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L I P I D PRODUCTION BY A S O I L YEASTROBERT L . STARKEY'

New J e r s e y A g r i c u l t u r a l E x p e r i m e n t S t a t i o n , R u t g e r s U n i v e r s i t y , New B r u n s w i c k , New J e r s e yR e c e i v e d f o r p u b l i c a t i o n A u g u s t 3 0 , 1 9 4 5

I t h a s b e e n w e l l e s t a b l i s h e d t h a t f a t t y s u b s t a n c e s a r e p r o d u c e d b y v a r i o u sm i c r o o r g a n i s m s , n o t a b l y b y c e r t a i n y e a s t s a n d f i l a m e n t o u s f u n g i a s w e l l a s b yt h e t u b e r c l e b a c i l l i a n d a s p e c i e s o f A z o t o b a c t e r . T h e t u b e r c l e b a c i l l i a n d o t h e ra c i d - f a s t b a c t e r i a c o n t a i n f r o m 2 0 t o 4 0 p e r c e n t l i p i d o n t h e d r y - w e i g h t b a s i s( A n d e r s o n , 1 9 3 9 ) . E v e n s o m e o f t h e c o m m o n n o n - a c i d - f a s t b a c t e r i a may c o n -t a i n c o n s i d e r a b l e a m o u n t s o f l i p i d . E s c h e r i c h i a c o l i , S t a p h y l o c o c c u s a l b u s , a n dB a c i l l u s m e g a t h e r i u m w e r e f o u n d t o c o n t a i n f r o m 8 t o 4 0 p e r c e n t l i p i d w h e ng r o w n o n c e r t a i n m e d i a ( L a r s o n a n d L a r s o n , 1 9 2 2 ) . M o r e c o m m o n l y , h o w e v e r ,t h e l i p i d c o n t e n t o f b a c t e r i a h a s b e e n r e p o r t e d t o b e b e l o w 1 0 p e r c e n t . T h er e s u l t s o f G o r b a c h a n d S a b l a t n o g ( 1 9 3 4 a , 1 9 3 4 b ) may b e c i t e d i n t h i s c o n n e c t i o n .T h e y f o u n d t h a t w h e r e a s t h e l i p i d c o n t e n t o f P s e u d o m o n a s a e r u g i n o s a w a s 0 . 6p e r c e n t w h e n g r o w n o n m e a t e x t r a c t a g a r a t pH 7 . 0 , t h e r e w a s a s m u c h a s3 . 9 p e r c e n t l i p i d w h e n t h e o r g a n i s m w a s c u l t i v a t e d o n m a n n i t o l . A n d e r s o n( 1 9 3 9 ) r e p o r t e d 2 t o 6 p e r c e n t l i p i d i n c e l l s o f P h y t p m o n a s t u m e f a c i e n s a n d 7 p e rc e n t i n L a c t o b a c i l l u s a c i d o p h i l u s .Among t h e b a c t e r i a , A z o t o b a c t e r i n d i c u m i s u n i q u e i n l i p i d p r o d u c t i o n ( S t a r k e ya n d D e , 1 9 3 9 ) . T h e c e l l s o f t h i s b a c t e r i u m c o m m o n l y c o n t a i n t w o l a r g e f a tg l o b u l e s , o n e a t e a c h e n d o f t h e r o d - s h a p e d c e l l s , a n d a s m u c h a s 5 0 p e r c e n to f t h e c e l l v o l u m e i s o c c u p i e d b y t h e f a t g l o b u l e s .T h e l i p i d c o n t e n t o f f i l a m e n t o u s f u n g i r a n g e s b e t w e e n 1 a n d 4 0 p e r c e n t , a n dd i f f e r s w i t h t h e v a r i o u s c u l t u r e s a n d t h e c o n d i t i o n s u n d e r w h i c h t h e y a r e g r o w n .( P r u e s s , E i c h i n g e r , a n d P e t e r s o n , 1 9 3 4 ; P r e s c o t t a n d D u n n , 1 9 4 0 ; B l o o r , 1 9 4 3 ) .T h e l i p i d c o n t e n t o f 2 4 f i l a m e n t o u s f u n g i s t u d i e d b y P r u e s s a n d S t r o n g ( 1 9 3 3 )w a s f r o m 1 t o 2 5 p e r c e n t w i t h a n a v e r a g e b e t w e e n 6 a n d 9 p e r c e n t . W a r d ,L o c k w o o d , M a y , a n d H e r r i c k ( 1 9 3 5 ) d e t e r m i n e d t h e l i p i d c o n t e n t o f 6 1 f u n g ia n d r e p o r t e d t h a t s i x o f t h e f u n g i c o n t a i n e d o v e r 2 0 p e r c e n t l i p i d . U n d e rf a v o r a b l e c o n d i t i o n s o f c u l t i v a t i o n , P e n i c i l l i u m j a v a n i c u m w a s f o u n d t o c o n t a i na s m u c h a s 4 1 . 5 p e r c e n t . L a r g e a m o u n t s o f l i p i d w e r e p r o d u c e d b y s p e c i e s o fO o s p o r a W a l l r o t h w h e n g r o w n o n m i l k , a n d t h e r e s u l t s o f G e f f e r s ( 1 9 3 7 ) i n d i c a t et h a t t h i s o r g a n i s m c a n b e u s e d t o s y n t h e s i z e f a t f r o m m i l k w a s t e s . U p t o 5 0 p e rc e n t o f t h e m y c e l i u m c o u l d b e e x t r a c t e d w i t h f a t s o l v e n t s .A t t e n t i o n w a s f o c u s e d o n l i p i d p r o d u c t i o n b y y e a s t s a n d r e l a t e d o r g a n i s m st h r o u g h t h e r e s u l t s o f L i n d n e r a n d a s s o c i a t e s , who d e v e l o p e d a p r o c e s s f o r t h ep r o d u c t i o n o f f a t f r o m c a r b o h y d r a t e s b y E n d o m y c e s v e r n a l i s i n G e r m a n y d u r i n gW o r l d War I ( F i n k , H a e h n , a n d H o e r b u r g e r , 1 9 3 7 ; P r e s c o t t a n d D u n n , 1 9 4 0 ) .When c u l t i v a t e d u n d e r c o n d i t i o n s f a v o r a b l e f o r l i p i d p r o d u c t i o n , t h i s y e a s t c o n -

1 J o u r n a l S e r i e s P a p e r o f t h e Ne w J e r s e y A g r i c u l t u r a l E x p e r i m e n t S t a t i o n , R u t g e r sU n i v e r s i t y , D e p a r t m e n t o f M i c r o b i o l o g y . 3 3

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ROBERT L . STARKEYt a i n e d a s m u c h a s 4 4 . 7 p e r c e n t l i p i d ; b u t w h e n c u l t i v a t e d o n a p r o d u c t i o n s c a l e ,t h e r e w a s a b o u t 2 0 p e r c e n t l i p i d . H e i d e ( 1 9 3 9 ) , w h o r e c e n t l y s t u d i e d t h ei n f l u e n c e o f m e d i u m c o m p o s i t i o n o n l i p i d p r o d u c t i o n b y E n d o m y c e 8 v e r n a l l i s ,f o u n d a s m u c h a s 4 2 p e r c e n t l i p i d i n t h e c e l l s u n d e r c o n d i t i o n s f a v o r a b l e f o rl i p i d a c c u m u l a t i o n .S e v e r a l y e a s t s w e r e s t u d i e d b y R i p p e l ( 1 9 4 3 ) f o r l i p i d p r o d u c t i o n , a m o n g w h i c hw a s N e c t a r o m y c e s r e u k a u f i i , w h i c h p r o d u c e d 1 0 t o 1 5 g o f l i p i d f o r e a c h 1 0 0 g o fc a r b o h y d r a t e d e c o m p o s e d .T h e r e s u l t s o f H e i d e ( 1 9 3 9 ) a n d o t h e r s ( B i c h k o v s k a y a , 1 9 3 9 ; P r e s c o t t a n dD u n n , 1 9 4 0 ; R a a f , 1 9 4 1 - 1 9 4 2 ; R i p p e l , 1 9 4 3 ) i n d i c a t e t h a t c o n d i t i o n s f a v o r a b l ef o r maximum l i p i d c o n t e n t o f y e a s t a r e n o t t h o s e g i v i n g t h e maximum c o n v e r s i o no f t h e c a r b o n s o u r c e o f t h e s u b s t r a t e t o l i p i d . C e l l s g r o w n i n m e d i a r i c h i nn i t r o g e n g i v e h i g h y i e l d s , b u t t h e i r l i p i d c o n t e n t i s l o w ; m e d i a d e f i c i e n t i nn i t r o g e n g i v e l o w y i e l d s o f c e l l m a t e r i a l , b u t t h e c e l l s c o n t a i n a n a b u n d a n c e o fl i p i d . A s s t a t e d b y S m e d l e y - M a c L e a n ( 1 9 2 2 ) , t h e r e i s g e n e r a l l y a n i n v e r s er e l a t i o n s h i p b e t w e e n t h e q u a n t i t y o f y e a s t c e l l s p r o d u c e d o n v a r i o u s m e d i a a n dt h e p e r c e n t a g e o f l i p i d i n t h e c e l l s .T h e r e l a t i v e c o n c e n t r a t i o n s o f c a r b o h y d r a t e a n d n i t r o g e n o u s m a t e r i a l s i n t h em e d i a m u s t t h e r e f o r e b e c a r e f u l l y b a l a n c e d t o o b t a i n t h e m a x i m u m y i e l d o fl i p i d . Among t h e o t h e r f a c t o r s a f f e c t i n g l i p i d p r o d u c t i o n a r e t h e r e a c t i o n o ft h e m e d i u m , p h o s p h a t e c o n o e n t r a t i o n , d e g r e e o f a e r a t i o n , n a t u r e o f t h e c a r b o ns o u r c e , a n d t h e p r e s e n c e o f c e r t a i n m e t a l l i c i o n s . N o t o n l y a r e t h e r e g r e a td i f f e r e n c e s i n t h e p o t e n t i a l i t i e s o f d i f f e r e n t m i c r o o r g a n i s m s f o r l i p i d p r o d u c t i o nb u t t h e c o m p o s i t i o n o f t h e m e d i u m a n d t h e e n v i r o n m e n t a l c o n d i t i o n s l i k e w i s eh a v e a p r o f o u n d e f f e c t o n l i p i d p r o d u c t i o n b y a n y o n e c u l t u r e . T h e s u b s t r a t e sw h i c h h a v e b e e n p r o p o s e d f o r l i p i d p r o d u c t i o n b y y e a s t s a n d f i l a m e n t o u s f u n g ii n c l u d e m i l k w a s t e , m o l a s s e s , w a s t e s u l f i t e l i q u o r , c e l l u l o s e w a s t e , a n d h y d r o -l y z e d w o o d .M e t h o d s h a v e a l s o b e e n d e v e l o p e d f o r t h e p r o d u c t i o n o f y e a s t a s a s o u r c e o fp r o t e i n . T h e y e a s t i s c u l t i v a t e d i n m e d i a c o n t a i n i n g c a r b o h y d r a t e a n d s u p p l i e dw i t h n i t r o g e n f r o m ammonium s a l t s . T h a y s e n ( 1 9 4 3 ) a n d T h a y s e n a n d M o r r i s( 1 9 4 3 ) r e c e n t l y r e p o r t e d r e s u l t s o f s t u d i e s w i t h T o r u l o p s i s u t i l i s f r o m w h i c h i tw a s c o n c l u d e d t h a t t h i s " f o o d y e a s t " w h i c h w a s r i c h i n p r o t e i n a n d v i t a m i n sc o u l d b e p r o d u c e d v e r y e c o n o m i c a l l y ( G o r t n e r a n d G u n d e r s o n , 1 9 4 4 ) . Ne ws t r a i n s w e r e d e v e l o p e d w h i c h g r e w w e l l a t r e l a t i v e l y h i g h t e m p e r a t u r e s a n d p r o -d u c e d c e l l s l a r g e r t h a n t h e o r i g i n a l s t r a i n s , t h u s f a c i l i t a t i n g p r o d u c t i o n a n dp r o c e s s i n g .

EXPERIMENTALT h e y e a s t w i t h w h i c h t h i s r e p o r t i s c o n c e r n e d w a s e n c o u n t e r e d d u r i n g s t u d i e so f t h e n i t r o g e n - f i x i n g p o p u l a t i o n o f s o i l s a n d h a s b e e n r e c o v e r e d f r o m s o i l sp e r i o d i c a l l y s i n c e 1 9 3 5 . 2 T h e y e a s t c u l t u r e s w e r e o b t a i n e d f r o m c o l o n i e s w h i c hd e v e l o p e d o n a " n i t r o g e n - f r e e " a g a r m e d i u m h a v i n g t h e f o l l o w i n g c o m p o s i t i o n :

g l u c o s e , 1 5 g ; K 2 H P 0 4 , 0 . 8 g ; K H 2 P O 4 , 0 . 2 g ; M g S O 4 - 7 H 2 0 , 0 . 2 g ; N a C l , 0 . 2 g ;2 A p r e l i m i n a r y r e p o r t w a s p r e s e n t e d b e f o r e t h e T h e o b a l d S m i t h S o c i e t y ( S t a r k e y , 1 9 4 4 ) .

