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Republica Ereden,diva d BCOSB+54: trdtdouidd eadidt•i0
Inetddità NaddNa: P5dpriadede 31.1:12J2:41.
(21) P10710210-0 A2
(22) Data de Depósito: 29/03/2007(43) Data da Publicação: 24/05/2011(RPI 2107)
*11.11 pl .1 II 11111 1111 ADI(51) !M.a.:A61K 39/085 2006.01
A61 K 31/70 2006.01
A61 P 31/04 2006.01
(54) Título: COMPOSIÇÃO IMUNOGÊNICA, VACINA,MÉTODOS PARA PREPARAR A VACINA, E PARAPREVENIR OU TRATAR INFECÇÃOESTAFILOCÓCICA, USO DA COMPOSIÇÃOIMUNOGÊNICA, E, PROCESSO PARA CONJUGAROLIGASSACARÍDEO OU POLISSACARÍDEOCAPSULAR
(30) Prioridade Unionista: 30/03/2006 GB 0606416.6,30/03/2006 US 60/787249, 30/03/2006 US 60/787587
(73) Titular(es): Glaxomithkline Biologicals S.A.
(72) Inventor(es): Jan Poolman, Philippe Denoel
(74) Procurador(es): Momsen, Leonardos & CIA.
(86) Pedido Internacional: PCT EP2007053057 de 29/03/2007
(87) Publicação Internacional: wo W02007/113222de1 1/10/2007
(57) Resumo: COMPOSIÇÃO IMUNOGÊNICA, VACINA,METODOS PARA PREPARAR A VACINA, E PARA PREVENIR OUTRATAR INYECÇAO ESTAFILOCÓCICA, USO DA COMPOSIÇÃOIMUNOGÊNICA, E, PROCESSO PARA CONJUGAROLIGOSSACARIDEO OU POLISSACARIDEO CAPSULAR A presenteinvenção refere-se às composições imunogênicas compreendendooligossacarídeo ou polissacarídeo capsular de Tipos 5 e/ou 8 de S.aureus possuindo entre 30 e 100% de 0-acetilação. Vacinas, métodosde tratamento usando [sie] e processos para preparar umacomposição imunogênica compreendendo polissacarídeos capsularesde Tipos 5 e/ou 8 com 30-100% de 0-acetilação também são descritos.
1
"COMPOSIÇÃO IMUNOGÊNICA, VACINA, MÉTODOS PARA
PREPARAR A VACINA, E PARA PREVENIR OU TRATAR INFECÇÃO
ESTAFILOCÓCICA, USO DA COMPOSIÇÃO IMUNOGÊNICA, E,
PROCESSO PARA CONJUGAR OLIGOSSACARÍDEO OU
5 POLISSACARÍDEO CAPSULAR"
Campo técnico
A presente invenção refere-se ao campo das vacinas e
composições imunogênicas, à sua manufatura e ao uso de tais composições
em medicina. Mais particularmente, refere-se às composições de vacina
10 compreendendo polissacarídeos de tipos 5 e/ou 8 de S. aureus nos quais o
grau de 0-acetilação está entre 30 e100%. Também são proporcionados
métodos para o tratamento ou a prevenção de infecções estafilocócicas usando
tais vacinas.
Fundamentos
15 O número de infecções tanto adquiridas em comunidade
quanto adquiridas em hospitais tem aumentado no decorrer dos anos recentes
com o uso aumentado de dispositivos intravasculares. Infecções adquiridas
em hospitais (nosocomiais) são uma causa maior de morbidez e de
mortalidade, mais particularmente nos E.U.A., onde elas afetam mais do que
20 2 milhões de pacientes anualmente. Após vários estudos, cerca de 6 por cento
dos pacientes dos E.U.A. adquirirão uma infecção durante sua estadia em
hospital. O encargo econômico nos E.U.A. foi estimado em mais de 4,5
bilhões de dólares americanos em 1992 (Emori e Gaynes, 1993, Clin.
Microbiol. Rev. 6; 428). As infecções mais freqüentes são infecções do trato
25 urinário (UTI-33% das infecções), seguidas por pneumonia (15,5%),
infecções de sítio cirúrgico (14,8%) e infecções de corrente sanguínea
primária (13%) Emori e Gaynes, 1993, Clin. Microbiol. Rev. 6; 428).
Staphylococcus aureus, estafilococos negativos para coagulase
(em sua maior parte Staphylococcus epidermidis), enterococcus spp,
2
Esherichia coli e Pseudomonas aeruginosa são os patógenos nosocomiais
maiores. Embora aqueles patógenos causem quase o mesmo número de
infecções, a severidade dos distúrbios que podem produzir combinada com a
freqüência de isolados resistentes a antibióticos balança esta classificação na
5 direção de S. aureus e S. epidermidis como sendo os patógenos nosocomiais
mais significativos.
