y o ft h e E t i o l o g y o f C e r e b r a l P a l s y a n d R e l a t e d D i s o r d e r s .1 S u g g e s t e d t o t h e a u t h o r b y D r . R . E . C o o k e .

s e r u m p r o t e i n i n o r d e r t o d i f f u s e t h r o u g h c e l lm e m b r a n e s .T h e s t u d y o f p r o t e i n - b i n d i n g o f b i l i r u b i n b yv a r i o u s t e c h n i q u e s h a s l e d t o d i f f e r e n t i n t e r p r e -t a t i o n s a s t o w h i c h o f t h e s e r u m p r o t e i n s a r e p r i -m a r i l y i n v o l v e d i n t h e i n v i v o t r a n s p o r t o f t h i sp i g m e n t ( 1 7 , 2 5 , 2 6 . A l p h a 1 - g l o b u l i n , a 2 - g l o b -u l i n , i r o n - b i n d i n g g l o b u l i n a n d , 8 - g l o b u l i n h a v ea l l b e e n d e m o n s t r a t e d c a p a b l e o f b i n d i n g b i l i r u b i n .A l l s t u d i e s a r e i n a g r e e m e n t t h a t s e r u m a l b u m i n i sc o n c e r n e d i n t h e b i n d i n g o f b i l i r u b i n b u t t h e r e i sd i s a g r e e m e n t t h a t a l b u m i n b i n d s u n c o n j u g a t e db i l i r u b i n ( 2 6 ) . A l p h a 1 - g l o b u l i n h a s b e e n s h o w nt o b i n d m o r e u n c o n j u g a t e d b i l i r u b i n o n a w e i g h tb a s i s t h a n a l b u m i n , b u t s e r u m c o n t a i n s s o l i t t l eo f t h i s c o m p o n e n t t h a t t h e a m o u n t o f b i l i r u b i nb o u n d b y a , - g l o b u l i n i s s m a l l c o m p a r e d t o t h e t o t a lb o u n d b i l i r u b i n i n v e r y i c t e r i c s e r a ( 1 9 , 2 5 .T h e a f f i n i t y o f a l b u m i n f o r many o r g a n i c a n i o n si s w e l l known a n d c a n o f t e n b e e x p r e s s e d s t o i c h i o -m e t r i c a l l y ( 2 7 ) . M e t h o d s h a v e b e e n d e v e l o p e d f o rq u a n t i t a t i v e a n d q u a l i t a t i v e d e t e r m i n a t i o n o f a l -b u m i n i n s e r u m b a s e d o n t h i s p r o p e r t y 2 8 - 3 1 .H o w e v e r , m a n y o f t h e s e m e t h o d s g a v e e r r o n e o u s l yl o w r e s u l t s i n t h e p r e s e n c e o f b i l i r u b i n e m i a . T h e s el a t t e r o b s e r v a t i o n s d e m o n s t r a t e d t h a t b i l i r u b i nw o u l d i n t e r f e r e w i t h o r g a n i c a n i o n b i n d i n g o f s e -rum a l b u m i n , p r e s u m a b l y b y c o m p e t i t i o n f o r t h es a m e l o c i ( 2 9 ) .T h e p r e s e n t s t u d y r e p o r t s o b s e r v a t i o n s o f t h ee f f e c t s o n t h e p r o t e i n b i n d i n g o f b i l i r u b i n o f c e r -t a i n o r g a n i c a n i o n s s o m e o f w h i c h a r e u s e d i nc l i n i c a l m e d i c i n e . A p r e l i m i n a r y r e p o r t o f t h e s es t u d i e s h a s b e e n p r e v i o u s l y p r e s e n t e d 3 2 .

METHODSS e r a f r o m 2 0 n e w b o r n i n f a n t s w i t h h i g h b i l i r u b i n c o n -c e n t r a t i o n s r a n g i n g f r o m 1 0 t o 2 8 m g . p e r c e n t w e r e c o l -l e c t e d a n d , i f n o t i m m e d i a t e l y u s e d , w e r e k e p t r e f r i g e r a t e da t 4 0 C . T h e c a u s e s o f t h e b i l i r u b i n e m i a w e r e e r y t h r o -

8 2 3


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GERARD B . ODELLb l a s t o s i s o r n o n h e m o l y t i c h y p e r b i l i r u b i n e m i a o f u n k n o w nc a u s e . T h e s e r a u s e d c o n t a i n e d l e s s t h a n 2 m g . p e r c e n td i r e c t r e a c t i n g b i l i r u b i n .A m o d e l s e r u m w a s e m p l o y e d u s i n g d i l u t i o n s o f b o v i n ea l b u m i n 2 i n a 0 . 1 M p h o s p h a t e b u f f e r , pH 7 . 4 . To t h ed i l u t e d a l b u m i n s o l u t i o n s , v a r i o u s a m o u n t s o f a q u e o u sb i l i r u b i n w e r e a d d e d . T h e b i l i r u b i n s o l u t i o n w a s m a d e b yd i s s o l v i n g c r y s t a l l i n e b i l i r u b i n H o f f m a n - L a R o c h e i nd e a e r a t e d N / 2 0 s o d i u m h y d r o x i d e c o n t a i n i n g a s c o r b i ca c i d . T h e m o d e l s e r a w e r e f r e s h l y m a d e o n t h e d a y o fu s e .S p e c t r o p h o t o m e t r i c s t u d i e s . A q u e o u s b i l i r u b i n i s k n o w nt o h a v e a n a b s o r p t i o n maximum b e t w e e n 4 2 0 a n d 4 4 0 m p ,a n d p r o t e i n - b o u n d b i l i r u b i n i n a q u e o u s s o l u t i o n s h a s a na b s o r p t i o n maximum i n t h e v i c i n i t y o f 4 6 0 m A t . T h em o l e c u l a r e x t i n c t i o n c o e f f i c i e n t s o f t h e t w o f o r m s o fb i l i r u b i n a r e s i m i l a r a n d t h e i r s o l u t i o n s o b e y B e e r ' s La w 1 5 , 1 9 , 2 5 ) .I n t h e p r e s e n t e x p e r i m e n t s t h e e f f e c t s o f o r g a n i c a n i o n sw e r e s t u d i e d b y o b s e r v i n g t h e c h a n g e s i n s p e c t r a l a b s o r p -t i o n o f b i l i r u b i n e m i c s e r a o r m o d e l s e r a w i t h a B e c k m a nDU m o d e l s p e c t r o p h o t o m e t e r . T h e s e r a f r o m t h e p a t i e n t sw e r e d i l u t e d 2 0 - o r 5 0 - f o l d w i t h w a t e r o r 0 . 1 M p h o s -p h a t e b u f f e r , pH 7 . 4 . E q u a l v o l u me s w e r e p i p e t t e d i n t oe a c h o f t h r e e 1 c m. c or e x c u v e t t e s . W a t e r w a s u s e d a s ab l a n k . T h e s p e c t r a l a b s o r p t i o n o f t h e s a m p l e s w a s m e a s -u r e d b e t w e e n 4 0 0 a n d 5 0 0 m, a n d t h e w a v e l e n g t h a tw h i c h maximum a b s o r p t i o n o c c u r r e d i n t h e 4 6 0 m A r a n g ew a s c o n s i d e r e d t h a t d u e t o p r o t e i n - b o u n d b i l i r u b i n . S u b -s e q u e n t l y e q u a l v o l u m e s o f v a r i o u s o r g a n i c a n i o n s i nc o n c e n t r a t e d s o l u t i o n s w e r e p i p e t t e d i n t o t w o o f t h e c u -v e t t e s a m p l e s . A c o n t r o l c o n s i s t e d o f a n e q u a l d i l u t i o n o ft h e t h i r d s a m p l e w i t h w a t e r o r t h e p h o s p h a t e b u f f e r .T h e a d d i t i o n s w e r e m a d e s e r i a l l y w i t h c a l i b r a t e d 2 0l a m b d a w a s h o u t p i p e t t e s . T h e o p t i c a l d e n s i t y o f e a c hs o l u t i o n w a s m e a s u r e d a t t h e o r i g i n a l 4 6 0 m A u maximumf o r t h e s e r u m a f t e r e a c h a d d i t i o n o f o r g a n i c a n i o n o rd i l u e n t . T h e s p e c t r a l c u r v e s b e t w e e n 4 0 0 a n d 5 0 0 m Aw e r e r e p e a t e d a f t e r t h e f i n a l a d d i t i o n s . D e c r e a s e i n a b -s o r p t i o n a f t e r a n i o n a d d i t i o n g r e a t e r t h a n t h a t w h i c ho c c u r r e d i n t h e c o n t r o l s a m p l e s w a s c o n s i d e r e d a s a n i n -d i c a t i o n o f u n c o u p l i n g o f b i l i r u b i n f r o m p r o t e i n . T h ec h a n g e s i n o p t i c a l d e n s i t y w e r e e x p r e s s e d a s p e r c e n t a g ec h a n g e s f r o m t h e c o n t r o l s a m p l e :

A O . D . 4 6 0 m . = E a X 1 0 0 .C Ce a n d e . a r e , r e s p e c t i v e l y t h e o p t i c a l d e n s i t i e s a t t h ea b s o r p t i o n maximum o f t h e c o n t r o l s a m p l e a n d t h e s a m -p l e t o w h i c h a n i o n h a d b e e n a d d e d . T h e c o n t r i b u t i o n o ft h e u n c o u p l e d b i l i r u b i n t o t h e t o t a l a b s o r p t i o n a t t h e4 6 0 m A maximum w a s n o t s u b t r a c t e d . C o n s e q u e n t l yt h e p e r c e n t A O . D . r e p r e s e n t s a m i n i m u m v a l u e f o r t h eu n c o u p l i n g o f p r o t e i n - b o u n d b i l i r u b i n . T h e pH o f t h es e r u m s a m p l e s w a s m e a s u r e d w i t h a B e c k m a n m o d e l

2 A r m o u r a n d C o m p a n y , p r e p a r e d b y t h e c o l d d e c a n o lf r a c t i o n a t i o n p r o c e d u r e o f C o h n . P u r c h a s e d a s a 3 0 p e rc e n t a q u e o u s s o l u t i o n .