3 4

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LIPID PRODUCTION BY A SOIL YEAST

C a C l 2 2 H 2 0 , 0 . 0 5 g ; Na2MoO4 2 H 2 0 , 0 . 0 0 0 5 g ; MnSO4 2 H 2 0 , 0 . 0 0 0 5 g ;Na2WO4 2 H 2 0 , 0 . 0 0 0 5 g ; F e S O 4 7 H 2 0 , 0 . 0 2 5 g ; a g a r , 1 5 . 0 g ; a n d d i s t i l l e d w a t e r ,1 , 0 0 0 m l . A s m a l l a m o u n t o f t h e s o i l b e i n g t e s t e d w a s s c a t t e r e d o v e r t h e s u r f a c eo f p l a t e s o f t h e s o l i d i f i e d a g a r medium a n d i n c u b a t e d a t 2 8 C . T h e comm o nt y p e s o f A z o t o b a c t e r , i f p r e s e n t , u s u a l l y d e v e l o p e d w i t h i n 2 t o 3 d a y s a n d w e r ec h a r a c t e r i z e d b y t h e i r g l i s t e n i n g , s o f t , s m o o t h , r a i s e d c o l o n i e s . W h e n t h e i n c u -b a t i o n p e r i o d w a s p r o l o n g e d t o f r o m 7 t o 1 0 d a y s , o t h e r c o l o n i e s a p p e a r e d w h i c hr e s e m b l e d t h o s e o f A z o t o b a c t e r . T h e y w e r e r a i s e d a n d g l i s t e n i n g a n d h a d t h ea p p e a r a n c e o f v e r y t h i n s t a r c h p a s t e . T h e y w e r e w a t e r y , t e n d e d t o s p r e a d , a n ds o m e t i m e s c o a l e s c e d , f o r m i n g a t h i n w a t e r y f i l m o v e r a c o n s i d e r a b l e p o r t i o n o ft h e p l a t e . W h e n e x a m i n e d u n d e r t h e m i c r o s c o p e , t h i s m a t e r i a l w a s f o u n d t oc o n t a i n l a r g e , n e a r l y s p h e r i c a l c e l l s a p p r o x i m a t e l y 8 , i n d i a m e t e r s u s p e n d e di n t h i n s l i m e . S o m e o f t h e c e l l s h a d a s i n g l e s m a l l e r s p h e r i c a l b u d , b u t t h e r ew a s n o t e n d e n c y t o w a r d t h e f o r m a t i o n o f l a r g e a g g r e g a t e s . E a c h o f t h e c e l l sw as f o u n d t o c o n t a i n a l a r g e , h i g h l v r e f r a c t i v e g l o b u l e w h i c h n e a r l y f i l l e d t h e c e l l( f i g u r e s 1 , 2 , a n d 3 ) .

T h e w a t e r y , s p r e a d i n g c o l o n i e s w v e r e c o n s i s t e n t l y o b t a i n e d f r o m v a r i o u s s o i l si n c l u d i n g t h o s e f r o m c u l t i v a t e d a n d u n c u l t i v a t e d f i e l d s , f r o m p a s t u r e s , w a s t el a n d , a n d w o o d l a n d . T h e s o i l s v a r i e d i n r e a c t i o n f r o m pH 4 . 0 t o 7 . 5 . T h e c e l l sw h i c h c o m p o s e d t h e c o l o n i e s a l l h a d t h e s a m e a p p e a r a n c e a n d w e r e c h a r a c t e r i z e db y t h e p r e s e n c e o f l a r g e r e f r a c t i v e g l o b u l e s , o n e i n e a c h c e l l . T h e r e g u l a r i t yw i t h w h i c h t h e y e a s t w a s e n c o u n t e r e d s u g g e s t s t h a t t h e o r g a n i s m i s a common s o i li n h a b i t a n t .When i s o l a t e d i n p u r e c u l t u r e a n d c u l t i v a t e d o n s l a n t s o f t h e g l u c o s e , n i t r o g e n -f r e e , a g a r m e d i u m , t h e y e a s t c u l t u r e s c o n t i n u e d t o p r o d u c e l a r g e s p h e r i c a l c e l l s

n e a r l y f i l l e d w i t h t h e l a r g e r e f r a c t i v e g l o b u l e s . T h e c e l l m a t e r i a l h a d a w a t e r yc o n s i s t e n c y a n d t e n d e d t o s e t t l e t o t h e b a s e o f t h e s l a n t .T h e a p p e a r a n c e o f t h e g l o b u l e s u g g e s t e d t h a t i t w a s l i p i d , a n d t e s t s i n d i c a t e dt h a t t h i s w a s t h e c a s e . When t h e c e l l m a t e r i a l w a s t r e a t e d w i t h S u d a n I I I ,t h e g l o b u l e s s t a i n e d r e d , w h e r e a s t h e r e m a i n d e r o f t h e c e l l w a s c o l o r l e s s . T h el i p i d g l o b u l e s o f c e l l s w h i c h w e r e t r e a t e d w N i t h w arm d i l u t e a c i d t o h y d r o l y z e t h es l i m e s t a i n e d m o r e r e a d i l y . T h e f a c t t h a t l a r g e a m o u n t s o f f a t t y m a t e r i a l w e r eo b t a i n e d b y e x t r a c t i n g t h e c e l l s w i t h f a t s o l v e n t s , a s w e l l a s t h e f a c t t h a t t h ec e l l s n o l o n g e r b e c a m e c o l o r e d w i t h S u d a n I I I a f t e r t h e e x t r a c t i o n , p r o v e d t h a tt h e g l o b u l e s w e r e l i p i d .S p o r u l a t i o n . T h e y e a s t i s o f i n t e r e s t n o t o n l y b y r e a s o n o f i t s h i g h l i p i d c o n -

t e n t b u t b e c a u s e o f i t s u n u s u a l s p o r e f o r m a t i o n . T h e f o l l o w i n g s e q u e n c e o fc h a n g e s w a s o b s e r v e d w i t h c u l t u r e s d e v e l o p i n g i n a s s o c i a t i o n w i t h o t h e r m i c r o -o r g a n i s m s o n t h e g l u c o s e , n i t r o g e n - f r e e , a g a r m e d i u m w h i c h h a d b e e n i n o c u l a t e dw i t h s o i l . D u r i n g t h e f i r s t t w o w e e k s t h e c e l l s c o n s i s t e d e n t i r e l y o f t h e s p h e r i c a lc e l l s w i t h s p h e r i c a l b u d s , n e a r l y f i l l e d w i t h g l o b u l e s o f l i p i d . D u r i n g t h e n e x tf e w d a y s s o m e o f t h e y e a s t c e l l s p r o d u c e d b u d s o f a d i f f e r e n t t y p e . T h e y N v e r es h a p e d l i k e a s a c a n d c o n t a i n e d m a t e r i a l w h i c h h a d a g r a n u l a r a p p e a r a n c e i nc o n t r a s t t o t h e h o m o g e n e o u s , r e f r a c t i v e l i p i d g l o b u l e s i n t h e s p h e r i c a l b u d s( f i g u r e s 4 a n d 5 ) . I n a f e w more d a y s t h e g r a n u l a r s u b s t a n c e b e c a m e t r a n s -

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ROBERT L . STARKEY

y l Oa, . ' ' :

.. . K ............o aq.C0~~A 0~~JI.0 . 0

o ' n.. o c0 -

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F I G . 1 . CELLS F R O N I A COLONY ON A N I T R O G E N - F R E E , G L U C O S E , AGAR PLATE SEEDEDWITH S O I L

Each s p h e r i c a l c e l l i s n e a r l y f i l l e d w i t h a s i n g l e l a r g e f a t g l o b u l e . On e c e l l a t l o w e rr i g h t h a s a h a z y o u t l i n e c a u s e d b y t h e b r e a k i n g away o f an o u t e r c e l l membrane. C u l t u r ea g e 1 3 d a y s . M a g n i f i c a t i o n X 3 3 0 .F I G . 2 . CELLS OF A PURE CULTURE OF STRAIN 7 2 GROWN ON G L U C O S E , NITROGEN-FREE AGAR

T h e r e i s a f a i r - s i z e d s i n g l e f a t g l o b u l e i n e a c h c e l l . C u l t u r e a g e 6 d a y s . M a g n i f i c a -tion X330. F I G . 3 . CELLS OF A PURE CULTURE OF S T R A I N 7 2

T y p i c a l s p h e r i c a l c e l l s e a c h n e a r l y f i l l e d w i t h a s i n g l e f a t g l o b u l e . C u l t u r e grown onn i t r o g e n - d e f i c i e n t a e r a t e d s o l u t i o n medi u m. Th e c e l l s were taken from one o f t h e a e r a t e ds o l u t i o n s u s e d f o r t e s t s o f f a t p r o d u c t i o n b y t h e y e a s t . Culture a g e 2 0 d a y s . M a g n i f i -c a t i o n X 3 3 0 .

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L I P I D PRODUCTION BY A SOIL Y E A S I s

f o r m e d i n t o a s c o s p o r e s ( f i g u r e s 6 , 7 , 8 , a n d 9 ) . T h e a s c u s r e m a i n e d a t t a c h e d t ot h e p a r e n t c e l l e v e n a f t e r s p o r e f o r m a t i o n w a s c o m p l e t e d , a n d a d d i t i o n a l v e g e t a -t i v T e b u d s w e r e f r e q u e n t l y s e e n a t t a c h e d t o t h e p a r e n t c e l l . I n s o m e c a s e s t h ep a r e n t c e l l b o r e m o r e t h a n o n e a s c u s . I n n o c a s e w a s t h e r e e v i d e n c e o f s p o r e sw i t h i n t h e p a r e n t c e l l . T h e g l o b u l e o f l i p i d p e r s i s t e d i n t h e p a r e n t c e l l t h r o u g h -o u t t h e p e r i o d o f s p o r e f o r m a t i o n , b u t i t h e c a m e r e d u c e d i n s i z e a s t h e i n c u b a t i o np e r i o d w a s p r o l o n g e d .Ma n y y e a s t s , t w o o f w h i c h w e r e c h a r a c t e r i z e d b y t h e p r e s e n c e o f l a r g e f a tg l o b u l e s , w e r e i s o l a t e d f r o m s o i l b y S t a r k e y a n d H e n r i c i ( 1 9 2 7 ) . T h e s e w e r ed e s c r i b e d a s N a d s o n i a f u l v e s c e n s a n d T o r u l a s p o r a s p . T h e d e s c r i p t i o n s o f t h e s ed o n o t c h a r a c t e r i z e t h e y e a s t u n d e r c o n s i d e r a t i o n .

S p o r e f o r m a t i o n h a s n o t b e e n o b s e r v e d w i t h p u r e c u l t u r e s g r o w n o n t h e g l u -c o s e , n i t r o g e n - f r e e , a g a r o r s i m i l a r m e d i a c o n t a i n i n g 0 . 0 1 p e r c e n t y e a s t e x t r a c t .T h e medium c o n t a i n i n g 0 . 0 1 p e r c e n t y e a s t e x t r a c t w a s s i m i l a r t o t h e m e d i u mf r o m w h i c h t h e v e a s t c u l t u t r e s w v e r e i s o l a t e d , b u t d i f f e r e d i n t h a t i t c o n t a i n e d n os o d i u m c h l o r i d e , y e a s t e x t r a c t , o r s a l t s o f m a n g a n e s e , m o l y b d e n u m , a n d t u n g s t e n .T h e m o d i f i e d m e d i u m w i t h 0 . 0 1 p e r c e n t y e a s t e x t r a c t i s t h e o n e s u b s e q u e n t l yd e s i g n a t e d a s t h e n i t r o g e n - d e f i c i e n t m e d i u m . S p o r e s w e r e p r o d u c e d , h o w e v e r ,o n s e v e r a l m e d i a . On t h e v e g e t a b l e i n f u s i o n a g a r o f M r a k , P h a f f , a n d D o u g l a s( 1 9 4 2 ) s p o r e s w e r e f i r s t n o t e d w i t h c u l t u r e s 1 4 d a y s o l d , a n d t h e a s c i b e c a m e m o r en u m e r o u s d u r i n g t h e i n c u b a t i o n p e r i o d o f 2 m o n t h s . No s p o r e s w e r e p r o d u c e db y c u l t t u r e s g r o w n i n a s o l u t i o n m e d i u m o f s i n m i l a r c o m p o s i t i o n . S p o r e s w e r ep i o d u i c e d b y c u l t t u r e s w h i c h w e r e h e a v i l y i n o c u l a t e d o n m e d i a u n f a v o r a b l e f o rg r o w t h , s u c h a s n i t r o g e n - d e f i c i e n t a g a r m e d i a i n w h i c h r h a m n o s e , l a c t o s e ,e t h a n o l , o i r g l y c e r o l w a s s u b s t i t u t e d f o r g l u c o s e . On t h e s e m e d i a t h e r e w a s n oa p p a r e n t g r o w t h i n s o m e c a s e s a n d p o o r g r o w t h i n o t h e r s , b u t s p o r e s w e r e p r o -d t u c e d . S p o r e s w e r e o b s e r v e d w i t h s o m e c u l t u r e s a f t e r 7 d a y s ' i n c u b a t i o n o nm e d i a c o n t a i n i n g r h a m n o s e , l a c t o s e , o r g l y c e r o l , a n d t h e r e w a s m o r e s p o r u l a t i o na f t e r 2 7 d a y s .

