150831 fly テックの一言コラム 2015年9月号これから創薬を始める方へ[ vol. 4]...

1
これから創薬を始める方へ Vol. 4酵素阻害剤編 2015 9 月号 酵素阻害剤をとらえようしたときに、どんなアッセイ系を構築し ますか。 系を構築するにあたり考慮する点として、シグナルが検出できる ことは言わずもがなですが、コスト計算はもとより、簡便性、所 要時間、false positivefalse negative がないこと、さらにできれ ば希望するようなものが取れるようにする、なんていうのもあり ます。 酵素反応が、単純な Michaelis-Menten の式にどこまで当てはま るのかどうかはさておき、参考になることがあります。酵素量 や基質量の調整です。教科書的には可逆的阻害剤には、 competitivenon-competitiveun-competitive な阻害剤があり、 次のような阻害様式で示されます。 酵素と基質の親和性を Km、酵素と阻害剤の親和性を Ki とし ます。 E :酵素 S:基質 I :阻害剤 P:反応生成物 たとえば Kinase 阻害剤について考えます。もちろん Kinase は単 一基質ではありませんが、ここでは単純に考えます。 下記の図は、典型的な Kinase のアッセイで、ATP の濃度を振っ た場合に得られる理論的な阻害剤の IC50 を示しています。ATP の濃度が Km の何倍か、阻害剤の IC50 Ki の何倍かを表して います。 ATP competitive な阻害剤の場合、ATP 濃度を Km と同じにし た場合は、実験で得られる IC50 Ki 2 倍になります。とこ ろが ATP の濃度を Km 10 倍にすると得られる IC50 Ki 10 倍強。IC50 5 倍違うということは、ある濃度で 50% 阻害 を示すものが ATP 濃度が高いと 20% 阻害以下になってしまうこ とになります。 Kinase assay を構築するにあたり、もしも ATP competitor を望 まないのであれば、アッセイ中の ATP の濃度を高く設定するこ とにより、ATP competitor Hit を減らすことができます。また この原理を使って、Hit したものが、ATP competitive か見ること ができます。また ATP 濃度を下げた方が ATP competitive 阻害剤 が見つけやすくなりますが、Km よりも下げてもさほど大きな効 果はないともいえます。 そもそも、上記は 1 基質酵素反応で考えており、実際にはそん な単純ではないし、不可逆阻害剤もありえます。そもそも薬理 作用を示すかどうかが重要なのだから、あまり深く考えても仕 方がないのかもしれません。 さて、多くの酵素は細胞内に存在していますので、前述のセル フリー in vitro アッセイを示した薬剤は、細胞内の酵素に実際に 結合するのでしょうか。 セルフリーアッセイは、すべてが人口的に作られた環境ですので、 アッセイ系での役者はすべてわかっていてクリアーですが、実際 の細胞内での反応系は未知のものがたくさんあります。細胞内 のタンパク質は多くの分子と相互作用をしているといわれてい るので、本来の酵素の環境下で、その活性を確認することが理 想です。 セルフリーの系であれば、分子間相互作用を調べる方法として SPR 等が利用されますが、セルベースとなるとなかなか一般的 な方法はありません。そんな細胞内での酵素への結合活性を BRET の技術を用いた Target Engagement のアッセイ法の開発を 現在 Promega では行っています。 この方法を用いることにより、昨今話題になっている薬剤の Residence Time による評価も可能になります。こちらの技術は機 会を改めてご紹介いたします。 テクニカルの コラム ひと こと 0.1 1 10 100 0.01 0.1 1 10 100 IC50 [ x Ki] 基質ATP濃度. [ x Km] competitive un-competitive un-competitive non-competitive Sensitive Sensitive competitive non-competitive competitive un-competitive competitive un-competitive non-competitive NanoBRET Target Engagement Tracer NLuc テクニカルサービス Tel. 03-3669-7980 Fax. 03-3669-7982 E-Mail : [email protected] プロメガ株式会社 本   社 〒103-0011 東京都中央区日本橋大伝馬町14-15 マツモトビル Tel. 03-3669-7981 Fax. 03-3669-7982

Upload: others

Post on 06-Feb-2021

0 views

Category:

Documents


0 download

TRANSCRIPT

  • これから創薬を始める方へ [Vol. 4]~ 酵素阻害剤編 ~

    2015年9月号

    酵素阻害剤をとらえようしたときに、どんなアッセイ系を構築しますか。

    系を構築するにあたり考慮する点として、シグナルが検出できることは言わずもがなですが、コスト計算はもとより、簡便性、所要時間、false positive、false negative がないこと、さらにできれば希望するようなものが取れるようにする、なんていうのもあります。

    酵素反応が、単純な Michaelis-Menten の式にどこまで当てはまるのかどうかはさておき、参考になることがあります。酵素量や基質量の調整です。教科書的には可逆的阻害剤には、competitive、non-competitive、un-competitive な阻害剤があり、次のような阻害様式で示されます。酵素と基質の親和性を Km、酵素と阻害剤の親和性を Ki とします。

    E:酵素 S:基質 I:阻害剤 P:反応生成物

    たとえば Kinase阻害剤について考えます。もちろん Kinase は単一基質ではありませんが、ここでは単純に考えます。

    下記の図は、典型的な Kinase のアッセイで、ATP の濃度を振った場合に得られる理論的な阻害剤の IC50を示しています。ATP の濃度が Km の何倍か、阻害剤の IC50が Ki の何倍かを表しています。

    ATP に competitive な阻害剤の場合、ATP 濃度を Km と同じにした場合は、実験で得られる IC50は Ki の 2倍になります。ところが ATP の濃度を Km の 10倍にすると得られる IC50は Ki の10倍強。IC50が 5倍違うということは、ある濃度で 50%阻害を示すものが ATP 濃度が高いと 20%阻害以下になってしまうことになります。

    Kinase の assay を構築するにあたり、もしも ATP competitor を望まないのであれば、アッセイ中の ATPの濃度を高く設定することにより、ATP competitor の Hit を減らすことができます。またこの原理を使って、Hit したものが、ATP competitive か見ることができます。また ATP 濃度を下げた方が ATP competitive 阻害剤が見つけやすくなりますが、Km よりも下げてもさほど大きな効果はないともいえます。

    そもそも、上記は 1基質酵素反応で考えており、実際にはそんな単純ではないし、不可逆阻害剤もありえます。そもそも薬理作用を示すかどうかが重要なのだから、あまり深く考えても仕方がないのかもしれません。

    さて、多くの酵素は細胞内に存在していますので、前述のセルフリー in vitro アッセイを示した薬剤は、細胞内の酵素に実際に結合するのでしょうか。

    セルフリーアッセイは、すべてが人口的に作られた環境ですので、アッセイ系での役者はすべてわかっていてクリアーですが、実際の細胞内での反応系は未知のものがたくさんあります。細胞内のタンパク質は多くの分子と相互作用をしているといわれているので、本来の酵素の環境下で、その活性を確認することが理想です。

    セルフリーの系であれば、分子間相互作用を調べる方法として SPR 等が利用されますが、セルベースとなるとなかなか一般的な方法はありません。そんな細胞内での酵素への結合活性を BRET の技術を用いた Target Engagement のアッセイ法の開発を現在 Promegaでは行っています。

    この方法を用いることにより、昨今話題になっている薬剤の Residence Time による評価も可能になります。こちらの技術は機会を改めてご紹介いたします。

    テクニカルの コラムひとこと

    0.1

    1

    10

    100

    0.01 0.1 1 10 100

    IC50

    [ x

    Ki]

    基質ATP濃度. [ x Km]

    competitive un-competitive

    un-competitive

    non-competitive

    Sensitive

    Sensitive

    competitive

    non-competitive

    competitive

    un-competitive

    competitive un-competitivenon-competitive

    現在 Promegaでは行っています。

    NanoBRET Target Engagement

    Tracer

    NLuc

    テクニカルサービスTel. 03-3669-7980/Fax. 03-3669-7982E-Mail : [email protected]

    プロメガ株式会社本   社 〒103-0011東京都中央区日本橋大伝馬町14-15 マツモトビルTel. 03-3669-7981/Fax. 03-3669-7982