Staphylococcus aureus é a causa mais comum de infecções
nosocomiais com uma morbidez e uma mortalidade significativas (Romero-
Vivas et al. 1995, Infect. Dis. 21; 1417). É a causa de alguns casos de
10 osteomielite, endocardite, artrite séptica, pneumonia, abscessos e síndrome de
choque tóxico.
S. epidermidis é o comensal de pele normal que também é um
patógeno oportunista importante responsável por infecções de dispositivos
médicos implantados e infecções em sítios de cirurgia. Dispositivos médicos
15 infectados por S. epidermidis incluem marca-passos cardíacos, derivações de
fluido cerebroespinal, cateteres de diálise peritoneal ambulatorial contínua,
dispositivos ortopédicos e válvulas cardíacas prostéticas.
Infecções de S. aureus e S. epidermidis são tratadas com
antibióticos, com penicilina sendo a droga de escolha enquanto que
20 vancomicina é usada para isolados resistentes à meticilina. A percentagem de
cepas estafilocócicas exibindo resistência de amplo espectro aos antibióticos
tem se tornado crescentemente prevalente desde os anos 1980's (Panlilo et al.
1992, Infect.Control. Hosp. Epidemiol. 13; 582), colocando sob ameaça a
terapia antimicrobiana efetiva. Em adição, a emergência recente de cepa de S.
25 aureus resistente à vancomicina tem causado medo de que cepas de S. aureus
resistentes à meticilina emergirão e se disseminarão para as quais não está
disponível terapia efetiva.
Uma abordagem alternativa de uso de anticorpos contra
antígenos estafilocócicos em imunoterapia passiva tem sido investigada.
3
Terapia envolvendo a administração de anti-soros policlonais está sob
desenvolvimento (WO 00/15238, WO 00/12132) bem como o tratamento com
um anticorpo monoclonal contra ácido lipoteicóico (WO 98/57994).
Uma abordagem alternativa seria o uso de vacinação ativa para
5 gerar uma resposta imune contra estafilococos. Vários candidatos para
inclusão como componentes de vacina têm sido identificados. Estes incluem
proteína ligante de Fibronectina (US5840846), análogo de MHC II
(US5648240), proteína ligante de fibrinogênio (US6008341), GehD (US
2002/0169288), proteína ligante de colágeno (US6288214), SdrF, SdrG e
10 SdrH (WO 00/12689), exotoxinas SEA e SEB mutantes (WO 00/02523) e
proteína ligante de vitronectina de 52 kDa (WO 01/60852).
O genoma de S. aureus tem sido seqüenciado e muitas das
seqüências codificadoras têm sido identificadas (EP786519, W002/094868).
O mesmo é verdade para S. epidermidis (WO 01/34809). Como um
15 refinamento desta abordagem, outros têm identificado proteínas que são
reconhecidas por soros hiper-imunes de pacientes que têm sofrido de infecção
estafilocócica (W001/98499, WO 02/059148).
A primeira geração de vacinas contra S. aureus ou contra as
exoproteínas que ela produz têm alcançado sucesso limitado (Lee 1996
20 Trends Microbiol. 4; 162). Ainda permanece uma necessidade para o
desenvolvimento de vacinas efetivas contra infecções estafilocócicas.
Descrição das figuras
Figura 1 - Seqüências de polipeptídeo de proteínas para
inclusão em uma composição imunogênica. Tabela 1 proporciona informação
25 sobre qual proteína é representada por cada SEQ ID.
Figura 2 - Seqüências de nucleotídeos codificadoras de
proteínas para inclusão em uma composição imunogênica. Tabela 1
proporciona informação sobre qual proteína é representada por cada SEQ ID.
Figura 3 - Purificação de alfa-toxina sob condições nativas.
4
Painel A mostra uma SDS-PAGE corada com coommassie de amostras
preparadas durante a purificação de alfa-toxina. Pista 1 - marcadores de peso
molecular, pista 2 - fração solúvel contendo alfa-toxila sobre-expressada,
pista 3 - fluxo através da coluna de Ni-NTA, pista 4 - frações eluídas com
5 tampão B 10%, pista 5 - frações eluídas com tampão B 20%, pista 6 - frações
eluídas com tampão B 30%, pista 7 - frações eluídas com tampão B 50%,
pista 8 - frações eluídas com tampão B 75%, pista 9 e 10 frações eluídas com
tampão B 100%, pista 11 bactérias em T=0 antes da indução, pista 12 -
bactérias em T=4 horas após a indução, pista 13 - lisado de célula, pista 14 -
10 fração solúvel, pista 15 - fração insolúvel. Painel B mostra uma SDS-PAGE
corada com coommassie de 10, 5, 2 e 1µL da alfa-toxina purificada.
Figura 4 - Purificação de SdrC sob condições desnaturantes.
