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Bqca. Ivan Mara Victoria

Hematologa Clnica2013

CITOQUIMICAAPLICADA A LA HEMATOLOGIA

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Son un complemento de las tinciones hematolgicas.

Por medio de ellas se localizan enzimas y sustanciasinorgnicas. As se mejora la diferenciacin celular. Tambin sirven para el diagnstico

La citoqumica estudia la composicin qumica de laclula y permite detectar la localizacin topogrficade algunos principios inmediatos: enzimas, metalespesados, sustancias orgnicas molculas de depsito y

otras sustancias.

MORFOLOGA BIOQUMICA

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CITOMORFOLOGIA. 70-80%

CITOQUIMICA. 90-95%

INMUNOFENOTIPO

MICROSC. ELECTRN.

MAS 99-

100%

CITOGENETICA Y BIOL. MOLECULAR

CONFIABILIDAD DE LOS METODOS PARA EL DxDE LAS LEUCEMIAS AGUDAS

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MUESTRAS UTILIZADAS EXTENDIDOS DE SANGRE PERIFRICA

PUNCION DE MDULA SEA

PUNCION DE GANGLIOS

LCR

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TIPOS DE TINCIONESSe pueden clasificar en:

Atendiendo al nivel de vitalidad de las clulas que

se pretende colorear, se pueden dividir en vitales yno vitales.

Atendiendo al momento en el que empezaron a ser

utilizadas para el Dx hematolgico, se dividen entradicionales y especiales.

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TINCIONES VITALES Y NO VITALES

Las tinciones vitales y supravitales son aquellas que sepractican sobre clulas que estn vivas.

Las tinciones vitales son aquellas que se efectan sobreclulas que estn vivas, mediante la introduccin de uncolorante en la circulacin de un organismo vivo. Son

colorantes vitales: el verde Jano y elazul de metileno

. Las tinciones supravitales son aquellas que se realizan sobre

clulas o tejidos vivos, pero que estn aislados del organismodel que proceden.

Las tinciones no vitales se realizan sobre clulas muertas. Lacoloracin de clulas muertas requiere un proceso previo defijacin, que tiene por objeto el mantener inalterada suestructura y el adherirlas firmemente a la superficie delportaobjetos.

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TINCIONES TRADICIONALES Y ESPECIALES Colorantes cidos: tienen una especial afinidad por lasestructuras alcalinas de las clulas, como por ejemplo la

hemoglobina (eosina).

Colorantes bsicos: tienen una especial afinidad por lasestructuras cidas de las clulas, como por ejemplo loscidos nucleicos (azul de metileno).

Colorantes neutros: son sales de un cido y de una basecoloreados. Tien el ncleo de un color y el citoplasma deotro (eosinato de azul de metileno).

Colorantes indiferentes: son los que no tienen afinidad porestructuras cidas o bsicas. Son insolubles en el agua ytien a aquellas sustancias que tienen un poder dedisolucin superior al del lquido empleado para preparar lasolucin colorante (Sudn III)

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Tambin hay combinaciones de colorantes

que dan lugar a tinciones polcromas. Una coloracin es panptica cuando se utilizansucesivamente sustancias colorantes neutras.

(May-Grnwald-Giemsa)

Y es pancrmica cuando se aplican todas lassustancias colorantes neutras juntas (azul demetileno, eosina, Wright)

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Las reacciones citoqumicas pueden tambinclasificarse segn el mecanismo qumico

involucrado1-Progresivas estables: Son reacciones que

exigen un tiempo mnimo pero no un mximo.

2-Progresivas indefinidas: En estas la reaccincontina y puede hacer ilegible el preparado oconducir a valores errneos.

3-Fugaces: Son las que pierden colorrpidamente y no pueden conservarse muchotiempo.

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CLASIFICACION DE LAS TCNICAS

CITOQUMICASCITOQUMICA CLSICA

INMUNOCITOQUMICANO FLUORESCENTE

CITOQUMICA FLUORESCENTECITOQUMICA ELCTRNICA

CITOQUMICA AUTOMATIZADA

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Citoqumica Clsica: Se fundamenta en reacciones coloreadas que pueden observarse einterpretarse con el microscopio ptico comn.