G pH m e t e r b e f o r e a n d a f t e r a n i o n a d d i t i o n s i n 1 0 i n -s t a n c e s : f i v e w h e n w a t e r w a s u s e d a s t h e d i l u e n t a n d f i v ew h e n t h e p h o s p h a t e b u f f e r w a s u s e d . No f a l l i n pH o c -c u r r e d e x c e p t w h e r e m e n t i o n e d i n t h e r e s u l t s .T o t a l b i l i r u b i n c o n c e n t r a t i o n s w e r e m e a s u r e d o n t h ec u v e t t e s a m p l e s b y t h e M a l l o y a n d E v e l y n m o d i f i c a t i o no f t h e v a n d e n B e r g h r e a c t i o n ( 3 3 ) i n t h e 1 0 i n s t a n c e sw h e r e t h e s a m p l e s w e r e d i l u t e d w i t h w a t e r . A B a u s c ha n d Lomb S p e c t r o n i c 2 0 c o l o r i m e t e r a d a p t e d f o r 1 c m .c o r e x c e l l s was e m p l o y e d .T h e c o n c e n t r a t i o n o f t h e p r o t e i n i n t h e b o v i n e a l b u m i nm o d e l s e r a w a s 6 0 t o 2 4 0 m g . p e r c e n t a n d w a s d e t e r -m i n e d f r o m t h e d i l u t i o n o f t h e k n o w n 3 0 p e r c e n t s t o c ks o l u t i o n . T h e p r o t e i n c o n c e n t r a t i o n s w e r e n o t d e t e r -m i n e d i n t h e p a t i e n t ' s s e r a .C h a n g e s i n o p t i c a l d e n s i t y o f 0 . 0 0 2 u n i t w e r e c o n -s i d e r e d s i g n i f i c a n t a f t e r i n d i v i d u a l a n i o n a d d i t i o n s w h e nt h e o p t i c a l d e n s i t y o f t h e s a m p l e w a s b e t w e e n 0 . 1 a n d0 . 5 a n d 0 . 0 0 5 u n i t w h e n b e t w e e n 0 . 5 a n d 1 . 0 .B i l i r u b i n v a l u e s d e t e r m i n e d b y t h e v a n d e n B e r g h r e a c -t i o n i n t h i s l a b o r a t o r y h a v e a 3 p e r c e n t e r r o r i n b i l i -r u b i n c o n c e n t r a t i o n s o f 1 0 m g . p e r c e n t o r m o r e a n d a 4t o 5 p e r c e n t e r r o r i n t h e 5 t o 1 0 m g . p e r c e n t r a n g e .O t h e r s p e c t r o p h o t o m e t r i c a n a l y s e s w e r e d o n e b y q u a n -t i t a t i v e d i l u t i o n o f s e r u m a l i q u o t s i n c a l i b r a t e d v o l u -m e t r i c f l a s k s . T h e d i l u e n t w a s e i t h e r d i s t i l l e d w a t e r o rp h o s p h a t e - b u f f e r c o n t a i n i n g v a r i o u s c o n c e n t r a t i o n s o fo r g a n i c a n i o n s . T h e s p e c t r a l a n a l y s e s w e r e d on e i m m e d i -a t e l y a f t e r d i l u t i o n o r d e l i b e r a t e l y d e l a y e d f o r v a r i o u si n t e r v a l s .T h e o r g a n i c a ni on s u s e d w e r e s u l f i s o x a z o l e d i e t h a -n o l a m i n e H o f f m a n L a R o c h e , I n c . ) ; U . S . P . s o d i u ms u l f a d i a z i n e A b b o t t C o . ; s o d i u m s a l i c y l a t e B a k e rC h e m i c a l C o . ; h e p a r i n s o d i u m , 1 0 m g . p e r 1 m l . T h eU p j o h n C o . ; s u l f a n i l i c a c i d M e r c k ; g l u c u r o n i c a c i d( C a l i f o r n i a F o u n d a t i o n f o r B i o c h e m i c a l R e s e a r c h ; a n ds o d i u m g l u c u r o n a t e ( C a l i f o r n i a F o u n d a t i o n f o r B i o -c h e m i c a l R e s e a r c h .U l t r a f i l t r a t i o n s t u d i e s . U l t r a f i l t r a t i o n s o f w h o l e o r d i -l u t e d h u m a n a n d m o d e l s e r a w e r e d o n e b y c e n t r i f u g a -t i o n a t r o o m t e m p e r a t u r e o f s e r a c o n t a i n e d i n a d i a l y s i sb a g s u s p e n d e d i n a c e n t r i f u g e t u b e .

V a r i o u s v o l u m e s o f c o n c e n t r a t e d s o d i u m s a l i c y l a t e ,s o d i u m s u l f a d i a z i n e , s u l f i s o x a z o l e a n d s u l f a n i l i c a c i d w e r ea d d e d t o t h e s e r a t o y i e l d c o n c e n t r a t i o n s o f 5 t o 2 5 m g .p e r c e n t b e f o r e u l t r a f i l t r a t i o n . A c o n t r o l c o n s i s t e d o f as i m u l t a n e o u s u l t r a f i l t r a t i o n o f a s e r u m s a m p l e d i l u t e dw i t h w a t e r e q u a l t o t h e v o l u m e o f a d d e d o r g a n i c a n i o ns o l u t i o n . U l t r a f i l t r a t i o n s w e r e a l s o d o n e w i t h s e r u ms a m p l e s c o n t a i n i n g a d d e d g l u c u r o n i c a c i d a n d s o d i u m g l u -c u r o n a t e i n c o n c e n t r a t i o n s o f 2 0 , 5 0 a n d 2 0 0 m g . p e r c e n t .T h e u l t r a f i l t r a t i o n o f s e r u m b y c e n t r i f u g a t i o n r e q u i r e d1 0 t o 3 0 m i n u t e s .T h e q u a l i t a t i v e a n a l y s i s o f t h e u l t r a f i l t r a t e s f o r b i l i r u -b i n w a s d o n e s p e c t r o p h o t o m e t r i c a l l y a n d c o l o r i m e t r i c a l l yb y t h e v a n d e n B e r g h r e a c t i o n . T h e u l t r a f i l t r a t e s o b -t a i n e d f r o m t h e c e n t r i f u g a t i o n o f t h e m o d e l s e r a w e r ee x t r a c t e d w i t h c h l o r o f o r m , a n d t h e c h l o r o f o r m l a y e r w a st e s t e d f o r b i l i r u b i n q u a l i t a t i v e l y a s a b o v e . T h e u l t r a -f i l t r a t e s w e r e t e s t e d f o r p r o t e i n q u a l i t a t i v e l y b y t h e

8 2 4


3/11

PR OT EI N B IN D IN G OF BILIRUBINp r e s e n c e o f a p r e c i p i t a t e a f t e r a d d i t i o n o f 1 0 p e r c e n tt r i c l o r a c e t i c a c i d .D i a l y s i s . s t u d i e s . J a u n d i c e d h u m a n s e r a w e r e p r e p a r e da s i n t h e u l t r a f i l t r a t i o n s t u d i e s a n d d i a l y z e d i n c e l l u l o s ec a s i n g s a g a i n s t r u n n i n g c o l d w a t e r , p r o t e c t e d f r o m l i g h t ,f o r 5 t o 7 2 h o u r s . T h e s a m p l e s w e r e s u b s e q u e n t l y a n a -l y z e d f o r t h e r e m a i n i n g b i l i r u b i n . T h e s e e x p e r i m e n t sw e r e d o n e u s i n g e i t h e r t h e u n d i l u t e d s e r a o r s a m p l e s d i -l u t e d w i t h w a t e r .

