13. vorlesung ws 2005/06 software-werkzeuge der bioinformatik1 v13 zusammenfassung (v1 – v12)...

13. Vorlesung WS 2005/06

Software-Werkzeuge der Bioinformatik

1

V13 Zusammenfassung (V1 – V12)

Inhalt dieser Veranstaltung: Softwarewerkzeuge für

I Sequenzanalyse

II Analyse von Proteinstruktur und Ligandenbindung

III Zell- bzw. Netzwerksimulationen

auf den folgenden Folien ist der klausurrelevante Teil der Vorlesungzusammengefaßt.



2

Organisatorisches: Scheinvergabe- Bewertung: Vorlesung zählt 2V + 2P = 9 Leistungspunkte- Curriculum: Pflichtvorlesung für die Vertiefung „Bioinformatics“ (neue PO)- kann für CMB-Bachelor eingebracht werden- Wahlfach Pharmazie/Diplom, M.Sc. Biotechnologie

- Benotung der Scheine:

50% der Benotung ergibt sich aus der mittleren Benotung von drei praktischen Aufgaben, die während des

Semesters von jedem Studenten einzeln zu bearbeiten sind.

Die Aufgaben werden etwa alle 4 Wochen ausgegeben und sind innerhalb von 2 Wochen zu bearbeiten

und durch ein mindestens 5-seitiges Protokoll zu dokumentieren. Jeder Student muss mindestens zwei

der drei praktischen Aufgaben mit einer Note von 4 und besser bestehen.

Am Ende des Semesters wird eine 2-stündige Klausur über die Inhalte der Vorlesung und der Übungen

geschrieben. Die Klausurnote geht ebenfalls mit 50% in die Scheinnote mit ein. Die Klausur muss mit

einer Note von 4 und besser bestanden werden.



3

Sequenzanalyse



4

Ziele

(0) Identifiziere alle menschlichen Proteine (ORFs) und ihre Funktion

Sind dies alle Proteine?

Nein: post-translationelle Modifikationen möglich wie Methylierung,

Phosphorylierung, Glykosilierung …

(1) Identifiziere Gen-Netzwerke. Welche Proteine wechselwirken miteinander?

(2) Identifiziere Module: abgeschlossene Einheiten

(3) Identifiziere Sequenz-Abschnitte, in denen Mutationen für Krankheiten codieren



5

Was hat nun Sequenz-Konservierung mit Proteinstrukturen zu tun?

sehr viel!

Die Twilight zone kennzeichnet das Mass an Sequenzidentität, bis zu der zwei

Proteinstrukturen mit hoher Wkt. die gleiche Struktur besitzen.

Richtlinien von Doolittle:

• Sequenzen mit > 150 Residuen und 25% Sequenzidentität sind wahrscheinlich verwandt

• mit 15-20% Sequenzidentität können sie verwandt sein

• bei <15% Sequenzidentität ist es schwierig zu sagen ob sie verwandt sind oder nicht ohne weitere strukturelle oder funktionelle Hinweise

Proteinstruktur Sequenz

TWILIGHT ZONE



6

- Konservierung von Residuen sind Indizien für den Verwandtschaftsgrad von

Proteinen, für die Evolution und für die Verwandtschaft von Organismen

Q: aus welchen Gründen können bestimmte Bereiche der Proteinsequenz

konserviert sein?

- Konservierung von Residuen im aktiven Zentrum

- Konservierung von Residuen, die die Architektur der Proteinstruktur stabilisieren

- Konservierung von Residuen, die während Faltung des Proteins wichtig sind

- Konservierung von Residuen an Bindungsschnittstellen für Liganden und

andere Proteine

Proteinstruktur Sequenz



7

Eigenschaften der Aminosäuren

Aminosäuren unterscheiden sich in ihren physikochemischen Eigenschaften.

Q: müssen Bioinformatiker die Eigenschaften von Aminosäuren kennen?



8

Transmembrandomänen: Hydrophobizitätsskalen

http://blanco.biomol.uci.edu/mpex/Stephen White group, UC Irvine

TM Helices sind 20 Residuen lange

Abschnitte aus vorwiegend hydrophoben

Resiuden.



9

V2 Paarweises Sequenzalignment

• Methoden des Sequenzalignments

• Áustauschmatrizen

• Bedeutsamkeit von Alignments

• BLAST, Algorithmus – Parameter – Ausgabe http://www.ncbi.nih.gov

• Diese Vorlesung lehnt sich eng an das BLAST Tutorial-

• Buch (links) an, Kapitel 3-9

• siehe auch Vorlesung Bioinformatik I von Prof. Lenhof,

• Wochen 3 und 5



10

Sequenz-Alignment

•Wenn man 2 oder mehr Sequenzen vorliegen hat, möchte man zunächst

einmal

- ihre Ähnlichkeiten quantitativ erfassen

- Entsprechungen zwischen einzelnen Bausteinen beider Sequenzen erfassen

- Gesetzmässigkeiten der Konservierung und Variabilität beobachten

- Rückschlüsse auf entwicklungsgeschichtliche Verwandschaftsverhältnisse

ziehen

-Wichtiges Ziel: Annotation, z.B. Zuordnung von Struktur und Funktion



11

Suche in Datenbanken

•Identifiziere Ähnlichkeiten zwischen

• einer neuen Testsequenz, deren

• Struktur und Funktion unbekannt und nicht charakterisiert ist

•und

Sequenzen in (öffentlichen) Datenbanken

deren Strukturen und Funktionen bekannt sind.

•N.B. Die ähnlichen Regionen können die ganze Sequenz, oder Teile von

ihr umfassen!

• Lokales Alignment globales Alignment



12

Ähnlichkeit von Aminosäuren•Margaret Dayhoff stellte die Ähnlichkeit (beobachtete Austauschhäufigkeiten zwischen

verwandten Sequenzen) zwischen Aminosäuren als log2 odds Verhältnis, oder lod score dar.

•

•Lod score einer Aminosäure: nehme den Logarithmus zur Basis 2 (log2) von dem Verhältnis

der beobachteten Häufigkeit für ein Paar durch die zufällig für das Paar erwartete Häufigkeit.

•Lod score = 0 → beobachtete und erwartete Häufigkeiten sind gleich

• > 0 → ein Austauschpaar tritt häufiger auf als zufällig erwartet

• < 0 → unwahrscheinlicher Austausch

•Allgemeine Formel für den Score sij von zwei Aminosäuren i und j.

ji

ijij pp

qs log mit den individuellen Häufigkeiten pi und pj,

und der Paarungsfrequenz qjj,



13

Ähnlichkeit der Aminosäuren•Beispiel: die relative Häufigkeiten von Methionin und Leucin seien 0.01 und 0.1.

•Durch zufällige Paarung erwartet man 1/1000 Austauschpaare Met – Leu.

•Wenn die beobachtete Paarungshäufigkeit 1/500 ist, ist das Verhältnis der

•Häufigkeiten 2/1.

•Im Logarithmus zur Basis 2 ergibt sich ein lod score von +1 or 1 bit.

•Wenn die Häufigkeit von Arginin 0.1 und die Paarung mit Leu mit Häufigkeit 1/500 ist, dann ergibt

sich ein lod score für ein Arg – Leu Paar von -2.322 bits.

•Gewöhnlich berechnet man nats, multipliziert die Werte mit einem Skalierungsfaktur und rundet

sie dann auf Integer Werte

•→ Austauschmatrizen PAM und BLOSUM.

•Diese Integer-werte nennt man raw scores.



14

Bewertungs- oder Austausch-Matrizen

– dienen um die Qualität eines Alignments zu bewerten

–Für Protein/Protein Vergleiche:

eine 20 x 20 Matrix für die Wahrscheinlichkeit mit der eine bestimmte

Aminosäure gegen eine andere durch zufällige Mutationen ausgetauscht

werden kann.

–Der Austausch von Aminosäuren ähnlichen Charakters (Ile, Leu) ist

wahrscheinlicher (hat einen höheren Score) als der von Aminosäuren

unterschiedlichen Charkters (e.g. Ile, Asp).

–Matrizen werden als symmetrisch angenommen, besitzen also Form

einer Dreiecksmatrix.



15

Substitutions-Matrizen

•Nicht alle Aminosäuren sind gleich

– Einige werden leichter ausgetauscht als andere

– Bestimmte Mutationen geschehen leichter als andere

– Einige Austausche bleiben länger erhalten als andere

•Mutationen bevorzugen bestimmte Austausche

– Einige Aminosäuren besitzen ähnliche Codons

– Diese werden eher durch Mutation der DNA mutiert

•Selektion bevorzugt bestimmte Austausche

– Einige Aminosäuren besitzen ähnliche Eigenschaften und Struktur



16

PAM250 Matrix



17

Beispiel für eine Bewertung

•log (A B) = log A + log B

Die Bewertung (Score) eines Alignments ist die Summe aller

•Bewertungen für die Paare an Aminosäuren (Nukleinsäuren) des

Alignments:

•Sequenz 1: TCCPSIVARSN•Sequenz 2: SCCPSISARNT• 1 12 12 6 2 5 -1 2 6 1 0 => Alignment Score = 46



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Dayhoff Matrix (1)

– wurde von M.O. Dayhoff aufgestellt, die statistische Daten über die

Austauschhäufigkeit von Aminosäuren sammelte

– Datensatz von eng verwandten Proteinsequenzen (> 85% Identität).

–Diese können zweifelsfrei aligniert werden.

– Aus der Frequenz, mit der Austausche auftreten, wurde die 20 x 20 Matrix

für die Wahrscheinlichkeiten aufgestellt, mit der Mutationen eintreten.

– Diese Matrize heisst PAM 1. Ein evolutionärer Abstand von 1 PAM (point

accepted mutation) bedeutet, dass es 1 Punktmutation pro 100 Residuen

gibt, bzw. Dass die beiden Sequenzen zu 99% identisch sind.



19

•Log odds Matrix: enthält den Logarithmus der Elemente der PAM Matrizen.

•Score der Mutation i j

•beobachtete Mutationsrate i j

= log( )

• aufgrund der Aminosäurefrequenz erwartete Mutationsrate

•Die Wkt zweier unabhängiger Mutationsereignisse ist das Produkt der

Einzelwahrscheinlichkeiten.

•Bei Verwendung einer log odds Matrix (d.h. bei Verwendung der

logarithmisierten Werte) erhält man den gesamten Score des Alignments

als Summe der Scores für jedes Residuenpaar.

Dayhoff Matrix (2)



20

•Aus PAM 1 kann man Matrizen für grössere evolutionäre Entfernungen

herstellen indem man die Matrix mehrfach mit sich selbst multipliziert.

•PAM250:

– 2,5 Mutationen pro Residue

– entspricht 20% Treffern zwischen zwei Sequenzen,

– d.h. man beobachtet Änderungen in 80% der

Aminosäurepositionen.

– Dies ist die Default-Matrize in vielen Sequenzanalysepaketen.

Dayhoff Matrix (3)



21

BLOSUM Matrix

•Einschränkung der Dayhoff-Matrix:

•Die Matrizen, die auf dem Dayhoff-Modell der evolutionären Raten basieren,

sind von eingeschränktem Wert, da ihre Substitionsraten von

Sequenzalignments abgeleitet wurden, die zu über 85% identisch sind.

•Ein anderer Weg wurde von S. Henikoff und J.G. Henikoff eingeschlagen,

welche lokale multiple Alignments von entfernter verwandten Sequenzen

verwendeten.

•Ihre Vorteile:

- grössere Datenmengen

- multiple Alignments sind robuster



22

BLOSUM Matrix (2)

•Die BLOSUM Matrizen (BLOcks SUbstitution Matrix) basieren auf der BLOCKS

Datenbank.

•Die BLOCKS Datenbank verwendet das Konzept von Blöcken (lückenlose

Aminosäure-Signaturen), die charakteristisch für eine Proteinfamilie sind.

•Aus den beobacheten Mutationen innerhalb dieser Blöcke wurden

Austauschwahrscheinlichkeiten für alle Aminosäurepaare berechnet und für eine

log odds BLOSUM matrix benutzt.

•Man erhält unterschiedliche Matrizen indem man die untere Schranke des

verlangten Grads an Identität variiert.

•z.B. wurde die BLOSUM80 Matrix aus Blöcken mit > 80% Identität abgeleitet.



23

Welche Matrix soll man benutzen?

•Enge Verwandtschaft (Niedrige PAM, hohe Blosum)

Entfernte Verwandtschaft (Hohe PAM, niedrige Blosum)

•Vernünftige Default-Werte: PAM250, BLOSUM62



24

Gewichtung von Lücken (Gaps)

•Neben der Substitutionsmatrix braucht man auch eine Methode zur Bewertung

von Lücken.

•Welche Bedeutung haben Insertionen und Deletionen im Verhältnis zu

Substitutionen?

• Unterscheide Einführung von Lücken:

• aaagaaa

• aaa-aaa

• von der Erweiterung von Lücken:

• aaaggggaaa

• aaa----aaa

•Verschiedene Programme (CLUSTAL-W, BLAST, FASTA) empfehlen

unterschiedliche Default-Werte, die man wohl erst einmal verwenden sollte.



25

Needleman-Wunsch Algorithmus

-- allgemeiner Algorithmus für Sequenzvergleiche

-- maximiert einen Ähnlichkeitsscore

-- bester Match = grösste Anzahl an Residuen einer Sequenz, die zu denen

einer anderen Sequenz passen, wobei Deletionen erlaubt sind.

-- Der Algorithmus findet durch dynamische Programmierung das bestmögliche

GLOBALE Alignment zweier beliebiger Sequenzen

-- NW beinhaltet eine iterative Matrizendarstellung

- alle möglichen Residuenpaare (Basen oder Aminosäuren) – je eine

von jeder Sequenz – werden in einem zwei-dimensionalen Gitter dargestellt.

- alle möglichen Alignments werden durch Pfade durch dieses Gitter

dargestellt.

-- Der Algorithmus hat 3 Schritte: 1 Initialisierung 2 Auffüllen 3 Trace-back



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Needleman-Wunsch Algorithm: Initialisierung

•Aufgabe: aligniere die Wörter “COELACANTH” und “PELICAN” der Länge m =10 und n

=7. Konstruiere (m+1) (n+1) Matrix.

•Ordne den Elementen der ersten Zeile und Reihe die Werte – m gap und – n gap zu.

•Die Pointer dieser Felder zeigen zurück zum Ursprung.

C O E L A C A N T H

0 -1 -2 -3 -4 -5 -6 -7 -8 -9 -10

P -1

E -2

L -3

I -4

C -5

A -6

N -7



27

Needleman-Wunsch Algorithm: Auffüllen

•Fülle alle Matrizenfelder mit Werten und Zeigern gemäss von simplen Operationen,

die die Werte der diagonalen, vertikal, und horizontalen Nachbarzellen einschliessen.

Berechne

- match score: Wert der Diagonalzelle links oben + Wert des Alignments (+1 oder -1)

- horizontal gap score: Wert der linken Zelle + gap score (-1)

- vertical gap score: Wert der oberen Zelle + gap score (-1)

-ordne der Zelle das Maximum dieser 3 Werte zu. Der Pointer zeigt in Richtung des

maximalen Scores.

-max(-1, -2, -2) = -1

-max(-2, -2, -3) = -2

-(Pointer soll bei gleichen Werte immer in eine bestimmte Richtung zeigen, z.B.

-entlang der Diagonalen.

C O E L A C A N T H

0 -1 -2 -3 -4 -5 -6 -7 -8 -9 -10

P -1 -1 -2



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Needleman-Wunsch Algorithmus: Trace-back

•Trace-back ergibt das Alignment aus der Matrix.

•Starte in Ecke rechts unten und folge den Pfeilen bis in die Ecke links oben.

•COELACANTH

•-PELICAN--

C O E L A C A N T H

0 -1 -2 -3 -4 -5 -6 -7 -8 -9 -10

P -1 -1 -2 -3 -4 -5 -6 -7 -8 -9 -10

E -2 -2 -2 -1 -2 -3 -4 -5 -6 -7 -8

L -3 -3 -3 -2 0 -1 -2 -3 -4 -5 -6

I -4 -4 -4 -3 -1 -1 -2 -3 -4 -5 -6

C -5 -3 -4 -4 -2 -2 0 -1 -2 -3 -4

A -6 -4 -4 -5 -3 -1 -1 1 0 -1 -2

N -7 -5 -5 -5 -4 -2 -2 0 2 1 0



29

Smith-Waterman-Algorithmus•Smith-Waterman ist ein lokaler Alignment-Algorithmus. SW ist eine sehr

einfache Modifikation von Needleman-Wunsch. Lediglich 3 Änderungen:

- die Matrixränder werden auf 0 statt auf ansteigende Gap-Penalties gesetzt.

- der maximale Wert sinkt nie unter 0. Pointer werden nur für Werte grösser als

0 eingezeichnet.

- Trace-back beginnt am grösseten Wert der Matrix und endet bei dem Wert 0.

•ELACAN

•ELICANC O E L A C A N T H

0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0

P 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0

E 0 0 0 1 0 0 0 0 0 0 0

L 0 0 0 0 2 1 0 0 0 0 0

I 0 0 0 0 1 1 0 0 0 0 0

C 0 1 0 0 0 0 2 0 0 0 0

A 0 0 0 0 0 1 0 3 2 1 0

N 0 0 0 0 0 0 0 1 4 3 2



30

BLAST – Basic Local Alignment Search Tool

• Findet das am besten bewertete lokale optimale Alignment einer

Testsequenz mit allen Sequenzen einer Datenbank.

• Sehr schneller Algorithmus, 50 mal schneller als dynamische

Programmierung.