Citoqumica electrnica: Se caracteriza por ser una metodologa de elevada sensibilidad

Citoqumica Fluorescente: puede o no ser inmunocitoqumica, se fijan sobre distintasestructuras de las clulas y al ser excitadas por luz UV producen fluorescencias de distintos colores

Inmunocitoqumica no fluorescente:Se basa en la marcacin de anticuerpos consustancias que son capaces de dar reacciones citoqumicas intensamente coloreadas que permiten su revelacin.

Fisicocitoqumca electrofortica Permite reconocer determinados componentesde las organelas celulares obtenidas en solucin mediante la lisis de la misma. Mediante electroforesis en un

campo elctrico y la identificacin por reacciones citoqumicas, permite identificar complejos isoenzimticos,mientras que los mtodos citoqumicos simples revelan una enzima en bloque.

Citoqumica automatizada: Es el fundamento de la CMF que utiliza la citoqumicafluorescente

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CITOQUIMICA ELECTRONICA:

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CITOQUIMICA FLUORESCENTE:

INMUNES

NO INMUNESS

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INMUNOCITOQUMICA NO FLUORESCENTE

Inmunocitoqumica con deteccinindirecta y enzimtica. La seccinse obtiene de tejido previamentefijado. Inmediantemante despusse incuban en una solucin debloqueo que satura los posiblessitios de unin inespecfica, graciasa una alta concentracin deprotena como la albmina de suerobovino. Tras cada paso de unin deanticuerpos o del complejo avidina-biotina-peroxidasa se procede alavar los cortes en una solucintamponada de fosfato (tampnfosfato), en la que tambin van

disueltos los anticuerpos. Lareaccin de la peroxidasa convierteunos sustratos, la diaminobencidinay el perxido de hidrgeno, en unproducto insoluble y coloreadovisible con el microscopio tico.

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CITOQUIMICA AUTOMATIZADA:

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Definicin de reaccin citoqumicaEs la reaccin que por el mtodo de uno o mas

reactivos qumicos: aplicados a la clula encondiciones definidas; determina la formacin de

productos coloreados; insolubles; no difusibles;que permiten el reconocimiento microscpico; desustancias o grupos qumicos definidos; en su

real ubicacin citolgica; para lo cual no debendestruir a la clula, y si lo hacen deben

reemplazar a la sustancia identificada en sutopografa

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Las finalidades primordiales

El reconocimiento y diagnostico celular

El estudio de la fisiologa y la fisiopatologacelulares

El Dx de la patologa

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ESTANDARIZACION DE METODOS ENCITOQUIMICA

Preparacin estricta de los reactivos

Practicas permanentes de las reacciones con preparados testigos

Realizacin, la fijacin y conservacin adecuada de los preparados yreactivos

Determinacin de tiempos exactos para cada uno de los pasos

dem de temperatura (especial para enzimas)

Tiempo y condiciones de la inmersin para la lectura

Dimetros y conservacin idneos de los elementos sobre los cualesse lleva a cabo la determinacin

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Tres pasos fundamentales:

Fijacin: preservar las estructuras y reactividad funcional de lasclulas.

Incubacin en el medio de reaccin: como consecuencia se generan

productos que ponen en evidencia el componente a ser estudiado.

Contraste: permite detectar con mayor facilidad el producto dereaccin .

Las reacciones deben tener 3caractersticas:sensibilidad, especificidad y

reproductibilidad .

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Pueden ser reconocibles.

SUSTANCIAS RECONOCIBLES:

1-DNA Y RNA.2-PROTEINAS.3-HEMOGLOBINA.4-HIDRATOS DE CARBONO.5-LIPIDOS.6-FOSFOLIPIDOS.