N i c k e r s o n a n d T h i m a n n ( 1 9 4 1 ) f o u n d t h a t m a t e r i a l p r o d u c e d b y A s p e r g i l l u sn i g e r o n m a l t e x t r a c t m e d i u m e n h a n c e d c o n j u g a t i o n a n d s p o r e f o r m a t i o n b yF I G . 4 . CELLS FROM A COLONY ON A N I T R O G E N - F R E E , G I L U C O S E , AGAR PLATE SEEDEDWITH S O I L

S e v e r a l o f t h e c e l l s s h o w s a c l i k e b u d s f i l l e d w i t h g r a n u l a r m a t e r i a l a n d a t t a c h e d t o t h ep a r e n t c e l l s , e a c h o f w h i c h i s n e a r l y f i l l e d w i t h a s i n g l e l a r g e f a t g l o b u l e . Some f a t - f i l l e dc e l l s f r e e f r o m b u d s . C u l t u r e a g e 1 7 d a y s . M l a g n i f i c a t i o n X 3 3 0 :

F I G . 5 . C E I , L S F R O N I TH E S A M I E CULTURE A S FIGURE 4Ma n y c e l l s s h o w s a c l i k e b u d s f i l l e d w i t h g r a n u l a r m a t e r i a l a n d a t t a c h e d t o t h e p a r e n tc e l l s , w h i c h h a v e l a r g e f a t g l o b u l e s . S o I m i e c e l l s h a v e 2 b u d s e a c h . C u l t u r e a g e 1 7 d a y s .M a g n i f i c a t i o n X 3 3 0 .F I G . 6 . CELLS F R O N I THE S A N I E COLONY ON N I T R O G E N - F R E E , G L U C O SE , AGAR PLATE SEEDEDWITH S O I I , AS THAT FROM WHICH CELLS OF FIGURES 4 AND 5 WERE OBTAINED

Th e c e l l s show a t r a n s i t i o n s t a g e i n s p o r e f o r m a t i o n . Some o f t h e s a c l i k e b u d s a r e f i l l e dw i t h g r a n u l a r m i a t e r i a l , w h e r e a s o t h e r b u d s c o n t a i n s p o r e s , u p t o 8 i n n u m b e r . C u l t u r ea g e 2 0 d a y s . M a g n i f i c a t i o n X 3 3 0 .F I G . 7 . S A M I E AS FIGURE 6

On e c e l l a t u p p e r r i g h t s h o w s an e l o n g a t e d a s c u s w i t h e i g h t e a s i l y d i s t i n g u i s h e d s p o r e s .A s c i a t t a c h e d t o o t h e r c e l l s s h o w v a r i o u s s t a g e s i n s p o r e f o r m a t i o n . C u l t u r e a g e 2 0 d a y s .M a g n i f i c a t i o n X 3 3 0 .

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ROBERT L . STA RKEY

c e r t a i n s p e c i e s o f Z y g o s a c c h a r o m y c e s . S i m i l a r m a t e r i a l w a s a d d e d t o g l u c o s e ,n i t r o g e n - d e f i c i e n t , s o l u t i o n m e d i a w h i c h w e r e i n o c u l a t e d w i t h t h e l i p i d - p r o d u c i n gy e a s t t o t e s t f o r s p o r e f o r m a t i o n . O t h e r s o l u t i o n m e d i a r e c e i v e d a d d i t i o n s o fm a l t e x t r a c t , y e a s t e x t r a c t , a n d g r a s s e x t r a c t . I n n o n e o f t h e s e s o l u t i o n s w a st h e r e e v i d e n c e o f s p o r e f o r m a t i o n e v e n a f t e r i n c u b a t i o n f o r s e v e r a l m o n t h s . I ns o m e c a s e s s o l u t i o n m e d i a s u p p o r t i n g g r o w t h o f t h e y e a s t w e r e i n o c u l a t e d w i t hc u l t u r e s o f A s p e r g i l l u s a n d P e n i c i l l i u m , b u t t h e a s s o c i a t i v e d e v e l o p m e n t o f t h ef u n g i f a i l e d t o r e s u l t i n s p o r e f o r m a t i o n b y t h e y e a s t .

S o m e s t r a i n s p r o d u c e d 4 s p o r e s i n e a c h a s c u s , w h e r e a s i n o t h e r s t r a i n s t h e r ew e r e a s m a n y a s 8 s p o r e s ( f i g u r e s 6 a n d 7 ) . O n e s t r a i n p r o d u c e d s t i l l l a r g e rn u m b e r s o f s p o r e s ( s t r a i n 7 4 ) . T h e v e g e t a t i v e c e l l s o f t h i s s t r a i n w e r e l a r g e rt h a n t h o s e o f t h e o t h e r s t r a i n s ; 1 6 o r more s p o r e s h a v e b e e n s e e n i n t h e a s c i ,a n d i t i s p r o b a b l e t h a t t h e n u m b e r was g r e a t e r t h a n t h i s , s i n c e i t w a s d i f f i c u l tt o d e t e r m i n e t h e e x a c t n u m b e r o f s p o r e s w h i c h were e n c l o s e d i n d e n s e a g g r e g a t e si n t h e a s c i ( f i g u r e s 1 0 , 1 1 , 1 2 , a n d 1 3 ) . T h e n u m b e r o f s p o r e s i n e a c h a s c u sv a r i e d a s t h e c o m p o s i t i o n o f t h e medium w a s c h a n g e d , b u t s t r a i n 7 4 g e n e r a l l yh a d l a r g e r n u m b e r s o f s p o r e s t h a n t h e o t h e r s t r a i n s w h i c h w N e r e s t u d i e d .

T h e s p o r e s h a d a l i g h t a m b e r c o l o r , a n d t h e a s c i s h o w e d s o m e c o n t r a s t i n c o l o rw i t h t h e v e g e t a t i v e c e l l s . T h e s p o r e s w e r e o v a l i n s h a p e a n d s m o o t h o n t h es u r f a c e , a n d h a d a s i z e o f 2 . 5 t o 3 . 3 x 3 . 6 t o 4 . 6 , u , w i t h an a v e r a g e o f 3 . 0 x 4 . 3 u .S i z e a n d s h a p e o f v e g e t a t i v e c e l l s . T h e v e g e t a t i v e c e l l s v a r i e d g r e a t l y i n s i z e ,b u t w h e n t h e c u l t u r e s w e r e g r o w n o n a n i t r o g e n - d e f i c i e n t , c a r b o h y d r a t e m e d i u mt h e f u l l y d e v e l o p e d c e l l s o f m o s t s t r a i n s h a d d i a m e t e r s o f 8 . 0 t o 9 . 5 , . O n es t r a i n ( n o . 7 4 ) c o n s i s t e n t l y p r o d u c e d l a r g e r c e l l s , w h i c h h a d d i a m e t e r s o f 9 . 8 t o1 0 . 5 t .

U n d e r c e r t a i n c u l t u r a l c o n d i t i o n s t h e c u l t u r e s p r o d u c e d c e l l s w h i c h w e r ev a r i a b l e i n s h a p e . W h e n c u l t i v a t e d o n m a l t e x t r a c t a g a r o r o n 2 p e r c e n t g l u c o s ea g a r c o n t a i n i n g 0 . 1 p e r c e n t ammoni u m s u l f a t e o r a s p a r a g i n e , t h e c e l l s w e r e l o wi n f a t c o n t e n t . D u r i n g t h e f i r s t f e w d a y s o f i n c u b a t i o n t h e c e l l s w e r e m o s t l ys p h e r i c a l , b u t l a t e r t h e y s h o w e d v a r i a t i o n . T h e y w e r e e l o n g a t e d a n d s w o l l e na n d v a r i e d g r e a t l y i n s i z e . On a l l m e d i a t h e c e l l s m u l t i p l i e d b y m u l t i p o l a rb u d d i n g . C e l l s o f c u l t u r e s g r o w n o n n i t r o g e n - d e f i c i e n t , c a r b o h y d r a t e m e d i ag e n e r a l l y h a d n o more t h a n o n e b u d . T h e b u d s f r e e l y s e p a r a t e d f r o m t h e c e l l sg r o w n i n t h e s e m e d i a , b u t o n m a l t e x t r a c t a g a r a n d o n a g a r m e d i a c o n t a i n i n gl a r g e r a m o u n t s o f n i t r o g e n t h e c e l l s f r e q u e n t l y o c c u r r e d i n c l u s t e r s .T h e c e l l s f r e q u e n t l y s h e d t h e i r o u t s i d e m e m b r a n e s . T h i s c o a t i n g s p l i t a n dw a s s h e d i n o n e p i e c e l i k e t h e c o a t i n g o n a b e a n s e e d , w i t h n o a p p a r e n t d e t e r i o r a -t i o n o f t h e c e l l ( f i g u r e 1 4 ) .

M y c e l i u m p r o d u c t i o n . T h e c u l t u r e s p r o d u c e d n o t y p i c a l m y c e l i u m a n d s h o w e dn o t e n d e n c y t o w a r d m y c e l i u m p r o d u c t i o n o n m o s t c a r b o h y d r a t e m e d i a . Somer u d i m e n t a r y p s e u d o m y c e l i u m w a s f o r m e d , h o w e v e r , i n o l d c u l t u r e s o n a g a r m e d i ac o n t a i n i n g r h a m n o s e , g l y c e r o l , o r m a n n i t o l . T h e r e w a s g o o d g r o w t h o n m a n -n i t o l b u t v e r y l i t t l e d e v e l o p m e n t o n t h e o t h e r t w v o m e d i a . T h e m y c e l i u m c o n -s i s t e d o f s h o r t , d i s t o r t e d , h y p h a l p r o j e c t i o n s f r o m t h e r o u n d c e l l s , a n d s o m e o ft h e s e s h o r t h y p h a e w e r e b r a n c h e d .

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/ ~ ~ ~ 9X 9I~~~~~~

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. . . . . . .s!.g. : ; .F I G . 8 . SAME AS FIGURE 6

On e c e l l i n t h e c e n t e r shows t h e i n i t i a l s t a g e o f l o s s o f t h e o u t e r c e l l me mb raneF I G . 9 . SAME AS FIGURE 6

F I G . 1 0 . OLD CELLS OF S T R A I N 7 4 GROWN ON A N I T R O G E N - D E F I C I E N T , AGAR MEDIUMCONTAINING 0 . 5 PER CENT ETHANOLMost o f t h e v e g e t a t i v e c e l l s h ad d e g e n e r a t e d . M a n y c e l l s show spores. On e c e l l a t

upper l e f t s h o w s many spores, 1 4 o f w h i c h can b e c o u n t e d . Some c e l l s s t i l l show p r e s e n c eo f f a t . C u l t u r e a g e 2 8 d a y s . M a g n i f i c a t i o n 3 3 0 .F I G . 1 1 . SAME AS FIGURE 1 0

Some o f t h e c e l l s c o n t a i n many sp or e sF I G . 1 2 . SAME AS FIGURE 1 0F I G . 1 3 . SAME AS FIGURE 1 0

F I G . 1 4 . C E L L S FROM A N I T R O G E N - F R E E , G L U C O S E , AGAR PLATEOn e c e l l a t l o w e r l e f t s h o w s a c a p - s h a p e d o u t e r m em br a n e b r e a k i n g away from t h e c e l l .C u l t u r e a g e 1 3 d a y s . M a g n i f i c a t i o n X 3 3 0 .

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ROBERT L . STARKEYT y p e o f g r o w t h o n a g a r a n d s o l u t i o n m e d i a . On g l u c o s e , n i t r o g e n - f r e e a g a r t h e