Painel A mostra uma SDS-PAGE corada com coommassie de amostras
preparadas durante a purificação de alfa-toxina. Pista M - marcadores de peso
15 molecular, pista Início - sobrenadante formado da fração insolúvel contendo
SdrC sobre-expressado, pista FT1 - fluxo através da coluna de Ni-NTA, pista
C - frações eluídas com tampão de lavagem C, pista D - frações eluídas com
tampão D, pista E - frações eluídas com tampão E. Painel B mostra uma SDS-
PAGE corada com coommassie de 1, 2, 5 e 10 !..iL de SdrC purificado.
20 Figura 5 - Resultados de ELISA para anti-soros contra
proteínas estafilocócicas em placas revestidas com proteínas purificadas.
Resultado de combinação camundongos pré - usando soros combinados
extraídos de camundongos pré-inoculação. Resultado de combinação
camundongos pós III - usando soros de camundongo combinados extraídos
25 pós-imunização. Resultado de combinação coelho pré - usando soros
combinados extraídos de coelhos pré-inoculação. Resultado de combinação
coelho pós III usando soros de coelho combinados extraídos pós-imunização.
Figura 6 - Resultados de ELISA para anti-soros de
camundongo produzidos contra proteínas estafilocócicas em placas revestidas
5
com estafilococos mortos.
Painel A usa placas revestidas com células inteiras mortas de
sorotipo 5 de S. aureus. Painel B usa placas revestidas com células inteiras
mortas de sorotipo 8 de S. aureus. Painel C usa placas revestidas com células
5 inteiras mortas de S. epidermidis.
A linha marcada com sinais quadrados mostra o resultado de
ELISA usando anti-soros de camundongos imunizados três vezes com a
proteína estafilocócica indicada. A linha marcada com sinais de diamante
mostra o resultado de ELISA para soros de camundongo pré-imunes.
10 Figura 7 - Resultados de ELISA para anti-soros de coelho
produzidos contra proteínas estafilocócicas em placas revestidas com
estafilococos mortos.
Painel A usa placas revestidas com células inteiras mortas de
sorotipo 5 de S. aureus. Painel B usa placas revestidas com células inteiras
15 mortas de sorotipo 8 de S. aureus. Painel C usa placas revestidas com células
inteiras mortas de S. epidermidis.
A linha marcada com sinais quadrados mostra o resultado de
ELISA usando anti-soros de coelhos imunizados três vezes com a proteína
estafilocócica indicada (exceto para HarA onde apenas uma imunização foi
20 dada). A linha marcada com sinais de diamante mostra o resultado de ELISA
para soros de coelho pré-imunes.
Descrição detalhada
A presente invenção descreve composições imunogênicas que
compreendem Polissacarídeos de S. aureus de Tipos 5 e/ou 8 nos quais o
25 oligossacarídeo ou polissacarídeo capsular de Tipo 5 e/ou de Tipo 8 está entre
30% e 100% 0-acetilado. Em modalidades particulares, a composição
imunogênica da invenção adicionalmente compreende proteína(s)
estafilocócica(s) ou PNAG. PNAG está elevadamente conservada dentre
bactérias Gram-positivas e proporciona proteção contra uma ampla variedade
6
de bactérias enquanto que polissacarídeos de Tipos 5 e 8 são imunógenos
potentes que geram uma resposta imune contra a maioria das cepas de S.
aureus que é a causa mais comum de infecção nosocomial.
Polissacarídeos
5 As composições imunogênicas da invenção compreendem
polissacarídeos dos tipos 5 e 8 e PNAG de S. aureus qualquer um dos quais
ou ambos os quais estão entre 30% e 100% 0-acetilados.
Poli-glicosamina N-acetilada (PNAG)
PNAG é uma adesina intercelular de polissacarídeo e é
10 composta de um polímero de glicosamina r3-(1—>6)-ligada, opcionalmente
substituída com constituintes N-acetila e/ou 0-succinila. Este polissacarídeo
está presente em ambas S. aureus e S. epidermidis e pode ser isolado de
qualquer fonte (Joyce et al. 2003, Carbohydrate Research 338; 903; Maira
Litran et al. 2002, Infect. Imun. 70; 4433). Por exemplo, PNAG pode ser
15 isolada de cepa MN8m de S. aureus (WO 04/43407). A preparação de
dPNAG é descrita em WO 04/43405.
Foi recentemente mostrado que o polissacarídeo previamente
conhecido como poli-N-succini1-13-(1-6)-glicosamina (PNSG) não possui a
estrutura esperada porque a identificação da N-succinilação foi incorreta
20 (Maira-Litran et al. 2002, Infect. Imun. 70; 4433). Portanto o polissacarídeo
formalmente conhecido como PNSG e agora verificado em ser PNAG
também é incluído pelo termo PNAG.
PNAG pode ser de tamanhos diferentes variando de mais de
400kDa a entre 75 e 400kDa a entre 10 e 75kDa para oligossacarídeos
25 compostos de até 30 unidades repetidas (de glicosamina (3-(1—>6)-ligada,
opcionalmente substituída com constituintes N-acetila e 0-succinila).