7-METALES

ENZIMAS RECONOCIBLES

1-MIELOPEROXIDASAS (MPO)2-FOSFATASA ALCALINA (FAL)3-FOSFATASA ACIDA (FAC)4-ESTERASAS (EST)5-FOSFATASA ACIDA TARTRATORESISTENTE (FAC-TR)

6-DEHIDROGENASAS (DH)

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CITOQUIMICA CLASICA

reconocimiento por:principios no enzimticos principios enzimticos

Hidratos de carbonos: PAS MPO

Fe hemosidernico: PERLS FAL

Lpidos: Red Ol/Sudan Black FAL

Hemoglobina fetal: elucin acida ESTEARASAS

CATALASAS

ENZIMAS HIDROLITICAS

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TINCIONES CLASICAS1) RECONOCIMIENTO DE SUSTRATOS NO

ENZIMATICOS

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TINCIN DE PAS

(Peryodic Schiff Acid)Se basa en la rotura de los enlaces -C-C- presentes en loscarbohidratos por la accin del cido perydico, potente

agente oxidante, liberndose grupos aldehdo que alcombinarse con el reactivo de Schiff dan un compuesto de

color rojo prpura intenso.

-C-C- ALDEHIDOS PURPURA

ACIDO PERYODICO SCHIFF

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RESULTADOS: clulas (+) con patrn difuso fucsiaintenso, lacunar y granular de acuerdo a la progenie

Serie granulocitica normal: (+) difusa en toda la seriemieloide

Basfilos: (+) con patrn lacunar o () hasta un 50%

Serie eritroide normal: negativa

Serie megacariocitica normal: (+) en plaquetas con unpatrn difuso mas granular o bloques

Precursores linfoides: (-), hasta llegar a linfocito en elque un 30% es (+) en corona de grnulos

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NEUTROFILO Y ERITROBLASTOS NORMALES

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MEGACARIOCITOS Y PLAQUETAS NORMALES

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LINFOBLASTOS LEUCEMICOS PAS (+)LMA6 en MO PAS (+)

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TINCION DE PERLS Se basa en la liberacin de los iones frricos de su

unin con las protenas por la accin del cido

clorhdrico; dichos iones frricos al reaccionar conel ferrocianuro potsico dan un precipitado azulverdoso de ferrocianuro frrico.

Por esta reaccin se detecta el Fe hemosidernico, quees insoluble, pero no el Fe contenido en la ferritina quees hidrosoluble.

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Sideroblastos en anillo

Reflejando una anormalidaden la acumulacin de Fe enlas mitocondrias(azul de Prusia)

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HEMOSIDENURIA: hierro liberado en orina en una HPN

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En el estudio del Fe medular hay que valorarconjuntamente 3 parmetros:

n de sideroblastos, tipo de los mismos y Femacrofgico.Bsicamente se presentas 3 patrones:

1) n sideroblastos alto y Fe de depsito aumentado: esfrecuente hallarlo en estados anmicos que cursan consobrecarga frrica.

2) n sideroblastos bajo y Fe de depsito disminuido oausente: es el patrn caracterstico de la anemiaferropnica pura; de aparicin muy precoz en un balancefrrico negativo.

3) n sideroblastos bajo con acmulo de Fe en losmacrfagos medulares. Este patrn disociado es propio deentidades que condicionan un bloqueo del Fe a nivel de losmacrfagos, por lo que el Fe no puede ser cedido a loseritroblastos, suele observarse en anemias secundarias.

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Hemocromatosis(cortes histolgicos de

hgado)

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HEMOGLOBINA FETALTest de Kleihauer-Betke

La hemoglobina fetal (HbF o 22) es cido y lcaliresistente. Por consiguiente, sometiendo unpreparado fresco de sangre a una elucin cidaser arrastrada la hemoglobina A y retenida la

fetal dentro de los eritrocitos, lo cual se reconocepor la coloracin de estos ltimos.

Los hemates con hemoglobina fetal se colorean con

eritrosina o eosina. Los que contienen hemoglobinaA han sido reducidos a sus membranas vacas yaparecen como sombras.

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Esta prueba se usa para determinar si hay GR

del feto en una mujer embarazada con ungrupo sanguneo Rh(-).

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SUDAN BLACK / RED OILAmbas se utilizan para la deteccin de lpidos,

en el caso del Sudan Black este tie los

fosfolpidos y esteroles de membrana de losgrnulos.

Es un colorante lipofilo que se une de forma

irreversible a un componente granular indefinidoen los granulocitos, en los eosinofilos y en algunosmonocitos.