o r g a n i s m g r e w s l o w l y a n d p r o d u c e d g l i s t e n i n g , w h i t e , w a t e r y s l i m e r e s e m b l i n gt h i n s t a r c h p a s t e . On a s i m i l a r m e d i u m c o n t a i n i n g 0 . 0 1 p e r c e n t y e a s t e x t r a c tt h e c u l t u r e s g r e w m o r e r a p i d l y a n d p r o d u c e d m o r e c e l l m a t e r i a l . On 2 . 5 p e rc e n t m a l t e x t r a c t a g a r t h e r e w a s a b u n d a n t b r o w n i s h - g r a y , r a i s e d , s p r e a d i n g ,s l i m y g r o w t h . On t h e p l a n t i n f u s i o n a g a r o f Mrak e t a l . ( 1 9 4 2 ) t h e c u l t u r e sg r e w v e r y r a p i d l y a n d p r o d u c e d d a r k b r o w n , m o i s t , r a i s e d , s p r e a d i n g g r o w t h .I n a l l c a s e s t h e c e l l s w e r e i m b e d d e d i n s l i m e w h i c h c a u s e d t h e c e l l m a t e r i a l t os e t t l e t o t h e b a s e o f t h e s l a n t s . On a g a r s l a n t s i n w h i c h v a r i o u s c a r b o h y d r a t e sw e r e s u b s t i t u t e d f o r g l u c o s e , t h e g r o w t h c h a r a c t e r i s t i c s w e r e t h e s a m e ; t h ec u l t u r e s p r o d u c e d w h i t e , g l i s t e n i n g , w a t e r y g r o w t h h a v i n g t h e a p p e a r a n c e o fs t a r c h p a s t e . On g l y c e r o l a g a r t h e g r o w t h w a s n o t m u c o i d b u t r e l a t i v e l y f r e ef r o m s l i m e ; t h e c e l l m a t e r i a l w a s f i r s t w h i t e b u t l a t e r t u r n e d s l i g h t l y b r o w n i nc o l o r . On 2 p e r c e n t g l u c o s e a g a r c o n t a i n i n g 0 . 1 p e r c e n t a s p a r a g i n e t h e r e w a sa b u n d a n t w h i t e , m u c o i d g r o w t h . T h e r e w a s e v e n m o r e g r o w t h w h e n 0 . 1 p e rc e n t ( N H 4 ) 2 S O 4 w a s u s e d a s t h e s o u r c e o f n i t r o g e n , b u t t h e c u l t u r e s p r o d u c e dv e r y l i t t l e s l i m e o n t h i s m e d i u m .T h e y e a s t c u l t u r e s m a d e v e r y p o o r g r o w t h o n s t a t i c s o l u t i o n m e d i a ; n o p e l l i c l ew a s f o r m e d a n d t h e s o l u t i o n s s h o w e d o n l y s l i g h t t u r b i d i t y . M o s t o f t h e c e l lm a t e r i a l a c c u m u l a t e d a s s e d i m e n t . S i n c e d e v e l o p m e n t o f t h e o r g a n i s m i s c h a r -a c t e r i z e d b y o x i d a t i v e a n d n o t f e r m e n t a t i v e c h a n g e s , t h e s u b m e r g e d c e l l s g r e ws l o w l y . G r o w t h w a s v e r y much i n c r e a s e d b y a e r a t i o n , a n d i n a e r a t e d c u l t u r es o l u t i o n s t h e y e a s t c e l l s w e r e u n i f o r m l y d i s p e r s e d a n d p r o d u c e d a w h i t e t o c r e a m -c o l o r e d t u r b i d i t y . T h e s e r e s u l t s a r e i n a g r e e m e n t w i t h t h o s e o f S m e d l e y - M a c -L e a n a n d H o f f e r t ( 1 9 2 3 , 1 9 2 6 ) , w h o r e p o r t e d t h a t l i p i d s t o r a g e i s f a v o r e d b yv i g o r o u s a e r a t i o n . T h e i r e x p e r i m e n t s a r e n o t s t r i c t l y c o m p a r a b l e , h o w e v e r , s i n c et h e y s t u d i e d t h e p r o d u c t i o n o f l i p i d b y y e a s t c e l l s s u s p e n d e d i n s o l u t i o n s c o n -t a i n i n g v a r i o u s c a r b o n s o u r c e s b u t n o n i t r o g e n , a n d u n d e r t h e s e c o n d i t i o n sg r o w t h w a s s u p p r e s s e d a l m o s t c o m p l e t e l y .U t i l i z a t i o n o f c a r b o h y d r a t e s a n d s o m e r e l a t e d c o m p o u n d s . T h e a b i l i t y o f t h ey e a s t t o u s e v a r i o u s s u b s t a n c e s a s e n e r g y s o u r c e s w a s t e s t e d o n b o t h a g a r a n ds o l u t i o n m e d i a h a v i n g a c o m p o s i t i o n s i m i l a r t o t h a t o f t h e n i t r o g e n - d e f i c i e n tm e d i u m b u t w i t h v a r i o u s c a r b o n c o m p o u n d s s u b s t i t u t e d f o r t h e g l u c o s e . T h ec u l t u r e s w e r e e x a m i n e d a t v a r i o u s p e r i o d s d u r i n g t h e 2 6 d a y s o f i n c u b a t i o n .G r o w t h w a s m e a g r e o n a l l t h e s o l u t i o n m e d i a , b u t i t w a s m o r e a b u n d a n t o n t h ea g a r s l a n t s . T h e s a m e s u b s t a n c e s s u p p o r t e d g r o w t h - o n b o t h a g a r a n d s o l u t i o nm e d i a . T h e y e a s t s g r e w w e l l o n a g a r s l a n t s c o n t a i n i n g g l u c o s e , f r u c t o s e , g a l a c -t o s e , s u c r o s e , m a n n o s e , m a l t o s e , d e x t r i n , s t a r c h , i n u l i n , m a n n i t o l , a n d e t h a n o l .T h e y e a s t g r e w p o o r l y o n g l y c e r o l . Two o f t h e f o u r s t r a i n s t e s t e d made a s m a l la m o u n t o f g r o w t h o n r h a m n o s e ; t h e o t h e r t w o f a i l e d t o g r o w . N o n e o f t h es t r a i n s g r e w o n l a c t o s e .

G l u c o s e w a s n o t f e r m e n t e d . P r e s u m a b l y , t h e r e f o r e , n o n e o f t h e c a r b o h y d r a t e si s f e r m e n t e d ( H e n r i c i , 1 9 4 1 ) .

U t i l i z a t i o n o f n i t r o g e n c o m p o u n d s . A l t h o u g h t h e c u l t u r e s w e r e i s o l a t e d f r o mm e d i a t o w h i c h n o n i t r o g e n h a d b e e n a d d e d ( g l u c o s e , n i t r o g e n - f r e e a g a r ) , t h ey e a s t w a s u n a b l e t o f i x a t m o s p h e r i c n i t r o g e n . I t w a s c u l t i v a t e d o n n i t r o g e n - f r e e

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LIPID PRODUCTION BY A SOIL YEAST

s o l u t i o n m e d i a c o n t a i n i n g 1 . 5 p e r c e n t g l u c o s e o r m a n n i t o l a s s o u r c e s o f c a r b o na n d o n s i m i l a r m e d i a c o n t a i n i n g 0 . 0 1 p e r c e n t y e a s t e x t r a c t . S o m e o f t h e c u l -t u r e s w e r e a e r a t e d a n d o t h e r s w e r e s t a t i c . I n n o n e o f t h e m e d i a w a s t h e r e a n yn i t r o g e n f i x a t i o n b y t h e y e a s t , a l t h o u g h t h e r e w a s f i x a t i o n o f 9 t o 2 0 mg o fn i t r o g e n b y c u l t u r e s o f A z o t o b a c t e r g r o w n i n 1 0 0 - m l p o r t i o n s o f s i m i l a r m e d i a .T h e y e a s t u t i l i z e d ammonium s a l t s , a s p a r a g i n e , a n d y e a s t e x t r a c t a s s o u r c e so f n i t r o g e n . N i t r a t e w a s n o t u t i l i z e d .G e l a t i n w a s n o t l i q u e f i e d i n g e l a t i n s t a b s c o n t a i n i n g 2 p e r c e n t g l u c o s e , a n dt h e r e w a s n o d e c o m p o s i t i o n o f g e l a t i n i n g e l a t i n - a g a r p l a t e s c o n t a i n i n g 2 p e r c e n tg l u c o s e ( F r a z i e r , 1 9 2 6 ) d u r i n g 1 8 d a y s o f i n c u b a t i o n .I n f l u e n c e o f m e d i u m c o m p o s i t i o n o n l i p i d p r o d u c t i o n . T h e l i p i d c o n t e n t o f t h ec e l l s w a s g r e a t e s t w h e n t h e c u l t u r e s w e r e g r o w n o n n i t r o g e n - d e f i c i e n t c a r b o -h y d r a t e m e d i a . T h e l i p i d g l o b u l e s w e r e s m a l l i n c e l l s g r o w n o n m a l t e x t r a c ta g a r , t h e v e g e t a b l e i n f u s i o n a g a r o f M r a k e t a l . ( 1 9 4 2 ) , a n d a g a r m e d i a c o n t a i n i n g2 p e r c e n t g l u c o s e a n d 0 . 1 p e r c e n t a s p a r a g i n e o r ( N H 4 ) 2 S 0 4 . A s h a s b e e nr e p e a t e d l y n o t e d b y o t h e r s w i t h c u l t u r e s o f y e a s t a n d f i l a m e n t o u s f u n g i , t h en i t r o g e n c o n t e n t o f t h e m e d i u m h a d a p r o n o u n c e d e f f e c t o n l i p i d p r o d u c t i o n .I n m e d i a w i t h r e l a t i v e l y l a r g e a m o u n t s o f a v a i l a b l e n i t r o g e n p e r u n i t o f c a r b o -h y d r a t e , l i p i d a c c u m u l a t i o n w a s s u p p r e s s e d . N i t r a t e h a d n o e f f e c t o n l i p i da c c u m u l a t i o n . T h i s a p p a r e n t a n o m a l y i s e x p l a i n e d b y t h e f a c t t h a t t h e y e a s td i d n o t u t i l i z e n i t r a t e . I t h a s b e e n o b s e r v e d t h a t t h e c e l l s f r e q u e n t l y c o n t a i n e ds m a l l e r f a t g l o b u l e s d u r i n g t h e f i r s t f e w d a y s o f i n c u b a t i o n t h a n a t l a t e r s t a g e so f g r o w t h .

C e l l s i n s t a t i c s o l u t i o n m e d i a c o n t a i n e d r e l a t i v e l y s m a l l a m o u n t s o f l i p i d ,w h e r e a s t h e y w e r e n e a r l y f i l l e d w i t h l i p i d w h e n c u l t i v a t e d i n a e r a t e d m e d i a o f t h es a m e c o m p o s i t i o n . T h e c u l t u r e s g r e w w e l l a n d p r o d u c e d l a r g e a m o u n t s o f l i p i di n a e r a t e d s o l u t i o n m e d i a c o n t a i n i n g 3 p e r c e n t g l u c o s e , 0 . 0 5 p e r c e n t ( N H 4 ) 2 S 0 4 ,a n d 0 . 0 1 p e r c e n t y e a s t e x t r a c t .A l l o f t h e y e a s t s t r a i n s w h i c h h a v e b e e n i s o l a t e d a p p e a r e d t o b e t h e s a m e e x c e p tf o r m i n o r d i f f e r e n c e s . T h e y e a s t i s c h a r a c t e r i z e d b y s l o w g r o w t h i n s o l u t i o nm e d i a , l a c k o f f e r m e n t a t i o n , d i s t i n c t i v e m e a n s o f s p o r u l a t i o n , a n d h i g h l i p i dp r o d u c t i o n u n d e r s u i t a b l e c u l t u r a l c o n d i t i o n s .C l a s s i f t c a t i o n . T h e m o r p h o l o g i c a l a n d p h y s i o l o g i c a l c h a r a c t e r i s t i c s o f t h ey e a s t a r e s u c h t h a t t h e o r g a n i s m i s n o t r e a d i l y c l a s s i f i e d . W i c k e r h a m c o n c l u d e dt h a t , e x c e p t f o r s p o r e f o r m a t i o n , i t i s i n many r e s p e c t s s i m i l a r t o s o m e m e m b e r so f t h e a s p o r o g e n o u s y e a s t s o f t h e g e n u s T o r u l o p s i s ( W i c k e r h a m , 1 9 4 4 ) .A c u l t u r e i s o l a t e d b y d e n D o o r e n d e J o n g ( 1 9 2 6 ) a n d n a m e d T o r u l a l i p o f e r ar e s e m b l e s t h e y e a s t m o r p h o l o g i c a l l y a n d p h y s i o l o g i c a l l y , e x c e p t f o r s p o r e f o r m a -t i o n . T h e name o f t h e o r g a n i s m w a s s u b s e q u e n t l y c h a n g e d t o T o r u l o p s i sl i p o f e r a b y L o d d e r ( 1 9 3 4 ) . T h e y e a s t w a s i s o l a t e d f r o m s o i l , p r o d u c e d c e l l s w i t hl a r g e f a t g l o b u l e s w h e n g r o w n o n s u i t a b l e m e d i a , d i d n o t f e r m e n t c a r b o h y d r a t e s ,p r o d u c e d n o p e l l i c l e , a n d g r e w o n s i m i l a r c a r b o h y d r a t e s , a l c o h o l s , a n d n i t r o g e -- n o u s m a t e r i a l s ( L o d d e r , 1 9 3 4 ) . S i n c e t h e r e i s s u c h a c l o s e s i m i l a r i t y b e t w e e n T .l i p o f e r a a n d t h e y e a s t i s o l a t e d f r o m New J e r s e y s o i l s , c u l t u r e s o f T . l i p o f e r am i g h t p r o f i t a b l y b e r e - e x a m i n e d f o r s p o r e f o r m a t i o n .T h e y e a s t m i g h t b e c l a s s i f i e d u n d e r t h e f a m i l y E n d o m y c e t a c e a e , s u b f a m i l y