Qualquer tamanho de oligossacarídeo ou polissacarídeo de PNAG pode ser
usado em uma composição imunogênica da invenção, por exemplo um
tamanho de acima de 40kDa pode ser usado. O ajuste do tamanho pode ser
7
realizado por qualquer método conhecido na arte, por exemplo por
microfluidização, irradiação ultra-sônica ou por clivagem química (WO
03/53462, EP497524, EP497525).
Faixas de tamanho de PNAG são por exemplo 40-400kDa, 50-
5 350kDa, 40-300kDa, 60-300kDa, 50-250kDa e 60-200kDa.
PNAG pode possuir grau de acetilação diferente devido à
substituição nos grupos amino por acetato. PNAG produzida in vitro está
quase totalmente substituída nos grupos amino (95-100%).
Alternativamente, pode ser usada uma PNAG acetilada
10 possuindo menos do que 50%, 40%, 30%, 20%, 10% ou 5% de N-acetilação.
Uso de uma PNAG acetilada permite morte opsônica de bactérias Gram-
positivas, opcionalmente S. aureus e/ou S. epidermidis (WO 04/43405). Em
uma modalidade, a PNAG possui um tamanho entre 40kDa e 300kDa e é
desacetilada de modo que menos do que 50%, 40%, 30%, 20%, 10% ou 5%
15 dos grupos amino estejam N-acetilados.
Em uma modalidade, a PNAG não está 0-succinilada ou está
0-succinilada em menos do que 25, 20, 15, 10, 5, 2, 1 ou 0,1% de resíduos.
O termo PNAG desacetilada (dPNAG) refere-se a um
oligossacarídeo ou polissacarídeo PNAG no qual menos do que 50%, 40%,
20 30%, 20%, 10% or 5% dos grupos amino estão acetilados.
Como aqui usado, o termo PNAG inclui ambas as formas
acetiladas e desacetiladas do sacarídeo.
Em uma modalidade, PNAG é desacetilada para formar
dPNAG, por tratamento químico do polissacarídeo nativo. Por exemplo, a
25 PNAG nativa é tratada com uma solução básica de tal modo que o pH suba
para acima de 10. Por exemplo a PNAG é tratada com NaOH, KOH ou
NH4OH 0,1-5M, 0,2-4M, 0,33M, 0,5-2M, 0,75-1,5M ou 1M. Tratamento é
por pelo menos 10 ou 30 minutos, ou 1, 2, 3, 4, 5, 10, 15 ou 20 horas em uma
temperatura de 20-100, 25-80, 30-60 or 30-50 ou 35-45°C. dPNAG pode ser
8
preparada como descrito em WO 04/43405.
Em uma modalidade, o(s) polissacarídeo(s) incluído(s) na
composição imunogênica da invenção é (são) conjugado(s) em uma proteína
carreadora como descrito abaixo ou alternativamente não é (são)
5 conjugado(s).
Polissacarídeos de Tipo 5 e de Tipo 8 de S. aureus
A maioria das cepas de S. aureus que causa infecção em
homem contém polissacarídeos quer de Tipo 5 quer de Tipo 8.
Aproximadamente 60% de cepas de humano são de Tipo 8 e
10 aproximadamente 30% são de Tipo 5. As estruturas de antígenos
polissacarídeo capsular de Tipo 5 e de Tipo 8 são descritas em Moreau et al.
Carbohydrate Res. 201; 285 (1990) e Fournier et al. Infect. Immun. 45; 87
(1984). Ambas possuem FucNVAcp em sua unidade repetida bem como
ManNAcA que pode ser usado para introduzir um grupo sulfidrila.
15 Recentemente (Jones Carbohydrate Research 340, 1097-1106
(2005)) espectroscopia em NMR revisou as estruturas dos polissacarídeos
capsulares para:
Tipo 5
—>4)-p-D-ManNAcA-(1 —+4)-a-L-FucNAc(3OAc)-(1 .-->3)-0-D-FucNAc-(1 --->
Tipo 8
—>3)-p-D-ManNAcA(40Ac)-(1 —>3)-a-L-FucNAc(1 --43)-a-D-FucNAc(1 —>
20 Polissacarídeos podem ser extraídos da cepa apropriada de S.
aureus usando métodos bem conhecidos pelo homem experiente, por exemplo
como descrito em US6294177 ou Infection and Immunity (1990) 58(7); 2367.
Por exemplo, ATCC 12902 uma cepa de S. aureus de Tipo 5 e ATCC 12605 é
uma cepa de S. aureus de Tipo 8.
25 Polissacarídeos são de tamanho nativo ou alternativamente
podem ser de tamanho ajustado, por exemplo por microfluidização, irradiação
9
ultra-sônica ou por tratamento químico. A invenção também cobre os
oligossacarídeos derivados de polissacarídeos de tipos 5 e 8 de S. aureus.