• Kann verwendet werden um sehr grosse Datenbanken zu durchsuchen, da

BLAST eine vor-indizierte Datenbank benutzt

• Ist ausreichend sensititv und selektiv für die meisten Zwecke

• Ist robust – man kann üblicherweise die Default-Parameter verwenden



31

BLAST Algorithmus, Schritt 1

• Für ein gegebenes Wort der Länge w (gewöhnlich 3 für Proteine) und

eine gegebene Score-Matrix

•

Erzeuge eine Liste aller Worte (w-mers), die einen Score > T erhalten,

wenn man sie mit dem w-mer der Eingabe vergleicht

P D G 13

P Q A 12

P Q N 12etc.

unterhalb Schranke (T=13)

Test Sequenz L N K C K T P Q G Q R L V N Q

P Q G 18

P E G 15 P R G 14

P K G 14 P N G 13

benachbarte Wörter

Wort

P M G 13



32

BLAST Algorithmus, Schritt 2

• jedes benachbarte Wort ergibt alle Positionen in der

Datenbank, in denen es gefunden wird (hit list).

P D G 13

P Q G 18P E G 15 P R G 14P K G 14 P N G 13

P M G 13 PMG Database



33

Traditional BLAST programs

Sequence 1

Sequ

ence

2

AlignmentsGapped alignments

Search Space



34

Seeding

Sequence 1

Sequ

ence

2

Word hits



35

Neighboorhood for 3-letter words

• BLOSUM62 PAM200• Word Score Word Score• RGD 17 RGD 18• KGD 14 RGE 17• QGD 13 RGN 16• RGE 13 KGD 15• EGD 12 RGQ 15• HGD 12 KGE 14• NGD 12 HGD 13• RGN 12 KGN 13• AGD 11 RAD 13• MGD 11 RGA 13• RAD 11 RGG 13• RGQ 11 RGH 13• RGS 11 RGK 13• RND 11 RGS 13• RSD 11 RGT 13• SGD 11 RSD 13• TGD 11 WGD 13

Choice of cut-off Twill affect seeding



36

Seeding

Sequence 1

Sequ

ence

2

Word clustersIsolated words



37

BLAST Algorithm: Extension

• Program tries to extend seeds in both directions by adding residue

pairs until the added score is smaller than a cut-off.

• After terminating the extension, the alignment is trimmed back to that

with the maximal score.



38

PSI-BLAST

• “Position-Specific Iterated BLAST”

– Entfernte Verwandtschaften lassen sich besser durch Motiv- oder Profil-

Suchen entdecken als durch paarweise Vergleiche

– PSI-BLAST führt zunächst eine BLAST-Suche mit Gaps durch.

– Das PSI-BLAST Programm verwendet die Information jedes signifikanten

Alignments um eine positionsspezifische Substitionsmatrix zu konstruieren,

die an Stelle der Eingabesequenz in der nächsten Runde der Datenbank-

Suche verwendet wird.

– PSI-BLAST kann iterativ verwendet werden bis keine neuen signifikanten

Alignments mehr gefunden werden.



39

• Kleine Wahrscheinlichkeit deutet an, dass der Treffer wohl nicht zufällig zustande kam.

BLAST Output (2)



40

Bedeutung des Alignments in BLAST

•P-Wert (Wahrscheinlichkeit)

– Gibt die Wahrscheinlichkeit an, mit der der Score eines Alignments zufällig

zustande kommen kann.

– Je näher P bei Null liegt, desto grösser die Sicherheit, dass ein

gefundener Treffer ein richtiger Treffer (homologe Sequenz) ist.

•E-Wert (Erwartungswert)

– E = P * Anzahl der Sequenzen in Datenbank

– E entspricht der Anzahl an Alignments eines bestimmten Scores, die man

zufällig in einer Sequenz-Datenbank dieser Grösse erwartet

– (wird z.B. für ein Sequenzalignment E=10 angegeben, erwartet man

10 zufällige Treffer mit dem gleichen Score). Dieses Alignment ist also nicht

signifikant.

– Treffer werden in BLAST nur ausgegeben, wenn der E-Wert unterhalb einer

Schranke liegt.



41

Grobe Anhaltspunkte

•P-Wert (Wahrscheinlichkeit) – A. M. Lesk

–P 10-100 genaue Übereinstimmung

–P zwischen 10-100 und 10-50 nahezu identische Sequenzen, zum

Beispiel Allele oder SNPs

–P zwischen 10-50 und 10-10 eng verwandte Sequenzen,

– Homologie gesichert

–P zwischen 10-10 und 10-1 in der Regel entfernte Verwandte

–P > 10-1 Ähnlichkeit vermutlich nicht signifikant

•E-Wert (Erwartungswert)

• E 0,02 Sequenzen vermutlich homolog

• E zwischen 0,02 und 1 Homologie ist nicht auszuschliessen

• E 1 man muss damit rechnen, dass diese gute

• Übereinstimmung Zufall ist.



42

Tips für den Einsatz von BLAST

•Verwende nicht stur die Standardparameter “You get what you look for”.

•Führe Kontrollen durch, besonders in der twilight zone.

• z.B. Schüttle die Sequenz durcheinander und wiederhole die Suche.

• Falls die variierte Sequenz ähnliche Ergebnisse liefert, beruht das

Alignment auf einer systematischen Verfälschung, oder die Parameter sind

nicht empfindlich genug gewählt

•Setze Komplexitätsfilter ein wenn erforderlich.

•Maskiere Repeats in genomischer DNA.

•Teile große Genomsequenzen in Stücke auf um die Suche zu beschleunigen.

•



43

Zusammenfassung

Paarweises Sequenzalignment ist heute Routine, aber nicht trivial.

Mit dynamischer Programmierung (z.B. Smith-Waterman) findet man

garantiert das Alignment mit optimaler Bewertung.

Vorsicht: die Bewertungsfunktion ist nur ein Modell der biologischen Evolution.

FASTA ist erheblich schneller als dynamische Programmierung.

Am schnellsten ist BLAST und seine Derivate.

Beide geben sehr robuste und brauchbare Ergebnisse für Proteinsequenzen.

FASTA ist für Nukleotidsequenzen zuverlässiger.

Multiple Sequenzalignments sind in der Lage, entferntere Ähnlichkeiten

aufzuspüren und bieten ein besseres funktionelles Verständnis von Sequenzen

und ihren Beziehungen

Kommt nächste Woche dran.



44

V3 Multiples Sequenz Alignment

Literatur: Kapitel 4 in Buch von David Mount

Thioredoxin-Beispiel heute aus Buch von Arthur Lesk



45

Homo sapiens DjlA protein

Escherichia coli DjlA protein

Protein-Alignment kann durch tertiäre Strukturinformationen geführt werden

nur so kann man letztlich auch bewerten, ob ein Sequenzalignmentkorrekt ist.



46

• Homologie: Ähnlichkeit, die durch

Abstammung von einem gemeinsamen

Ursprungsgen herrührt –

die Identifizierung und Analyse von

Homologien ist eine zentrale Aufgabe

der Phylogenie.

• Ein Alignment ist eine Hypothese

für die positionelle Homologie

zwischen Basenpaaren bzw.

Aminosäuren.

Definition von “Homologie”

http://www.cellsignal.com



47

MSA für Thioredoxin-FamilieFarbe Aminosäuretyp Aminosäurengelb klein, wenig polar Gly, Ala, Ser, Thrgrün hydrophob Cys, Val, Ile, Leu

Pro, Phe, Tyr, Met, Trpviolett polar Asn, Gln, Hisrot negativ geladen Asp, Glublau positiv geladen Lys, Arg



48

Infos aus MSA von Thioredoxin-Familie

Thioredoxin: aus 5 beta-Strängen bestehendes beta-Faltblatt, das auf beiden Seiten von alpha-Helices flankiert ist.

gemeinsamer Mechanismus: Reduktion von Disulfidbrücken in Proteinen



49


1) Die am stärksten konservierten Abschnitte entsprechen wahrscheinlich dem

aktiven Zentrum.

Disulfidbrücke zwischen Cys32 und Cys35 gehört zu dem konservierten

WCGPC[K oder R] Motiv.

Andere konservierte Sequenzabschnitte, z.B. Pro76Thr77 und Gly92Gly93 sind

an der Substratbindung beteiligt.



50


2) Abschnitte mit vielen Insertionen und Deletionen entsprechen vermutlich

Schleifen an der Oberfläche. Eine Position mit einem konservierten Gly oder

Pro läßt auf eine Wendung der Kette (‚turn‘) schließen.



51


3) Ein konserviertes Muster hydrophober Bausteine mit dem Abstand 2 (d.h.,

an jeder zweiten Position), bei dem die dazwischenliegenden Bausteine

vielfältiger sind und auch hydrophil sein können, läßt auf ein -Faltblatt an der

Moleküloberfläche schließen.



52


4) Ein konserviertes Muster hydrophober Aminosäurereste mit dem Abstand

von ungefähr 4 läßt auf eine -Helix schließen.



53


Die Thioredoxine sind Teil einer Superfamilie, zu der auch viele weiter entfernte

homologe Protein gehören,

z.B. Glutaredoxin (Wasserstoffdonor für die Reduktion von Ribonukleotiden bei

der DNA-Synthese)

Protein-Disulfidisomerase (katalysiert bei der Proteinfaltung den Austausch

falsch gefalteter Disulfidbrücken)

Phosducin (Regulator in G-Protein-abhängigen Signalübertragungswegen)

Glutathion-S-Transferasen (Proteine der chemischen Abwehr).

Die Tabelle des MSAs für Thioredoxinsequenzen enthält implizit auch Muster,

die man zur Identifizierung dieser entfernteren Verwandten nutzen kann.



54

Es gibt im wesentlichen 3 unterschiedliche Vorgehensweisen:

(1) Manuell

(2) Automatisch

(3) Kombiniert

Multiples Sequenz-Alignment - Methoden

manuelles Alignment bietet sich an falls

– Alignment einfach ist.

– es zusätzliche (strukturelle) Information gibt.

– automatische Alignment –Methoden in lokalen Minima feststecken.

– ein automatisch erzeugtes Alignment manuell “verbessert” werden kann.



55

2 Methoden:

• Dynamische Programmierung

– betrache 2 Proteinsequenzen von 100 Aminosäuren Länge.

- wenn es 1002 Sekunden dauert, diese beiden Sequenzen erschöpfend

zu alignieren, dann wird es

1003 Sekunden dauern um 3 Sequenzen zu alignieren,

1004 Sekunden für 4 sequences und

1.90258x1034 Jahre für 20 Sequenzen.

• Progressives Alignment

multiples Sequenzalignment



56

berechne zunächst paarweise Alignments

für 3 Sequenzen wird Würfel aufgespannt:

D.h. dynamische Programmierung hat nun Komplexität n1 * n2 * n3mit den Sequenzlängen n1, n2, n3.

Sehr aufwändig! Versuche, Suchraum einzuschränken.

dynamische Programmierung mit MSA Programm



57


Links: Baum für 5 Sequenzen ohne Paarung von Sequenzen.

Neighbour-joining Methode: berechne Summe aller Kantenlängen

S = a + b + c + d + e (Kantenlängen sind bekannt)

In diesem Fall seien sich A und B am nächsten. Konstruiere daher den Baum

rechts.

Generell: Verbinde die Sequenzpaare mit den kürzesten Abständen …

Man erhält den Baum mit der kleinsten Summe der Kantenlängen.

Konstruiere anhand phylogenetischem Baum ein versuchsweises Multiples

Sequenz Alignment.



58

Dieses Alignment dient dazu, den möglichen Raum inmitten des Würfels

einzugrenzen, in dem das beste MSA zu finden sein sollte.

Grosse Rechenersparnis!




59

• wurde von Feng & Doolittle 1987 vorgestellt

• ist eigentlich eine heuristische Methode. Daher ist nicht garantiert, das

“optimale” Alignment zu finden.

• benötigt (n-1) + (n-2) + (n-3) ... (n-n+1) paarweise Sequenzalignments

als Ausgangspunkt.

• weitverbreitete Implementation in Clustal

(Des Higgins)

ClustalW ist eine neuere Version, in der den Parameter für Sequenzen

und Programm Gewichte (weights) zugeteilt werden.

Progressives Alignment



60

Schnelle paarweise Alignments:

berechne Matrix der Abstände

1 PEEKSAVTALWGKVN--VDEVGG2 GEEKAAVLALWDKVN--EEEVGG3 PADKTNVKAAWGKVGAHAGEYGA4 AADKTNVKAAWSKVGGHAGEYGA5 EHEWQLVLHVWAKVEADVAGHGQ

Hbb_Human 1 -Hbb_Horse 2 .17 -Hba_Human 3 .59 .60 -Hba_Horse 4 .59 .59 .13 -Myg_Whale 5 .77 .77 .75 .75 -

Hbb_Human

Hbb_Horse

Hba_Horse

Hba_Human

Myg_Whale

2

1

3 4

2

1

3 4

alpha-helices

Nachbar-Verbindungs-

Baumdiagramm

progressive Alignments

entsprechend dem

Baumdiagramm

CLUSTAL W

Überblick der ClustalW Prozedur



61

• Berechne alle möglichen paarweisen Alignments von Sequenzpaaren.

Es gibt (n-1)+(n-2)...(n-n+1) Möglichkeiten.

• Berechne aus diesen isolierten paarweisen Alignments den “Abstand”

zwischen jedem Sequenzpaar.

• Erstelle eine Abstandsmatrix.

ClustalW- Paarweise Alignments

• aus den paarweisen Distanzen wird ein Nachbarschafts-Baum erstellt

• Dieser Baum gibt die Reihenfolge an, in der das progressive Alignment

ausgeführt werden wird.



62

• aligniere die beiden ähnlichsten Sequenzen zuerst.

• dieses Alignment ist dann “fest” und wird nicht mehr angetastet. Falls

später ein GAP eingeführt werden muss, wird er in beiden Sequenzen

an der gleichen Stelle eingeführt.

• Deren relatives Alignment bleibt unverändert.

Multiples Alignment - Erstes Paar

Vorteil:

– Geschwindigkeit.

Nachteile:

– keine objektive Funktion.

– Keine Möglichkeit zu quantifizieren ob Alignment gut oder schlecht ist.

– Keine Möglichkeit festzustellen, ob das Alignment “korrekt” ist.



63

Mögliche Probleme:

– in ein lokales Minimum zu geraten.

Falls zu einem frühen Zeitpunkt ein Fehler im Alignment eingebaut

wird, kann dieser später nicht mehr korrigiert werden.

– Zufälliges Alignment.

ClustalW - Lokales Minimum



64

• Sollen all Sequenzen gleich behandelt werden?

Obwohl manche Sequenzen eng verwandt und andere entfernt

verwandt sind?

• Sollen alle Positionen der Sequenzen gleich behandelt werden?

Obwohl sie unterschiedliche Funktionen und Positionen in der

dreidimensionalen Strukturen haben können?

Genauigkeit des Alignments verbessern



65

• Sequenzgewichtung

• Variable Substitutionsmatrizen

• Residuen-spezifische Gap-Penalties und verringerte Penalties in hydrophilen

Regionen (externe Regionen von Proteinsequenzen), bevorzugt Gaps in

Loops anstatt im Proteinkern.

• Positionen in frühen Alignments, an denen Gaps geöffnet wurden, erhalten

lokal reduzierte Gap Penalties um in späteren Alignments Gaps an den

gleichen Stellen zu bevorzugen

ClustalW- Besonderheiten



66

• Zwei Parameter sind festzulegen (es gibt Default-Werte, aber man sollte

sich bewusst sein, dass diese abgeändert werden können):

• Die GOP- Gap Opening Penalty ist aufzubringen um eine Lücke in einem

Alignment zu erzeugen

• Die GEP- Gap Extension Penalty ist aufzubringen um diese Lücke um

eine Position zu verlängern.

ClustalW- vom Benutzer festzulegende Parameter



67

• Bevor irgendein Sequenzpaar aligniert wird, wird eine Tabelle von GOPs

erstellt für jede Position der beiden Sequenzen.

• Die GOP werden positions-spezifisch behandelt und können über die

Sequenzlänge variieren.

• Falls ein GAP an einer Position existiert, werden die GOP und GEP

penalties herabgesetzt – und alle anderen Regeln treffen nicht zu.

• Daher wird die Bildung von Gaps an Positionen wahrscheinlicher, an

denen bereits Gaps existieren.

Positions-spezifische Gap penalties



68

• Solange kein GAP offen ist, wird GOP hochgesetzt falls die Position innerhalb von 8

Residuen von einem bestehenden Gap liegt.

• Dadurch werden Gaps vermieden, die zu eng beieinander liegen.

• An jeder Position innerhalb einer Reihe von hydrophilen Residuen wird GOP

herabgesetzt, da diese gewöhnlich in Loop-Regionen von Proteinstrukturen liegen.

• Eine Reihe von 5 hydrophilen Residuen gilt als

hydrophiler stretch.

• Die üblichen hydrophilen Residuen sind:

D Asp K Lys P Pro

E Glu N Asn R Arg

G Gly Q Gln S Ser

Dies kann durch den Benutzer geändert werden.

Vermeide zu viele Gaps



69

• Progressives Alignment ist ein mathematischer Vorgang, der völlig unabhängig von

der biologischen Realität abläuft.

• Es kann eine sehr gute Abschätzung sein.

• Es kann eine unglaublich schlechte Abschätzung sein.

• Erfordert Input und Erfahrung des Benutzers.

• Sollte mit Vorsicht verwendet werden.

• Kann (gewöhnlich) manuell verbessert werden.

• Es hilft oft, farbliche Darstellungen zu wählen.

• Je nach Einsatzgebiet sollte der Benutzer in der Lage sein, die zuverlässigen

Regionen des Alignments zu beurteilen.

• Für phylogenetische Rekonstruktionen sollte man nur die Positionen verwenden, für

die eine zweifelsfreie Hypothese über positionelle Homologie vorliegt.

Tips für progressives Alignment



70

• Es macht wenig Sinn, proteinkodierende DNS-Abschnitte zu alignieren!