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ROBERT L . STARKEYS a c c h a r o m y c o i d e a e , a n d t r i b e S a c c h a r o m y c e t e a e , b u t i t c a n n o t b e c l a s s i f i e d a st o t h e g e n u s w i t h c e r t a i n t y . ' I n f a c t , i t s h o w s many c h a r a c t e r i s t i c s w h i c h s u g -g e s t c l o s e r a g r e e m e n t w i t h s o m e o f t h e a s p o r o g e n o u s y e a s t s t h a n w i t h t h e w e l l -c h a r a c t e r i z e d g e n e r a o f s p o r e f o r m i n g y e a s t s .On t h e b a s i s o f p r e l i m i n a r y o b s e r v a t i o n s , W i c k e r h a m ( 1 9 4 4 ) c o n c l u d e d t h a t i tw a s u n l i k e l y t h a t t h e y e a s t b e l o n g e d i n a n y o f t h e p r e s e n t g e n e r a o f s p o r o g e n o u sy e a s t s s i n c e n o n e o f t h e l a t t e r c o n t a i n y e a s t s w i t h i t s c h a r a c t e r i s t i c s , s u c h a sm u c o i d c e l l m a t e r i a l , c o l o r e d a s c o s p o r e s , a s c o s p o r e s i n e x c e s s o f e i g h t w h e n c u l -t u r e d o n c e r t a i n m e d i a , a n d a s t r o n g t e n d e n c y o f o l d c e l l s t o s h e d t h e i r o u t e rm e m b r a n e s . I n s o m e r e s p e c t s t h e y e a s t r e s e m b l e s a c u l t u r e d e s c r i b e d a sD e b a r y o m y c e s h o m i n i s b y T o d d a n d H e r r m a n n ( 1 9 3 6 ) . H o w e v e r , t h e s t r u c t u r e sw h i c h w e r e d e s c r i b e d a s s p o r e s o f D . h o m i n i s a r e d i f f e r e n t f r o m t h e s p o r e s o f t h es o i l y e a s t , b u t c o m p a r a t i v e s t u d i e s m i g h t s h o w m o r e s i m i l a r i t y b e t w e e n t h e t w ot h a n i s a p p a r e n t f r o m t h e d e s c r i p t i o n o f T o d d a n d H e r r m a n n .A d d i t i o n a l i n f o r m a t i o n i s n e e d e d b e f o r e t h e y e a s t c a n b e c o m p l e t e l y c l a s s i f i e da n d b e f o r e i t i s p o s s i b l e t o d e t e r m i n e w i t h c e r t a i n t y w h e t h e r i t i s i d e n t i c a l w i t ha n y y e a s t w h i c h h a s a l r e a d y b e e n d e s c r i b e d o r i s a n ew s p e c i e s .E f f i c i e n c y o f c o n v e r s i o n o f c a r b o h y d r a t e t o l i p i d . T h e y e a s t w a s c u l t i v a t e d i nv o l u m e s o f m e d i u m v a r y i n g f r o m 5 0 0 t o 7 , 0 0 0 m l , i n o r d e r t o d e t e r m i n e t h ea m o u n t o f l i p i d c o n t a i n e d i n t h e c e l l s a n d t h e r e l a t i v e p o r t i o n o f t h e c a r b o h y d r a t ew h i c h w a s c o n v e r t e d t o l i p i d . T h e m e d i u m c o m m o n l y u s e d h a d t h e f o l l o w i n gc o m p o s i t i o n : t a p w a t e r , 1 , 0 0 0 m l ; g l u c o s e , 1 5 g ; y e a s t e x t r a c t , 0 . 1 g ; K 2 H P O 4 ,0 . 8 g ; K H 2 P O 4 , 0 . 2 g ; M g S O 4 . 7 H 2 0 , 0 . 2 g ; C a C l , 2 2 H 2 0 , 0 . 0 5 g ; a n d F e S O 4 .7 H 2 0 , 0 . 0 2 5 g . T h e c a r b o h y d r a t e w a s s t e r i l i z e d s e p a r a t e l y f r o m t h e r e s t o f t h em e d i u m . S i n c e p r e l i m i n a r y t e s t s i n d i c a t e d t h a t g r o w t h w a s m u c h g r e a t e r i na e r a t e d m e d i a , a v i g o r o u s s t r e a m o f s t e r i l e a i r w a s b u b b l e d t h r o u g h t h e m e d i u mt h r o u g h o u t t h e p e r i o d o f i n c u b a t i o n . T h e s a m e y e a s t c u l t u r e ( s t r a i n 7 2 ) w a su s e d i n a l l t h e s e e x p e r i m e n t s .E x t r a c t i o n o f l i p i d f r o m t h e c e l l s . T h e y e a s t w a s c u l t i v a t e d i n 5 0 0 m l o fm e d i u m , a n d t h e c e l l m a t e r i a l w a s h a r v e s t e d a f t e r 5 d a y s ' i n c u b a t i o n . I t h a dg r o w n w e l l a n d p r o d u c e d a h e a v y , c r e a m - c o l o r e d s u s p e n s i o n o f c e l l s w h i c h c o n -t a i n e d l a r g e l i p i d g l o b u l e s . T h e c e l l s w e r e r e m o v e d b y c e n t r i f u g a t i o n , a n d t h ew h i t e , c r e a m y c e l l p a s t e w a s d r i e d i n a c u r r e n t o f a i r a t 5 0 C . A f t e r m o s t o f t h ew a t e r w a s r e m o v e d , t h e m a t e x i a l w a s d r i e d a t 6 0 t o 7 0 C . D e t e r m i n a t i o n s w e r em a d e o n t h e m e d i u m f o r r e s i d u a l c a r b o h y d r a t e a n d r e a c t i o n , a n d a p o r t i o n o ft h e c e l l m a t e r i a l w a s t e s t e d f o r a s h c o n t e n t . T h e r e s t o f t h e c e l l m a t e r i a l w a se x t r a c t e d w i t h e t h y l e t h e r . O n l y a s m a l l a m o u n t o f m a t e r i a l w a s o b t a i n e d i nt h e e x t r a c t . T h e d r i e d c e l l m a t e r i a l w a s t h e n e x t r a c t e d w i t h c h l o r o f o r m , w h i c hr e m o v e d l e s s m a t e r i a l t h a n t h e e t h e r . C h l o r o f o r m e x t r a c t i o n w a s f o l l o w e d b ye x t r a c t i o n w i t h a b o i l i n g m i x t u r e o f e q u a l p a r t s o f e t h y l e t h e r a n d e t h a n o l . A

3 D r . L . J . W i c k e r h a m o f t h e N o r t h e r n R e g i o n a l R e s e a r c h L a b o r a t o r y a t P e o r i a , I l l i n o i s ,a n d t h e l a t e D r . A . T . H e n r i c i o f f e r e d many h e l p f u l s u g g e s t i o n s a n d a i d e d m a t e r i a l l y i nc h a r a c t e r i z i n g t h e y e a s t a n d c l a r i f y i n g i t s t a x o n o m i c s t a t u s . T h e y h a v e v e r i f i e d many o ft h e r e s u l t s w h i c h a r e h e r e i n r e p o r t e d a n d h a v e t e s t i f i e d t o t h e d i f f i c u l t y o f i d e n t i f y i n g t h ey e a s t w i t h a n y o f t h e k n o w n s p e c i e s .

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LIPID PRODUCTION BY A SOIL YEAST 43s m a l l a d d i t i o n a l a m o u n t o f e x t r a c t w a s o b t a i n e d . T h e t o t a l a m o u n t o f m a t e r i a le x t r a c t e d b y t h e t h r e e s o l v e n t s w a s 1 1 . 0 p e r c e n t o f t h e i n i t i a l c e l l w e i g h t . A f t e re a c h e x t r a c t i o n t h e c e l l m a t e r i a l w a s t r e a t e d w i t h t h e f a t s t a i n , S u d a n I I I , a n de x a m i n e d m i c r o s c o p i c a l l y . N o n e o f t h e s o l v e n t s a l t e r e d t h e a p p e a r a n c e o f t h el i p i d g l o b u l e s , w h i c h s t a i n e d a s w e l l w i t h S u d a n I I I a f t e r e x t r a c t i o n a s b e f o r eb e i n g t r e a t e d . I n a n a t t e m p t t o r e l e a s e t h e l i p i d , t h e c e l l m a t e r i a l w a s h y d r o -l y z e d w i t h 2 p e r c e n t H C I a t 1 0 0 C f o r 4 h o u r s . T h e a c i d w a s t h e n n e u t r a l i z e d ,a n d t h e m i x t u r e w a s e x t r a c t e d w i t h e t h e r . An a m o u n t o f m a t e r i a l e q u a l t o4 2 . 3 p e r c e n t o f t h e o r i g i n a l s u b s t a n c e w a s e x t r a c t e d . T h e e x t r a c t w a s a l i g h t -a m b e r - c o l o r e d f a t t y s u b s t a n c e h a v i n g a l o w m e l t i n g p o i n t . A s s h o w n b y t h ed a t a i n t a b l e 1 , 5 3 . 3 p e r c e n t o f t h e o r i g i n a l c e l l m a t e r i a l w a s e x t r a c t e d b y t h e

TABLE 1R e c o v e r y o f l i p i d f r o m y e a s t c e l l s *

R e a c t i o n o f mediumI n i t i a l pH . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 7 . OF i n a l pH . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 3 . 8G l u c o s e c o n t e n tI n i t i a l . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .............................. 6 . 3 5 0 gF i n a l ....................................... 0 . 1 1 0 gG l u c o s e u t i l i z e d .................................. 6 . 2 4 0 gY e a s t c e l l s ...................................... 1 . 8 2 8 gC o n v e r s i o n o f g l u c o s e t o y e a s t c e l l s .......................... 2 9 . 3 %A s h c o n t e n t o f c e l l s ............................................... 3 . 1 %E x t r a c t i o n o f l i p i d f r o m c e l l s :1 . I n i t i a l e t h e r e x t r a c t ........................................ 3 . 2 %2 . E x t r a c t e d w i t h c h l o r o f o r m a f t e r t r e a t m e n t 1 .............................. 0 . 6 %3 . E x t r a c t e d w i t h b o i l i n g m i x t u r e o f 5 0 - 5 0 e t h e r a n d e t h a n o l a f t e r t r e a t m e n t 2 . 7 . 2 %4 ; E x t r a c t e d w i t h e t h e r a f t e r h y d r o l y s i s w i t h h o t 2 % H C 1 f o l l o w i n g t r e a t m e n t 3 4 2 . 3 %

Total material extracted. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 53.3%C o n v e r s i o n o f g l u c o s e t o l i p i d . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 1 5 . 6 %* I n c u b a t i o n p e r i o d 5 d a y s ; a e r a t e d m e d i u m c o n t a i n i n g 0 . 0 1 % y e a s t e x t r a c t a n d 1 . 5 %g l u c o s e .

s o l v e n t s . M o s t o f t h e g l u c o s e h a d b e e n c o n s u m e d , a n d 1 5 . 6 p e r c e n t a s m u c hl i p i d w a s r e c o v e r e d a s g l u c o s e u s e d . T h e y i e l d o f c e l l m a t e r i a l w a s 2 9 . 3 p e r c e n to f t h e w e i g h t o f t h e g l u c o s e u s e d . T h e r e a c t i o n o f t h e m e d i u m b e c a m e d i s t i n c t l ya c i d a n d d r o p p e d f r o m a n i n i t i a l pH o f 7 . 0 t o 3 . 8 .S m e d l e y - M a c L e a n ( 1 9 2 2 ) a l s o f o u n d t h a t o n l y a s m a l l p o r t i o n o f t h e l i p i d o fy e a s t c e l l s w i t h w h i c h s h e w o r k e d c o u l d b e o b t a i n e d b y d i r e c t e t h e r e x t r a c t i o n .S e v e r a l t i m e s a s m u c h l i p i d w a s o b t a i n e d a f t e r h y d r o l y s i s w i t h H C l ( b o i l i n gn o r m a l H C l f o r 2 h o u r s ) . S h e a l s o r e p o r t e d t h a t s i m i l a r r e s u l t s h a d b e e n o b t a i n e db y N a e g e l i a n d L o e w i n 1 8 7 8 . M o s t o f t h e y e a s t l i p i d w a s b e l i e v e d t o b e b o u n du p i n t h e c e l l s w i t h s t e r o l , p r o t e i n , a n d c a r b o h y d r a t e a n d b e c a m e l i b e r a t e d o na c i d h y d r o l y s i s ; a s m a l l e r p a r t o f t h e l i p i d w h i c h e x i s t e d a s f r e e f a t c o u l d b e e x -t r a c t e d d i r e c t l y w i t h e t h e r .

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44ROBERT. STARKEYY e a s t g r o w t h a n d l i p i d p r o d u c t i o n . O n e 5 - l i t e r a n d two 2 - l i t e r p o r t i o n s o f me-d i u m s i m i l a r t o t h e a b o v e b u t c o n t a i n i n g - 3 pe r c e n t g l u c o s e w e r e i n o c u l a t e d w i t h

t h e y e a s t a n d a e r a t e d f o r 3 3 d a y s b e f o r e h a r v e s t i n g . A t t h e t i m e o f h a r v e s t t h ec u l t u r e s w e r e c o m p o s e d o f t y p i c a l l a r g e s p h e r i c a l c e l l s e a c h c o n t a i n i n g a s i n g l el a r g e l i p i d g l o b u l e . I t was u n e x p e c t e d t o f i n d t h e c e l l s so well p r e s e r v e d a f t e rs u c h a l o n g i n c u b a t i o n p e r i o d . T h e c e l l s w e r e s e p a r a t e d f r o m t h e 5 - l i t e r p o r t i o no f m e d i u m b y c e n t r i f u g a t i o n . T h e o t h e r t w o c u l t u r e s w e r e e x t r a c t e d w i t h o u t

TABLE 2L i p i d p r o d u c t i o n i n g l u c o s e , n i t r o g e n - d e f i e n t m e d i u m *C U J L T U R A C U L T U R E B C U L T U R E C

P e r i o d o f i n c u b a t i o n , d a y s.333 3 3V o l u m e o f m e d i u m ,ml.5,000 2 , 0 0 0 2 , 0 0 0R e a c t i o n , pHI n i t i a l .............................. 7 . 0 7 . 0 7 . 0F i n a l ............................. 3 . 0 2 . 9 2 . 9G l u c o s e c o n t e n tI n i t i a l .............................. 1 2 7 . 0 g 5 0 . 8 g 5 0 . 8 gF i n a l .............................. 2 2 . 2 g 0 . 8 g - 5 . 0 gG l u c o s e u t i l i z e d ....................... 1 0 4 . 8 g 5 0 . 0 g 4 5 . 8 gY e a s t c e l l s . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 2 1 . 1 7 5 gC o n v e r s i o n o f g l u c o s e t o y e a s t c e l l s ...... 2 0 . 2 % oL i p i d e x t r a c t e dFrom c e l l s ............................. 1 2 . 6 5 8 gP r o m medium ......................... 0 . 2 2 7 g