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Tie tanto los grnulos azurfilosinespecficos como los especficos

de los neutrofilos

El producto dela reaccin esnegro ygranular

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LMA2 (con eosinofilia t(8;21): intensa tincin delas clulas en maduracin y de los grnulos de

los eosinofilos anormales.

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2) RECONOCIMIENTO DE SUSTRATOSENZIMATICOS

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MIELOPEROXIDASALa demostracin citoqumica de esta enzima se

basa en la accin oxidante de la peroxidasa sobreun sustrato (bencidina) en presencia de perxido

de hidrgeno, apareciendo un precipitado azul enel lugar del citoplasma en donde se ha producidola reaccin.

BENCIDINA

H2O2MPO

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Resultados.siempre patrones granulares! ERITROCITOS Y SU PROGENIE : NEGATIVOS (etanol)

GRANULOCITOS Y SU PROGENIE : (+) patrn granular intenso entoda la serie granuloctica mieloide y en menos del 3% de los blastos enMO. Los blastos mieloides dan un patrn caracterstico polar, en casquete.

EOSINFILO (+) en la membrana granular, el fondo del granuloconserva la coloracin parda.

BASFILO (+) en 50%

LINFOCITOS Y SU PROGENIE: NEGATIVOS MONOCITOS: (+) patrn granular escaso o disperso

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NORMALES..

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PATOLOGICOS

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ESTRES OXIDATIVOScorificacin de MPO en granulocitos:

Se categorizaron los neutrfilos de acuerdo al contenido degrnulos presente en el citoplasma, en scores que van de 0 a 4,en orden creciente.

Grado 0: Sin granulaciones teidas. (fig. 1 y

2)

Grado 1: Escasas granulaciones teidas

dispersas (fig.3 y 4)

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Grado 2: Regulares granulaciones sincubrir el ncleo (fig. 5)

Grado 3: abundantes granulaciones teidas en

todo su citoplasma sin llegar a cubrir

completamente el ncleo. (fig.6 )

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Grado 4: granulaciones que cubren la clula completamente dndoles unaspecto de casquete. (fig.8 y 9)

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FOSFATASA ALCALINA

La FA es una fosfomonoesterasa que es activa francamente aph alcalino y acta sobre grupos esteres fosforados liberando

el ion fosfato.

La actividad de la FA granuloctica es marcadora de lagranulacin especifica de los neutrfilos.

Inicialmente se pens que la FA estaba localizada en grnulos

especficos (secundarios), pero se demostr que esta asociadacon un componente membranoso del citoplasma identificadocomo una estructura tubular de forma irregular distinta de los

grnulos 1 o 2 y de otras organelas citoplasmticas.

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ph alcalino

FAL

Alfa-naftil fostato

naftilo fosfato

Colorantediazoico

Compuesto diazotado

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Cuidados: Efectuar la reaccin en frotis de no mas de 24 hs. Conservar los preparados en heladera envueltos en

papel absorbente con un desecador. Ph de la reaccin

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La actividad granulocitica de la FA semanifiesta en forma de un

precipitado de color pardo negruzcolocalizado en el citoplasma

. Se encuentran actividad FA enalgunas clulas maduras ysemimaduras de la

granulopoyesis neutrofilica

(segmentados y bandas)

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ndice de actividad de FAL

Grado 0: sin reaccin

Grado I: coloracin difusa o con pequeos puntos coloreados

Grado II: mayor densidad cromtica, por lo general en la zona del hilio nuclear.

Grado III: mayor granulacin oscura, tie todo el citoplasma.

Grado IV: completamente oscuro

Es la suma de los grados de posit ividad de 100neutrfilos.

Score: 95+/-20

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Su mximo inters se centra en el estudiodelos sndromes mieloproliferativos: LMC valoresmuy bajos o nulos. Su determinacin es muy tilpara establecer el diagnstico diferencialentre LMC y reacciones neutroflicassecundarias que cursan con valoreselevadsimos.

Hemoglobinuria Paroxstica Nocturna Hipofosfatemia hereditaria.

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FOSFATASA ACIDASe basa en la hidrlisis del substrato

naftol-AS-Bi-fosfato.

La aplicacin prctica del estudio de la FA se refiere sobretodo al estudio de los sndromes linfoproliferativos

crnicos (LPC) y leucemia aguda linfoblstica (LAL), dndeexiste una buena correlacin entre el tipo de positividad y

el fenotipo de membrana.