ATGCTGTTAGGGATGCTCGTAGGG

ATGCT-GTTAGGGATGCTCGT-AGGG

Das Ergebnis kann sehr unplausibel sein und entspricht eventuell nicht dem

biologischen Prozess.

Es ist viel sinnvoller, die Sequenzen in die entsprechenden Proteinsequenzen

zu übersetzen, diese zu alignieren und dann in den DNS-Sequenzen an den

Stellen Gaps einzufügen, an denen sie im Aminosäure-Alignment zu finden

sind.

Alignment von Protein-kodierenden DNS-Sequenzen



71

Progressive Alignments sind die am weitesten verbreitete Methode für multiple

Sequenzalignments.

Sehr sensitive Methode ebenfalls: Hidden Markov Modelle (HMMer)

Multiples Sequenzalignment ist nicht trivial. Manuelle Nacharbeit kann in

Einzelfällen das Alignment verbessern.

Multiples Sequenzalignment erlaubt Denken in Proteinfamilien und –funktionen.

Zusammenfasusng



72

V4 Prediction of Phylogenies based on single genes

Material of this lecture taken from

- chapter 6, DW Mount „Bioinformatics“

and from Julian Felsenstein‘s book.

A phylogenetic analysis of a family of related

nucleic acid or protein sequences is a determination

of how the family might have been derived during

evolution.

Placing the sequences as outer branches on a tree,

the evolutionary relationships among the sequences

are depicted.

Phylogenies, or evolutionary trees, are the basic structures to describe

differences between species, and to analyze them statistically.

They have been around for over 140 years.

Statistical, computational, and algorithmic work on them is ca. 40 years old.



73

3 main approaches in single-gene phylogeny

- maximum parsimony

- distance matrix

- maximum likelihood (not covered here)

Popular programs:

PHYLIP (phylogenetic inference package – J Felsenstein)

PAUP (phylogenetic analysis using parsimony – Sinauer Assoc



74

Methods for Single-Gene Phylogeny

Choose set of

related sequences

Obtain multiple

sequence

alignment

Is there

strong

sequence

similarity?

Maximum

parsimony

methods

Yes

No

Is there clearly recogniza-

ble sequence similarity?

YesDistance

methods

No

Maximum likelihood

methods

Analyze how well

data support

prediction



75

Parsimony methods

Edwards & Cavalli-Sforza (1963): that evolutionary tree is to be preferred that

involves „the minimum net amount of evolution“.

seek that phylogeny on which, when we reconstruct the evolutionary events

leading to our data, there are as few events as possible.

(1) We must be able to make a reconstruction of events, involving as few events

as possible, for any proposed phylogeny.

(2) We must be able to search among all possible phylogenies for the one or

ones that minimize the number of events.



76

A simple example

Suppose that we have 5 species,

each of which has been scored for 6 characters (0,1)

We will allow changes 0 1 and 1 0.

The initial state at the root of a tree may be either state 0 or state 1.



77

Evaluating a particular tree

Figure right shows another tree also requiring 8 changes. These two most

parsimonious trees are the same tree when the roots of the tree are removed.



78

Methods of rooting the tree

There are many rooted trees, one for each branch of this unrooted tree,

and all have the same number of changes of state.

The number of changes of state only depends on the unrooted tree, and not at all on

where the tree is then rooted.

Biologists want to think of trees as rooted

need method to place the root in an otherwise unrooted tree.

(1) Outgroup criterion

(2) Use a molecular clock.



79

Outgroup criterion

Assumes that we know the answer in advance.

Suppose that we have a number of great apes,

plus a single old-world monkey.

Suppose that we know that the great apes are a monophyletic group.

If we infer a tree of these species, we know that the root must be placed on the

lineage that connects the old-world monkey (outgroup) to the great apes (ingroup).



80

Molecular clock

If an equal amount of changes were observed on all lineages, there should be a

point on the tree that has equal amounts of change (branch lengths) from there to

all tips.

With a molecular clock, it is only the expected amounts of change that are equal.

The observed amounts may not be.

using various methods find a root that makes the amounts of change

approximately equal on all lineages.



81

Branch lengths

Having found an unrooted tree, locate the changes on it and find out how many

occur in each of the branches.

The location of the changes can be ambiguous.

average over all possible reconstructions of each character for which there is

ambiguity in the unrooted tree.

Fractional numbers in some branches of left tree

add up to (integer) number of changes (right)



82

Open questions

* Particularly for larger data sets, need to know how to count number of changes

of state by use of an algorithm.

* need to know algorithm for reconstructing states at interior nodes of the tree.

* need to know how to search among all possible trees for the most parsimonious

ones, and how to infer branch lengths.

* sofar only considered simple model of 0/1 characters.

DNA sequences have 4 states, protein sequences 20 states.

* Justification: is it reasonable to use the parsimony criterion?

If so, what does it implicitly assume about the biology?

* What is the statistical status of finding the most parsimonious tree?

Can we make statements how well-supported it is compared to other trees?



83

Counting evolutionary changes

2 related dynamic programming algorithms: Fitch (1971) and Sankoff (1975)

- evaluate a phylogeny character by character

- for each character, consider it as rooted tree, placing the root wherever seems

appropriate.

- update some information down a tree; when we reach the bottom, the number of

changes of state is available.

Do not actually locate changes or reconstruct interior states at the nodes of the tree.



84

Fitch algorithm

intended to count the number of changes in a bifurcating tree with nucleotide

sequence data, in which any one of the 4 bases (A, C, G, T) can change to any

other.

At the particular site, we have observed the bases C, A, C, A and G in the 5 species.

Give them in the order in which they appear in the tree, left to right.



85

Fitch algorithm

For the left two, at the node that is their immediate common ancestor,

attempt to construct the intersection of the two sets.

But as {C} {A} = instead construct

the union {C} {A} = {AC} and count 1

change of state.

For the rightmost pair of species, assign

common ancestor as {AG},

since {A} {G} = and count another

change of state.

.... proceed to bottom

Total number of changes = 3. Algorithm works on arbitrarily large trees.



86

Complexity of Fitch algorithm

Fitch algorithm can be carried out in a number of operations that is proportional to

the number of species (tips) on the tree.

Don‘t we need to multiply this by the number of sites n ?

Any site that is invariant (which has the same base in all species, e.g. AAAAA) can

be dropped.

Other sites with a single variant base (e.g. ATAAA) will only require a single change

of state on all trees. These too can be dropped.

For sites with the same pattern (e.g. CACAG) that we have already seen, simply use

number of changes previously computed.

Pattern following same symmetry (e.g. TCTCA = CACAG) need same number of

changes numerical effort rises slower than linearly with the number of sites.



87

Sankoff algorithm

Fitch algorithm is very effective – but we can‘t understand why it works.

Sankoff algorithm: more complex, but its structure is more apparent.

Assume that we have a table of the cost of changes cij between each character state

i and each other state j.

Compute the total cost of the most parsimonious combinations of events by

computing it for each character.

For a given character, compute for each node k in the tree a quantity Sk(i).

This is interpreted as the minimal cost, given that node k is assigned state i,

of all the events upwards from node k in the tree.



88

Sankoff algorithm

If we can compute these values for all nodes,

we can also compute them for the bottom node in the tree.

Simply choose the minimum of these values

which is the desired total cost we seek, the minimum cost of evolution for this

character.

At the tips of the tree, the S(i) are easy to compute. The cost is 0 if the observed

state is state i, and infinite otherwise.

If we have observed an ambigous state, the cost is 0 for all states that it could be,

and infinite for the rest.

Now we just need an algorithm to calculate the S(i) for the immediate common

ancestor of two nodes.

iSSi

0min



89

Sankoff algorithm

Suppose that the two descendant nodes are called l and r (for „left“ and „right“).

For their immediate common ancestor, node a, we compute

kScjSciS rikk

lijj

a minmin

The smallest possible cost given that node a is in state i is the cost cij of going from

state i to state j in the left descendant lineage, plus the cost Sl(j) of events further up

in the subtree gien that node l is in state j. Select value of j that minimizes that sum.

Same calculation for right descendant lineage sum of these two minima is the

smallest possible cost for the subtree above node a, given that node a is in state i.

Apply equation successively to each node in the tree, working downwards.

Finally compute all S0(i) and use previous eq. to find minimum cost for whole tree.



90

Sankoff algorithm

The array (6,6,7,8) at the bottom of the tree has a minimum value of 6

= minimum total cost of the tree for this site.



91

Finding the best tree by heuristic search

The obvious method for searching for the most parsimonious tree is to consider ALL

trees and evaluate each one.

Unfortunately, generally the number of possible trees is too large.

use heuristic search methods that attempt to find the best trees without looking at

all possible trees.

(1) Make an initial estimate of the tree and make small rearrangements of it

= find „neighboring“ trees.

(2) If any of these neighbors are better, consider them and continue search.



92

Distance matrix methods

introduced by Cavalli-Sforza & Edwards (1967)

and by Fitch & Margoliash (1967)

general idea „seems as if it would not work very well“ (Felsenstein):

- calculate a measure of the distance between each pair of species

- find a tree that predicts the observed set of distances as closely as possible.

All information from higher-order combinations of character states is left out.

But computer simulation studies show that the amount of lost information is

remarkably small.

Best way to think about distance matrix methods:

consider distances as estimates of the branch length separating that pair of

species.



93

Least square method

- observed table (matrix) of distances Dij

- any particular tree leads to a predicted set of distances dij.



94

Least square method

Measure of the discrepancy between the observed and expected distances:

n

i

n

jijijij dDwQ

1 1

2

where the weights wij can be differently defined:

- wij = 1 (Cavalli&Sforza, 1967)

- wij = 1/Dij2 (Fitch&Margoliash, 1967)

- wij = 1/Dij (Beyer et al., 1974)

Aim: Find tree topology and branch lengths that minimize Q.

Equation above is quadratic in branch lengths.

Take derivative with respect to branch lengths, set = 0,

and solve system of linear equations. Solution will minimize Q.

Doug Brutlag‘s course



95

Least square method

Number species in alphabetical order.

The expected distance between species A and D d14 = v1 + v7 + v4

The expected distance between speices B and E d25 = v5 + v6 + v7 + v2.

v1v2

v3

v4

v5 v6 v7



96

Finding the least squares tree topology

Now that we are able to assign branch lengths to each tree topology.

we need to search among tree topologies.

This can be done by the same methods of heuristic search that were presented for

the Maximum Parsimony method.

Note: no-one has sofar presented a branch-and-bound method for finding the least

squares tree exactly. Day (1986) has shown that this problem is NP-complete.

The search is not only among tree topologies, but also among branch lengths.



97

neighbor-joining method

introduced by Saitou and Nei (1987) – algorithm works by clustering - does not

assume a molecular clock but approximates the „minimum evolution“ model.

„Minimum evolution“ model:

among possible tree topologies, choose the one with minimal total branch length.

Neighbor-joining, as the least-squares method, is guaranteed to recover the true

tree if the distance matrix is an exact reflection of the tree.



98

neighbor-joining method

(1) For each tip, compute

(2) Choose the i and j for which Dij – ui – uj is smallest.

(3) Join items i and j. Compute the branch length

from i to the new node (vi) and from j to the new

node (vj) as

(4) Compute distance between the new node (ij) and each of the remaining tips as

(5) Delete tips i and j from the tables and replace them by the new node, (ij), which

is now treated as a tip.

(6) If more than 2 nodes remain, go back to step (1). Otherwise, connect the two

remaining nodes (e.g. l and m) by a branch of length Dlm.

n

ij

iji n

Du

2

ijijj

jiiji

uuDv

uuDv

2

1

2

12

1

2

1

2,ijjkik

kij

DDDD



99

limitation of distance methods

Distance matrix methods are the easiest phylogeny method to program,

and they are very fast.

Distance methods have problems when the evolutionary rates vary largely.

One can correct for this in distance methods as well as in likelihood methods.

When variation of rates is large, these corrections become important.

In likelihood methods, the correction can use information from changes in one part

of the tree to inform the correction in others.

Once a particular part of the molecule is seen to change rapidly in the primates, this

will affect the interpretation of that part of the molecule among the rodents as well.

But a distance matrix method is inherently incapable of propagating the information

in this way. Once one is looking at changes within rodents, it will forget where

changes were seen among primates.



100

V5 – Analyse von Genomsequenzen

- Genom-Assemblierung

finde identische k-Tupel

- Genom-Alignment

Suche nach MUMs (maximal unique matches)

andere wichtige Bereiche, für die wir heute keine Zeit haben

- Gene identifizieren

Hidden Markov Modelle

- Transkriptionsfaktorbindestellen

Position Specific Scoring Matrices (PSSM)

- finde Repeat-Sequenzen

Suche nach bekannten Repeat-Motiven

Suche auf Suffix-Baum



101

Whole Genome Shotgun Assemblierung

Es gibt 2 Strategien für die

Sequenzierung von Genomen:

clone-by-clone Methode

whole-genome shotgun Methode

(Celera, Gene Myers).

Die Shotgun Sequenzierung wurde

bereits 1977 von F. Sanger et al.

eingeführt und ist seither eine

Standardmethode für die

Sequenzierung von Genen.

Umstritten war jedoch, ob man sie

auch für komplette Genome

verwenden kann. ED Green, Nat Rev Genet 2, 573 (2001)



102

Arachne Programm

von Serafin Batzoglou (MIT, Doktorarbeit 2000)

(i) konstruiere Graph G für Überlappungen zwischen Paaren von reads aus

Shotgun-Daten

(i) prozessiere G um Supercontigs von gemappten reads zu erhalten.

Batzoglou et al. Genome Res 12, 177 (2002)

Wichtige Variation der whole-genome shotgun Sequenzierung:

sequenziere reads jeweils von beiden Enden eines Klons.

Da die Inserts nach ihrer Größe ausgewählt werden, ist damit der ungefähre

Abstand zwischen dem Paar von reads bekannt.

Man nennt diese earmuff (Ohrenwärmer) Verbindungen.



103

Arachne: erzeuge Überlappungsgraphen

Liste von reads R = (r1, ..., rN) , N ist die Anzahl der reads.

Jeder read ri besitzt eine Länge li < 1000.

Wenn beide reads von den Endpunkten desselben Klons stammen (earmuff link),

besitzt ri eine Verknüpfung zu einem anderen read rj in einer festen Distanz dij.

Erstes Ziel: erzeuge Graphen G der Überlappungen (Kanten) zwischen Paaren an

reads (Knoten) dies ergibt die Paare an reads in R, die aligniert werden müssen.

Da R sehr lang sein kann, sind N2 alignments nicht praktikabel.

erstelle Tabelle für das Vorkommen von k-Tupel (Strings der Länge k) in den reads,

zähle die Anzahl von k-Tupel Treffern für jedes Paar an reads.

Führe dann paarweise Alignments zwischen den Paaren an reads durch,

die mehr als cutoff gemeinsame k-mere besitzen.

Batzoglou PhD thesis (2002)



104

Arachne: Tabelle für Vorkommen von k-meren

Ermittle die Anzahl an k-Tupel Treffern in der Vorwärts- und Rückwärts-Richtung

zwischen jedem Paar von reads in R.

(1) Ermittle alle Triplets (r,t,v)

r = Nummer des reads in R

t = Index eines k-mers, das in r vorkommt

v = Richtung des Auftretens (vorwärts oder rückwärts)

(2) sortiere die Menge der Paare nach den k-mer Indices t

(3) verwende eine sortierte Liste um eine Tabelle T von Quadrubletts (ri, rj, f, v)

zu erstellen, wobei ri und ri die reads sind, die mindestens einen gemeinsamen

k-mer enthalten, v die Richtung angiebt, und f die Anzahl an gemeinsamen

k-mers zwischen ri und rj in Richtung v.




105

Arachne: Tabelle für Vorkommen von k-mers


Hier:k = 3



106

Arachne: Tabelle für Vorkommen von k-mers

Wenn ein k-Tupel „zu oft“ auftritt gehört er wahrscheinlich zu einer

Repeat-Sequenz.

Man sollte diese nicht für die Detektion von Überlappungen verwenden.

Implementierung

(1) finde k-Tupel (r,t,v) und sortieren sie in 64 Dateien entsprechen den ersten

drei Nukleotiden jedes k-mers.

(2) Für i=1,64

lade Datei in den Speicher, sortiere nach t, speichere sortierte Datei ab.

end

(3) lade 64 sortierte Dateien nacheinander in den Speicher,

fülle Tabelle T nacheinander auf.

In der Praxis ist k = 8 bis 24.Batzoglou PhD thesis (2002)



107

Arachne: paarweise read-Alignments

Führe paarweise Alignments zwischen den Reads durch, die mehr als Cutoff

gemeinsame k-mers besitzen.

Sobald man zu häufige k-mers ausschließt (mehr als ein zweiter Cutoff), ist

sichergestellt, daß nur O(N) viele paarweise Sequenzalignments durchgeführt

werden müssen.

Nur eine kleine Anzahl an Basen-Austauschen und Indels ist in einer

überlappenden Region zweier alignierter reads erlaubt.

Output des Alignment-Algorithmus:

für die reads ri, rj gibt es Quadrubletts (b1, b2, e1, e2) für jede detektierte

Überlappungsregion mit den Anfangspositionen b1, b2 und Endpositionen e1,e2.

Falls eine signifikante Überlappungsregion vorliegt, wird (ri, rj, b1, b2, e1, e2) eine

Kante im Überlappungsgraphen G. Batzoglou PhD thesis (2002)



108

Kombination teilweiser Alignments

3 teilweise Alignments der Länge

k=6 zwischen einem Paar von

reads werden zu einem einzigen

vollen Alignment der Länge k=19

kombiniert.

Die vertikalen Linien verbinden

übereinstimmenden Basen,

wogegen x Mismatche sind.

Dies ist eine oft auftretende

Situation, in der ein ausgedehnter

k-mer Treffer ein volles Alignment

von zwei reads ist.