RESULTSS p e c t r o p h o t o m e t r i c s t u d i e s

T h e a b s o r p t i o n maximum o f t h e d i l u t e d s e r aw a s 4 6 0 m p + 1 m p i n 1 8 o f t h e 2 0 p a t i e n t s . Oneo f t h e p a t i e n t ' s s e r a e x h i b i t e d i t s a b s o r p t i o n m a x -i m a a t 4 6 5 m M F i g u r e 2 a n d a n o t h e r a t 4 7 0 m j L .I f t h e h u m a n s e r a w e r e d i l u t e d i n 0 . 1 M P O 4 b u f -f e r , pH 7 . 4 , t h e s p e c t r a l c u r v e o f t h e s e r a w a ss h i f t e d s l i g h t l y t o w a r d h i g h e r w a v e l e n g t h s i n t h e4 0 0 t o 5 0 0 r a n g e , a n d t h e a b s o r p t i o n p e a k w a su s u a l l y s h i f t e d f r o m 4 6 0 m a t t o 4 6 2 m l i , w i t h o u tc h a n g e i n e x t i n c t i o n a t t h e r e s p e c t i v e m a x i m a .T h e a d d i t i o n o f e i t h e r s a l i c y l a t e o r s u l f o n a m i d e st o i c t e r i c s e r u m s a m p l e s p r o d u c e d a l t e r a t i o n s i nt h e i r a b s o r p t i o n s p e c t r u m . I l l u s t r a t i v e c h a n g e sa r e p r e s e n t e d i n F i g u r e s 1 a n d 2 . T h e i n s e r t o fF i g u r e 1 i l l u s t r a t e s t h e l o s s o f o p t i c a l d e n s i t yf o u n d i n t h e d i l u t e d s e r u m a f t e r e a c h a d d i t i o n o fs u l f i s o x a z o l e a n d s a l i c y l a t e u n t i l 3 a n d 5 j u M h a db e e n a d d e d , r e s p e c t i v e l y . T h e s p e c t r a l c u r v e ss h o w n a b o v e t h e i n s e r t a r e t h e c u r v e s o f t h e s e r u ms a m p l e s a f t e r t h e a d d i t i o n o f e q u a l v o l u m e s ( 0 . 2m l . ) o f w a t e r , 4 0 0 m g . p e r c e n t s u l f i s o x a z o l e a n d4 0 0 m g . p e r c e n t s a l i c y l a t e h a d b e e n m a d e t oe i t h e r t h e c o n t r o l o r e x p e r i m e n t a l s a m p l e s i n t h ec u v e t t e s . T h e s e v o l u m e s c o r r e s p o n d e d t o t h e3 M L M a n d t h e 5 MM a n i o n a d d i t i o n s . As c a n b es e e n f r o m t h e s e s p e c t r a l c u r v e s , t h e a n i o n s p r o -d u c e d a d e p r e s s i o n i n t h e a b s o r p t i o n a t 4 6 0 m M za n d a s i m u l t a n e o u s i n c r e a s e i n a b s o r p t i o n o v e r t h ec o n t r o l s a m p l e f r o m 4 1 0 t o 4 4 0 mM w i t h a p e a k a t4 2 0 m u . T h e b i l i r u b i n c o n c e n t r a t i o n i n e a c h o ft h e t h r e e c u v e t t e s a m p l e s , a f t e r t h e s p e c t r a l a n a l y -s i s w a s d o n e , g a v e t h e s a m e v a l u e s b y t h e v a n d e nB e r g h r e a c t i o n .T h e a d d i t i o n o f s a l i c y l a t e a n d s u l f i s o x a z o l e a si l l u s t r a t e d i n F i g u r e 1 h a s now b e e n d o n e o n s e r af r o m 2 0 i c t e r i c b a b i e s a n d s i m i l a r c h a n g e s h a v eb e e n o b s e rv e d i n a l l i n s t a n c e s . Th e p e r c e n t a g el o s s i n a b s o r p t i o n a t t h e 4 6 0 mM maximum h a s d i f -f e r e d f r o m b a b y t o b a b y . Th e r a n g e h a s v a r i e d

. 4 0 0 -

. 3 5 0 i> - . 3 0 0 -I -V )zw . 2 5 0 10- J0 .0

. 2 0 0 -

. 1 5 0 -

. 1 0 0 -.. 0 5 0 -

3 SUMNION ADDED0 4 ; 0 0 45 0 500

WAVE LENGTH M JF I G . 1 . S P E C T R A L A B S O R P T I O N CHANGES IN SERUM FROM

A P A T I E N T WITH E R Y T H R O B L A S T O S I SB i l i r u b i n c o n c e n t r a t i o n : 0 . 4 d i r e c t , 1 2 mg. pe r c e n tt o t a l . T h e i n s e r t i s a p l o t o f t h e l o s s i n o p t i c a l d e n s i t ya t 4 6 0 mu a f t e r e a c h 2 0 X a d d i t i o n o f 4 0 0 mg. pe r c e n ts a l i c y l a t e a n d s u l f i s o x a z o l e .T h e s p e c t r a l curves a b o v e r e p r e s e n t t h e o p t i c a l d e n -s i t i e s o f t h e 1 : 2 0 d i l u t i o n o f t h e serum a f t e r t h e f i n a lw a t e r or a n i o n a d d i t i o n s . T o t a l v o l u m e o f a d d i t i o n , 0 . 2m l . ; b i l i r u b i n c o n c e n t r a t i o n i n c u v e t t e s , 0 . 0 1 uM pe r m l .0 @ c o n t r o l s a m p l e ; O O s a m p l e c o n t a i n i n g3 M M s u l f i s o x a z o l e f i n a l c o n c e n t r a t i o n , 1 . 1 u M p e r m l ) ;X-X, s a m p l e c o n t a i n i n g 5 / A M s o d i u m s a l i c y l a t e ( f i n a lc o n c e n t r a t i o n , 1 . 8 AM pe r m l . ) .M o l a r r a t i o s o f a d d e d a n i o n t o b i l i r u b i n may b e e s t i -m a t e d b y m u l t i p l y i n g FM o f a n i o n a d d e d ( a b s c i s s a ) b y0 . 4b i l i r u b i n c o n c e n t r a t i o n M A M pe r m l . ) 'f r o m 5 t o 1 2 per c e n t w i t h 5 MM a d d i t i o n s o fs a l i c y l a t e a n d 2 t o 8 pe r c e n t f o r 3MM a d d i t i o n s o fs u l f i s o x a z o l e . S a l i c y l a t e a l w a y s p r o d u c e d ag r e a t e r l o s s i n a b s or pt i o n t h a n t h e s u l f o n a m i d e i nt h e sera f r o m t h e 2 0 b a b i e s s t u d i e d .

F i g u r e 2 s h o w s t h e s p e c t r a l cuves o f a s e r u m i nw h i c h on e o f t h r e e 0 . 2 m l . a l i q u o t s was d i l u t e d 5 0 -f o l d w i t h w a t e r a l o n e or w a t e r a n d 4 0 0 mg. pe rc e n t s o d i u m s a l i c y l a t e t o h a v e f i n a l s a l i c y l a t e con-c e n t r a t i o n s o f 0 . 4 a n d 4 0 . 0 mg. pe r c e n t . Th e d e -p r e s s i o n o f a b s o r p t i o n a t 4 6 5 mM a n d t h e appear-a nce o f a s h o u l d e r a t 4 2 0 t o 4 4 0 mM L i s a p p a r e n t .

~ ~ ~ x

A20

t a

8 2 5


4/11


5/11


6/11

GERARD B . ODELL

ML 0 1 ~ ~ ~0 ~ 6 - .

0 . 2 . 4 . 6 . 8 . o .2( . 0 6 ) ( . 1 2 ) a S ( . 2 3 ) ( . 2 9 ) . 3 4 ( . 4 ),UM ANION ADDEDF I G . 6 . BOVINE ALBUMIN B I L I R U B I N M I X T U R E I N P0,

B U F F E R , PH 7 . 4 , T O WHICH AQUEOUS 2 0 0 M G . P E R CENTS U L F I S O X A Z O L E HAD BEEN A D D E DTh e c o n d i t i o n s o f t h i s e x p e r i m e n t w e r e i d e n t i c a l t ot h o s e s h o w n i n F i g u r e 5 .M o l a r r a t i o s o f a d d e d a n i o n t o b i l i r u b i n ma y b e e s t i -

m a t e d b y m u l t i p l y i n g , u M o f a n i o n a d d e d ( a b s c i s s a ) b y0 . 4b i l i r u b i n c o n c e n t r a t i o n ( , u M p e r m l . ) -o f t h e a b s o r p t i o n a t 4 6 0 m M u , t h a n w a s n e c e s s a r yw i t h e i t h e r t h e p a t i e n t ' s s e r a F i g u r e s 1 a n d 7 ) o rt h e b o v i n e - a l b u m i n - b i l i r u b i n m i x t u r e s a t c o m -p a r a b l e a l b u m i n c o n c e n t r a t i o n s ( s e e F i g u r e s 5a n d 6 . )