Os oligossacarídeos ou polissacarídeos capsulares de tipos 5
e/ou 8 incluídos na composição imunogênica da invenção estão 0-acetilados.
5 Em uma modalidade, o grau de 0-acetilação do oligossacarídeo ou
polissacarídeo capsular de tipo 5 é 10-100%, 20-100%, 30-100%, 40-100%,
50-100%, 60-100%, 70-100%, 80-100%, 90-100%, 50-90%, 60-90%, 70-90%
ou 80-90%. Em uma modalidade, o grau de 0-acetilação do oligossacarídeo
ou polissacarídeo capsular de tipo 8 é 10-100%, 20-100%, 30-100%, 40-
10 100%, 50-100%. 60-100%, 70-100%, 80-100%, 90-100%, 50-90%, 60-90%,
70-90% ou 80-90%. Em uma modalidade, o grau de 0-acetilação dos
oligossacarídeos ou polissacarídeos capsulares de tipo 5 e de tipo 8 é 10-
100%, 20-100%, 30-100%, 40-100%, 50-100%, 60-100%, 70-100%, 80-
100%, 90-100%, 50-90%, 60-90%, 70-90% ou 80-90%.
15 O grau de 0-acetilação do oligossacarídeo ou polissacarídeo
pode ser determinado por qualquer método conhecido na arte, por exemplo,
por NMR de próton (Lemercinier e Jones 1996, Carbohydrate Resarch 296;
83-96, Jones e Lemercinier 2002, J Pharmaceutical and Biomedical Analysis
30; 1233-1247, WO 05/033148 ou WO 00/56357). Um outro método
20 comumente usado é aquele descrito por Hestrin (1949) J. Biol. Chem. 180;
249-261.
Grupos 0-acetila podem ser removidos por hidrólise, por
exemplo pelo tratamento com uma base tal como hidrazina anidra (Konadu et
al. 1994; Infect. Immun. 62; 5048-5054) ou tratamento com NaOH 0,1 N por
25 1-8 horas. Com o propósito de manter níveis altos de 0-acetilação no
oligossacarídeo ou polissacarídeo de tipos 5 e/ou 8, tratamentos que levariam
à hidrólise dos grupos 0-acetila são minimizados. Por exemplo tratamento em
extremos de pH são minimizados.
Os polissacarídeos de tipos 5 e 8 incluídos na composição
10
imunogênica da invenção estão normalmente conjugados em uma proteína
carreadora como descrito abaixo ou alternativamente estão não-conjugados.
As composições imunogênicas da invenção alternativamente
contêm polissacarídeo quer de tipo 5 quer de tipo 8.
5 Antígeno 336 de S. aureus
Em uma modalidade, a composição imunogênica da invenção
compreende o antígeno 336 de S. aureus descrito em US6294177.
O antígeno 336 compreende hexosamina (3-ligada, não contém
grupos 0-acetila e especificamente se liga em anticorpos para S. aureus Tipo
10 336 depositado sob ATCC 55804.
Em uma modalidade, o antígeno 336 é um polissacarídeo que é
de tamanho nativo ou alternativamente pode ser dimensionado, por exemplo
por microfluidização, irradiação ultra-sônica ou por tratamento químico. A
invenção também cobre oligossacarídeos derivados do antígeno 336.
15 O antígeno 336, onde incluído na composição imunogênica da
invenção opcionalmente está conjugado em uma proteína carreadora como
descrito abaixo ou alternativamente está não-conjugado.
Polissacarídeos de Tipos I, II e III de S. epidermidis
Cepas ATCC-31432, SE-360 e SE-10 de S. epidermidis são
20 características de três tipos capsulares diferentes I, II e III respectivamente
(Ichiman e Yoshida 1981, J. Appl. Bacteriol. 51; 229). Polissacarídeos
capsulares extraídos de cada sorotipo de S. epidermidis constituem os
polissacarídeos de Tipos I, II e III. Polissacarídeos podem ser extraídos por
vários métodos incluindo o método descrito em US4197290 ou como descrito
25 em Ichiman et al. 1991, J. Appl. Bacteriol. 71; 176.
Em uma modalidade da invenção, a composição imunogênica
compreende oligossacarídeos ou polissacarídeos de tipos I e/ou II e/ou III de
S. epidermidis.
Polissacarídeos são de tamanho nativo ou alternativamente
11
podem ser de tamanho ajustado, por exemplo por microfluidização, irradiação
ultra-sônica ou clivagem química. A invenção também cobre os
oligossacarídeos extraídos de cepas de S. epidermidis.
Estes polissacarídeos estão não-conjugados ou são
5 opcionalmente conjugados como descrito abaixo.