109

Repeats erzeugen Mehrdeutigkeit

Ohne das Auftreten von Sequen-

zierungsfehlern und Repeats wäre es

einfach, alle entdeckbaren paarweise

Abstände von reads zu finden und

den Graph G zu konstruieren.

Da es Repeats jedoch sehr häufig

auftreten, bedeutet eine Verbindung

zwischen zwei reads in G nicht ohne

weiteres eine wahre Überlappung.

Eine „Repeat-Verbindung“ ist eine

Verbindung in G zwischen zwei

reads, die aus verschiedenen

Regionen des Genoms stammen und

in der repetitiven Sequenz überein-

stimmen. Batzoglou PhD thesis (2002)



110

Sequence contigs


unerläßlich für die Assemblierung ist die ausreichende Überdeckung (mehrfache

Sequenzierung = coverage) derselben Genomregionen



111

Verbinden von Contigs


Sequenz-Contigs werden gebildet

indem Paare von reads verbunden

werden, die eindeutig verbunden

werden können.

Tatsächlich ist die Situation viel

schwieriger als hier gezeigt, da

Repeats häufig nicht zu 100%

zwischen Kopien konserviert sind.

Durch die Löschung von k-mers hoher Frequenz wird einiges an Repetition im

Genom vor der Erzeugung von G effizient maskiert.

Zur Erkennung von repetitiven Verbindung dienen weitere heuristische Algorithmen,

die hier nicht diskutiert werden sollen.



112

Benutze Überlapp-Paarungen um die reads zu verbinden

Arachne sucht nach 2 Plasmiden mit

gleicher Insert-Länge, deren

Sequenzen an beiden Enden

überlappen paired pairs.


(A) A paired pair of overlaps.

The top two reads are end sequences from

one insert, and the bottom two reads are

end sequences from another.

The two overlaps must not imply too

large a discrepancy between the insert

lengths.

(B) Initially, the top two pairs of reads

are merged. Then the third pair of

reads is merged in, based on having

an overlap with one of the top two left

reads, an overlap with one of the top

two right reads, and consistent insert

lengths. The bottom pair is similarly

merged.

Unten: eine Menge von paired pairs

werden zu contigs zusammengefasst

und eine Konsensussequenz erzeugt.



113

Detection of repeat contigs

Contig R is linked to contigs A and

B to the right. The distances

estimated between R and A and

R and B are such A and B cannot

be positioned without substantial

overlap between them. If there is

no corresponding detected overlap

between A and B then R is

probably a repeat linking to two

unique regions to the right.


Some of the identified contigs are repeat contigs in which nearly identical

sequence from distinct regions are collapsed together. Detection by

(a) repeat contigs usually have an unusually high depth of coverage.

(b) they will typically have conflicting links to other contigs.

After marking repeat contigs, the remaining

contigs should represent the correctly

assembled sequence.



114

Contig assembly

If (a,b) and (a,c) overlap, then

(b,c) are expected to overlap.

Moreover, one can calculate that

shift(b,c)=shift(a,c)-shift(a,b).

A repeat boundary is detected

toward the right of read a, if there

is no overlap (b,c), nor any path

of reads x1, ..., xk such that (b,x1),

(x1,x2) ..., (xk,c) are all overlaps,

and shift(b,x1) + ... + shift(xk,c)

shift(a,c) – shift(a,b).




115

Consistency of forward-reverse links

(A) The distance d(A,B) (length of

gap or negated length of

overlap) between two linked

contigs A and B can be

estimated using the forward-

reverse linked reads between

them.

(B) The distance d(B,C) between

two contigs B,C that are

linked to the same contig A

can be estimated from their

respective distances to the

linked contig.




116

Filling gaps in supercontigs

(A) Contigs A and B are connected by

a path p of contigs X1,..., Xk. The

distance dp(A,B) between A and B

(along the path p) is the length of

the sequence in the path that does

not overlap A and B.

(B) Contigs Y1 and Y2 share forward-

reverse links with the supercontig

S. These links position them in the

vicinity of the gap between A and

B. Therefore, Y1 and Y2 will be

used as possible stepping points in

the path closing the gap from A to

B. Batzoglou et al. Genome Res 12, 177 (2002)



117

Comparison of different assemblers

Pevzner, Tang, Waterman PNAS 98, 9748 (2001)

you should look out for:

- smallest number of contigs + misassembled contigs- highest possible coverage by contigs- lowest possible coverage by misassembled contigs



118

Whole Genome Alignment (WGA)

Nachdem die genomische DNA-Sequenz eng verwandter Organismen verfügbar

wird, ist die erste Frage, wie das Alignment beider Genome aussieht.

Globale Genom-Alignments machen nur für eng verwandte Organismen Sinn.

Im anderen Fall muß man erst die genomischen Rearrangements betrachten.

Dann kann man die systenischen Regionen (Regionen, in denen Gen-

Reihenfolge des nächsten gemeinsamen Vorfahrens in beiden Spezies konserviert

blieb) betrachten und lokale Genom-Alignments dieser Regionen produzieren.



119

Vergleich von Maus und Mensch auf Genomebene

Wichtigste Ergebnisse:

* das Mausgenom ist etwa 14% kürzer als das menschliche Genom.

Die unterschiedliche Länge liegt wohl an der höheren Deletionsrate in Maus.

* über 90% des Maus- und Menschen-Genoms kann in entsprechende

Regionen mit konservierter Syntenie eingeteilt werden

* auf dem Nukleotid-Level kann etwa 40% des menschlichen Genoms mit dem

Maus-Genom aligniert werden (diese am stärksten orthologen Sequenzen

blieben wohl in beiden Linien vom gemeinsamen Vorfahren erhalten).

Der Rest wurde wohl in einem oder beiden Genomen gelöscht.

* die neutrale Substitutionsrate beträgt etwa 0.5 Nucleotid-Substitutionen pro

Position seit der Divergenz der beiden Spezien. Etwa doppelt so viele

Austausche haben in Maus gegenüber Mensch stattgefunden.

aus dem Paper des Mouse Genome Sequencing Consortiums „Initial sequencing and comparative analysis of the mouse genome“,Nature 420, 520-562 (5.12.2002). Excellent paper! Well readable!



120

Vergleich von Maus und Mensch auf Genomebene

Key findings:

* der Anteil kurzer (50-100 bp) Segmente in den Säugetier-Genomen, der

reinigender Selektion unterliegt, ist etwa 5%, d.h. wesentlich höher als der Anteil

der Protein-kodierenden Regionen

Genome enthalten viele zusätzliche Eigenschaften wie UTRs (untranslated

regions), regulatorische Elemente, nicht-Protein-kodierende Gene, chromosomale

Strukturelemente, die unter Selektion für die biologische Funktion stehen.

* die Evolution von Säugetier-Genomen verläuft ungleichmäßig. Es gibt deutliche

Unterschiede an Divergenz je nach Genomposition.

* Sowohl Maus wie Mensch-Genom enthalten etwa 30.000 Gene, die für Proteine

kodieren. Der Anteil an Mausgenen mit einem eindeutigen Orthologen im

menschlichen Genom ist etwa 80%. Der Anteil der Mausgene ohne ein homologes

Gen im menschlichen Genom ist < 1%.



121

The mouse genome. Nature 420, 520 - 562

Konservierung von Syntenie zwischen Mensch und Maus

Ein typisches 510-kb Segment des Maus-Chromosoms 12, das mit einem

600-kb Stück des menschlichen Chromosom 14 verwandt ist.

Blaue Linien: reziprok eindeutige Treffer in beiden Genomen.

Rote Markierungen kennzeichnen die Länge der passenden Regionen.

Die Abstände zwischen diesen „Landmarks“ sind im Maus-Genom kleiner als

im Mensch, was mit der 14% kürzeren Gesamtlänge des Genoms

übereinstimmt.



122

The mouse genome. Nature 420, 520 - 562

Entsprechung syntenischer Regionen

342 Segmente und 217 Blöcke >300 kb mit konservierter Syntenie im Mensch

sind im Maus-Genom markiert.

Jede Farbe entspricht einem bestimmten menschlichen Chromosom.



123

Sensitivität

Couronne, ..., Dubchak, Genome Res. 13, 73 (2003)

Im globalen Mensch:Maus Alignment sind mehr als eine Millionen Regionen

stärker als 70% konserviert (auf 100-bp Level)

– diese Regionen decken > 200 Million bp ab.

Nur 62% von ihnen werden von (lokalen) BLAT-Treffern abgedeckt.

Dies bedeutet, daß man 38% der konservierten Abschnitte nur durch das globale

Alignment finden kann!

Idee: lokales Alignment soll als Anker-Verfahren für anschliessendes globales

Alignment dienen. Dadurch hofft man, viele zusätzliche konservierte Regionen

ausserhalb der Anker-Regionen zu finden.



124

hohe Sensitivität von globalen Alignments

Couronne, ..., Dubchak, Genome Res. 13, 73 (2003)

Beispiel: das globale Alignment der mouse finished sequence

NT_002570 gegen die Region, die mit BLAT-Ankern gefunden

wurde, zeigt konservierte kodierende und nicht-kodierende

Elemente, die mit BLAT nicht gefunden wurden.



125

Zusätzliche Informationen aus globalem WGA

• Unterschiede in Repeat-Merkmalen

– Duplikationen (große Fragmente, chromosomal)

– Tandem-Repeats

• Große Insertionen und Deletionen

• Translokationen von einem Teil des Genoms zu einem anderen

• Single Nucleotide Polymorphism



126

Methods for WGA: iterative pairwise global alignment

These Methods follow a general strategy of iteratively merging two multiple

alignments of two disjoint subsets of sequences into a single multiple

alignment of the union of those subsets.

Construct a hash table on either the query string, or the database string (or

both) for all possible substrings of a pre-specified size (say l)

Find exactly matching substrings of length l using this hash table (seeds).

In the second phase, these seeds are extended in both directions, and

combined if possible, in order to find better alignments.

If the global pairwise alignment of two genomic DNA sequences S1 and S2

is computed by standard dynamic programming algorithms

(which requires O( | S1 |∙| S2 | time, where |S| is the length of sequence S)

such iterative methods cannot be used in practice to align DNA sequences

of entire genomes due to time and memory limitations.

examples are: FASTA, BLAST, MegaBLAST, BL2SEQ,

Wu-blast, flash,PipMaker (BLASTZ), and PatternHunter



127

Methods for WGA: anchor-based global multiple alignment

These methods try to identify substrings of the sequences under

consideration that they are likely parts of a global alignment.

(As mentioned, these substrings can be obtained from local alignments).

These substrings form „anchors“ in the sequences to be aligned.

These methods first align the anchors and subsequently close the gaps

(align the substrings between the anchors).

Anchor-based alignment methods are well suited for aligning very

long sequences.

MUMmer is a very successful implementation of this strategy for aligning

two genome sequences.



128

Was ist MUMmer?

• A.L. Delcher et al. 1999, 2002 Nucleic Acids Res.

• http://www.tigr.org/tigr-scripts/CMR2/webmum/mumplot

• Nimm an, dass zwei Sequenzen eng verwandt sind (sehr ähnlich)

• MUMmer kann zwei bakterielle Genome in weniger als 1 Minute alignieren

• nutzt Suffix-Bäume um Maximal Unique Matches zu finden

• Definition eines Maximal Unique Matches (MUM):

– Eine Subsequenz, die in beiden Sequenzen genau einmal ohne Abweichungen vorkommt und in keine Richtung verlängert werden kann.

• Grundidee: ein MUM ausreichender Länge wird sicher Teil eines globalen Alignments sein.

A maximal unique matching subsequence (MUM) of 39 nt (shown in uppercase) shared by

Genome A and Genome B. Any extension of the MUM will result in a mismatch.

By definition, an MUM does not occur anywhere else in either genome. Delcher et al. Nucleic Acids Res 27, 2369 (1999)



129

MUMmer: wichtige Schritte

• Erkenne MUMs (Länge wird vom Benutzer festgelegt)

ACTGATTACGTGAACTGGATCCAACTCTAGGTGAAGTGATCCA

ACTGATTACGTGAACTGGATCCAACTCTAGGTGAAGTGATCCA

ACTGATTACGTGAACTGGATCCA

ACTC--TAGGTGAAGTG-ATCCA

1 10

1 10

20

20



130

Definition von MUMmers

• Für zwei Strings S1 und S2 und einen Parameter l

• Der Substring u ist eine MUM Sequenz wenn gilt: |u| > l u kommt genau einmal in S1 und genau einmal in S2 (Eindeutigkeit) Für jeden Buchstaben a kommt weder ua noch au sowohl in

S1 als auch in S2 vor (Maximalität)



131

Wie findet man MUMs?

• Naiver Ansatz

– Vergleiche alle Teilsequenzen von A mit allen Teilsequenzen von B.

Dies dauert O(nn)

• verwende Suffix-Bäume als Datenstruktur

– ein naiver Ansatz, einen Suffix-Baum zu konstruieren hat

eine quadratische Komplexität in der Rechenzeit und dem Speicherplatz

– durch klevere Benutzung von Pointern gibt es lineare Algorithmen in

Rechenzeit und Speicherplatz wie den Algorithmus von McCreight



132

Suffix-Bäume

CACATAG$

Suffix-Bäume sind seit über 20

Jahren wohl etabliert.

Einige ihrer Eigenschaften: • ein “Suffix” beginnt an jeder

Position I der Sequenz und reicht

bis zu ihrem Ende. • Eine Sequenz der Länge N hat N

Suffices.• Es gibt N Blätter.• Jeder interne Knoten hat mindest

zwei Kinder.• 2 Kanten aus dem selben Knoten

können nicht mit dem selben

Buchstaben beginnen.• Am Ende wird $ angefügt



133

Suchen in einem Suffix-Baum

CA

T

CA

G$

A

T

CA

G$

TT

A

G

$G

$

AA

T G $A

G

$

G $$

123

4

5

6

78

A

Search Pattern:CATA



134

Suchen in einem Suffix-Baum

CA

T

CA

G$

A

T

CA

G$

TT

A

G

$G

$

AA

T G $A

G

$

G $$

123

4

5

6

78

A

Search Pattern:ATCG



135

MUMmer 1.0: Wie findet man MUMs?

• Konstruiere einen Suffix-Baum aus allen Suffices von Genom A• Füge jedes Suffix von Genom B in diesen Suffix-Baum ein• Kennzeichne jedes Blatt mit dem Genom, das es enthält



136

Sortieren der MUMs

• MUMs werden nach ihren Positionen in Genom A sortiert

1 2 3 4 5 6 7

1 3 2 4 6 7 5

Genome A:

Genome B:

1 2 4 6 7

1 2 46 7

Genome A:

Genome B:

Jeder MUM ist nur mit seiner Nummer gekennzeichnet, ohne Berücksichtigung seiner Länge.

Das obere Alignment zeigt alle MUMs.

Die Verschiebung von MUM 5 in Genom B zeigt eine Transposition an.

Die Verschiebung von MUM 3 könnte ein Zufallstreffer oder Teil einer inexakten Repeat-Sequenz sein.

Unteres Alignment: suche in beiden Genomen die längste gemeinsam ansteigende Folge an

Subsequenzen



137

Es gibt 4 Arten an Gaps in MUM-Alignments

Delcher et al. Nucleic Acids Res 27, 2369 (1999)

Diese Beispiele

stammen aus dem

Alignment der beiden

M.tuberculosis

Genome.



138

Beispiel: Alignment zweier Mikroorganismen


Das Genom von M.genitalium ist nur etwa 2/3 so

lang wie das von M.pneumoniae.

Obere Abbildung: FASTA-Alignment von

M.genitalium und M.pneumoniae.

Mitte: Alignment mit 25mers

Unten: Alignment mit MUMs. 5 Translokationen.

Ein Punkt bedeutet jeweils einen Treffer zwischen

den Genomen.

FASTA-Plot: ähnliche Gene

25-mer-Plot: 25-Basen-Sequenz, die in beiden

Sequenzen genau einmal vorkommt.

MUM-Plot: MUM-Treffer.



139

Example: alignment human:mouse


Alignment of even more distant

species: human and mouse.

Here: alignment of a 222 930 bp

subsequence of human

chromosome 12p13, accession

no. U47924, to a 227 538 bp

subsequence of mouse

chromosome 6, accession no.

AC002397. Each point in the plot

corresponds to an MUM of

[ge]15 bp.



140

Zusammenfassung

• Die Anwendung der Suffix-Bäume war ein Durchbruch für die

Alignierung ganzer Genome

• MUMmer 2 besitzt zusätzliche Verbesserung für die Rechenzeit und

den Speicherplatz

– die Verwendung von Suffix-Arrays anstatt von Suffix-Bäumen gibt

eine verbesserte Datenstruktur ( Stefan Kurtz, Hamburg)

– es wird nun möglich, mehr als zwei Genome zu alignieren

(implementiert in MGA)



141

V6: Bioinformatische Analyse von Proteinstrukturen

Angelehnt an Kapitel 1 und 5 aus dem Buch von Arthur Lesk

- Hierarchischer Aufbau der Proteinstruktur

- Klassifikation von Proteinstrukturen



142

Funktion von Proteinen

Strukturproteine (Hüllenproteine von Viren, Cytoskelett)

Enzyme, die chemische Reaktionen katalysieren

Transport- und Speicheproteine (Hämoglobin)

Regulatoren wie Hormone und Rezeptoren/Signalübertragungsproteine

Proteine, die die Transkription kontrollieren

oder an Erkennungsvorgängen beteiligt sind:

Zelladhäsionsproteine, Antikörper



143

Warum sind Proteine so groß?

Proteine sind große Moleküle.

Ihre Funktion ist oft in einem kleinen Teil der Struktur, dem aktiven Zentrum,

lokalisiert.

Der Rest?

- Korrekte Orientierung der Aminosäuren des aktiven Zentrums

- Bindungsstellen für Interaktionspartner

- Konformationelle Dynamik

Evolution der Proteine: Veränderungen der Struktur, die durch Mutationen in ihrer

Aminosäuresequenz hervorgerufen werden.