I n o r d e r t o e l u c i d a t e s o m e o f t h e v a r i a b l e s w h i c hi n f l u e n c e t h e s p e c t r o s c o p i c b e h a v i o r o f p r o t e i n -b o u n d b i l i r u b i n , t h e f o l l o w i n g s t u d i e s w e r e d o n ea n d a r e i l l u s t r a t e d i n F i g u r e s 4 t h r o u g h 7 .A s e r i e s o f b u f f e r e d a l b u m i n a n d b i l i r u b i n s o l u -t i o n s w e r e m i x e d s o a s t o h a v e d i f f e r e n t m o l a rc o n c e n t r a t i o n r a t i o s o f b i l i r u b i n t o a l b u m i n . T h r e e2 . 5 m l . s a m p l e s f r o m e a c h m o ~ l a r m i x t u r e w e r ep i p e t t e d i n t o t h e c u v e t t e s a n d 0 . 0 2 m l . a d d i t i o n s o f

2 0 0 m g . p e r c e n t s a l i c y l a t e ( F i g u r e 5 ) o r s u l f i s o x -a z o l e F i g u r e 6 w e r e m a d e d i r e c t l y t o t h e c u -v e t t e . T h e a b s o r p t i o n a t 4 7 0 m p u w a s m e a s u r e da f t e r m i x i n g o f e a c h a d d i t i o n o f a n i o n a n d com-p a r e d t o t h e c o n t r o l s a m p l e w h i c h w a s e q u a l l y d i -l u t e d w i t h d i s t i l l e d w a t e r . F i g u r e s 5 a n d 6 s h o wt h e d e c r e a s e i n o p t i c a l d e n s i t y e x p r e s s e d a s p e r -c e n t a g e c h a n g e f r o m t h e c o n t r o l s a m p l e p l o t t e da g a i n s t t h e m o l e s o f a d d e d a n i o n . T h e n u m b e r si n p a r e n t h e s e s r e f e r t o t h e m o l a r c o n c e n t r a t i o n o fa n i o n i n t h e c u v e t t e .

T h e r e s u l t s o f t h e s e e x p e r i m e n t s i n d i c a t e d a )t h a t a g r e a t e r d e p r e s s i o n o f a b s o r p t i o n a t 4 7 0 m p up e r m o l e o f a n i o n a d d e d o c c u r r e d i n t h e s o l u t i o n sw i t h h i g h e r m o l a r r a t i o s o f b i l i r u b i n t o a l b u m i nr e g a r d l e s s o f a b s o l u t e b i l i r u b i n c o n c e n t r a t i o n ; t h ec u r v e s o f t h e 0 . 6 a n d 0 . 3 m o l a r r a t i o s h a d t h e s a m eb i l i r u b i n c o n c e n t r a t i o n ; a n d b ) t h a t a g r e a t e r d e -p r e s s i o n o f a b s o r p t i o n a t 4 7 0 mu w a s p r o d u c e d b yi n c r e a s i n g t h e a n i o n c o n c e n t r a t i o n r e l a t i v e t o t h a to f b i l i r u b i n a n d a l b u m i n a t a l l m o l a r r a t i o s ; t h ec h a n g e w a s n o t l i n e a r .

F i g u r e 7 i l l u s t r a t e s t h e c h a n g e s i n s p e c t r a l a b -s o r p t i o n o f s e r u m , f r o m a p a t i e n t w ho h a d h y p e r -b i l i r u b i n e m i a , u p o n a d d i t i o n s o f s u l f i s o x a z o l e a n ds a l i c y l a t e . T h e m o l a r c o n c e n t r a t i o n r a t i o o f b i l i -r u b i n t o p r o t e i n w a s c o n s t a n t , b u t b e c a u s e t h es e r u m w a s d i l u t e d 1 : 2 0 a n d 1 : 5 0 t h e r e l a t i v e c o n -c e n t r a t i o n o f a n i o n t o b i l i r u b i n a n d p r o t e i n d i f -

aI0( 06o4 I

6

4

2

2 4 6P M ANION ADDED

F I G . 7 . TH E S P E C T R A L A B S O R P T I O N C H A N G E S O F HUMANS E R U M A F T E R A D D I T I O N O F O R G A N I C A N I O NT h e u n d i l u t e d s e r u m h a d a b i l i r u b i n c o n c e n t r a t i o n :0 . 8 d i r e c t , 1 5 m g . p e r c e n t t o t a l .

x - X , 1 : 5 0 d i l u t i o n o f t h e 4 0 0 m g . p e r c e n t s a l i c y l -s e r u m a t e a d d e d i n 2 0 X ( 0 . 5 0X - - - X , 1 : 2 0 d i l u t i o n o f t h e Au M a m o u n t s t o 2 . 5 m l .s e r u m J o f d i l u t e d s e r u m .0-0, 1 : 5 0 d i l u t i o n o f t h e 4 0 0 m g . p e r c e n t s u l f i s o x -s e r u m a z o l e a d d e d i n 2 0 X ( 0 . 3 00 - - - 0 , 1 : 2 0 d i l u t i o n o f t h e , M a m o u n t s t o 2 . 5 m l .s e r u m J o f d i l u t e d s e r u m .B i l i r u b i n c o n c e n t r a t i o n i n 1 : 2 0 d i l u t i o n , 0 . 0 1 , M p e r m l . ;i n 1 : 5 0 d i l u t i o n , 0 . 0 0 5 , s M p e r m l .M o l a r r a t i o s o f a d d e d a n i o n t o b i l i r u b i n ma y b e e s t i -m a t e d b y m u l t i p l y i n g ,M o f a n i o n a d d e d ( a b s c i s s a ) b y0 . 4b i l i r u b i n c o n c e n t r a t i o n A M p e r m l . ) '

8 2 8


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PROT EI N BIND ING OF BILIRUBINf e r e d . I t was s e e n , as w i t h t h e m o d e l serum, t h a ti n c r e a s i n g t h e a n i o n c o n c e n t r a t i o n o f e i t h e r s a l i c y l -a t e or s u l f i s o x a z o l e r e l a t i v e t o t h e p r o t e i n a n d b i l i -r u b i n c o n c e n t r a t i o n s p r o d u c e d g r e a t e r d e p r e s s i o n si n a b s o r p t i o n . T h e i m p o r t a n c e o f a b s o l u t e a s w e l la s r e l a t i v e c o n c e n t r a t i o n s o f a n i o n , p r o t e i n a n db i l i r u b i n was i l l u s t r a t e d b y t h e f a c t t h a t t h e curvesf o r t h e 1 : 2 0 d i l u t i o n s i n t e r s e c t e d t h o s e o f t h e 1 : 5 0d i l u t i o n s w i t h d i f f e r e n t s l o p e s . A l t h o u g h n o t i l -l u s t r a t e d i n F i g u r e s 5 a n d 6 , a l l t h r e e curves even-t u a l l y i n t e r s e c t e d o n e a n o t h e r a n d p l a t e a u e d a ta b o u t t h e same l e v e l .U l t r a f i l t r a t i o n s t u d i e s

I n o r d e r t o a s c e r t a i n t h a t t h e d e p r e s s i o n i n a b -s o r p t i o n a t 4 6 0 m t u was d u e t o an u n c o u p l i n g o fp r o t e i n - b o u n d b i l i r u b i n , t h e d i l u t e d human orb o v i n e sera w e r e u l t r a f i l t e r e d b y c e n t r i f u g a t i o n i n1 5 i n s t a n c e s . T h e p r o t e i n - f r e e u l t r a f i l t r a t e s werec o l o r e d y e l l o w when s a l i c y l a t e , s u l f a d i a z i n e , s u l -f i s o x a z o l e or s u l f a n i l i c a c i d h a d b e e n a d d e d p r i o rt o u l t r a f i l t r a t i o n . S e r u m c o n c e n t r a t i o n s over 3 0mg pe r c e n t o f s u l f a d i a z i n e w e r e r e q u i r e d a s com-p a r e d w i t h c o n c e n t r a t i o n s o f 5 t o 2 5 mg. pe r c e n to f t h e o t h e r a n i o n s . S p e c t r o p h o t o m e t r i c a n a l y s i so f t h e f i l t r a t e s s h o w e d a n a b s o r p t i o n maximum a t4 2 0 mu. A f t e r a d d i t i o n o f m e t h y l a l c o h o l a n dd i a z o t i z e d s u l f a n i l i c a c i d t h e a b s o r p t i o n maximuma t 4 2 0 was a b s e n t a n d a new p e a k a t 5 3 0 t o 5 6 0m, was p r e s e n t , t h e a b s o r p t i o n p e a k o f b i l i r u b i n

c o u p l e d t o d i a z o t i z e d s u l f a n i l i c a c i d . T h e s h i f t i na b s o r p t i o n maximum d i d n o t occur w h e n d i a z o -t i z e d s u l f a n i l i c a c i d a l o n e was a d d e d , b u t t h e s o l u -t i o n s b e c a m e c o l o r l e s s , so t h a t i t was necessary t oa d d m e t h y l a l c o h o l b e f o r e a d d i t i o n o f t h e d i a z or e a g e n t . T h e c o n t r o l s a m p l e s o f sera u l t r a f i l t e r e ds i m u l t a n e o u s l y h a d c o m p l e t e l y c o l o r l e s s f i l t r a t e sa n d y i e l d e d no c o l o r e d p r o d u c t b y t h e van d e nB e r g h t e s t . S a m p l e s o f sera t o w h i c h g l u c u r o n i ca c i d or s o d i u m g l u c u r o n a t e h a d b e e n a d d e d a l s oh a d c o l o r l e s s f i l t r a t e s w h e n u l t r a f i l t e r e d a n d an e g a t i v e van d e n B e r g h t e s t .D i a l y s i s s t u d i e s