Conjugação de polissacarídeos
Dentre os problemas associados com o uso de polissacarídeos
em vacinação, está o fato de que os polissacarídeos per se são imunógenos
insatisfatórios. Estratégias, que tem sido planejadas para suplantar esta falta
10 de imunogenicidade, incluem a ligação do polissacarídeo em carreadores
protéicos grandes, que proporcionam auxílio de célula-T espectadora.
Exemplos de carreadores que podem ser usados para copulação em
imunógenos polissacarídeo ou oligossacarídeo incluem os toxóides de Difteria
e Tétano (DT, DT Crm197 e TT), Hemocianina de Lapa Buraco de Fechadura
15 (KLH), exoproteína A de Pseudomonas aeruginosa (rEPA) e o derivado de
proteína purificado de Tuberculina (PPD), proteína D de Haemophilus
influenzae, pneumolisina ou fragmentos de qualquer um dos acima.
Fragmentos adequados para uso incluem fragmentos incluindo epitopos de
célula T-auxiliadora. Em particular framento de proteína D opcionalmente
20 conterá o 1/3 N-terminal da proteína. Proteína D é uma proteína ligante de
IgD de Haemophilus influenzae (EP O 594 610 B1).
Uma proteína carreadora alternativa para uso na composição
imunogênica da invenção é uma proteína estafilocócica única ou seu
fragmento ou uma proteína de fusão compreendendo pelo menos ou
25 exatamente 1, 2, 3 ou 4 ou mais das proteínas estafilocócicas ou seus
fragmentos listados na sessão abaixo.
Uma proteína carreadora nova que seria particularmente
vantajosa para uso no contexto de uma vacina estafilocócica é o alfa-toxóide
estafilocócico. A forma nativa pode estar conjugada em um polissacarídeo
12
porque o processo de conjugação reduz a toxicidade. Opcionalmente uma
alfa-toxina geneticamente destoxificada tal como as variantes His35Leu ou
His35Arg são usadas como carreadoras porque a toxicidade residual é mais
baixa. Alternativamente a alfa-toxina é quimicamente destoxificada pelo
5 tratamento com um agente reticulante, formaldeído ou glutaraldeído. Uma
alfa-toxina geneticamente destoxificada é opcionalmente quimicamente
destoxificada, opcionalmente pelo tratamento com um agente reticulante,
formaldeído ou glutaraldeído para reduzir mais a toxicidade.
Os polissacarídeos podem ser ligados na(s) proteína(s)
10 carreadora(s) por método conhecido (por exemplo, por Likhite, Patente U.S.
4.372.945 de Armor et al., Patente U.S. 4.474.757, WO e Jennings et al.,
Patente U.S. 4.356.170). Opcionalmente, química de conjugação de CDAP é
realizada (veja W095/08348).
Em CDAP, o reagente de cianilação tetrafluoro-borato de 1-
15 ciano-dimetil-amino-piridínio (CDAP) é opcionalmente usado para a síntese
de conjugados de polissacarídeo-proteína. A reação de cianilação pode ser
conduzida sob condições relativamente brandas, que evita a hidrólise dos
polissacarídeos alcalinamente sensíveis. Esta síntese permite a copulação
direta em uma proteína carreadora.
20 O polissacarídeo pode ser solubilizado em água ou uma
solução salina. CDAP pode ser dissolvido em acetonitrila e adicionado
imediatamente na solução de polissacarídeo. O CDAP reage com os grupos
hidroxila do polissacarídeo para formar um éster de cianato. Após a etapa de
ativação, a proteína carreadora é adicionada. Grupos amino de usina reagem
25 com o polissacarídeo ativado para formar uma ligação covalente de isouréia.
Após a reação de copulação, um excesso grande de glicina é então adicionado
para extinguir os grupos funcionais ativados residuais. O produto é então
passado através de uma coluna de permeação em gel para remover a proteína
carreadora não reagida e os reagentes residuais.
13
Proteínas
A composição imunogênica da invenção opcionalmente
adicionalmente compreende uma proteína estafilocócica, por exemplo uma
proteína de S. aureus ou de S. epidermidis. Algumas modalidades da invenção
5 contêm proteínas de ambas S. aureus e S. epidermidis.
Composições imunogênicas da invenção compreendem uma
proteína isolada que compreende uma seqüência de aminoácidos que possui
pelo menos 85% de identidade, opcionalmente pelo menos 90% de
identidade, pelo menos 95% de identidade, pelo menos 97-99% ou identidade
10 exata, em relação àquela de qualquer seqüência da figura 1.
Onde uma proteína é especificamente aqui mencionada, é
opcionalmente uma referência a uma proteína de comprimento total, nativa ou
recombinante, ou opcionalmente uma proteína madura na qual qualquer
seqüência de sinal tem sido removida. A proteína pode ser isolada diretamente
15 da cepa estafilocócica ou produzida por técnicas de DNA recombinante.