144

Hierarchischer Aufbau

Primärstruktur – Sekundärstruktur – Tertiärstruktur – Quartärnere Struktur –

Komplexe

Welche „Kräfte“ sind für die Ausbildung der verschiedenen „Strukturen“

wichtig?



145

Einleitung: Aminosäuren

Aminosäuren sind die Bausteine von Proteinen:

R

NH

H

O

OH

H

Carboxylsäure

Aminogruppe

Aminosäuren unterscheiden sich hinsichtlich ihrer- Größe- elektrischen Ladung- Polarität- Form und Steifigkeit



146

Proteine sind aus 20 verschiedenen natürlichenAminosäuren aufgebaut

5 sind hydrophob.Sie sind vor allemIm Proteininneren. H

NH

H

O

OH

H

CH

NH

H

O

OH

H

CH

NH

H

O

OH

CH

H

CH

NH

H

O

OH

CHCH

H

CH

NH

H

O

OH

CH

CH

H

CH

H C

Glycine

3

3

2 3

Alanine3

Valine

33

Leucine3

2

Isoleucine

Einleitung: hydrophobe Aminosäuren



147

Es gibt drei voluminöse aromatische Aminosäuren. Tyrosin und Tryptophan

liegen bei Membranproteinen vor allem in der Interface-region.

H

CH

NH

H

O

OH

H

CH

NH

H

O

OH

OH

H

CHN

CH

NH

H

O

OH

H

Phenylalanin

2

Tyrosin

2

Tryptophan

2

Einleitung: aromatische Aminosäuren



148

Es gibt 2 Schwefel enthaltende Aminosäuren und das ungewöhnliche Prolin.

Cysteine können Disulfidbrücken bilden.

Prolin ist ein “Helixbrecher”.

H

S

CH

NH

H

O

OH

H

H

CH

CH

NH

H

O

OH

S

CH

HNH

H

O

OH

CH

CHCH

Cystein

2 2

2

3

Methionin

2

Prolin

2

2




149

Es gibt zwei Aminosäuren mit terminalen polaren Hydroxlgruppen:

H

CH2

CH

NH

H

O

OH

OH

H

CH

CH

NH

H

O

OH

CH O H

Serin

2 2

3

Threonin




150

Es gibt 3 positiv geladene Aminosäuren. Sie liegen vor allem auf der

Proteinoberflächen und in aktiven Zentren.

Thermophile Organismen besitzen besonders viele Ionenpaare auf den Protein-

oberflächen.H

CH

NH

H

O

OH

CH

CH

CH

NH

H

CH

NH

H

O

OH

CH

CH

N H

NH NH

H

CH

NH

H

O

OH

N N

H

H

H

H

Lysin

2

2

2

2

3

+

2

2

2

2 2

+

Arginin

2

+

Histidin




151

Es gibt 2 negativ geladene Aminosäuren und ihre zwei neutralen Analoga.

Asp und Glu haben pKa Werte von 2.8. Das heisst, erst unterhalb von pH=2.8

werden ihre Carboxylgruppe protoniert.

H

CH

NH

H

O

OH

O O

H

O O

CH

NH

H

O

OH

CH

H

CH

NH

H

O

OH

O NH

H

O NH

CH

NH

H

O

OH

CH

Asparaginsäure

2 2

Glutaminsäure

2

Asparagin

2 2

Glutamin

2

2

2-

-




152

• Ein- und Drei-Buchstaben-Codes der Aminosäuren

G Glycin Gly P Prolin ProA Alanin Ala V Valin ValL Leucin Leu I Isoleucin IleM Methionin Met C Cystein CysF Phenylalanin Phe Y Tyrosin TyrW Tryptophan Trp H Histidin HisK Lysin Lys R Arginin ArgQ Glutamin Gln N Asparagin AsnE Glutaminsäure Glu D Asparaginsäure AspS Serin Ser T Threonin Thr

Zusätzliche CodesB Asn/Asp Z Gln/Glu X Irgendeine Aminosäure

Kenntnis dieser Abkürzungen ist essentiell für Sequenzalignments und für Proteinstrukturanalyse!

Buchstaben-Code der Aminosäuren



153

In Peptiden und Proteinen sind die Aminosäuren miteinander als lange

Ketten verknüpft.

Ein Paar ist jeweils über eine „Peptidbindung“ verknüpft.

Die Aminosäuresequenz eines

Proteins bestimmt seinen

„genetischen code“.

Die Kenntnis der Sequenz eines

Proteins allein verrät noch nicht

viel über seine Funktion.

Entscheidend ist seine

drei-dimensionale Struktur.

O

OR

H

H N

O

OR

H

H N

O

O

O

R

H

H N N

H

H

R

O

O

O

R

H

H N N

H

H

R

+

-3

+

-3+

+3

-+ H O2

2

2

1

1

+3

21

peptide bond

G>0

Einleitung: Peptidbindung



154

E.J. Corey und Linus Pauling studierten die Petidbindung in den

1940‘ern und 1950‘ern.

Sie fanden: die C-N Länge ist 1.33 Å.

Sie liegt damit zwischen 1.52 Å und 1.25 Å,

was die Werte für eine Einfach- bzw.

Doppelbindung sind.

Die benachbarte C=O Bindung hat eine Länge

Von 1.24 Å, was etwas länger als eine typische

Carbonyl- C=O Doppelbindung ist (1.215 Å).

die Peptidbindung hat einen teilweise

konjugierten Charakter und ist nicht frei drehbar.

Es bleiben damit pro Residue 2 frei drehbare

Diederwinkel des Proteinrückgrats übrig.

O

OR

H

H N

O

OR

H

H N

O

O

O

R

H

H N N

H

H

R

O

O

O

R

H

H N N

H

H

R

+

-3

+

-3+

+3

-+ H O2

2

2

1

1

+3

21

peptide bond

G>0

Eigenschaften der Peptidbindung

Linus PaulingNobelpreise fürChemie 1954 undFrieden 1963



155

Wie seit den 1950‘er Jahren bekannt,

können Aminosäure-Stränge

Sekundärstrukturelemente

bilden:(aus Stryer, Biochemistry)

-Helices

und -Stränge.

In diesen Konformationen

bilden sich jeweils

Wasserstoffbrückenbindungen

zwischen den C=O und N-H

Atomen des Rückgrats. Daher

sind diese Einheiten strukturell

stabil.

Einleitung: Sekundärstrukturelemente



156

Diederwinkel des Proteinrückgrats

Lesk-Buch

Die dreidimensionale

Faltung des Proteins wird

vor allem durch die

Diederwinkel des

Proteinrückgrats bestimmt.

Pro Residue gibt es 2 frei

drehbare Diederwinkel, die

als und bezeichnet

werden.



157

Stabilität und Faltung von Proteinen

Die gefaltete Struktur eines Proteins ist

die Konformation, die die günstigste freie

Enthalpie G für diese

Aminosäuresequenz besitzt.

Der Ramachandran-Plot charakterisiert

die energetisch günstigen Bereiche des

Aminosäurerückgrats.

r-Helix-Region

-Faltblatt-Region

(rechtsgängige Helix)



158

Kompakter Bereich im

Faltungsmuster einer

Molekülkette,

der den Anschein hat, “er

könnte auch unabhängig von

den anderen stabil sein”.

Domänen

cAMP-abhängige Proteinkinase

SERCA Calcium-Pumpe

Lesk-Buch



159

Modular aufgebaute Proteine bestehen aus mehreren Domänen.

Anwendung von SMART (www.smart.embl-heidelberg.de) für die Src-Kinase HcK

ergibt

Sequenz: MGGRSSCEDP GCPRDEERAP RMGCMKSKFL QVGGNTFSKT ETSASPHCPVYVPDPTSTIK PGPNSHNSNT PGIREAGSED IIVVALYDYE AIHHEDLSFQKGDQMVVLEE SGEWWKARSL ATRKEGYIPS NYVARVDSLE TEEWFFKGISRKDAERQLLA PGNMLGSFMI RDSETTKGSY SLSVRDYDPR QGDTVKHYKIRTLDNGGFYI SPRSTFSTLQ ELVDHYKKGN DGLCQKLSVP CMSSKPQKPWEKDAWEIPRE SLKLEKKLGA GQFGEVWMAT YNKHTKVAVK TMKPGSMSVEAFLAEANVMK TLQHDKLVKL HAVVTKEPIY IITEFMAKGS LLDFLKSDEGSKQPLPKLID FSAQIAEGMA FIEQRNYIHR DLRAANILVS ASLVCKIADFGLARVIEDNE YTAREGAKFP IKWTAPEAIN FGSFTIKSDV WSFGILLMEIVTYGRIPYPG MSNPEVIRAL ERGYRMPRPE NCPEELYNIM MRCWKNRPEERPTFEYIQSV LDDFYTATES QYQQQP

Modular aufgebaute Proteine



160

Die Klassifikation von Proteinstrukturen

nimmt in der Bioinformatik eine

Schlüsselposition ein, weil sie das

Bindeglied zwischen Sequenz und

Funktion darstellt.

Lesk-Buch

Klassifikation von Proteinen



161

Lesk-Buch

Anwendungen der Hydrophobizität



162

Betrachte die Residuen einer

Transmembranhelix …

-Helices in globulären Proteinen

haben oft eine ins Innere des

Proteins weisende „hydrophobe“

Seite und eine „hydrophile“ Seite,

die zum Lösungsmittel gerichtet

ist.

In einer -Helix ist jede Aminosäure

um etwa 100 Grad gegenüber ihrem

Vorgänger verdreht.

Damit müssen sich hydrophile und

hydrophobe Residuen etwa alle

4 Positionen abwechseln.

Anwendungen der Hydrophobizität: Das helikale Rad

Dasselbe Verhalten zeigen

amphipatische Helices, die

auf der Oberfläche einer

Lipid-Doppelschicht binden.



163

Im Inneren der Lipidschicht kann das Proteinrückgrat keine Wasserstoffbrücken-

Bindungen mit den Lipiden ausbilden

die Atome des Rückgrats müssen miteinander Wasserstoffbrückenbindungen

ausbilden,

sie müssen entweder helikale oder -Faltblattkonformation annehmen.

Topologie von Membranproteinen



164

Topologie von Membranproteinen

http://www.biologie.uni-konstanz.de/folding/Structure%20gallery%201.html

Die hydrophobe Umgebung erzwingt, dass (zumindest die bisher bekannten)

Strukturen von Transmembranproteinen entweder reine -Barrels (links)

oder reine -helikale Bündel (rechts) sind.



165

Vergleich von zwei Proteinstrukturen:

Angabe des RMS-Werts, die Wurzel

der mittleren quadratischen

Abweichung,

oder root-mean-square deviation

Interessanterweise ist bei zwei

verschiedenen Proteinen oft nicht klar,

welche Atome überlagert werden

sollen!

Superposition von Strukturen und Struktur-Alignment

n

dRMS i

2

di : Abstand zwischen den Koordinaten

des i-ten Atompaares

n : Anzahl an Atompaaren



166

Die Sekundärstrukturelemente -Helix und -Faltblatt werden durch energetisch

günstige Wasserstoffbrücken zwischen Atomen des Peptidrückgrats gebildet.

Sie sind sequenzunabhängig.

Protein ”folds” ergeben sich durch die Assemblierung von

Sekundärstrukturelementen.

Der Ramachandran-Plot ist ein wichtiges Werkzeug um die Güte von Protein-

strukturen (bzw. –modellen) zu beurteilen.

Proteine sind oft modular aus mehreren Domänen aufgebaut.

Der Vergleich mehrerer Proteinstrukturen ist nicht-trivial.

Zusammenfassung



167

V7: Aufklärung von Proteinstrukturen in der nahen Zukunft

Structural genomics soll die Strukturen von 1000-10.000 Proteinen vor allem

mit neuen Faltungsmustern („folds“) aufklären.

Bedeutung von Folds. Grundsätzliches zu Struktur – Funktion Beziehung.

Definition von Folds: siehe V6

Homologiemodellierung der Strukturen aller verwandten Proteine unter

Verwendung der bekannten 3D-Strukturen als Vorlagen.



168

Analyse einer unbekannten Sequenz

Suche in Sequenzdatenbankennach identischer Sequenz bzw. ähnlichen Sequenzen

Gibt es ähnliche Sequenz mit bekannter 3D-Struktur?

Vorhersage der Sekundärstruktur

Kann man Funktionzuordnen?

Modellierung der Proteinstruktur durch Homologiemodellierung

Ab inito Vorhersage der Tertiärstruktur

Zuordnung eines Protein-Folds

Multiples Sequenzalignment

Input: neue Proteinsequenz

Alignment der Sekundärstrukturen.

Erkenne Domänen

Analyse dieses Folds, Nachbarn?

ExperimentelleDaten vorhanden?

3D-Proteinstruktur

Alignment der Sequenzmit einer Target-Struktur

Fold erkannt?

Nein

Ja

Nein

Ja

Nach Rob Russell,http://speedy.embl-heidelberg.de/gtsp/flowchart2.html



169

Homologie/Komperative Modellierung

Protein structure modeling for structural genomics. R. Sánchez et al. Nat. Struct. Biol. 7, 986 - 990 (2000)

Qualität der Modellierung

hängt von Sequenzidentität

mit Vorlage ab.



170

Genomweite Strukturmodellierung

R. Sánchez et al. Nat. Struct. Biol. 7, 986 - 990 (2000)

Effekt des Wachstums der PDB-

Datenbank auf die Zahl der Protein des

Bakteriums M. Genitalium, deren Fold

und Struktur im jeweiligen Jahr

vorhergesagt werden konnte.

Homologie-Modellierung ist nicht

aufwendig, dauert pro Struktur nur

wenige Minuten.

Akkurate Modellierung von Loops und

Seitenketten kann jedoch erheblich

aufwendiger sein.

Grün: Proteine mit Modell oder fold

assignment aus PSI-BLAST für mindestens

30 ihrer Residuen.

Blau: nur Modell

Rot: Anteil der Residuen des Genoms, die

in Modell oder fold assignment vorkommen.



171

Schliesse von Struktur auf Funktion?

From structure to function: Approaches and

limitations J. M. Thornton et al. Nat. Struct.

Biol. 7, 991 (2000)



172

Methode zur Fold-Erkennung: Threading

• Gegeben:

– Sequenz:

IVACIVSTEYDVMKAAR…

– Ein Datenbank von möglichen

Proteinstrukturen (“folds”)

• Bilde die Sequenz auf jeden fold ab

• Bestimme anhand einer

Bewertungsfunktion, welcher Fold am

besten zu dieser Sequenz passt.



173

Bryngelson, Wolynes, PNAS

(1987)

Gradient Rauhigkeit

beschleunigt bremst

Faltung Faltung

“Frustration”

„New view of protein folding“:Faltung entlang trichterähnlichen Energielandschaften

Brooks, Gruebele, Onuchic, Wolynes,

PNAS 95, 11037 (1998)



174

Fold Optimierung

• Einfache Gittermodelle (HP-Modelle)

– Zwei Sorten von Seitenketten:

hydrophob und polar

– 2-D oder 3-D Gitter

– Treibende Kräfte:

hydrophober Kollaps – es ist günstig,

Kontakte zwischen hydropoben Seitenketten

zu bilden

– Bewertung = Anzahl an HH Kontakten



175

Homologie-basierte Proteinmodellierung (SwissModel)

• Methode: Wissensbasierter Ansatz.

• Erfordernis: Mindestens 1 bekannte 3D-Struktur eines verwandten Proteins,

• Prozedur:

• Superposition der verwandten 3D-Strukturen

• Erzeugung eines multiplen Sequenzalignments mit der Zielsequenz.

• Generierung eines Frameworks für die neue Sequenz.

• Konstruiere fehlende Loops.

• Vervollständige und korrigieren das Proteinrückgrat.

• Korrigiere die Seitenketten.

• Überprüfe die Qualität der modellierten Struktur und deren Packung.

• Strukturverfeinerung durch Energieminimierung und Moleküldynamik.www.expasy.org/swissmodel/SWISS-MODEL.html



176

Überlagerung der 3D-Strukturen

Regionen mit Sequenzähnlichkeit werden automatisch ausgewählt und ihre

Residuen in 3D überlagert.

Diese erste Auswahl wird weiter verfeinert.

www.expasy.org/swissmodel/SWISS-MODEL.html



177

(a) Für alle Atome, die eine ähnliche Position besitzen und vermutlich eine

strukturelle Entsprechung in der neuen Struktur besitzen, werden gemittelte

Positionen als Framework-Koordinaten bestimmt.

(b) Seitenketten mit völlig inkorrekter Geometrie werden entfernt.

(c) Matrix mit Gewichten für lokale Ähnlichkeit.

3D Framework für die neue Sequenz




178

Basierend auf den Verankerungen der Loops werden

(a) wird eine Datenbank bekannter Loopfragmente in der PDB-Datenbank

durchsucht.

Für den neuen Loop verwendet man entweder das am besten passende

Fragment oder ein Framework aus den 5 besten Fragmenten.

(b) Der Torsionsraum der Loopresiduen wird durchsucht

- 7 erlaubte Kombinationen der - Winkel

- benötigter Raum für den gesamten Loop

Konstruktion fehlender Loops




179

Rekonstruktion von fehlendem Proteinrückgrat

Das Rückgrat wird auf der Grundlage von

C -Positionen konstruiert.

- 7 Kombinationen der - Winkel sind

erlaubt.

- Durchsuche Datenbank für Backbone-

Fragmente mit Fenster aus 5 Residuen,

Verwende die Koordinaten der 3 zentralen

Residuen des am besten passenden

Fragments.




180

Verwende Bibliothek erlaubter Seitenketten-Rotamere geordnet nach der

Häufigkeit des Auftretens in der PDB-Datenbank.

- Erst werden verdrehte (aber komplette) Seitenketten korrigiert.