T o t a l .............................. 1 2 . 8 8 5 g 5 . 8 1 1 g 5 . 1 4 4 gC o n v e r s i o n o f g l u c o s e t o l i p i d ............ 1 2 . 3 % 1 1 . 6 % 1 1 . 2 % oL i p i d c o n t e n t o f c e l l s .................... 6 0 . 9 % 5 7 . 5 % t 5 5 . 6 % t

* A e r a t e d m e d i u m c o n t a i n e d 3% g l u c o s e a n d 0 . 0 1 % y e a s t e x t r a c t .t C a l c u l a t e d o n b a s i s o f c o n v e r s i o n o f g l u c o s e t o c e l l s w i t h c u l t u r e A .f i r s t s e p a r a t i n g t h e c e l l s f r o m t h e m e d i u m . T h e p r o c e d u r e s w e r e s i m i l a r t o t h o s eu s e d i n t h e p r e c e d i n g e x p e r i m e n t e x c e p t t h a t t h e c e l l m a t e r i a l a n d m e d i a w e r eh y d r o l y z e d w i t h 2 p e r c e n t HC1 a n d t h e n n e u t r a l i z e d b e f o r e e x t r a c t i o n , a n d e t h e rw a s t h e o n l y s o l v e n t u s e d . S i n c e t h e c e l l s w e r e n o t a l l r e c o v e r e d f r o m c u l t u r e Ab y c e n t r i f u g i n g , b o t h t h e m e d i l u m a s w e l l a s t h e s e p a r a t e d c e l l s w e r e h y d r o l y z e da n d e x t r a c t e d . T h e r e s u l t s a r e r e p o r t e d i n t a b l e 2 . M o s t o f t h e c a r b o h y d r a t eh a d b e e n c o n s u m e d b y a l l t h r e e c u l t u r e s . T h e c o n v e r s i o n o f g l u c o s e t o c e l l m a -t e r i a l b y c u l t u r e A w a s 2 0 . 2 p e r c e n t , w h i c h w a s s o m e w h a t l o w e r t h a n t h e c o n -v e r s i o n i n t h e e x p e r i m e n t r e p o r t e d a b o v e . T h e l i p i d c o n t e n t o f t h e c e l l s , 6 0 . 9

AA

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LIPID PRODUCTION BY A SOIL YEASTp e r c e n t , w a s v e r y h i g h . S i n c e t h e c e l l s w e r e n o t h a r v e s t e d f r o m c u l t u r e s B a n dC , t h e a c t u a l l i p i d c o n t e n t o f t h e c e l l s c o u l d n o t b e c a l c u l a t e d . An a p p r o x i m a -t i o n c a n b e o b t a i n e d b y a s s u m i n g t h e s a m e c o n v e r s i o n o f g l u c o s e t o c e l l s a s i nc u l t u r e A ( 2 0 . 2 p e r c e n t ) . On t h i s a s s u m p t i o n , t h e l i p i d c o n t e n t s o f c u l t u r e s Ba n d C a r e 5 7 . 5 a n d 5 5 . 6 p e r c e n t , r e s p e c t i v e l y - v a l u e s c l o s e t o t h a t f o r c u l t u r e A .T h e c o n v e r s i o n o f g l u c o s e t o l i p i d w a s s i m i l a r w i t h a l l t h r e e c u l t u r e s a n d v a r i e df r o m 1 1 . 2 t o 1 2 . 3 p e r c e n t . T h e r e a c t i o n o f t h e m e d i a b e c a m e d i s t i n c t l y a c i d

TABLE 3L i p i d p r o d u c t i o n b y y e a s t *

C UL TU RE A CULTURE B CULTURE C CULTURE D

P e r i o d o f i n c u b a t i o n , d a y s . . . 1 2 1 9 2 5 3 2V o l u m e o f m e d i u m , m l . . . . . . . 5 , 0 0 0 7 , 0 0 0 5 , 0 0 0 7 , 0 0 0R e a c t i o n , pHI n i t i a l . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 7 . 0 7 . 0 7 . 0 7 . 0

F i n a l . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 4 . 0 3 . 2 3 . 0 3 . 1G l u c o s e c o n t e n tI n i t i a l ..................... 1 2 7 . 0 g 1 7 7 . 8 g 1 2 7 . 0 g 1 7 7 . 8 gF i n a l ..................... 6 3 . 3 g 6 4 . 9 g 2 0 . 7 g 4 4 . 7 gG l u c o s e ' u t i l i z e d . . . . . . . . . . . . 6 3 . 7 g 1 1 2 . 9 g 1 0 6 . 3 g 1 3 3 . 1 gY e a s t cel ls. . .... .... 1 4 . 9 3 g 2 5 . 8 1 g 2 0 . 6 0 g 2 2 . 3 1 gC o n v e r s i o n o f g l u c o s e t o y e a s tc e l l s . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 2 3 . 4 4 % 2 2 . 9 % 1 9 . 4 4 % 1 6 . 8 %L i p i d e x t r a c t e dFrom c e l l s ................. 8 . 5 4 g 1 4 . 3 3 g 1 2 . 4 5 g 1 3 . 9 4 gF r o m m e d i u m 2 . 0 7 g 3 . 1 5 g

T o t a l .................... 8 . 5 4 g 1 4 . 3 3 g 1 4 . 5 2 g 1 7 . 0 9 gC o n v e r s i o n o f g l u c o s e t o l i p i d . 1 3 . 4 % 1 2 . 7 % 1 3 . 7 % 1 2 . 8 %L i p i d c o n t e n t o f c e l l s ........ 5 7 . 3 % 5 $ 5 . 5 % - 6 0 . 4 % 6 2 . 5 %* A e r a t e d m e d i u m c o n t a i n i n g 3% g l u c o s e a n d 0 . 0 2 % y e a s t e x t r a c t .d u r i n g y e a s t g r o w t h , c h a n g i n g f r o m a n i n i t i a l pH o f 7 . 0 t o pH 2 . 9 t o 3 . 0 . I t i s o fi n t e r e s t t h a t t h e c o n v e r s i o n s w e r e s o h i g h i n v i e w o f t h e l o n g p e r i o d o f i n c u b a t i o n .T h e r e s u l t s o f a n a d d i t i o n a l e x p e r i m e n t a r e p r e s e n t e d i n t a b l e 3 . T h e c u l t u r e sw e r e g r o w n i n a m e d i u m s i m i l a r t o t h a t u s e d p r e v i o u s l y b u t c o n t a i n i n g 3 p e r c e n tg l u c o s e a n d 0 . 0 2 p e r c e n t y e a s t e x t r a c t . E a c h o f t w o c o n t a i n e r s h e l d 5 l i t e r s o fm e d i u m a n d t w o o t h e r s e a c h h e l d 7 l i t e r s . O n e c u l t u r e w a s h a r v e s t e d a t e a c ho f t h e f o l l o w i n g i n c u b a t i o n p e r i o d s : 1 2 , 1 9 , 2 5 , a n d 3 2 d a y s . T h r o u g h o u t t h ep e r i o d s o f i n c u b a t i o n t h e m e d i a w e r e a e r a t e d .T h e y e a s t c e l l s o f a l l c u l t u r e s w e r e f i l l e d w i t h l i p i d a t t h e t i m e o f h a r v e s t . T h e

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ROBERT L . STARKEYc u l t u r e s h a r v e s t e d a t t h e 2 5 - a n d 3 2 - d a y p e r i o d s s h o w e d s o m e s i g n s o f d e t e r i o r a -t i o n , h o w e v e r . Many c e l l s w e r e s h e d d i n g t h e i r o u t e r m e m b r a n e s , a n d t h e r e w a sc o n s i d e r a b l e t u r b i d i t y o f t h e m e d i u m a f t e r c e n t r i f u g i n g . T h i s t u r b i d i t y w a sp r o b a b l y d u e t o d i s i n t e g r a t i o n o f s o m e o f t h e c e l l s . T h e r e w a s s o m e t u r b i d i t yo f t h e c e n t r i f u g e d l i q u i d f r o m c u l t u r e s A a n d B b u t m o r e f r o m C a n d s t i l l m o r ef r o m D . I n o r d e r t o r e c o v e r t h e l i p i d a s c o m p l e t e l y a s p o s s i b l e , b o t h t h e c e l lm a t e r i a l a n d t h e c e n t r i f u g e d l i q u i d o f c u l t u r e s C a n d D w e r e e x t r a c t e d w i t h e t h e ra f t e r b e i n g h y d r o l y z e d w i t h H C I a n d t h e n n e u t r a l i z e d . T h e e x t r a c t o b t a i n e df r o m t h e c e n t r i f u g e d l i q u i d w a s 1 4 p e r c e n t o f t h e t o t a l o b t a i n e d f r o m c u l t u r e Ca n d 1 8 p e r c e n t o f t h e t o t a l f r o m c u l t u r e D .T h e r e s u l t s a r e s i m i l a r t o t h o s e o f t h e o t h e r e x p e r i m e n t s : ( 1 ) t h e r e a c t i o n b e -c a m e s t r o n g l y a c i d d u r i n g g r o w t h ; ( 2 ) t h e r e w a s b e t w e e n 1 6 . 8 a n d 2 3 . 4 p e r c e n ta s m u c h c e l l m a t e r i a l a s g l u c o s e c o n s u m e d , a n d t h e e f f i c i e n c y o f c o n v e r s i o n w a sg r e a t e s t a t t h e s h o r t e s t i n c u b a t i o n p e n r o d a n d d e c r e a s e d a s t h e p e r i o d w a s i n -c r e a s e d ; ( 3 ) t h e a m o u n t o f l i p i d e x t r a c t e d w a s e q u a l t o f r o m 5 5 . 5 t o 6 2 . 5 p e rc e n t o f t h e t o t a l w e i g h t o f t h e c e l l s ; a n d ( 4 ) t h e r e w a s f r o m 1 2 . 7 t o 1 3 . 7 p e r c e n ta s m u c h l i p i d p r o d u c e d a s , g l u c o s e c o n s u m e d .T h e r e s u l t s a s a w h o l e i n d i c a t e t h a t t h e y e a s t i s a r e l a t i v e l y e f f i c i e n t c o n v e r t e ro f c a r b o h y d r a t e t o l i p i d a n d t h a t t h e y i e l d s c o m p a r e f a v o r a b l y w i t h t h o s e r e -p o r t e d f o r o t h e r y e a s t s a n d f i l a m e n t o u s f u n g i ( F i n k , H a e h n , a n d H o e r b u r g e r ,1 9 3 7 ; G e f f e r s , 1 9 3 7 ; H e i d e , 1 9 3 9 ; P r u e s s a n d S t r o n g , 1 9 3 3 ; R a a f , 1 9 4 1 - 1 9 4 2 ;R i p p e l , 1 9 4 3 ; W a r d , L o c k w o o d , M a y , a n d H e r r i c k , 1 9 3 5 ) . D u r i n g t h e c o u r s eo f t h e s t u d i e s s o m e o f t h e c u l t u r e s m a d e r e l a t i v e l y s l o w g r o w t h . T h e f a c t o r sa f f e c t i n g t h e r a t e o f g r o w t h a n d t h e e f f i c i e n c y o f t h e c o n v e r s i o n o f c a r b o h y d r a t et o l i p i d h a v e n o t b e e n e x a m i n e d c o m p l e t e l y , b u t i t i s p r o b a b l e t h a t t h e r a t e o fg r o w t h c a n b e a c c e l e r a t e d a n d t h e e f f i c i e n c y o f c o n v e r s i o n i n c r e a s e d b y m o d i f y i n gt h e m e d i u m a n d c h a n g i n g t h e c u l t u r a l c o n d i t i o n s . A m o n g t h e f a c t o r s w h i c h ma yb e e x p e c t e d t o i n f l u e n c e t h e t r a n s f o r m a t i o n a r e t h e s i z e o f t h e i n o c u l u m , t h en a t u r e a n d c o n c e n t r a t i o n o f t h e s o u r c e o f c a r b o n a n d n i t r o g e n , t h e r a t e o fa e r a t i o n , a n d n e u t r a l i z a t i o n o f t h e a c i d p r o d u c e d d u r i n g g r o w t h .T h e i n f l u e n c e o f t h e n i t r o g e n c o n t e n t o f t h e m e d i u m w a s s h o w n b y a n e x p e r i -m e n t i n w h i c h o n e m e d i u m c o n t a i n e d 0 . 0 1 p e r c e n t y e a s t e x t r a c t a s t h e o n l ys o u r c e o f n i t r o g e n a n d a s e c o n d m e d i u m c o n t a i n e d 0 . 0 5 p e r c e n t ( N H 4 ) 2 S O 4 i na d d i t i o n . T h e c u l t u r e s w e r e g r o w n i n 5 - l i t e r p o r t i o n s o f m e d i u m w h i c h w e r ea e r a t e d d u r i n g i n c u b a t i o n f o r 2 0 d a y s a t 2 8 C . T h e r e s u l t s r e p o r t e d i n t a b l e 4a r e s i m i l a r t o t h o s e o b t a i n e d i n t h e p r e v i o u s l y r e p o r t e d e x p e r i m e n t s .T h e r e w a s m a r k e d i n c r e a s e i n a c i d i t y , a n d t h e f i n a l r e a c t i o n o f t h e m e d i u mc o n t a i n i n g ammonium s u l f a t e w a s pH 2 . 6 . T h e y e a s t e x t r a c t m e d i u m c o n t a i n e di n a d e q u a t e n i t r o g e n , a s i n d i c a t e d b y t h e f a c t t h a t o n l y 5 4 p e r c e n t o f t h e c a r b o -h y d r a t e w a s u t i l i z e d ; 8 9 p e r c e n t o f t h e c a r b o h y d r a t e d i s a p p e a r e d f r o m t h em e d i u m c o n t a i n i n g a m m o n i u m s u l f a t e . O f p a r t i c u l a r i n t e r e s t i s t h e e f f i c i e n c yo f c o n v e r s i o n o f c a r b o h y d r a t e t o c e l l m a t e r i a l a n d l i p i d . T h e c o n v e r s i o n t o c e l ls u b s t a n c e w a s m u c h m o r e e f f i c i e n t i n t h e - a m m o n i u m s u l f a t e m e d i u m b u t t h el i p i d c o n t e n t o f t h e c e l l s w a s m u c h h i g h e r i n t h e n i t r o g e n - d e f i c i e n t m e d i u m , i nw h i c h c a s e t h e c e l l s h a d t h e r e m a r k a b l y h i g h l i p i d c o n t e n t o f 6 5 p e r c e n t . T h e