R e p r e s e n t a t i v e r e s u l t s o f a f e w d i a l y s i s e x p e r i -ments a r e s h o w n i n T a b l e I . T h e sera were d i -l u t e d a s i n d i c a t e d a n d t h e a n i o n a d d e d . Ana l i q u o t was t a k e n a n d e x a m i n e d s p e c t r o p h o t o -m e t r i c a l l y f o r t h e pe r c e n t AO . D . 4 6 0 m t u a n d t h er e m a i n d e r was d i a l y z e d .I t s h o u l d b e p o i n t e d o u t t h a t t h e m e t h o d o l o g yo f t h e s e two a p p r o a c h e s a re n o t c o m p a r a b l e . I nt h e s p e c t r o p h o t o m e t r i c p r o c e d u r e , t h e u n c o u p l e db i l i r u b i n c o m p e t e s w i t h t h e a d d e d a n i o n f o r pro-t e i n b i n d i n g , w h e r e a s i n t h e d i a l y s e s t h e concen-t r a t i o n s o f f r e e b i l i r u b i n a n d a n i o n a r e l o w e r e db e c a u s e t h e y ca n b e d i a l y z e d f r o m t h e p r o t e i np h a s e .T h e f i r s t t h r e e e x p e r i m e n t s d e m o n s t r a t e d ag r e a t e r l o s s i n b i l i r u b i n b y d i a l y s i s t h a n t h e spec-

TABLE IE f f e c t o f a n i o n s o n p r o t e i n - b i n d i n g o f b i l i r u b i n

P e r c e n t c h a n g e f r omc o n t r o l s a m p l eC o n c e n t r a t i o n O f o p t i c a lB i l i r u b i n i n d i l u t e d B i l i r u b i n d e n s i t y a tc o n c e n t r a t i o n D i l u t i o n s e r a o f c o n c e n t r a - O f b i l i r u b i n 4 6 0 ma b yi n o r i g i n a l of s e r a f o r D u r a t i o n a n i o n a f t e r t i o n a f t e r l o s t b y s p e c t r o p h o -s e r u m d i a l y s i s o f d i a l y s i s A n i o n a d d e d a d d i t i o n d i a l y s i s d i a l y s i s t o m e t r y

m g . h o u r s m g . m g . 1 : 1 5 0 . 5 : 0 . 5 2 7 2 0 0 8 . 2S u l f i s o x a z o l e 1 5 6 . 9 - 1 5 . 8 - 4 . 30 . 6 : 1 2 . 5 0 . 5 : 1 . 5 1 0 0 0 1 2 . 0S u l f i s o x a z o l e 3 . 6 1 1 . 4 - 5 . 0 - 2 . 40 . 8 : 1 1 0 . 2 : 1 0 5 0 0 1 0 . 2S u l f i s o x a z o l e 7 . 8 9 . 6 - 5 . 9 - 1 . 2S a l i c y l a t e 7 . 8 9 . 4 - 7 . 8 - 4 . 71 . 2 : 2 1 0 . 2 : 1 0 6 0 0 1 7 . 0S u l f i s o x a z o l e 0 . 8 1 7 . 0 0 - 3 . 9S a l i c y l a t e 0 . 8 1 6 . 0 - 5 . 9 - 5 . 8

8 2 9


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GERARD B . ODELLt r o p h o t o m e t r i c m e a s u r e m e n t i n d i c a t e d . T h e l a s tt w o e x p e ri me nt s d e m o n s t r a t e d t h a t t h e r e l a t i v ee f f e c t i v e n e s s o f s a l i c y l a t e w a s g r e a t e r t h a n s u l -f i s o x a z o l e .

A f t e r t h e d i a l y s e s t h e r e m a i n i n g s o l u t i o n s w e r ea l s o t e s t e d f o r s a l i c y l a t e w i t h f e r r i c c h l o r i d e a n df o r s u l f o n a m i d e b y t h e B r a t t o n - M a r s h a l l t e c h -n i q u e ( 3 4 ) . B o t h a n i o n s w e r e a b s e n t a t t h e e n do f t h e d i a l y s e s .

DISCUSSIONT h e s p e c t r o p h o t o m e t r i c s t u d i e s d e m o n s t r a t e dt h a t p r o t e i n - b o u n d b i l i r u b i n c a n b e m o d i f i e d b yo r g a n i c a n i o n s . T h e n e w p e a k w h i c h a p p e a r e d a t

4 2 0 t o 4 4 0 m j A ( t h e a b s o r p t i o n maximum f o r f r e eb i l i r u b i n ) a f t e r a d d i t i o n o f t h e a n i o n i s c o n s i s t e n tw i t h u n c o u p l i n g o f b i l i r u b i n f r o m p r o t e i n . T h ep r e s e n c e o f b i l i r u b i n i n t h e u l t r a f i l t r a t e s o f s e r u ma f t e r t h e a n i o n a d d i t i o n s c o n f i r m e d t h i s i n t e r -p r e t a t i o n . T h e r e a c t i o n o f t h e u l t r a f i l t r a t e s w a sc h a r a c t e r i s t i c o f b i l i r u b i n r a t h e r t h a n i t s g l u c u -r o n i d e , b e c a u s e i n a q u e o u s a c i d s o l u t i o n s i t d i dn o t c o u p l e w i t h t h e d i a z o r e a g e n t u n l e s s a l c o h o lw a s f i r s t a d d e d .T h e d i a l y s i s s t u d i e s a l s o d e m o n s t r a t e d a g r e a t e rl o s s o f b i l i r u b i n i n t h e p r e s e n c e o f c e r t a i n o r g a n i ca n i o n s . A l t h o u g h t h e b i l i r u b i n w a s n o t r e c o v e r e d ,i t w a s p r e s u m e d t o h a v e b e e n d i a l y z e d f r o m t h ep r o t e i n p h a s e a f t e r b e i n g u n c o u p l e d .

S o m e a u t h o r s h a v e f o u n d t h a t a q u e o u s b i l i r u b i nh a s a n a b s o r p t i o n p e a k a t 4 4 0 mu ( 1 5 , 1 9 ) w h i l eo t h e r s f o u n d t h e p e a k a t 4 2 0 m p t ( 3 5 , 3 6 ) . T h ea u t h o r h a s f o u n d b o t h v a l u e s . F r e s h l y m a d ea q u e o u s b i l i r u b i n h a d a n a b s o r p t i o n maximum a t4 4 0 m p t , b u t o n s t a n d i n g , e v e n w h e n p r o t e c t e df r o m l i g h t , t h e p e a k s h i f t e d t o 4 3 0 m p u a n d f i n a l l yt o 4 2 0 m 1 A . T h i s s h i f t o c c u r r e d w i t h o u t m u c hc h a n g e i n t h e e x t i n c t i o n c o e f f i c i e n t o r c h a n g e i nb i l i r u b i n c o n c e n t r a t i o n b y t h e v a n d e n B e r g h r e -a c t i o n ( 3 7 ) . N o s t u d i e s w e r e d o n e t o i n v e s t i g a t et h e s e d i f f e r e n c e s i n a b s o r p t i o n m a x i m a o f f r e eb i l i r u b i n , b u t may r e p r e s e n t f o r m a t i o n o f m o l e c u -l a r a g g r e g a t e s ( 3 8 ) . M e s o b i l i r u b i n h a s a s p e c t r a lc u r v e a n d d i a z o r e a c t i o n v e r y s i m i l a r t o b i l i r u b i n ' sa n d c a n b e f o r m e d b y r e d u c t i o n o f b i l i r u b i n w i t hv i g o r o u s h e a t i n g o v e r m e t a l a m a l g a m s ( 3 9 ) . O c -c u r r e n c e o f s u c h a r e d u c t i o n s e e m e d u n l i k e l y .