- fehlende Seitenketten werden aus der Rotamer-Bibliothek ergänzt.

Teste dabei, ob van-der-Waals Überlapps auftreten und ob die

Torsisonswinkel in erlaubten Bereichen liegen.

Konstruktion unvollständiger/fehlender Seitenketten




181

Überprüfe die Qualität der 3D-Modelle

Analysiere 3D-Umgebung jeder Seitenkette. Erlaubt die Identifizierung

missgefalteter Regionen.

Auch: WHATCHECK




182

Berechne, welche Bereiche des Proteins für eine kleine Probe zugänglich sind

(Connolly-Oberfläche bzw. Kubisches Gitter). Algorithmus entdeckt Oberflächen

innerhalb und ausserhalb des Proteins. Der Vergleich von Grösse und Verteilung

von internen Cavities zwischen Modell und Kristallstruktur-Vorlage erlaubt es,

Fehler im Modell aufzuspüren.

Analyse der Packungsdichte eines atomaren Modells




183

Bewertung der Qualität eines Homologiemodells1. Allgemeine Gesichtspunkte

• Ein Modell wird als falsch angesehen, wenn mindestens eines seiner strukturellen Elemente gegenüber dem Rest des Modells falsch angeordnet ist. Dies kann durch ein falsches

Sequenzalignment entstehen.

Das Modell kann dennoch korrekte Stereochemie besitzen.

• Man kann ein Modell als ungenau ansehen wenn seine atomare Koordinaten mehr als 0.5 Å von einer experimentellen Kontrollstruktur abweichen.

• Ungenauigkeiten können auch in der Stereochemie (Bindungslängen und –winkel auftreten). Dies kann leicht mit WhatCheck überprüft werden.

• Statistische Paarpotentiale für die Verteilung von Aminosäuren in bekannten Proteinen erlauben manchmal die Aufspürung von fehlerhaften Modellen.




184

2. Fehlerquellen

Die Qualität eines Modells hängt von 2 Kriterien ab

1 Seine Korrektheit hängt von der Qualität des Sequenzalignments ab.

2 Seine Genauigkeit wird durch seine Abweichung von einer (zukünftig zu bestimmenden) experimentellen Struktur bestimmt.

Strukturelle Abweichungen haben 2 Ursachen

- der inherente Fehler der Modellierungsprozedur

- durch Umgebung und Methoden der Datenerfassung bewirkte Variationen der experimentellen Strukturen, die als Vorlage verwendet werden.

• Ein durch komparative Methoden abgeleitetes Protein-Modell kann nicht genauer sein als der Unterschied zwischen einer NMR-Struktur und einer Kristallstruktur desselben Proteins.




185

3 Proteinkern und Loops

Fast jedes Proteinmodell enthält nicht-konservierte Loops, die als die am wenigsten zuverlässigen Teile des Proteinmodells angesehen werden

können.

Andererseits sind diese Bereiche der Struktur oft auch am flexibelsten –

hohe Temperaturfaktoren in Kristallstrukturen oder hohe Unterschiede zwischen verschiedenen (gleichsam gültigen) NMR-Strukturen.

Die Residuen im Proteinkern werden gewöhnlich fast in der identischen Orientierung wie in experimentellen Kontrollstrukturen modelliert.

Residuen an der Proteinoberfläche zeigen grössere Abweichungen.




186

Einordnung von Proteinmodellen in 3 Kategorien

1 Modelle, die auf falschen Alignments zwischen Vorlage und Zielprotein

basieren.

Strategie: konstruiere mehrere Modelle für unterschiedliche Alignments.

Wähle das am besten erscheinende Modell.

2 Modelle, die auf korrekten Alignments beruhen, können für zielgerichtete

Mutagenese-Experimente hilfreich sein.

Sind oft nicht zuverlässig genug für detaillierte Untersuchung von

Ligandenbindung.

3 Modelle, die auf einer hohen Sequenzidentität (> 70%) mit der Vorlage

beruhen. Solche Modelle können in Drug Design Projekten verwendet werden.

Fehler sind jedoch immer, also auch bei sehr hoher Identität möglich.



187

Test für die Zuverlässigkeit von SwissModell

3DCrunch-Projekt von Expasy zusammen mit SGI. Generiere „Homologie-

Modelle“ für Proteine mit bekannter 3D-Struktur.

Die Vorlagen besaßen 25 – 95 % Sequenzidentität mit dem Zielprotein.

1200 Kontrolle-Modelle.

Grad der Identität [%] Modell innerhalb von x Å RMSD zur Vorlage

< 1 < 2 < 3 < 4 < 5 > 5

25-29 0 10 30 46 67 33

30-39 0 18 45 66 77 23

40-49 9 44 63 78 91 9

50-59 18 55 79 86 91 9

60-69 38 72 85 91 92 8

70-79 42 71 82 85 88 12

80-89 45 79 86 94 95 5

90-95 59 78 83 86 91 9




188

Zusammenfassung

• Gemeinsamer Kern von Proteinen mit 50% Sequenzidentität

besitzt ca. 1 Å RMSD

• Dies gilt sogar für absolute identische Sequenzen.

• Der zuverlässigste Teil eines Proteinmodells ist der Sequenzabschnitt,

den es mit der Vorlage gemeinsam hat. Die größten Abweichungen liegen in

den konstruierten Schleifen.

• Die Wahl der Modellvorlage ist entscheidend!

Die An- oder Abwesenheit von Ko-faktoren, anderen Untereinheiten oder

Substraten kann Proteinkonformation sehr beeinflussen und somit alle Modelle,

die von ihnen abgeleitet werden.

• Jeder Fehler im Alignment produziert falsche Modelle!

Solche Alignment-Fehler treten bei Sequenzidentität unter 40% auf.



189

V8 Protein-Liganden-Wechselwirkung –anschaulich betrachtet

Beispiele für Protein-Liganden Komplexe

Wo ist das aktive Zentrum?

(Docking wird hier nicht behandelt – siehe Spezialvorlesungen von A. Kämper und

A. Hildebrandt/D. Neumann im SS05)

Wie stark binden Liganden an Proteine?

Wie kann man die Affinität des Liganden verbessern?



190

beta-Trypsin:Benzamidin (3ptb)

www.scripps.edu/pub/olson-web/doc/autodock

Enge, sehr polare Bindungstasche auf Proteinoberfläche.

Amidin-Gruppen des Liganden bilden 4 H-Bindungen mit Carboxylgruppen des Proteins (Trypsin) aus.

Benzolring passt optimal in hydro-phobe Tasche.



191

Cytochrome P450cam : Kampher (2cpp)


Weites, recht unpolares aktives Zentrum im Proteininneren.

Hämgruppe katalysiert Reaktion. Partielle Desolvatation.

Wie gelangt Substrat hinein?



192

Maus-Antikörper McPC-603:Phosphocholine (2mcp)


Bindungstasche auf Proteinoberfläche wird durch drei

hypervariable Loops geformt.



193

Streptavidin:Biotin (1stp)


Sehr polare, tiefe Bindungstasche.

Außerordentlich starke Affinität.



194

HIV-1 Protease:XK-263 Inhibitor (1hvr)


Inhibitor XK-263 stammt von Merck-Dupont. Er enthält eine 7-Ring

zyklische Urea-Einheit mit Phenyl- und Naphtyl-Ringen.

Die CO-Gruppe ahmt das ansonsten konservierte Wassermolekül 301 nach

und verdrängt es. Der tiefere Teil des zyklischen Urea-Rings enthält zwei

benachbarte Hydroxylgruppen, die H-Bindungen mit den katalytischen

Aspartat-Residuen bilden.



195

Identifikation von funktionellen Residuen

1 Funktionelle bzw. katalytische Residuen werden traditionell in (hoch)

konservierten Regionen von Multiple Sequence Alignments erwartet

evtl. Kopplung mit Information über 3D-Struktur

2: finde Residuen, die Proteinstruktur destabilisieren.

Grund: Funktionelle Residuen im Proteininneren sind oft energetisch ungünstig.

Funktionalität auf Kosten von Stabilität.

3: finde Löcher oder Einbuchtungen in Proteinstruktur.

Hier vorgestellt: integrierte Methode, die 1 -3 implementiert. Möglichkeit für

funktionelle Annotation von Proteinen mit unbekannter Funktion.



196

Wo ist das aktive Zentrum I?Auswahl von 49 Enzymen. Kriterien:

- Auflösung 2.0 Å

- funktionelle Residuen sind bekannt (in Swissprot-Eintrag in ACT_SITE)

- enthalten nur eine Domäne (SCOP Datenbank)

- die SCOP-Einträge sind unterschiedlich

- es gibt 10 homologe Sequenzen mit Blast E-Wert < 10-10.

98 katalytische Residuen:

22 His

17 Asp, Glu

10 Cys

8 Ser

7 Arg, Lys Ota, Kinoshita, Nishikawa, J Mol Biol 327, 1053 (2003)

5 Tyr

3 Asn

2 Thr



197

Repräsentative EnzymePDB Protein Länge Auflösung EC Zahl Zahl und Namen der

SCOP Seq. katalytischen Residuen



198

Fitness-Funktion

- Bewertung der Seitenketten-Konformation entsprechend Rotamer-Bibliothek

- Seitenketten-Packung (wissensbasiert)

- Hydratation (wissensbasiert)

- Analyse der Proteinoberfläche (MSP-Programm): Zuordnung zu den einzelnen

Residuen

- elektrostatische Energie: AMBER-Partialladungen elektrostatisches

Potential (aus Poisson-Boltzmann-Rechnung)

Jeder Score(S), Rang (R) und Position (L) werden gegen den Mittelwert und die

Standardabweichung für jeden Aminosäuretyp normalisiert.

Ota, Kinoshita, Nishikawa, J Mol Biol 327, 1053 (2003)



199

Vorhersage katalytischer Residuen in Enzymen

Beispiel: 3D-Profil für Lysozym aus Hühnereiweiss. D52 ist katal. Residue.

native Hydratations- lokale D52 hat sehr schlechten Rang. D.h.

Residue klasse Struktur es wäre günstig D52 zu ersetzen.

Katalytische Residuen sind stets un-

stabiler als nicht-katalytische.


Score Rang Score

native native beste

Residue Residue Residue



200

Vorhersage katalytischer Residuen in Enzymen

Flussdiagramm der Vorhersagemethode.

- Links oben Analyse der Konservierung.

- Rechts oben Analyse der Position in

3D-Struktur bzw. Stabilität der

Mutantenproteine

- untere Hälfte trifft für verschiedene

Aminosäuretypen (1-Letter-code)

die Entscheidung, ob katalytische

Residuen vorliegen.




201

Wo ist das aktive Zentrum II

Analyse mit elektrostatischen

Kontinuumsrechnungen

Die Titrationszustände der meisten

Aminosäuren folgen der

Henderson-Hasselbalch-Gleichung.

Berechne Titrationskurven für 3

Enzyme mit UHBD.

TIM und AR haben eine sehr ähnliche

Strukturen, katalysieren aber ganz

unterschiedliche Reaktionen.

AR und PMI haben sehr verschiedene

Strukturen, katalysieren aber ähnliche

Reaktionen.

HA

ApKpH a log

Ondrechen, Clifton, Ringe,

PNAS 98, 12473 (2001)



202

Theoretische Titrationskurven

Titrationskurven aller His-Residuen

in TIM

Triosephosphat Isomerase (TIM) katalysiert die Isomerierung von D-Glyceraldehyd-

3-Phosphat zu Dihydroxyaceton-Phosphat.

Man findet 4 Residuen mit verschobenen, flachen Titrationskurven:

His95, Glu165, Lys112, Tyr164.

Davon liegen H95, E165 und Y164 eng beieinander.Ondrechen, Clifton, Ringe,

PNAS 98, 12473 (2001)



203

Titrationskurven aller Tyr-Residuen

in AR


Aldose-Reduktase (AR) katalysiert die Reduktion einer Aldehydgruppe von

Aldose zu einem Alkohol.

Man findet 7 Residuen mit verschobenen, flachen Titrationskurven:

Tyr48, Cys298, Glu185, Lys21, Lys77, Tyr107, Tyr209.

Tyr48, His110 und Cys298 bilden das aktive Zentrum. Die anderen Residuen

liegen in der Nähe.


PNAS 98, 12473 (2001)



204

Titrationskurven aller Lys-Residuen

in PMI


PMI katalysiert die Interkonversion von Mannose-6-Phosphat und Fructose-6-Phosphat. Man findet 4 Residuen mit verschobenen, flachen Titrationskurven:His135, Lys100, Lys136, Tyr287.Alle liegen eng beieinander, die ersten 3 wohl im aktiven Zentrum und His135nahe bei Lys136.


PNAS 98, 12473 (2001)



205

Weitere BeispielePDB ID Name Chemie Residuen mit auffälligen Titrationskurven

1AMQ Aspartat [H189, Y225, K258, R266, C191, C192], aminotransferase Transamination [Y256], [Y295], [H301]

1CSE Subtilisin Peptidhydrolyse [D32, H64] Carlsberg (Serin-Protease)

1EA5 Acetylcholinesterase Ester Hydrolyse [Y130, E199, E327, H440, D392], [Y148], [H398], [H425]

1HKA 6-Hydroxymethyl- Kinase [D97, H115] 7,8-dihydropterin pyrophosphate kinase

1OPY 3-Keto-5-Steroid Isomerase [Y16, Y32, Y57], [C81] isomerase

1PIP Papain Peptidhydrolyse [C25, H159], (Cys Protease) [K17, K174, Y186], [R59], [R96]

1PSO Pepsin Peptidhydrolyse [D32, D215, D303], [D11] (Säure-Protease)

1WBA Winged bean Speicherung - keine keine albumin Enzymfunktion

Residue imzweiter Schale.Residue im

aktiven ZentrumOndrechen, Clifton, Ringe,

PNAS 98, 12473 (2001)



206

Fazit

Mittels elektrostatischer Kontinuumsrechnungen für bekannte Kristallstrukturen

von Proteinen wurde für verschiedene externe pH-Werte die energetisch

optimale Gesamtladung der Proteine berechnet.

Aktive Zentren von Enzymen enthalten oft mehrere polare bzw. geladene

Seitenketten um die chemische Umwandlung zu katalysieren.

Deren Titrationszustände sind eng aneinander gekoppelt und zeigen im

Vergleich zu isolierten Seitenketten sehr ungewöhnliche Titrationskurven.

Diese Methode erlaubt also die Position von aktiven Zentren allein aufgrund

der Proteinstruktur zu erkennen.


PNAS 98, 12473 (2001)



207

Wie stark binden Liganden an Proteine?

Kuntz, Chen, Sharp, Kollman, PNAS 96, 9997 (1999)



208

Bindungsaffinität

Metallionen oder Metalloenzyme

kleine Anionen

natürliche LigandenEnzyminhibitoren

linearer Anstieg der freien

Bindungsenthalpie zu Beginn

bis ca. 15 Nicht-H-Atome

Gbinding = - 60 kJ mol-1 maximal.

Dann wird Sättigung beobachtet.




209

Interpretation

Metallionen und Anionen binden

am stärksten.

Nanomolekulare Liganden können

bereits mit 7-10 Atomen erreicht werden.

Grössere Liganden

- besitzen üblicherweise nur eine

kleine Zahl polarer Atome pro Molekül

- die elektrostatischen Gruppen der

Bindungsstelle werden zunehmend

im Inneren begraben

- sind oft elektrisch neutral

- besitzen mehr entropische

Freiheitsgrade


-G pro Atom



210

Eine konkrete Studie an einem biologischen System –oft kommt es anders als man denkt.

Gu, W., Kofler, W., Antes, I., Freund, C., Helms, V. (2005)

Biochemistry, 44, 6404-6415.

Alternative Binding Modes of Proline-rich Peptides Binding

to the GYF-Domain.

entfällt



211

Zusammenfassung

Die Protein:Liganden Wechselwirkung ist heutzutage relativ gut verstanden.

Wir haben Tools kennengelernt, mit denen man

- die Position des aktiven Zentrums lokalisieren kann

- Bindungsaffinitäten abschätzen bzw. verbessern kann

- die Assoziation bzw. Dissoziation des Liganden simulieren kann.

Für die Zukunft bleibt:

(1) korrelierte Analysen aus der umgekehrten Richtung: finde einen Liganden,

der selektiv an ein bestimmtes Protein bindet, jedoch nicht an andere

(2) Automatisierung + Verknüpfung der obigen Schritte

(3) Einbeziehung zusätzlicher Gesichtspunkte (ADMET)



212

V9 From Protein Complexes to Networks and backProtein interaction could be defined in a number of ways

(1) Proteins that form permanent supracomplexes = „protein machines“

(2) Proteins that bind each other transiently

(signal transduction, bioenergetics ... )

(3) Co-regulated expression of genes/proteins

(4) Proteins participating in the same metabolic pathways

(5) Proteins sharing substrates

(6) Proteins that are co-localized

Techniques: Experimental methods + computational methods.



213

How transferable are interactions?

interaction similariy (iRMSD) vs. %

sequence identity for all the available

pairs of interacting domains with

known 3D structure.

Curve shows 80% percentile (i.e. 80%

of the data lies below the curve), and

points below the line (iRMSD = 10 Å)

are similar in interaction. Aloy et al. Science, 303, 2026 (2004)



214

6. In silico studies to predict protein protein contactsField of studying protein interactions is split into two areas:

(1) on the macro level: map networks of protein interactions

(2) on the micro level: understand mechanisms of interaction

to predict interaction sites

Growth of genome data stimulated a lot of research in area (1).

Fewer studies have addressed area (2).

Constructing detailed models of the protein-protein interfaces is important

for comprehensive understanding of molecular processes, for drug design and

for prediction the arrangement into macromolecular complexes.

Also: understanding (2) should facilitate (1).

Therefore, this lecture focusses on linking area (2) to area (1).