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LIPID PRODUCTION BY A B O I L YEAST

c e l l s g r o w n i n t h e a m m n o n i u m s u l f a t e m e d i u m c o n t a i n e d 4 8 p e r c e n t l i p i d . T h ea c t u a l p e r c e n t a g e o f c o n v e r s i o n o f g l u c o s e t o l i p i d w a s s i m i l a r i n b o t h m e d i a ,1 0 . 3 p e r c e n t i n t h e n i t r o g e n - d e f i c i e n t m e d i u m a n d 1 1 . 6 p e r c e n t i n t h e m e d i u mw h i c h c o n t a i n e d ammonium s u l f a t e , b u t t h e r e w a s m u c h m o r e t o t a l l i p i d i n t h el a t t e r m e d i u m .T h e f a c t t h a t u n d e r s u i t a b l e c u l t u r a l c o n d i t i o n s t h e r e a r e r a p i d g r o w t h , n e a r l yc o m p l e t e c o n s u m p t i o n o f c a r b o h y d r a t e , a n d h i g h - p e r c e n t a g e c o n v e r s i o n o f c a r b o -h y d r a t e t o l i p i d s u g g e s t s t h a t t h e y e a s t m i g h t b e c u l t i v a t e d f o r t h e p r o d u c t i o no f f a t f r o m c a r b o h y d r a t e .K l e i n z e l l e r ( 1 9 4 4 ) m a d e d e t a i l e d s t u d i e s o f t h e c o n v e r s i o n o f c a r b o h y d r a t e t ol i p i d b y a s i m i l a r a n d p o s s i b l y i d e n t i c a l y e a s t , T o r u l o p 8 i s l i p o f e r a . He r e p o r t e d

TABLE 4I n f l u e n c e o f n i t r o g e n c o n t e n t o f m e d i u m o n c o n v e r s i o n o f g l u c o s e t o l i p i d *NITROGEN SOURCz

yeastx t r a c t Y e a s t e x t r a c t a n d. Y e a s t e x c t r a c t ( N H 4 ) 2 S O 4P e r i o d o f i n c u b a t i o n , d a y s ........................ 2 0 2 0V o l u m e o f medium ................................ 5 , 0 0 0 5 , 0 0 0R e a c t i o n , pHI n i t i a l . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 7 . 0 7 . 0

F i n a l . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 3 . 7 2 . 6G l u c o s e c o n t e n t

I n i t i a l . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 1 4 8 . 5 g 1 4 8 . 5 gF i n a l . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 6 8 . 7 g 1 6 . 7 gG l u c o s e u t i l i z e d . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 7 9 . 8 g 1 3 1 . 8 g

Y e a s t c e l l s ........................................ 1 2 . 5 5 g 3 1 . 5 8 gC o n v e r s i o n o f g l u c o s e t o y e a s t c e l l s ................ 1 5 . 7 % 2 4 . 0 %L i p i d e x t r a c t e d f r o m c e l l s ......................... 8 . 1 9 g 1 5 . 2 4 gC o n v e r s i o n o f g l u c o s e t o l i p i d . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 1 0 . 3 % 1 1 . 6 %L i p i d c o n t e n t o f c e l s ............................... 6 5 . 3 % 4 8 . 3 %

* A e r a t e d m e d i u m c o n t a i n i n g 3 % g l u c o s e a n d 0 . 0 1 % y e a s t e x t r a c t .t h a t u n d e r f a v o r a b l e c o n d i t i o n s t h e y e a s t c o n v e r t e d 4 2 t o 4 8 p e r c e n t o f t h ec a r b o h y d r a t e t o y e a s t c e l l s ( d r y w e i g h t ) w h i c h c o n t a i n e d 1 8 . 6 t o 4 3 p e r c e n tl i p i d . F a t f o r m a t i o n w a s h i g h e s t a t pH 5 . 5 t o 6 . 0 a n d a t 2 0 t o 2 5 C . T h e h i g hn i t r o g e n c o n t e n t o f t h e m e d i u m d e p r e s s e d f a t f o r m a t i o n .

N a t u r e o f t h e y e a s t l i p i d . No t e s t s h a v e b e e n m a d e o f t h e c h e m i c a l c o m p o s i t i o no f t h e l i p i d . T h e m i x t u r e a s a w h o l e h a d a l o w m e l t i n g p o i n t . I t p e r s i s t e d a s as o f t s o l i d a t 2 0 C a n d m e l t e d s l o w l y a s t h e t e m p e r a t u r e w a s r a i s e d u n t i l m o s tw a s m o l t e n a t 2 8 C ; t h e r e w e r e s t i l l s o m e s u s p e n d e d s o l i d p a r t i c l e s a t 3 5 C .U p o n c o o l i n g t h e r e w a s n o s o l i d i f i c a t i o n a t 1 8 C , b u t m o s t o f t h e l i p i d w a s s o l i da t 1 5 C . Wh e n h e a t e d a g a i n t h e r e w a s l i t t l e e v i d e n c e o f m e l t i n g u n t i l t h e t e m -p e r a t u r e r e a c h e d 2 5 t o 3 0 C .T h e l i p i d o f T . l i p o f e r a w a s c h a r a c t e r i z e d b y K l e i n z e l l e r ( 1 9 4 4 ) a s f o l l o w s :c a r b o n c o n t e n t o f f a t t y a c i d s 7 6 p e r c e n t ; u n s a p o n i f i a b l e m a t e r i a l 6 . 8 t o 8 . 8 p e r

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ROBERT L . STARKEYc e n t o f t h e l i p i d ; m e a n m o l e c u l a r w e i g h t o f t h e f a t t y a c i d s , 2 6 8 t o 2 8 0 ; a n d i o d i n ev a l u e 5 5 t o 9 0 .T h e l i p i d s o b t a i n e d f r o m o t h e r y e a s t s h a v e b e e n f o u n d t o c o n t a i n f a t s , f r e ef a t t y a c i d s , p h o s p h o l i p i d s , a n d s t e r o l s ( B l o o r , 1 9 4 3 ; P r e s c o t t a n d D u i n n , 1 9 4 0 ;A n d e r s o n , 1 9 3 9 ) . D a u b n e y a n d S m e d l e y - M a c L e a n ( 1 9 2 7 ) r e p o r t e d t h a t t h ep r i n c i p a l f a t t y a c i d s i n y e a s t l i p i d w e r e t h e s a t u r a t e d p a l m i t i c a n d t h e u n s a t u -r a t e d o l e i c a n d l i n o l e i c a c i d s . T h e r e w e r e a l s o s m a l l a m o u n t s o f t h e s a t u r a t e dl a u r i c a c i d a n d p o s s i b l y s o m e a r a c h i d i c a c i d . A c c o r d i n g t o A n d e r s o n ( 1 9 3 9 ) ,y e a s t l i p i d c o n t a i n s s u c h s a t u r a t e d f a t t y a c i d s a s p a l m i t i c , s t e a r i c , l a u r i c , b u t y r i c ,a r a c h i d i c , a n d t e t r a c o s a n o i c a c i d s , a n d a l s o u n s a t u r a t e d C i s a n d C 1 8 a c i d s .P a l m i t i c a n d s t e a r i c a c i d s w e r e t h e p r i n c i p a l f a t t y a c i d s . Y e a s t l i p i d i s c h a r -a c t e r i z e d b y a h i g h p r o p o r t i o n o f u n s a p o n i f i a b l e m a t t e r c o m p r i s i n g o n e - t h i r d o rm o r e o f t h e m a t e r i a l e x t r a c t e d ( S m e d l e y - M a c L e a n a n d T h o m a s , 1 9 2 0 ) . A b o u to n e - h a l f o f t h e u n s a p o n i f i a b l e m a t e r i a l w a s s t e r o l i n c o m b i n a t i o n w i t h f a t t y a c i d s .T h e s t e r o l s e p a r a t e d o u t f r o m t h e r e s t o f t h e l i p i d o n s t a n d i n g ( S m e d l e y - M a c -L e a n , 1 9 2 2 ) . T h e p h o s p h o l i p i d s o f S a c c h a r o m y c e s c e r e v i s i a e h a v e b e e n r e p o r t e dt o c o m p r i s e m o r e t h a n o n e - h a l f t h e t o t a l e t h e r - s o l u b l e m a t e r i a l ( A n d e r s o n , 1 9 3 9 ) .T h e l i p i d e x t r a c t e d f r o m P e n i c i l l i u m j a v a n i c u m w a s r e p o r t e d b y W a r d , L o c k -w o o d , M a y , a n d H e r r i c k ( 1 9 3 5 ) t o b e s i m i l a r t o t h a t o b t a i n e d f r o m h i g h e r p l a n t sa n d c o n s i s t e d o f g l y c e r i d e s o f p a l m i t i c , s t e a n r c , t e t r a c o s a n o i c , o l e i c , a n d l i n o l e i ca c i d s , w i t h a s m a l l a m o u n t o f u n s a p o n i f i a b l e m a t t e r . B e r n h a u e r a n d P o s s e l t( 1 9 3 7 ) f o u n d t h a t t h e l i p i d o b t a i n e d f r o m A s p e r g i l l u s n i g e r c o n t a i n e d 6 p e r c e n tg l y c e r o l a n d 6 8 p e r c e n t t o t a l f a t t y a c i d s , t h r e e - f o u r t h s o f w h i c h w e r e m a d e u po f u n s a t u r a t e d a c i d s .

SUMMARYT h e y e a s t w a s r e c o v e r e d f r o m v a r i o u s s o i l s a n d a p p e a r s t o b e a common s o i li n h a b i t a n t . On p l a t e s o f n i t r o g e n - f r e e , g l u c o s e a g a r s e e d e d w i t h s o i l a n d i n c u -

b a t e d f o r t w o w e e k s o r m o r e i t p r o d u c e d l a r g e , s p r e a d i n g , s l i g h t l y o p a q u e c o l o n i e sw i t h t h e c e l l s d i s p e r s e d i n a w a t e r y s l i m e . On n i t r o g e n - d e f i c i e n t m e d i a t h e c e l l sw e r e l a r g e a n d n e a r l y s p h e r i c a l w i t h n o t e n d e n c y t o p r o d u c e c h a i n s ; m o s t c e l l sh a d o n l y o n e s m a l l b u d . E a c h c e l l c o n t a i n e d a s i n g l e l a r g e r e f r a c t i v e f a t g l o b u l e ,w h i c h n e a r l y f i l l e d t h e c e l l . O l d c e l l s t e n d e d t o s h e d t h e i r o u t e r m e m b r a n e s .S p o r e s w e r e p r o d u c e d , b u t t h e n u m b e r i n e a c h a s c u s w a s v a r i a b l e . T h e s p o r e sh a d a l i g h t a m b e r c o l o r . S o m e s t r a i n s p r o d u c e d u p t o 8 s p o r e s , b u t o n e s t r a i np r o d u c e d 1 6 o r m o r e w h e n c u l t i v a t e d o n s o m e m e d i a . U n d e r c e r t a i n c o n d i t i o n st h e s p o r e s w e r e f o r m e d i n a s a c l i k e b u d w h i c h r e m a i n e d a t t a c h e d t o t h e p a r e n tc e l l . T h e b u d w a s a t f i r s t f i l l e d w i t h g r a n u l a r c o n t e n t s , w h i c h l a t e r c h a n g e d t os p o r e s . No s p o r e s w e r e f o r m e d i n t h e p a r e n t c e l l . T h e m e t a b o l i s m o f t h e y e a s tw a s o x i d a t i v e a n d s u g a r s w e r e n o t f e r m e n t e d . N i t r a t e w a s n o t u t i l i z e d a n dg e l a t i n w a s n o t a t t a c k e d . I n s o l u t i o n m e d i a , g r o w t h w a s s e d i m e n t a r y w i t h n op e l l i c l e f o r m a t i o n , a n d r e l a t i v e l y f e w c e l l s r e m a i n e d s u s p e n d e d e x c e p t i n a e r a t e dm e d i a .