Fragmentos imunogênicos da proteína podem ser incorporados na composição
imunogênica da invenção. Estes são fragmentos compreendendo pelo menos
10 aminoácidos, pelo menos 20 aminoácidos, pelo menos 30 aminoácidos,
pelo menos 40 aminoácidos, pelo menos 50 aminoácidos ou pelo menos 100
20 aminoácidos, tomados contiguamente da seqüência de aminoácidos da
proteína. Em adição, tais fragmentos imunogênicos são tipicamente
imunogenicamente reativos com anticorpos gerados contra as proteínas
estafilocócicas ou com anticorpos gerados pela infecção de um hospedeiro
mamífero com estafilococos ou contem epitopos de célula-T. Em uma
25 modalidade, fragmentos imunógenos também incluem fragmentos que quando
administrados em uma dose efetiva, (quer sozinhos quer como um hapteno
ligado em um carreador), geram uma resposta imune protetora contra infecção
estafilocócica, opcionalmente é protetor contra infecção de S. aureus e/ou S.
epidermidis. Um tal fragmento imunógeno pode incluir, por exemplo, a
14
proteína faltante de uma seqüência líder N-terminal, e/ou um domínio de
transmembrana e/ou um domínio de âncora C-terminal. Em uma modalidade,
o fragmento imunógeno de acordo com a invenção compreende
substancialmente todo o domínio extracelular de uma proteína que possui
5 pelo menos 85%, 90%, 95%, 97% ou 99% de identidade, em relação àquela
de uma seqüência selecionada de Figura 1 sobre o comprimento inteiro da
seqüência de fragmento.
Em uma modalidade, composições imunogênicas da invenção
podem conter proteínas de fusão de proteínas estafilocócicas, ou fragmentos
10 de proteínas estafilocócicas. Tais proteínas de fusão podem ser preparadas
recombinantemente e podem compreender uma porção de pelo menos 2, 3, 4,
5 ou 6 proteínas estafilocócicas, por exemplo as combinações de proteínas
estafilocócicas listadas abaixo. Alternativamente, uma proteína de fusão pode
compreender uma multitude de porções de pelo menos 2, 3, 4 ou 5 proteínas
15 estafilocócicas. Estas podem combinar proteínas estafilocócicas diferentes ou
seus fragmentos na mesma proteína. Alternativamente, a invenção também
inclui proteínas de fusão individuais de proteínas estafilocócicas ou seus
fragmentos, como uma proteína de fusão com seqüências heterólogas tais
como um proporcionador de epitopos de célula-T ou marcadores de
20 purificação, por exemplo: 13-galactosidase, glutatione-S-transferase, proteínas
fluorescentes verdes (GFP), marcadores de epitopo tais como FLAG,
marcador myc, poli-histidina, ou proteínas de superficie viral tal como
hemaglutinina de vírus da gripe, ou proteínas bacterianas tais como toxóide
do tétano, toxóide da difteria, CRM197. A proteína de fusão pode estar
25 presente na composição imunogênica da invenção como uma proteína livre
ou pode ser uma proteína carreadora ligada em um sacarídeo.
Proteínas
Em uma modalidade, a composição imunogênica da invenção
adicionalmente compreende uma ou mais das proteínas mencionadas abaixo
15
ou seus fragmentos imunógenos. Muitas das proteínas caem dentro de
categorias de proteínas ligantes de componente extracelular, proteínas
transportadoras ou toxinas e reguladores de virulência. A composição
imunogênica da invenção opcionalmente adicionalmente compreende uma
5 proteína ligante de componente extracelular estafilocepa estafilocócica ou
uma proteína transportadora estafilocepa estafilocócica ou uma toxina
estafilocepa estafilocócica ou um regulador de virulência estafilocepa
estafilocócica. A composição imunogênica da invenção opcionalmente
compreende pelo menos ou exatamente 1, 2, 3, 4, 5 ou 6 proteínas
10 estafilocócicas.