215

Bioinformatic identification of interface patches

Statistical analysis of protein-protein interfaces in crystal structures of

protein-protein complexes: residues at interfaces have significantly different

amino acid composition that the rest of the protein.

predict protein-protein interaction sites from local sequence information ?

Conservation at protein-protein interfaces: interface regions are more conserved

than other regions on the protein surface

identify conserved regions on protein surface e.g. from solvent accessibility

Patterns in multiple sequence alignments: Interacting residues on two binding partners

often show correlated mutations (among different organisms) if being mutated

identify correlated mutations

Structural patterns: surface patterns of protein-protein interfaces: interface often

formed by hydrophobic patch surrounded by ring of polar or charged residues.

identify suitable patches on surface if 3D structure is known



216

7 Analysis of interfaces

1812 non-redundant protein

complexes from PDB

(less than 25% identity).

Results don‘t change

significantly if NMR structures,

theoretical models, or

structures at lower resolution

(altogether 50%) are excluded.

Most interesting are the results

for transiently formed

complexes.

Ofran, Rost, J. Mol. Biol. 325, 377 (2003)

permanent

transient



217

Amino acid composition of interface types

The frequencies of all residues found in SWISS-PROT were used as background

when the frequency of an amino acid is similar to its frequency in SWISS-PROT, the

height of the bar is close to zero. Over-representation results in a positive bar, and

under-representation results in a negative bar. Ofran, Rost, J. Mol. Biol. 325, 377 (2003)



218

Pairing frequencies at interfaces

red square: interaction occurs more

frequently than expected;

blue square: it occurs less frequently than

expected.

(A) Intra-domain: hydrophobic core is clear

(B) domain–domain,

(C) obligatory homo-oligomers,

(D) transient homo-oligomers,

(E) obligatory hetero-oligomers, and

(F) transient hetero-oligomers.

The amino acid residues are ordered

according to hydrophobicity, with isoleucine

as the most hydrophobic and arginine as the

least hydrophobic.

propensities have been successfully used

to score protein-protein docking runs. Ofran, Rost, J. Mol. Biol. 325, 377 (2003)



219

8 Correlated mutations at interface

Pazos, Helmer-Citterich, Ausiello, Valencia J Mol Biol 271, 511 (1997):

correlation information is sufficient for selecting the correct structural arrangement of

known heterodimers and protein domains because the correlated pairs between the

monomers tend to accumulate at the contact interface.

Use same idea to identify interacting protein pairs.



220

Correlated mutations at interface

Correlated mutations evaluate the similarity in variation patterns between positions in

a multiple sequence alignment.

Similarity of those variation patterns is thought to be related to compensatory

mutations.

Calculate for each positions i and j in the sequence a rank correlation coefficient (rij):

Pazos, Valencia, Proteins 47, 219 (2002)

lkjjkl

lkiikl

lkjjkliikl

ij

SSSS

SSSS

r

,

2

,

2

,

where the summations run over every possible pair of proteins k and l in the multiple

sequence alignment.

Sikl is the ranked similarity between residue i in protein k and residue i in protein l.

Sjkl is the same for residue j.

Si and Sj are the means of Sikl and Sjkl.



221

i2h method

Schematic representation of the i2h method.

A: Family alignments are collected for two

different proteins, 1 and 2, including

corresponding sequences from different

species (a, b, c, ).

B: A virtual alignment is constructed,

concatenating the sequences of the probable

orthologous sequences of the two proteins.

Correlated mutations are calculated.

C: The distributions of the correlation values

are recorded. We used 10 correlation levels.

The corresponding distributions are

represented for the pairs of residues internal

to the two proteins (P11 and P22) and for the

pairs composed of one residue from each of

the two proteins (P12). Pazos, Valencia, Proteins 47, 219 (2002)



222

Predictions from correlated mutations

Results obtained by i2h in a set of 14 two domain

proteins of known structure = proteins with two

interacting domains. Treat the 2 domains as different

proteins.

A: Interaction index for the 133 pairs with 11 or more

sequences in common. The true positive hits are

highlighted with filled squares.

B: Representation of i2h results, reminiscent of those

obtained in the experimental yeast two-hybrid system.

The diameter of the black circles is proportional to the

interaction index; true pairs are highlighted with gray

squares. Empty spaces correspond to those cases in

which the i2h system could not be applied, because they

contained <11 sequences from different species in

common for the two domains.

In most cases, i2h scored the correct pair of protein

domains above all other possible interactions.Pazos, Valencia, Proteins 47, 219 (2002)



223

Predicted interactions for E. coli

Number of predicted interactions for E. coli.

The bars represent the number of

predicted interactions obtained from the

67,238 calculated pairs (having at least 11

homologous sequences of common

species for the two proteins in each pair),

depending on the interaction index cutoff

established as a limit to consider

interaction.

Pazos, Valencia, Proteins 47, 219 (2002)

Among the high scoring pairs are many cases of known interacting proteins.



224

9 Coevolutionary Analysis

Idea: if co-evolution is relevant, a ligand-receptor pair should occupy related

positions in phylogenetic trees.

Goh & Cohen, 2002 showed that within correlated phylogenetic trees,

the protein pairs that bind have a higher correlation between their phylogenetic

distance matrices than other homologs drawn drom the ligand and receptor

families that do not bind.

Other Idea: analyze occurrence of proteins that can functionally substitute for

another in various organisms.

Detect analogous enzymes in thiamin biosynthesis



225

Detect analogous enzymes in thiamin biosynthesis Gene names are applied according to the first gene

described from a group of orthologs.

Solid black arrows represent known or proposed

reaction steps and dashed black arrows indicate

unknown reactions. In addition, significant

anticorrelations in the occurrence of genes across

species (red arrows), and relevant in silico predicted

protein-protein interactions (blue dashed arrows) are

illustrated.

Distinct precursors have been proposed for different

species (indicated in gray). Genes with orthologous

sequences in eukaryotes and prokaryotes are in

green; genes assumed to be prokaryote-specific are

black. Interestingly, significant 'one-to-one'

anticorrelations usually involve a prokaryote-specific

and a 'ubiquitous' gene.

Abbreviations: AIR, 5-aminoimidazole ribonucleotide;

Cys, cysteine; Gly, glycine; His, histidine; HMP, 2-

methyl-4-amino-5-hydroxymethylpyrimidine; THZ, 4-

methyl-5- -hydroxyethylthiazole; Tyr, tyrosine; Vit. B6,

Vitamin B6.

Morett et al. Nature Biotech 21, 790 (2003)



226

THI-PP biosynthesis pathway: analogous genesNegatively correlating gene

occurrences are highlighted using the

same colors. Species having at least

two genes with a role unique to THI-

PP biosynthesis are predicted to

possess the functional pathway. The

column 'STRING score' shows the

most significant interaction for each

gene, predicted using the STRING

server. Predicted interaction partners

are listed in the column 'Interact. with'.

COG id: „id in groups of orthologous

proteins server“

(a) Essential THI-PP biosynthesis

enzymes, which are unique to the

pathway.

(b) Essential THI-PP biosynthesis

enzymes, which have been implicated

in more than one biological process.

The thiO gene, suggested to play a

role in the pathway, was also added to

that list.

(c) Proteins predicted in silico to be

involved in the pathway.


4 analogies detected:thiE can be replaced by MTH861thiL by THI80thiG by THI4thiC by tenA



227

Interpretation

Proteins that functionally substitute eachother

have anti-correlated distribution pattern across organisms.

allows discovery of non-obvious components of pathways

and function prediction of uncharacterized proteins

and prediction of novel interactions.




228

Bereich 3: V10 - Integrative Biologie

1 Protein-Netzwerke: topologische Graphen-Netzwerke

2 Analyse von Stoffwechselwegen (metabolic pathways):

Konzentration auf Metabolite, enzym. Reaktionen

3 Zell-Simulationen: dynamische Simulation auf

Sekunden-Zeitskala, t = 0.01 s (V10 und V11)

Systems Biology: Integration von genomischen und

proteomischen Analysen (V12)

www.systemsbiology.org

Kom

plex

ität,

Lev

el a

n V

erst

ändn

is



229

Analyse von Stoffwechselwegen: Beispiel E. coli

verwende Daten aus Datenbank EcoCyc

(siehe auch MetaCyc: Stoffwechsel von > 150 Organismen)

EcoCyc enthält 905 Reaktionen für E.coli

davon gehören 161 nicht zum Stoffwechsel kleiner Moleküle, z.B. DNA Replikation,

von den verbleibenden 744 wurden 569 mindestens einem Pfad zugeordnet

Dagegen gibt es 607 Enzyme.

Es gibt also keine 1:1 Zuordnung zwischen Enzymen und Reaktionen, denn

(1) Manche Enzyme katalyiseren mehrere Reaktionen,

und manche Reaktionen werden von mehreren Enzymen katalysiert

(2) nicht zu allen Reaktionen sind die Enzyme bekannt, die sie katalysieren.

Ouzonis, Karp, Genome Research 10, 568 (2000)



230

Beispiel: Stoffwechsel von E. coli

Die 744 Reaktionen enthalten

791 verschiedene Substrate.


Im Mittel enthält jede Reaktion

4 Substrate.



231

Beispiel: Stoffwechsel von E. coli

EcoCyc enthält 131 Stoffwechsel-

Pfade.

Die Länge der Pfade variiert von

1 bis 16. Im Mittel 5.4.

Von den 607 Enzymen sind

100 multifunktional.

Purin-Nukleosid-Phosphorylase

und Nukleosid-Diphosphatkinase

katalysieren 7 bzw. 9 Reaktionen.

483 Reaktionen gehören zu einem

Pfad, 99 Reaktionen gehören zu

mehreren Pfaden.




232

Fazit

Stoffwechsel-Netzwerke von einfachen Organismen sind mittlerweile

fast vollständig bekannt.

Ist die Beschreibung mit einzelnen Stoffwechsel-Wegen adäquat?

- Reaktionen, Enzyme und Substrate gehören oft zu mehreren Pfaden.

- Die Einteilung in einzelne Stoffwechsel-Pfade ist nicht immer eindeutig.



233

Metabolische Pfade in der post-genomischen Ära

(a) klassische Biochemie

bestimmt Stöchiometrien

einzelner Reaktionen

(b) Katalogisierung vieler

Reaktionen, Gruppierung nach

gemeinsamen Metaboliten führt

zu traditionellen Pfaden wie

Glykolyse, Pentose-Phosphat-

Pfad

(c) Durch komplette Information

können nun die kompletten

metabolischen Pfade zugeordnet

werden.



234

Metabolische Pfade in der post-genomischen Ära

Traditionelle metabolische Pfade dienen als konzeptioneller Rahmen

für Forschung und Lehre.

Man kann dadurch Metabolismen verschiedener Organismen vergleichen.

Jedoch sind sie nicht für quantitative, systemische Bewertungen biologischer

Reaktionsnetzwerke geeignet, da sie nur Teile der Netzwerke darstellen.

Sie wurden oft in Zelltypen entdeckt, in denen sie wichtige metabolische

Funktionen übernehmen (z.G. Glykolyse in Hefe).

Man kann diese Pfade jedoch nicht einfach auf andere Zelltypen mit anderen

Enzymleveln und metabolischen Profilen übertragen.



235

3 Vorgehensweisen

1 konstruiere alle Transformationswege, die von einem gegebenen

Substrat zu einem gegebenen Produkt führen

2 verwende Satz von linear (systemisch) unabhängigen Basisvektoren

im Raum der Reaktionsflüsse, durch Linearkombination sollen sich

alle möglichen Flußverteilungen darstellen lassen.

Allerdings ist die Wahl dieser Basisvektoren nicht eindeutig.

3 Konzept der elementaren (Fluss-) Moden

Eine Elementarmode ist ein minimaler Satz von Enzymen, die im

Gleichgewicht operieren können. Minimal heisst: falls nur die

Enzyme dieser Mode operieren, führt Inhibition jedes einzelnen seiner

Enzyms zum Stop aller Gleichgewichtsflüsse im System



236

Beschreibung vernetzter metabolischer Pfade

(a) aus genomischen, biochemischen, physiologischen Daten wird ein

Reaktionsnetzwerk aufgestellt. Es gibt interne Flüsse innerhalb der

Systemgrenzen und externe Flüsse mit der Umgebung.

(b) Dieses Netzwerk wird durch eine stöchiometrische Matrix dargestellt,

in der Metaboliten durch Reaktionen miteinander verbunden werden.

(c) Mögliche Zustände der Zelle aufgrund dieser Matrix werden mit

Techniken wie „elementary modes“ oder „extreme pathways“ identifiziert.

Die möglichen Zustände liegen innerhalb eines Konus im durch die

verschiedenen Flüsse aufgespannten Koordinatensystem.

Papin et al. TIBS 28, 250 (2003)



237

Analyse der stöchiometrischen Matrix

Analyse der Matrix S Pathway-Darstellung P.Deren Zeilen enthalten den Reaktionen entsprechende Flüsseund die Spalten die sichergebenden Pfade.

Darstellung des Reaktions-netzwerks mit stöchiometrischerMatrix S.

Metabolite

stöchiometrischeKoeffizienten der einzelnenReaktionen.

Darstellung derPfade ist möglichfür einfache Netzwerke.




238

Netzwerk-Analyse

(a) welche Substrate (A-E) sind zur

Produktion der Biomasse erforderlich

(B,E), welche nicht?

(b) Aufspüren von nicht genutzten

Reaktionen (F E), Refinement

der Annotation von Genomen.

(c) quantitative Beschreibung von

Pathway-Redundanz bzw. Robustheit

des Netzwerks: P1 und P2 führen beide

von A nach D.

(d) Reaktionen RA, RB und RC werden

stets gemeinsam benutzt. Ihre Gene

werden daher vermutlich koordiniert

reguliert.




239

E-cell: Software Umgebung zur Simulation ganzer Zellen

Institute for Advanced Biosciences der Keio University (existiert seit 1996)

Dr. Masaru Tomita, Team enthält > 50 Mitglieder!

weitere Programme für integrative Zellsimulationen:

GEPASI (1993, 1997) – Simulation von Stoffwechselpfaden

KINSIM (1983, 1997)

METAMODEL (1991)

SCAMP (1993)

DBSolve (1997)

V-Cell (1999)

es gibt auch separate Programme, mit denen man Genregulation und –expression,

sowie Signaltransduktion und Zellteilung untersuchen kann.

Das allgemeine Problem sind fehlende experimentelle Daten.



240

Implementation des E-cell Systems

E-CELL wurde in C++ geschrieben, existiert nun in der Version 3.

Das Modell besteht aus 3 Listen, die bei Programmstart geladen werden:

substance list definiert alle Objekte, die die Zelle und das Kulturmedium enthalten

rule list definiert alle Reaktionen, die in der Zelle stattfinden

system list definiert die räumliche und/oder funktionelle Struktur der Zelle und

ihrer Umgebung

Der Zustand der Zelle zu jedem Zeitpunkt wird als Liste von Konzentrationen und

globalen Parametern wie Zellvolumen, pH und Temperatur angegeben.

Das Programm (simulation engine) erzeugt neue Zustände der Zelle nach

Iterationsschritten von jeweils z.B. t = 1 ms.



241

Erstes Modellsystem: Mycoplasma genitalium

1996 Veröffentlichung des Genoms von Mycoplasma genitalium

Dies ist eines der kleinsten bisher bekannten Genome (580 kb).

Es enthält die kleinste bisher bekannte Anzahl von Genen (ca. 480) von allen

bisher bekannten lebenden Organismen.

Genom ist 10 kleiner als E.coli

ca. 80% der Gene sind homolog zu Proteinen mit bekannter Funktion.

Intensive Gene-Knockout Untersuchungen zeigten, dass viele der 480 Gene für

das Überleben von M. genitalium nicht notwendig sind.

Es wurde ein minimaler Satz von 127 Genen als notwendig und hinreichend für das

Überleben und einen stabilen Zustand der Zelle ausgewählt.



242

Large-scale Organisation von metabolischen Netzwerken

Modell einer Zelle, die aus eigener Kraft lebt. Diese minimale Zelle besitzt 127

Gene, gerade ausreichend um Proteingehalt und Membranstruktur aufrecht zu

erhalten.

Glukose wird aus der Umgebung als Energiequelle aufgenommen; ATP wird durch

den Glykolyse-Pfad produziert und wird hauptsächlich zur Proteinsynthese

verbraucht.

Proteine und Phospholipide werden mit der Zeit spontan abgebaut.



243

Ausblick

Zusätzlich zu der „virtuellen, überlebensfähigen Zelle“ und zum Modell des

menschlichen Erythrozyten werden in Keio andere Modelle konstruiert:

- ein Modell eines Mitochondriums

- ein Signaltransduktionsmodell für Chemotaxis in E.coli

Ein allgemeines Problem von umfangreichen Zellmodellen ist derzeit der

Mangel an quantitativen experimentellen Daten:

- Konzentrationen von Metaboliten und Enzymen

- Flussraten

- kinetische Parameter und Dissoziationskonstanten

Das Institute of Advanced Biosciences in Keio besteht aus 3 Zentren:

Metabolom-Forschung, Bioinformatik, Genom-Engineering.

Ziel: Entwicklung von custom-made Bakterien.



244

V11 Zellsimulationen

Nerven-Verbindung (synaptischer Spalt).

Nach seiner Auschüttung bindet der

Neurotransmitter Acetylcholin (hellblaue

Kugeln) an die Acetylcholinrezeptoren

(tassenförmige Objekte) und an

Acetylcholinesterase. Doppelt besetzte

Rezeptoren (gelb) leiten Strom, der eine

Kaskade von Vorgängen einleitet, die zur

Kontraktion des Muskelstrangs führen.