E v e n t h o u g h p r o t e i n - b o u n d a n d f r e e b i l i r u b i nh a v e s i m i l a r m o l e c u l a r e x t i n c t i o n c o e f f i c i e n t s , t h eu n c o u p l i n g o f p r o t e i n - b o u n d b i l i r u b i n a s m e a s -

u r e d b y l o s s o f a b s o r p t i o n a t 4 6 0 m p d i d n o t p r od u c e a q u a n t i t a t i v e i n c r e a s e a t 4 2 0 t o 4 4 0 m p .B i l i r u b i n i s v e r y i n s o l u b l e a n d u n s t a b l e i n a q u e o u ss o l u t i o n a t pH 7 . 4 a n d may p r e c i p i t a t e o r o x i d i z et o o t h e r d e r i v a t i v e s w h e n u n c o u p l e d . T h e p r o -g r e s s i v e l o s s o f a b s o r p t i o n i n t h e 4 2 0 t o 4 4 0 m p ur a n g e o f t h e s e r u m s a m p l e s c o n t a i n i n g a d d e d a n i o nu p o n s t a n d i n g o r o n e x p o s u r e t o l i g h t w a s c o n -s i s t e n t w i t h t h e i n s t a b i l i t y o f b i l i r u b i n , a s w a s t h ea b s o l u t e l o s s o f b i l i r u b i n w h e n m e a s u r e d b y t h ev a n d e n B e r g h r e a c t i o n . C o n s e q u e n t l y , t h e q u a n -t i t a t i v e m a t h e m a t i c a l e v a l u a t i o n f o r u n c o u p l i n g a sd e s c r i b e d b y K l o t z , T r i w u s h a n d W a l k e r 4 0c o u l d n o t b e a p p l i e d . A l s o t h e a m o u n t o f b i l i -r u b i n u n c o u p l e d w h e n e x p r e s s e d a s p e r c e n t a g ec h a n g e o f o p t i c a l d e n s i t y w a s r e a l l y a m i n i m u mv a l u e b e c a u s e t h e a b s o r p t i o n o f t h e f r e e b i l i r u b i nc o n t r i b u t e d p r o g r e s s i v e l y m o r e t o t h e t o t a l a b -s o r p t i o n a t 4 6 0 mM a s m o r e a n i o n w a s a d d e d . I ft h e t o t a l s p e c t r a l c u r v e s o f F i g u r e 2 c o u l d b e r e -s o l v e d i n t o t h e i n d i v i d u a l c u r v e s f o r f r e e a n d p r o -t e i n - b o u n d b i l i r u b i n , t h e c u r v e o f f r e e b i l i r u b i nw i t h 4 0 m g . p e r c e n t s a l i c y l a t e w o u l d i n c l u d e ag r e a t e r a r e a i n t h e 4 6 0 mu r a n g e t h a n t h e f r e eb i l i r u b i n c u r v e c o n t a i n i n g 4 m g . p e r c e n t s a l i c y l a t e .D e s p i t e t h e s e d r a w b a c k s , t h e s p e c t r o p h o t o m e t r i cs t u d i e s d i d s h o w q u a l i t a t i v e s i m i l a r i t y t o t h e c h e m -i c a l l a w s o f m a s s a c t i o n o f c o m p e t i t i o n o f t w o i o n sf o r t h e s a m e l o c u s . T h i s w a s e x e m p l i f i e d b y t h er e s p o n s e o f p r o t e i n - b o u n d b i l i r u b i n a t d i f f e r e n tm o l a r r a t i o s t o s i m i l a r a n i o n c o n c e n t r a t i o n s , a n da l s o w h e n t h e b i l i r u b i n p r o t e i n r a t i o w a s s m a l l , l o wc o n c e n t r a t i o n s o f a n i o n d i d n o t i n t e r f e r e w i t h t h ep r o t e i n b o u n d b i l i r u b i n .

B o t h s a l i c y l a t e a n d s u l f o n a m i d e s h a v e a f f i n i t i e sf o r a l b u m i n t h r o u g h t h e i r a c i d r a d i c a l s a n d c o m -p e t e w i t h o t h e r o r g a n i c a n i o n s f o r p r o t e i n b i n d -i n g ( 4 0 , 4 1 ) . T h e m a j o r b i n d i n g s i t e s i n v o l v e da r e t h e a c i d r a d i c a l s o f a n i o n s a n d t h e c a t i o n i ca m i n e g r o u p s o f a l b u m i n , p r i m a r i l y t h e e - a m i n og r o u p s o f l y s i n e ( 2 7 ) . I f t h e c a r b o x y l g r o u p s o ft h e p r o p r i o n i c a c i d s i d e c h a i n s o f b i l i r u b i n a re c on -c e r n e d i n t h e p r o t e i n b i n d i n g , t h e n i n t e r f e r e n c e b ys a l i c y l a t e s o r s u l f o n a m i d e s m i g h t b e e x p e c t e d .O t h e r g r o u p s i n t h e b i l i r u b i n m o l e c u l e may a l s o b ei n v o l v e d i n i t s p r o t e i n b i n d i n g ( 4 2 ) . Th e f i n d i n g( 1 9 ) t h a t g u a n i d i n a t i o n o f a l b u m i n r e d u c e d i t sb i l i r u b i n b i n d i n g c a p a c i t y a l s o i n d i c a t e d t h a t m o r et h a n t h e p r o p r i o n i c s i d e c h a i n s a r e i n v o l v e d , f o rK l o t z a n d U r q u h a r t ( 4 3 ) f o u n d t h a t t h e b i n d i n g

8 3 0


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PROTEIN BINDING OF BILIRUBIN

o f m e t h y l o r a n g e w a s u n a f f e c t e d b y g u a n i d i n a t i o no f a l b u m i n . B e c a u s e o f t h e i r r e l a t i v e l y s i m p l e rs t r u c t u r e a n d g r e a t e r s o l u b i l i t y i n a q u e o u s m e d i a ,o n e w o u l d e x p e c t t h a t c o n s i d e r a b l y g r e a t e r m o l a rc o n c e n t r a t i o n s o f s u l f o n a m i d e s a n d s a l i c y l a t e r e l a -t i v e t o b i l i r u b i n w o u l d b e r e q u i r e d t o i n t e r f e r es i g n i f i c a n t l y w i t h t h e p r o t e i n b i n d i n g o f b i l i r u b i n .H o w e v e r , i n t h e p r e s e n t s t u d i e s t h e c o n c e n t r a t i o n so f s a l i c y l a t e a n d s u l f i s o x a z o l e u s e d w e r e w i t h i nt h e l i m i t s o f b l o o d l e v e l s s e e n i n c l i n i c a l m e d i c i n e .T h e s e r u m p r o t e i n a n d b i l i r u b i n c o n c e n t r a t i o n sw e r e c h o s e n i n t h e p r e s e n t s t u d i e s a t a l e v e l w h i c hm i g h t b e p r e s e n t i n i n t e r s t i t i a l f l u i d p a r t i c u l a r l yo f b r a i n .

I n v i e w o f t h e p r o t e i n b i n d i n g o f b i l i r u b i n , i t i so f i n t e r e s t t h a t R o s e n f e l d a n d S u r g e n o r f o u n dt h a t w h e n u s i n g h e m a t i n f o r a l b u m i n d e t e r m i n a -t i o n s , b i l i r u b i n d i d n o t i n t e r f e r e ( 2 8 ) . T h i s s u g -g e s t s t h a t i f h e m a t i n i s b o u n d b y t h e s a m e l o c i a sb i l i r u b i n i t s b i n d i n g c o n s t a n t m i g h t b e c o n s i d e r a b l yg r e a t e r t h a n t h a t o f b i l i r u b i n . H o w e v e r , t h e s e r aR o s e n f e l d a n d S u r g e n o r u s e d c o n t a i n e d m o s t l yd i r e c t r e a c t i n g b i l i r u b i n a n d a d i f f e r e n t t y p e o fb i n d i n g h a s b e e n s u g g e s t e d f o r b i l i r u b i n g l u c u r o -n i d e ( 2 6 ) . T h e a u t h or h a s r e c e n t s p e c t r o p h o t o -m e t r i c d a t a s h o w i n g t h a t s a l i c y l a t e a n d s u l f o n a -m i d e s b e h a v e t o w a r d a l b u m i n - b o u n d h e m a t i n j u s ta s t h e y d o t o w a rd b i l i r u b i n b o u n d t o a l b u m i n , a n di n v i t r o , h e m a t i n a n d b i l i r u b i n i n t e r f e r e w i t h o n ea n o t h e r f o r p r o t e i n b i n d i n g ( 3 7 ) .