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FAC LT(+) Y LB (-)

El 90% de las LAL de origen T dan una reaccin + intensa de localizacincentrosmica. La LLC-T y otros SLPC T suelen cursar con valores

elevados de FAC que es tartrato sensib le. La LLC-B presenta muy escasaactividad al igual que ocurre con otras proli feraciones de linfoci tos B.

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LLA-T: INTENSA ACTIVIDAD CENTROSOMICA DE FOSFATASA ACIDA ENMAS DEL 70 % DE LOS BLASTOS.

Tricoleucemia: Tincin fosfatasa cida (+) tartrato resistente

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ESTEARASAS Son un grupo de enzimas capaces de hidrolizar

una variedad de esteres alifticos u aromticos

en condiciones neutras o cidas.

Se distinguen tres tipos:

Esterasa especfica para lnea granuloctica

Esterasa monoctica

Esterasas comunes: son expresadas por varias

clulas hematopoyticas

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La demostracin citoqumica de las esterasasleucocitarias se basa generalmente en la habilidad de

reaccionar con el grupo ester del Naftol AS.

Los sustratos para las esterasas de uso comn enhematologa incluyen:

Naftol AS-D Cloroacetato Naftol AS-D acetato ( NASDA) -Naftil acetato -Naftil butirato

Estos sustratos al ser hidrolizados en presencia de unasal diazoica dan un precipitado insoluble en el lugar de

la reaccin.

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CLOROACETOESTEARASA (CEA) SUSTRATO ESPECIFICO: Naftol AS-D Cloroacetato

Es una esterasa que muestra una actividad especfica

para la lnea granuloctica.

Aparece ontognicamente posterior a

mieloperoxidasa por lo que es menos sensible paralos blastos muy inmaduros.

Los eosinoblastos que son positivos para peroxidasa

no muestran actividad para esta reaccin.

Las lneas monoctica, eritroide, linfoide ymegacarioctica son negativa.

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NAFTOL AS-D ACETATO ( NASDA)

Detecta las 3 esterasa: granulocticas: N, Eo, Ba

Monoctica comunes

La esterasa granuloctica es resistente a la inhibicin conFna mientras la monoctica es sensible al FNa.

Las esterasas comunes tienen un comportamiento variablefrente al FNA.

Los precursores de la lnea eosinofila son normalmente

negativos sin embargo la LMA M4 Eo es consistentementepositiva a esta reaccin ( inv 16).

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-NAFTIL ACETOESTERASA (ANAE)

Detecta las esterasas monoctica y esterasascomunes. Las esterasas granulocticas son normalmente noreactivas. El patrn observado en las esterasas monocticas esdifuso moderado a intenso y sensible a la inhibicinconFNa.

Las esterasas comunes muestran diferentes gradosde sensibilidad al FNa y presentan patrones dereaccin granular o focal.

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-Naftil butirato

Es el sustrato especfico para las esterasas

monoctica pero a pesar de su aparente

especificidad no es recomendado por el Comit

Internacional de Hematologa por su costo

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Granulocitos Linfocitos Monocitos Plaquetas Eritrocitos

Mb Seg

Lbl Lin

Mbl Mon

Mg Pq PEbl GR

PAS

Fe

MPO

FAL

FAC

ANAE

NCAE

Sudan

Black

EN RESUMEN..

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Progenie l infoide normales (-) Hasta l legar al linfocito donde un30% es (+) en corona degrnulos

Linfoblastos leucmicos (+) Positividad en mazacotes

Serie roja normal (-) Serie roja anormal (+) [LMA6]

Serie granulocitica (+) difusa

PAS en neutrofilos con unpatrn difuso

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Reaccin de PAS, mdula

sea. Grnulos gruesos en el

citoplasma de los

linfoblastos.

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LMA6 (eritroide) MO PAS : todos los precursores eritroidecontienen glucgeno, nunca los normales.

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La demostracin citoqumica se basa en la hidrlisisde ciertos substratos, de los cuales se liberan unosproductos intermedios que combinados con una sal

diazoica dan un precipitado coloreado.

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