Diese und nächste Stunde werden 3 Simulationspakete behandelt, E-cell, Virtual

Cell, Mcell, die 3 verschiedene Paradigmen für Zellsimulationen verkörpern

- ODE = gewöhnliche Differentialgleichungen, enthalten ∂/∂t

grösseres - PDE = partielle Differentialgleichungen, enthalten ∂/∂t und ∂/∂r

Detail - explizite Simulation der Brownschen Bewegungen einzelner

Moleküle

- Projekte unserer Arbeitsgruppe



245

Virtual Cell: Software-Umgebung für computerunterstützte Zellbiologie

Prof. Leslie Loew, University of Conneticut Health Center

National Resource for Cell Analysis and Modeling

Virtual Cell

- wurde für die Zellbiologie-Community entwickelt

- ermöglicht die Konstruktion räumlicher Modelle

- Verbindung zur quantiativen Lichtmikroskopie an lebenden Zellen

- Kann man auf der Basis des komplexen räumlichen und zeitlichen Zusammen-

spiels der Zellkomponenten ein quantitatives Verständnis des gesamten zellulären

Verhaltens entwickeln?

- Sind die identifizierten Komponenten notwendig und hinreichend?

- Wie sensitiv reagiert der Gesamtprozess auf Veränderungen einer Komponente?

(Zellen sind „robust“).

- Die Simulationen werden über das Internet auf einem 16-Prozessor cluster mit

Alpha-Prozessoren durchgeführt.



246

Design einer Virtuellen Zelle

Die `Physiologie' beinhaltet die

topologische Anordnung von

Kompartments und Membranen, die mit

ihnen assoziierten Moleküle, und die

Reaktionen zwischen den Molekülen.

Die getrennt definierte `Geometrie‘ ist

eine räumliche Beschreibung der

Kompartments in 0-3 Dimensionen.

Sie kann aus analytischen Ausdrücken

bestehen oder aus einem

experimentellen Bild abgeleitet werden,

das z.B. von einem Mikroskop stammt.

Das eigentliche Modell besteht aus

der Verbindung der Topologie der

physiologischen Beschreibung mit

einer geeigneten räumlichen

Geometrie.



247

Virtual cell: graphische Benutzerschnittstelle (GUI)

Das GUI von Virtual Cell ist als JAVA

applet innerhalb eines Webbrowsers

entwickelt.

Hier sieht man, wie eine Zelltopologie

einer bestimmten experimentellen

Geometrie zugeordnet wird.



248

Einzelschritte bei Erstellung von BioModellen

Structure Mapping – definiert die Beziehung zwischen der Physiologie (zelluläre

Strukturen) und der Geometrie des Modells. Bestimme das Verhältnis von

Oberfläche zu Volumen für die Modelle der Kompartments oder für nicht

aufgelöste räumliche Strukturen. Bilde die zellulären Strukturen auf geometrische

Objekte ab.

Wähle zwischen unterschiedlichen Randbedingungen (Wert bzw. Ableitung am

Rand = Dirichlet bzw. Neumann) für die Strukturen.

Anfangsbedingungen – Konzentrationen und Diffusionsraten können räumlich

variable definiert werden. Wähle Anfangsbedingungen für Diffusion ≠ 0.

Reaction Mapping – erlaube oder verbiete Reaktionen bzw. Flüsse.

Math Viewer – prüfe die mathematische Beschreibung, die vom Programm

automatisch für die Abbildung des physiologischen Modells auf ein

Kompartment-Modell oder auf ein räumliches Modell erstellt wird.



249

Virtual cell: Ausblick

aktuelle Version:

- ermöglicht Simulation von Reaktions-Diffusionsprozessen in beliebigen

Geometrien. Anpassung notwendig für Probleme, die Änderungen der Geometrie

erfordern (Zellwanderung, Zellteilung).

-behandelt nur bestimmte Sorten von stochastischen Prozessen:

Brownsche Bewegung, gerichtete Teilchenbewegung entlang von Mikrotubuli,

Reaktion einzelner Teilchen mit kontinuierlich verteilten Molekülen.

- wenn die Anzahl an wechselwirkenden Molekülen zu klein wird, braucht man

statt der stochastischen Beschreibung Reaktionen zwischen diskreten Molekülen.

- Behandlung diskreter Zustände ist auch erforderlich zur Modellierung der Ströme

von einzelnen Ionenkanälen und deren räumlicher Verteilung.



250

M-cell: Allgemeine Monte–Carlo Simulation vonzellulären Mikrophysiologien

Thomas M. Bartol Jr. Joel R. Stiles

Computational Neurobiology Laboratory Biomedical Applications

(T. Sejnowski), Salk Institute, San Diego Pittsburgh Supercomputing Center

Ziel: quantitatives, molekulares Verständnis der Nervenfortleitung,

Funktion von Nervengasen, Modulatoren, oder Autoimmunerkrankungen.



251

MCell: Idee + Motivation

MCell ermöglicht 3-D Monte–Carlo Simulationen für Ligandendiffusion und

chemische Signalprozesse.

Biologische Strukturen wie Neuronen zeigen auf der subzellulären Ebene eine

enorme Komplexität und Diversität. Die inter- und intrazelluläre Kommunikation

geschieht mittels verschiedener chemischer Signalpfade.

Am Prozess der synaptischen Transmission sind z.B. Neurotransmitter und

Neuromodulatoren beteiligt. Ebenfalls beteiligt sind Proteine, die die Auffüllung

und Entleerung der synaptischen Vesikel mit Neurotransmitter-Molekülen

beeinflussen, Rezeptorproteine, Transportproteine, sowie oxidierende und

hydrolytische Enzyme.

Mit Mcell kann man alle diese Parameter in beliebig komplexen räumlichen

Darstellungen der beteiligten zellulären Strukturen darstellen und variieren.

Anfangsbedingung: Eine Monte–Carlo Simulation beginnt damit, dass die

Zellumgebung mit einzelnen Liganden und Liganden-bindenden Molekülen

angefüllt wird.



252

Warum soll man Monte Carlo Algorithmen benutzen? 1. löse PDEs zwischen Voxels

Die Diffusion von Ligandenmolekülen in Lösung basiert auf Brownscher

Bewegung.

Der mittlere Netto-Fluss aus einer Region des Raums in eine andere hängt von

der Mobilität der Moleküle und dem räumlichen Konzentrationsunterschied der

beiden Regionen ab.

Eine Methode, den räumlichen Gradienten zu berechnen, ist, den Raum in kleine,

üblicherweise kubische Volumenelemente (Voxels) aufzuteilen, innerhalb derer

man gute Mischung annimmt, und dann mittels eindimensionaler partieller

Differentialgleichungen den mittleren Fluss durch die Verbindungsfläche zwischen

angrenzenden Voxeln zu berechnen.

Sofern die Granularität der räumlichen und zeitlichen Unterteilung fein genug ist,

wird eine numerische Simulation das korrekte mittlere Verhalten des Systems

erzeugen.



253

löse PDEs innerhalb von Voxels

Man kann weitere PDEs hinzufügen um die mittlere Raten chemischer Raten

Reaktionen innerhalb jedes Voxels zu beschreiben. Man erhält damit eine

Simulation des räumlichen und zeitlichen Diffusionsverhaltens und der

chemischen Reaktionen.

Für einfache räumliche Anordnungen kann diese Methode sehr effizient sein.

Für komplexe (d.h. realistische) Structuren werden die räumlichen Unterteilungen

immer komplexer und eine grosse Anzahl an Voxeln ist erforderlich.

Auf jeden Fall liefert die Simulation keine direkten Informationen über die

stochastischen Schwankungen, die auf der endlichen Anzahl an beteiligten

Molekülen beruhen. Diese sind in biologischen Systemen jedoch oft von grossem

Interesse.



254

2. völlig andere Methode: Random walk

Direkte Beschreibung der Brownschen Bewegung der einzelnen

Ligandenmoleküle. Durch Verwendung von Zufallszahlen werden bei jedem

Zeitschritt beliebige erlaubte Richtungen und Verschiebungen ausgewählt. Indem

die Zeitschritte und Verschiebungen deutlich kleiner als die Teilchengröße gehalten

werden, erreicht man eine hohe numerische Genauigkeit.

Kollisionen mit beliebigen Oberflächen werden entdeckt und gemäss von Regeln

behandelt (Bindung, Transport, Reflexion etc.). Voxel sind unnötig.

Gleichsam werden Kollisionen mit möglichen Bindungsstellen entdeckt und

behandelt. Für die Ausbildung von Bindungen werden Bindungswahrscheinlich-

keiten festgelegt. Die momentane Entscheidung wird durch eine Zufallszahl

bestimmt.

Alle möglichen Vorgänge werden auf einer Molekül-für-Molekül Basis betrachtet.

Dadurch enthält die Simulation realistische stochastische Schwankungen in

Abhängigkeit von der räumlichen Verteilung und der Anzahl an Molekülen.



255

Typische Vorgänge während einer MCell-Simulation

- Freisetzung von Ligandenmolekülen aus einer

Struktur (z.B. einem Vesikel)

- Erzeugung oder Vernichtung von Ligandenmolekülen

(z.B. Synthese, Hydrolyse, oder Redox-Reaktionen)

- Diffusion der Liganden innerhalb des Raums

zwischen beliebigen Oberflächen

(z.B. prä- und postsynaptische Membranen)

- chemische Reaktionen von Ligandenmolekülen

mit “Effektor”molekülen

(z.B. Rezeptoren oder Enzyme)



256

MCell: biologische Skala

Der Level an Detail von MCell Simulationen liegt

zwischen denen von atomistischen

Moleküldynamik-Simulationen und der

Simulationen gesamter Zellen (Virtual Cell, E-cell).

Die Diffusion einzelner Ligandenmoleküle wird als

Brownsche Bewegung mit einem Random–Walk–

Algorithmus simuliert.

Mittlere Ratenkonstanten werden in Monte– Carlo–

Wahrscheinlichkeiten für Reaktionen einzelner

Moleküle pro Zeitschritt umgeformt.

Damit können die Ligandenmoleküle stochastisch

reagieren sobald sie an Rezeptoren, Enzyme oder

Transporter gebunden sind.



257

ZusammenfassungZellsimulationen sind im Kommen!

Detaillierte, dreidimensionale Modelle sind notwendig,

sobald Lokalisation z.B. an Membran stattfindet, und

sobald wichtige Moleküle in kleinen Zahlen vorliegen.

Schlagwort: Systems Biology.

Messung von kinetischen Konstanten im Allgemeinen mühsam.

Daher zunächst Konzentration auf Modellsysteme.

Molekulare Simulationen können sehr aufwendig sein.Ein Volumen von 100 nm3 enthält ca. 1000 Proteine.

1 μm3 enthält dagegen bereits ca. 106 Proteine.

Bei Beschränkung auf Molekül-Konzentrationen kann

dagegen fast in real time simuliert werden.



258

V12 Bioinformatik-Tools für HT Proteinanalyse

traditionelle Ansätze: reduktionistisch; finde einzelne Gene und die kodierten

Proteinprodukte, die einen beobachteten Phänotyp definieren.

Oft werden hierdurch komplexe Systeme zu stark vereinfacht.

Hoch-Durchsatzmethoden: parallele Untersuchung vieler gleichzeitiger Vorgänge

omics-Welt: Genomics, Proteomics, Metabolomics, Transcriptomics ...



259

Wie soll man das Proteom untersuchen?

Proteomics zerfällt

derzeit in 2 Bereiche

Expression Proteomics- katalogisiere alle Proteine in

einer Probe- differentielle Expression:

Unterschied zwischen mehreren Proben

Cell-map Proteomics- Protein-Protein Wechselwirkung- Protein-Liganden Wechselwirkung- zelluläre Lokalisation



260

Expressions-Proteomik

Das zelluläre Proteom enthält 10.000ende von Proteinen,

deren Konzentrationen mehr als 106 fach verschieden sind.

Prof. Walter (UdS)



261

Technologien in Proteomics

Separation von Proteinen- 2-D gel Elektrophorese- Flüssig-Chromatographie- Affinitäts-Chromatographie

Annotation einzelner Proteine- Massenspektroskopie- kombinierte HPLC und MS- Protein-Quantifizierung mit MS

Protein-Chips



262

Analytische versus funktionelle Protein-Microarrays

(a) analytische Microarrays:

beobachte Proteinexpression und

klinische Diagnostik. Vergleiche

Proteinproben zweier biologischer

Zustände, wobei die Protein

entweder mit einem grünen oder

mit einem roten Farbstoff gelabelt

werden. Wenn eine Farbe

überwiegt, liegt das Protein

vornehmlich in dem

entsprechenden Zustand vor.

Phizicky et al. Nature 422, 208 (2003)

(b) funktionelle Microarrays: visualisieren Proteinaktivität, -bindung oder

posttranslationelle Modifikationen. Auch geeignet um Substrat- oder Inhibitor-

bindung an Enzyme zu messen und zur Konstruktion biologischer Netzwerke.



263

Phizicky et al. Nature 422, 208 (2003)

Yeast Two-Hybrid Methoden

(a) die DNA-bindende und die

Aktivierungsdomänen (Kreise)

sind an die Protein X und Y

fusioniert. Genexpression des

Reporters beginnt.

(b) Standard-2YH-Suche von X

gegen eine komplexe Bibliothek von

zufälligen, mit Y fusionierten Peptid-

Schnipseln.

(c) 2YH-Array. Screene X gegen

komplette Satz von ORFs.



264

Zweidimensionale Gelelektrophorese (2D PAGE)

2D Polyacrylamid-Gel für ein Biopsie-

Probe mit menschlicher Leber.

In x-Richtung – nichtlinearer pH-

Gradient - geschieht eine Auftrennung

nach dem isoelektrischen Punkt

(bei welchem pH ist die Ladung des

Proteins neutral?).

In y-Richtung geschieht durch Variation

des Anteils an Polyacrylamid eine

Trennung nach der molekularen Masse.

Problem: man kann nur Proteine

visualisieren, die relativ häufig

vorkommen. Banks et al. Lancet 356, 1749 (2000)



265

Annotation von 2D-Gelen: mühsam

Banks et al. Lancet 356, 1749 (2000)



266

Fallstudie: Expressions-Proteomik

Die Balken 1-6 stammen von Kardiomyopathie-diagnostizierten Rindern, 7-12

von gesunden Rindern. 13-16 sind Rinder, die selbst klinisch normal sind, aber

von kranken Rindern abstammen (nur SPP 943 ist deutlich abgesenkt).

Banks et al. Lancet 356, 1749 (2000)

Proteine des

Rinderherzen:

welche Proteine sind

im Herzen von

Rindern mit einer

vererbten

Kardiomyopathie

reduziert?



267

(Bio)informatische Aufgaben bei Analyse von 2D-Gelen

Zwei Gele stimmen oft in Grösse,

Kontrast, Auftrennung in x- und

y-Richtung nicht überein.

Darüberhinaus treten Unterschied

als Folge der experimentellen

Bedingungen auf.

Der Vergleich zweier Gele erfordert

daher oft Methoden der Bildbearbeitung,

z.B. mit dem Programm Flicker

http://www-lecb.ncifcrf.gov/flicker/

Eine Laplace-Transformation

verbessert die Übereinstimmung

zwischen dem linken und rechten

Gel erheblich in (b) gegenüber (a). Lemkin PF, Electrophoresis, 18, 461-470 (1997)



268

Fraktionierung der Probe vor 2D PAGE-Analyse

Hanash, Nature 422, 226 (2003)

Oft gibt es das Problem, dass die Proteineigen-

schaften über einen sehr grossen Bereich

variieren.

Lösung: konzentriere auf Teil der Proteine.

z.B. (a) versehe die ansonsten schwer detek-

tierbaren Proteine an der Membranoberfläche

mit einem Biotin ‚Anker‘ (tag).

Auftrennung in 2D-Gel. Erkenne die markierten

Proteine mit Avidin. Identifikation mit MS.

(b) Getrennte Visualisierung der markierten

Proteine (oben) gegenüber der Darstellung

des gesamten Zell-Lysats (unten).

Dies erlaubte die Identifikation neuer Proteine

auf der Oberfläche von Krebszellen.



269

Direkte Visualisierung der Protein-Verteilung mit MS

Ein gefrorener Schnitt durch

ein Rattengehirn wird mit

einem MALDI MS-Gerät

abgetastet.

Hier: je 15 Spektren für 74

75 Punkte, gleichzeitige

Aufnahme aller Massen.

Visualisiere den Schnitt

getrennt für verschiedene

Verhältnisse von Masse und

Ladung (jeweils oben rechts

gezeigt).

z.B. ist die Proteindichte für

m/z=6844 recht gering.

Hanash, Nature 422, 226 (2003)

Ziel: vergleiche gesundes und krankes Gewebe.

Aufgabe: Bildverarbeitung



270

Proteomics mit Massenspektroskopie (MS)

(1) Aufreinigung (SDS-PAGE).

Banden ausschneiden.

(2) Problem: Gesamtmasse eines

Proteins ist nicht aussagekräftig.

Daher Trypsin (Protease)-Verdau

Peptidschnipsel unterschiedlicher Länge,

diese sind charakteristisch für Protein.

(3) MS-Analyse in Vakuum

(4) Detektion der Massenintensität bei

vorgegebenem Verhältnis von Masse m

und Ladung z.

(5) Weitere Auftrennung der einzelnen

Peptidschnipsel in zweitem MS-Schritt.

Teilweise Sequenzierung möglich.

Aufgabe: Annotation des Proteins aus

Sequenz-Datenbank. Tyers, Mann, Nature 422, 193 (2003)



271

Sequenzdiversität in der Zelle: Analyse mit MS

Organismus kodiert über das

Genom viele Isoformen.

Identifikation der Proteine durch

Datenbanksuche um die Lücken

der exp. Daten zu füllen.

Sequenz-Datenbanken enthalten

jedoch keine komplette

Information über die natürlich

auftretende Sequenzdiversität.

Rappsilber, Mann, TIBS, 27, 74 (2002)

13. vorlesung ws 2005/06 software-werkzeuge der bioinformatik1 v13 zusammenfassung (v1 – v12)...

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