T h e c l i n i c a l p e r t i n e n c e o f t h e f i n d i n g s i n t h i sr e p o r t i s t o r e - e m p h a s i z e t h a t many o r g a n i c i o n sa r e b o u n d t o s e r u m a l b u m i n a n d ma y c o m p e t ew i t h o n e a n o t h e r . T h e d a t a p r e s e n t e d a n d t h es t u d i e s o f B r o w n , Z u e l z e r a n d R o b i n s o n ( 4 4 )d e m o n s t r a t e t h a t t h e s e r u m b i l i r u b i n c o n c e n -t r a t i o n d o e s n o t n e c e s s a r i l y r e f l e c t t h e d i f f u s i b l e o rt o t a l b o d y b i l i r u b i n .A l t h o u g h a v a l u e f o r a d i s s o c i a t i o n c o n s t a n t ( o rc o n s t a n t s ) o f p r o t e i n - b o u n d b i l i r u b i n i s n o t e x -a c t l y k n o w n , i t s v a l u e i s o b v i o u s l y s m a l l . H e n c e ,a s m a l l a b s o l u t e i n c r e a s e i n d i f f u s i b l e b i l i r u b i nw o u l d r e p r e s e n t a v e r y l a r g e p e r c e n t a g e c h a n g e .T h e r e f o r e , u n c o u p l i n g o f p r o t e i n - b o u n d b i l i r u b i nb y o r g a n i c a n i o n s w o u l d p r o d u c e a l a r g e r e l a t i v ec h a n g e i n t h e d i f f u s i b l e b i l i r u b i n . T h i s i n c r e a s ec o u l d s h i f t t h e d i f f u s i o n g r a d i e n t o f b i l i r u b i n a n dp r o m o t e i t s d i f f u s i o n o u t o f e x t r a c e l l u l a r f l u i d si n t o c e l l c y t o p l a s m . A d m i n i s t e r e d s u l f i s o x a z o l e , b yi t s i n t e r f e r e n c e w i t h p r o t e i n b i n d i n g o f b i l i r u b i n ,

may p r e v e n t a c c u m u l a t i o n o f b i l i r u b i n i n s e r u mt h u s f o r c i n g i t t o r e m a i n u n b o u n d o r l o o s e l y b o u n dt o o t h e r t i s s u e p r o t e i n s i n r e l a t i v e l y h i g h e r c o n -c e n t r a t i o n s i n e x t r a v a s c u l a r p h a s e s o f b o d y f l u i d s .T h i s w o u l d p r o m o t e g r e a t e r o p p o r t u n i t y f o r f i l -t r a t i o n a n d d i f f u s i o n t h r o u g h c e l l m e m b r a n e s . I ft h e b i l i r u b i n c a n n o t c o n c e n t r a t e i n t h e v a s c u l a rs p a c e a t t a c h e d t o s e r u m p r o t e i n s , t h e p l a s m a b i l i -r u b i n c o n c e n t r a t i o n w i l l b e l o w a n d w i l l b e c o m er e l a t i v e l y m i s l e a d i n g i n t h e m a n a g e m e n t o f h y p e r -b i l i r u b i n e m i a i n t h e n e o n a t e . T h e r e p o r t s o f k e r -n i c t e r u s i n p r e m a t u r e i n f a n t s g i v e n s u l f i s o x a z o l ewho h a d l ow s e r u m b i l i r u b i n s f i t t h i s c o n c e p t ( 1 1 ,1 2 ) . A l s o , t h e r e p o r t s ( 8 , 9 o f i n f a n t s w i t hh i g h h e m e p i g m e n t c o n c e n t r a t i o n s w i t h n e u r o l o g i cs i g n s o f e a r l y k e r n i c t e r u s a n d r e l a t i v e l y l o w s e -rum b i l i r u b i n l e v e l s a r e c o n s i s t e n t w i t h m e t h e m a l -b u m i n i n t e r f e r i n g w i t h t h e b i l i r u b i n c o n c e n t r a t i n go n s e r u m p r o t e i n s . I n p r e m a t u r e b a b i e s l a r g e ra b s o l u t e a m o u n t s o f b i l i r u b i n ma y o c c u r i n t h ee x t r a v a s c u l a r b o d y f l u i d s w i t h o u t b e i n g r e f l e c t e db y h i g h s e r u m l e v e l s , b e c a u s e p r e m a t u r e i n f a n t sh a v e l o w e r s e r u m a l b u m i n c o n c e n t r a t i o n s t h a n f u l lt e r m i n f a n t s ( 4 5 ) a n d , t h e r e f o r e , t h e i r p l a s m aw o u l d b e c o m e s a t u r a t e d a t l o w e r b i l i r u b i n c o n -c e n t r a t i o n s .T h e a d d i t i o n a l i n f o r m a t i o n o f t h e r e l a t i v e s a t u -r a t i o n o f s e r u m p r o t e i n s w i t h b i l i r u b i n i s a l s o d e -s i r a b l e . A t e c h n i q u e s u c h a s t h a t r e p o r t e d i n t h ep r e s e n t s t u d i e s c o u l d b e a p p l i e d w h e r e t h e a m o u n to f o r g a n i c a n i o n n e c e s s a r y t o u n c o u p l e , p r o t e i n -b o u n d b i l i r u b i n w o u l d b e a m e a s u r e o f t h e r e l a -t i v e s a t u r a t i o n o f s e r u m p r o t e i n s a n d , i n d i r e c t l y ,a m e a s u r e o f d i f f u s i b l e b i l i r u b i n . T h i s t y p e o f d e -t e r m i n a t i o n , c o u p l e d w i t h a k n o w l e d g e o f t h e t o t a la l b u m i n c o n c e n t r a t i o n , may g i v e a m o r e p r e c i s ea p p r o a c h t o t h e t h e r a p y o f h y p e r b i l i r u b i n e m i aa n d e x p l a i n s o m e o f t h e e x c e p t i o n s t o t h e c o n c e p tt h a t p r e v e n t i o n o f k e r n i c t e r u s d e p e n d s u p o n k e e p -i n g t h e s e r u m b i l i r u b i n b e l o w a c o n c e n t r a t i o n o f1 8 t o 2 0 m g . p e r c e n t d u r i n g t h e f i r s t 7 2 h o u r s o fl i f e .T h e f a c t t h a t s a l i c y l a t e i s r a r e l y u s e d i n t h e n e o -n a t e h a s b e e n f o r t u n a t e . Many i n f a n t s h a v e r e -c e i v e d s u l f a d i a z i n e , b u t t h e c o n c e n t r a t i o n s , a sf o u n d i n t h e p r e s e n t s t u d y , w h i c h w e r e r e q u i r e d t oi n t e r f e r e w i t h p r o t e i n b i n d i n g o f b i l i r u b i n i n v i t r o ,w e r e c o n s i d e r a b l y h i g h e r t h a n t h o s e p r o b a b l y o bt a i n e d c l i n i c a l l y a n d c o n s e q u e n t l y w o u l d n o t e n -h a n c e t h e d e v e l o p m e n t o f k e r n i c t e r u s .

8 3 1


10/11

GERARD B . ODELLSUMMARY

T h e p r o t e i n b i n d i n g o f b i l i r u b i n h a s b e e n s t u d -i e d b y s p e c t r o p h o t o m e t r y , u l t r a f i l t r a t i o n a n d d i a l y -s i s . I t was d e m o n s t r a t e d t h a t t h e o r g a n i c a n i o n s ,s a l i c y l a t e a n d s u l f i s o x a z o l e , c o u l d u n c o u p l e pro-t e i n - b o u n d b i l i r u b i n a n d t h e r e b y a l l o w i t s p a s s a g et h r ou g h s e m i p e r me a b l e m e m b r a n e s f r e e f r o m pro-t e i n . T h e c o n c e n t r a t i o n s o f a n i o n necessary t op r o d u c e t h i s e f f e c t were w i t h i n t h e ranges o b s e r v e di n c l i n i c a l m e d i c i n e . S u l f a d i a z i n e a n d s u l f a n i l i ca c i d w e r e a l s o c a p a b l e o f d i s p l a c i n g p r o t e i n - b o u n db i l i r u b i n b u t r e q u i r e d h i g h e r m o l a r c o n c e n t r a t i o n s .T h e d i s p l a c e m e n t o f t h e p r o t e i n - b o u n d b i l i r u b i ni n t h e presence o f d i f f e r e n t a n i o n c o n c e n t r a t i o n swas o b s e r v e d t o s h o w q u a l i t a t i v e s i m i l a r i t i e s t o t h ec h e m i c a l l a w s o f m a s s a c t i o n o f two a n i o n s com-p e t i n g f o r a common l o c u s on t h e a l b u m i nm o l e c u l e .T h e i m p o r t a n c e o f v a r i a t i o n s i n p r o t e i n b i n d i n ga n d o f d i f f u s i b l e r a t h e r t h a n t o t a l b i l i r u b i n wase m p h a s i z e d i n t h e p a t h o g e n e s i s o f k e r n i c t e r u s .

REFERENCES1 . Z i m m e r m a n , H . M . , a n d Y a n n e t , H . K e r n i k t e r u s ,

j a u n d i c e o f t h e n u c l e a r ma s ses o f t h e b r a i n . A m e r .J . D i s . C h i l d . 1 9 3 3 , 4 5 , 7 4 0 .2 . M o l l i s o n , P . L . , a n d C u t b u s h , M. H a e m o l y t i c d i s -ease o f t h e n e w b o r n ; c r i t e r i a o f s e v e r i t y . B r i t .med. J . 1 9 4 9 , 1 , 1 2 3 .