T h e c h a r a c t e r i s t i c s o f t h e y e a s t a r e d i f f e r e n t f r o m t h o s e o f p r e v i o u s l y d e -s c r i b e d y e a s t s w h i c h h a v e b e e n s t u d i e d f o r l i p i d s y n t h e s i s . I t w a s n o t p o s s i b l e

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LIPID PRODUCTION BY A SOIL YEASTt o i d e n t i f y t h e y e a s t w i t h k n o w n s p e c i e s . T h e y e a s t m a y b e a n e w s p e c i e s o r ay e a s t a l r e a d y d e s c r i b e d b u t w i t h c e r t a i n c h a r a c t e r i s t i c s w h i c h h a v e n o t b e e nr e c o g n i z e d u p t o t h i s t i m e .G r o w t h a n d l i p i d p r o d u c t i o n w e r e g o o d i n a e r a t e d g l u c o s e s o l u t i o n s c o n t a i n i n gs m a l l a m o u n t s o f y e a s t e x t r a c t a s t h e n i t r o g e n s o u r c e . U n d e r f a v o r a b l e c o n d i -t i o n s , 2 0 t o 2 5 p e r c e n t o f t h e c o n s u m e d g l u c o s e w a s c o n v e r t e d t o y e a s t c e l l sw h i c h c o n t a i n e d 5 0 t o 6 3 p e r c e n t l i p i d . From 1 0 t o 1 4 p e r c e n t o f t h e c o n s u m e dg l u c o s e w a s r e c o v e r e d a s l i p i d . T h e l i p i d c o n t e n t o f t h e c e l l s d e c r e a s e d a s t h en i t r o g e n c o n t e n t o f t h e m e d i u m i n c r e a s e d . O n l y a s m a l l p o r t i o n o f t h e l i p i dc o u l d b e e x t r a c t e d f r o m t h e c e l l s d i r e c t l y w i t h f a t s o l v e n t s , b u t i t b e c a m e r e l e a s e db y h y d r o l y s i s w i t h d i l u t e a c i d .

REFERENCESA N D E R S O N , R . J . 1 9 3 9 T h e c h e m i s t r y o f t h e l i p o i d s o f t h e t u b e r c l e b a c i l l u s a n d c e r t a i n

o t h e r m i c r o o r g a n i s m s . F o r t s c h r i t t e C h e m . o r g . N a t u r s t o f f e , 3 , 1 4 5 - 2 0 2 . J u l i u sS p r i n g e r , V i e n n a .B E R N H A U E R , K . , A N D P O S S E L T , G . 1 9 3 7 V U b e r S c h i m m e l p i l z l i p o i d e . I I . M i t t e i l u n g : D i eZ u s a m m e n s e t z u n g e i n e s A s p e r g i l l u s - n i g e r - F e t t e s . B i o c h e m . Z . , 2 9 4 , 2 1 5 - 2 2 0 .B I C E O V S K A Y A , A . L . 1 9 3 9 T h e f o r m a t i o n o f f a t b y t h e f u n g u s E n d o m y c e e v e r n w l i e .1 . T h e i n f l u e n c e o f t h e c o m p o s i t i o n o f t h e s u b s t r a t e o n t h e f o r m a t i o n o f f a t b y E n d o -m y c e s v e r n a l i s u n d e r c o n d i t i o n s o f f i l m g r o w t h . M i c r o b i o l o g y ( U S S R ) , 8 , 1 1 7 0 - 1 1 8 1 .B L O O R , W . R . 1 9 4 3 B i o c h e m i s t r y o f t h e f a t t y a c i d s a n d t h e i r c o m p o u n d s , t h e l i p i d s .R e i n h o l d P u b l . C o r p . , Ne w Y o r k . 3 8 7 p .D A U B N E Y , C . G . , AND S M E D L E Y - M A C L E A N , I . 1 9 2 7 T h e c a r b o h y d r a t e a n d f a t m e t a b o l i s mo f y e a s t . I V . T h e n a t u r e o f t h e p h o s p h o l i p i n s . B i o c h e m . J . , 2 1 , 3 7 3 - 3 8 5 .D E N DOOREN D E J O N G , L . E . 1 9 2 6 A new f a t - p r o d u c i n g y e a s t . N e d e r l a n d . T i j d s c h r .H y g . M i c r o b i o l . S e r o l . , 1 , 1 3 6 - 1 4 7 .F I N K , H . , H A E H N , H . , AND H O E R B U R G E R , W. 1 9 3 7 t J b e r d i e V e r s u c h e z u r F e t t g e w i n n u n gm i t t e l s M i k r o o r g a n i s m e n m i t b e s o n d e r e r B e r i i c k s i c h t i g u n g d e r A r b e i t e n d e s I n s t i t u t sf r r G a r u n g s g e w e r b e . C h e m . Z . , 6 1 , 6 8 9 - 6 9 3 , 7 2 3 - 7 2 6 , 7 4 4 - 7 4 7 .F A Z I E R , W. C . 1 9 2 6 A new m e t h o d f o r t h e d e t e c t i o n o f p r o t e o l y s i s b y b a c t e r i a . J .B a c t . , 1 1 , 8 0 .G E F F E R S , H . 1 9 3 7 U n t e r s u c h u n g e n - i b e r d a s F e t t b i l d u n g s v e r m o g e n b e i P i l s e n d e rG a t t u n g O o s p o r a W a l l r o t h ( e m . S a c c . ) . A r c h . M i k r o b i o l . , 8 , 6 6 - 9 8 .G O R B A C H , G . , A N D S A B L A T N 6 G , A . 1 9 3 4 a t J b e r d i e B i l d u n g von L i p o i d e n d u r c h B a k t e r i e n .I . M i t t e i l u n g : D i e G e s a m t f e t t b i l d u n g v o n B a c i l l u s p r o d i g i o s u s a u f f e s t e n N a h r m e d i e n .

A r c h . M i k r o b i o l . , 5 , 3 1 1 - 3 1 7 .G O R B A C H , G . , AND S A B L A T N 6 G , A . 1 9 3 4 b t J b e r d i e B i l d u n g v o n L i p o i d e n d u r c h B a k t e r i e n .I I . M i t t e i l u n g : D i e G e s a m t f e t t b i l d u n g v o n B a c . p r o d i g i o s u s i n N & h r l o s u n g e n . A r c h .M i k r o b i o l . , 5 , 3 1 8 - 3 2 7 .G O R T N E R , R . A . , J R . , AND G U N D E R S O N , F . L . 1 9 4 4 P r o t e i n s i n h u m a n n u t r i t i o n . P r o t e i nf o o d s , w a r a n d p o s t w a r . I n d . E n g . C h e m . , News E d . , 2 2 , 1 6 0 - 1 6 3 .H E I D E , S . 1 9 3 9 Z u r P h y s i o l o g i e u n d C y t o l o g i e d e r F e t t b i l d u n g b e i E n d o m y c e s v e r n a l i s .A r c h . M i k r o b i o l . , 1 0 , 1 3 5 - 1 8 8 .H E N R I C I , A . T . 1 9 4 1 Th e y e a s t s . G e n e t i c s , c y t o l o g y , v a r i a t i o n , c l a s s i f i c a t i o n , a n di d e n t i f i c a t i o n . B a c t . R e v s . , 5 , 9 7 - 1 7 9 .K L E I N Z E L L E R , A . 1 9 4 4 F a t f o r m a t i o n i n T o r u l o p s i s l i p o f e r a . B i o c h e m . J . , 3 8 , 4 8 0 - 4 9 2 .L A R S O N , L . W . , AND L A R S O N , W. P . 1 9 2 2 F a c t o r s g o v e r n i n g t h e f a t c o n t e n t o f b a c t e r i aa n d t h e i n f l u e n c e o f f a t o n p e l l i c l e f o r m a t i o n . J . I n f e c t i o u s D i s e a s e s , 3 1 , 4 0 7 - 4 1 5 .L O D D E R , J . 1 9 3 4 D i e H e f e s a m m l u n g d e s " C e n t r a a l b u r e a u V o o r S c h i m m e l c u l t u r e s . "I I . D i e a n a s k o s p o r o g e n e n H e f e n . E r s t e h a l f t e . p . 1 7 2 - 1 7 3 . A m s t e r d a m .

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50 ROBERT L . STARKEYM R A K , E . M . , P H A F F , H . J . , AND D O U G L A S , H . C . 1 9 4 2 A s p o r u l a t i o n s t o c k m e d i u m f o r

y e a s t s a n d o t h e r f u n g i . S c i e n c e , 9 6 , 4 3 2 .N I C K E R S O N , W. J . , AND T H M A N N , K . V . 1 9 4 1 T h e c h e m i c a l c o n t r o l o f c o n j u g a t i o n i nZ y g o e a c c h a r o m y c e s . Am. J . B o t a n y , 2 8 , 6 1 7 - 6 2 1 .P R E S C O r T , S . C . , AND D u N N , C . G . 1 9 4 0 I n d u s t r i a l m i c r o b i o l o g y . C h a p . 1 0 a n d 3 3 .M c G r a w - H i l l , New Y o r k .P R U E S s , L . M . , E I C H I N G E R , E . C . , AND P E T E R S O N , W. H . 1 9 3 4 T h e c h e m i s t r y o f m o l dt i s s u e . I I I . C o m p o s i t i o n o f c e r t a i n m o l d s w i t h s p e c i a l r e f e r e n c e t o t h e l i p i d c o n t e n t .Z e n t r . B a k t . P a r a s i t e n k . , I I , 8 9 , 3 7 0 - 3 7 7 .P R U E S S , L . M . , A N D S T R O N G , F . M . 1 9 3 3 T h e l i p i d c o n t e n t o f c e r t a i n m o l d s . J . B i o l .

C h e m . , 1 0 0 , l x x x .RAF, H . 1 9 4 1 - 1 9 4 2 F a t a n d p r o t e i n s y n t h e s i s i n E n d o m y c e s v e r n a l i s a n d o t h e r m i c r o -o r g a n i s m s . A r c h . M i k r o b i o l . , 1 2 , 1 3 1 - 1 8 2 ; C h e m . Z e n t r . , 1 , 3 2 1 7 .R I P P E L , A . 1 9 4 3 B i o l o g i s c h e F e t t g e w i n n u n g d u r c h H e f e n i m L 0 l f t u n g s v e r f a h r e n . N a t u r -w i s s e n s c h a f t e n , 3 1 , 2 4 8 .S M E D L E Y - M A C L E A N , I . 1 9 2 2 T h e c o n d i t i o n s i n f l u e n c i n g t h e f o r m a t i o n o f f a t b y t h e y e a s tc e l l . B i o c h e m . J . , 2 6 , 3 7 0 - 3 7 9 .S M E D L E Y - M A C L E A N , I . , AND H O F F E R T , D . 1 9 2 3 C a r b o h y d r a t e a n d f a t m e t a b o l i s m i ny e a s t . B i o c h e m . J . , 1 7 , 7 2 0 - 7 4 1 .S M E D L E Y - M A C L E A N , I . , AND H O F F E R T , D . 1 9 2 6 T h e c a r b o h y d r a t e a n d f a t m e t a b o l i s m o fy e a s t . P a r t I I I . T h e n a t u r e o f t h e i n t e r m e d i a t e s t a g e s . B i o c h e m . J . , 2 0 , 3 4 3 - 3 5 7 .S M E D L E Y - M A C L E A N , I . , AND T H O M A S , E . M . 1 9 2 0 T h e n a t u r e o f y e a s t f a t . B i o c h e m . J . ,1 4 , 4 8 3 - 4 9 3 .S T A R K E Y , R . L . 1 9 4 4 L i p i d p r o d u c t i o n b y a s o i l y e a s t . J . B a c t . , 4 7 , 5 7 9 - 5 8 0 .S T A R K E Y , R . L . , A N D D s , P . X . 1 9 3 9 A n e w s p e c i e s o f A z o t o b a c t e r . S o i l S c i . , 4 7 , 3 2 9 4 4 3 .S T A R K E Y , R . L . , AND H E N R I C I , A . T . 1 9 2 7 T h e o c c u r r e n c e o f y e a s t s i n s o i l . S o i l S c i . ,

2 3 , 3 3 - 4 5 .T H A Y S E N , A . C . 1 9 4 3 V a l u e o f m i c r o o r g a n i s m s i n n u t r i t i o n ( f o o d y e a s t ) . - N a t u r e ,1 5 1 , 4 0 6 .T H A Y S E N , A . C . , AND M O R R I S , M. 1 9 4 3 P r e p a r a t i o n o f a g i a n t s t r a i n o f T o r u l o p s i s u t i l i e .N a t u r e , 1 5 2 , 5 2 6 - 5 2 8 .T O D D , R . L . , AND H E R R M A N N , W. W. 1 9 3 6 T h e l i f e c y c l e o f t h e o r g a n i s m c a u s i n g y e a s tm e n i n g i t i s . J . B a c t . , 3 2 , 8 9 - 1 0 3 .W A R D , G . E . , L O C K W O O D , L . B . , M A Y , 0 . E . , AND H E R R I C K , H . T . 1 9 3 5 P r o d u c t i o n o f f a tf r o m g l u c o s e b y m o l d s . I n d . E n g . C h e m . , I n d . E d . , 2 7 , 3 1 8 - 3 2 2 .W I C K B E R H A M , L . J . 1 9 4 4 P e r s o n a l c o m m u n i c a t i o n .