3 . H s i a , D . Y . , A l l e n , F . H . , J r . , G e l l i s , S . S . , a n dD i a m o n d , L K . E r y t h r o b l a s t o s i s f e t a l i s . V I I .S t u d i e s o f s e r u m b i l i r u b i n i n r e l a t i on t o k e rn i c t e ru s .N ew E n g l . J . M e d . 1 9 5 2 , 2 4 7 , 6 6 8 .4 . C l a i r e a u x , A . E . , C o l e , P . G . , a n d L a t h e , G . H. I c -t e r u s o f b r a i n i n n e w b o r n . L a n c e t 1 9 5 3 , i i , 1 2 2 6 .

5 . W a t e r s , W. J . , R i c h e r t , D . A . , and R a w s o n , H. H.B i l i r u b i n e n c e p h a l o p a t h y . P e d i a t r i c s 1 9 5 4 , 1 3 , 3 1 9 .6 . D a y , R . L I n h i b i t i o n o f b r a i n r e s p i r a t i o n i ns i t r o b y b i l i r u b i n . R e v e r s a l o f i n h i b i t i o n b y v a r i -

ous m e a n s . P r o c . S o c . e x p . B i o l . N . Y . 1 9 5 4 ,8 5 , 2 6 1 .

7 . Z e t t e r s t r 6 m , R . , a n d E r n s t e r , L . B i l i r u b i n , an u n -c o u p l e r o f o x i d a t i v e p h o s p h o r y l a t i o n i n i s o l a t e dm i t o c h o n d r i a . N a t u r e 1 9 5 6 , 1 7 8 , 1 3 3 5 .

8 . A b e l s o n , N . M . , a n d B o g g s , T . R . , J r . Plasma p i g -m e n t s i n e r y t h r o b l a s t o s i s f e t a l i s . I . S p e c t r o p h o t o -m e t r i c a b s o r p t i o n p a t t e r n s . P e d i a t r i c s 1 9 5 6 , 1 7 ,4 5 2 .

9 . T u t t l e , A . H . Serum p i g m e n t s t u d i e s i n newborni n f a n t s . I . E r y t h r o b l a s t o s i s f e t a l i s . J . D i s . C h i l d .1 9 5 5 , 8 9 , 5 4 4 .1 0 . C r o s s e , V . M . , M e y e r , T . C . , and G e r r a r d , J . W.K e r n i c t e r u s a n d p r e m a t u r i t y . A r c h . D i s. C hi l d .1 9 5 5 , 3 0 , 5 0 1 .

1 1 . S i l v e r m a n , W. A . , A n d e r s e n , D . H . , B l a n c , W. A . ,a n d C r o z i e r , D . N . A d i f f e r e n c e i n m o r t a l i t y r a t ea n d i n c i d e n c e o f k e r n i c t e r u s among p r e m a t u r ei n f a n t s a l l o t t e d t o t w o p r o p h y l a c t i c a n t i b a c t e r i a lr e g i m e n s . P e d i a t r i c s 1 9 5 6 , 1 8 , 6 1 4 .1 2 . H a r r i s , R . C . , L u c e y , J . F . , a n d M a c L e a n , J . R .K e r n i c t e r u s i n p r e m a t u r e i n f a n t s a s s o c i a t e d w i t hl o w c o n c e n t r a t i o n s o f b i l i r u b i n i n t h e p l a s m a . P e d i -a t r i c s 1 9 5 8 , 2 1 , 8 7 5 .1 3 . J o h n s o n , L . M . C o n s c i o u s n e s s a n d t h e c h e m i c a l e n -v i r o n m e n t o f t h e b r a i n . R e p o r t o f t h e T w e n t y - F i f t hR o s s P e d i a t r i c s R e s e a r c h C o n f e r e n c e , M a r c h , 1 9 5 7 ,1 0 0 .1 4 . C o h n , E . J . T h e c h e m i c a l s p e c i f i c i t y o f t h e i n t e r a c -t i o n o f d i v e r s e h u m a n p l a s m a p r o t e i n s . B l o o d1 9 4 8 , 3 , 4 7 1 .1 5 . N a j j a r , V . A . , a n d C h i l d s , B . C r y s t a l l i z a t i o n a n dp r o p e r t i e s o f s e r u m b i l i r u b i n . J . b i o l . C h e m . 1 9 5 3 ,2 0 4 , 3 5 9 .1 6 . G r a y , C . H . , a n d K e k w i c k , R . A . B i l i r u b i n - s e r u mp r o t e i n c o m p l e x e s a n d t h e v a n d e n B e r g h r e a c t i o n .N a t u r e 1 9 4 8 , 1 6 1 , 2 7 4 .1 7 . K l a t s k i n , G . , a n d B u n g a r d s , L . B i l i r u b i n - p r o t e i nl i n k a g e s i n s e r u m a n d t h e i r r e l a t i o n s h i p t o t h e v a nd e n B e r g h r e a c t i o n . J . c l i n . I n v e s t . 1 9 5 6 , 3 5 , 5 3 7 .1 8 . B o u r r i l l o n , R I s o l e m e n t e t p r o p r i e t e s d u c om p l e x eb i l i r u b i n e - s e r u m a l b u m i ne d u s e r u m . B u l l . S o c .C h i m . b i o l . ( P a r i s ) 1 9 5 7 , 3 9 , 3 8 5 .1 9 . M a r t i n , N . H . P r e p a r a t i o n a n d p r o p e r t i e s o f s e r u ma n d p l a s m a p r o t e i n s . X X I . I n t e r a c t i o n s w i t h b i l i -r u b i n . J . A m e r . c h e m . S o c . 1 9 4 9 , 7 1 , 1 2 3 0 .2 0 . P e d e r s e n , K . O . , a n d W a l d e n s t r 6 m , J . S t u d i e n u b e rd a s B i l i r u b i n i n B l u t u n d G a l l e m i t H i l f e v o nE l e k t r o p h o r e s e u n d U l t r a z e n t r i f u g i e r u n g . H o p p e -S e y l e r ' s Z . p h y s i o l . C h e m . 1 9 3 7 , 2 4 5 , 1 5 2 .2 1 . F o r r a i , E . , a n d S i v o , R P h y s i k a l i s c h - c h e m i s c h eE i g e n s c h a f t e n d e s B i l i r u b i n s i n K 6 r p e r f l u s s i g k e i t e n .B i o c h e m . Z . 1 9 2 7 , 1 8 9 , 1 6 2 .2 2 . G r e g o r y , R . L . , a n d A n d e r s c h , M . T h e f i l t e r a b i l i t y o fb i l i r u b i n i n o b s t r u c t i v e j a u n d i c e . J . L a b . c l i n .M e d . 1 9 3 7 , 2 2 , 1 1 1 1 .2 3 . S n a p p e r , I . , a n d B e n d i e n , W. M . On t h e p h y s i c o -c h e m i c a l c o n d i t i o n o f t h e b i l i r u b i n i n t h e b l o o d s e -r u m a n d u r i n e . A c t a m e d . s c a n d . 1 9 3 8 , 9 8 , 7 7 .2 4 . C o o l i d g e , T . B . C h e m i s t r y o f t h e v a n d e n B e r g hr e a c t i o n . J . b i o l . C h e m . 1 9 4 0 , 1 3 2 , 1 1 9 .2 5 . B a r a c , G . I n t e r a c t i o n s o f b i l i r u b i n w i t h p l a s m ap r o t e i n s , a n d t h e s t a t e o f b i l i r u b i n i n n o r m a l h u -ma n p l a s m a . A r c h . i n t . P h y s i o l . 1 9 5 3 , 6 1 , 1 2 9 .2 6 . C h i l d s , B . T h e n a t u r e o f d i r e c t b i l i r u b i n . B u l l .J o h n s H o p k . H o s p . 1 9 5 5 , 9 7 , 3 3 3 .

2 7 . K l o t z , I . M . P r o t e i n i n t e r a c t i o n s i n T h e P r o t e i n s ,V o l . I B , H . N e u r a t h a n d K . B a i l e y , E d s . NewY o r k , A c a d e m i c P r e s s I n c . , 1 9 5 3 , p . 7 2 7 .2 8 . R o s e n f e l d , M . , a n d S u r g e n o r , D . M . T h e h e m a t i n -b i n d i n g r e a c t i o n a s a b a s i s f o r s e r u m a l b u m i n d e -t e r m i n a t i o n . J . b i o l . C h e m . 1 9 5 3 , 1 9 9 , 9 1 1 .2 9 . W e s t p h a l , U . , a n d G e d i g k , P . A z o r u b i n - b i n d i n g c a -p a c i t y o f n o r m a l a n d p a t h o l o g i c a l s e r a . P r o c . S o c .e x p . B i o l . N . Y . ) 1 9 5 1 , 7 6 , 838.

8 3 2


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1959 studies in kernicterus the protein binding of bilirubin

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