Tabela 1
A seguinte tabela exibe números de SEQ das seqüências de
proteína e seqüências de DNA que são encontradas em Figura 1 e Figura 2
respectivamente. SA indica uma seqüência de S. aureus e SE indica uma
15 seqüência de S. epidermidis.Nome Seqüência de proteína Seqüência de DNATransportador ABC imunodominanteSASE
SEQ ID 1 SEQ ID 34SEQ ID 2 SEQ ID 35
Receptor de lamininaSASE
SEQ ID 3 SEQ ID 36SEQ ID 4 SEQ ID 37
Antígeno Secretário A SsaASA 1SA 2SE
SEQ ID 5 SEQ ID 38SEQ ID 6 SEQ ID 39SEQ ID 7 SEQ ID 40
S itCSASE
SEQID8 SEQID41SEQ ID 9 SEQ ID 42
IsaA/PisA (IssA)SASE
SEQ ID 10 SEQ ID 43SEQ ID 11 SEQ ID 44
EbhA/BSA EbhASA EbhBSE EbhASE EbhB
SEQ ID 12 SEQ ID 45SEQ ID 13 SEQ ID 46SEQ ID 14 SEQ ID 47SEQ ID 15 SEQ ID 48
Acumulação-assoc pro AapASSE
SEQ ID 16 SEQ ID 49SEQ ID 17 SEQ ID 50
Proteína ativadora de RNA III RAPSASE
SEQ ID 18 SEQ ID 51SEQ ID 19 SEQ ID 52
16
FIG/SdrGSASE
SEQ ID 20 SEQ ID 53SEQ ID 21 SEQ ID 54
Proteína ligante de elastina EbpSSASE
SEQ ID 22 SEQ ID 55SEQ ID 23 SEQ ID 56
Proteína extracelular EFB SA SEQ ID 24 SEQ ID 57alfa-toxina SA SEQ ID 25 SEQ ID 58SBI SA SEQ ID 26 SEQ ID 59IsdA SA SEQ ID 27 SEQ ID 60IsdBSA SEQID28 SEQID61
SEQ ID 62SdrC SA SEQ ID 29CTfA SA SEQ ID 30 SEQ ID 63FnbA SA SEQ ID 31 SEQ ID 64C1fB SA SEQ ID 32 SEQ ID 65Coagulase SA SEQ ID 33 SEQ ID 66FnbB SA SEQ ID 67 SEQ ID 77MAP SA SEQ ID 68 SEQ ID 78HarA SA SEQ ID 69 SEQ ID 79Autolisina glicosaminidase SA SEQ ID 70 SEQ ID 80Autolisina amidase SA SEQ ID 71 SEQ ID 81fragmento Ebh SA SEQ ID 72 SEQ ID 82Autolisina Ant SA SEQ ID 73 SEQ ID 83SdrCSA SEQ ID74 SEQ ID84MRPIISA SEQ ID75 SEQ ID85SdrG SA SEQ ID 76 SEQ ID 86SdrE SA SEQ ID 87 SEQ ID 88SdrD SA SEQ ID 89 SEQ ID 90SasF SA SEQ ID 91 SEQ ID 92
Proteínas ligantes de componente extracelular
Proteínas ligantes de componente extracelular são proteínas
que se ligam em componentes extracelulares de hospedeiro. O termo inclui,
mas não é limitado às adesinas.
5 Exemplos de proteínas ligantes de componente extracelular
incluem receptor de laminina (Naidu et al. J. Med. Microbiol. 1992, 36; 177),
proteína ligante de saliva/SitC/MntC (US5801234, Wiltshire e Foster Infec.
Immun. 2001, 69; 5198), EbhA (Williams et al. Infect. Immun. 2002, 70;
6805), EbhB, proteína ligante de Elastina (EbpS) (Park et al. 1999, J. Biol.
10 Chem. 274; 2845), EFB (FIB) (Wastfelt e Flock 1995, J. Clin. Microbiol. 33;
2347), SBI (Zhang et al. FEMS Immun. Med. Microbiol. 2000, 28; 211),
autolisina (Rupp et al. 2001, J. Infect. Dis. 183; 1038), CTfA ( US6008341,
McDevitt et al. Mol. Microbiol. 1994, 11; 237), SdrC, SdrG (McCrea et al.
Microbiology 2000, 146; 1535), SdrH (McCrea et al. Microbiology 2000,
17
146; 1535), Lipase GehD (US2002/0169288), SasA (Roche et al.
Microbiology 2003, 149 ; 643), SasC (Roche et al. Microbiology 2003, 149 ;
643), SasK (Roche et al. Microbiology 2003, 149 ; 643), FnbA (Flock et al.
Mol Microbiol. 1994, 12; 599, US6054572), FnbB (WO 97/14799, Booth et
5 al. 2001 Infec. Immun. 69; 345), proteína ligante de colágeno Cna (Visci et al.
2000, J. Biol. Chem. 275; 39837), ClfB (WO 99/27109), SdrD (WO
99/27109), SdrE (WO 99/27109), FbpA (Phonimdaeng et al. 1988 J. Gen
Microbio1.134; 75), Npase (Flock 2001 J. Bacteriol. 183; 3999), IsaA/PisA
(Lonenz et al. FEMS Immuno. Med. Microbiol. 2000, 29; 145), SsaA (Lang
10 et al. FEMS Immunol. Med. Microbiol. 2000, 29; 213), EPB (Hussain e
Hermann symposium on Staph Denmark 1417th 2000), SSP-1 (Veenstra et al.
1996, J. Bacteriol. 178; 537), SSP-2 (Veenstra et al. 1996, J. Bacteriol. 178;
537), proteína ligante de heparina de 17 kDa HBP (Fallgren et al. 2001, J.
Med. Microbiol. 50; 547), proteína ligante de Vitronectina (Li et al. 2001,
15 Curr. Microbiol. 42; 361), proteína ligante de fibrinogênio, coagulase, Fig
(WO 97/48727) e MAP (US5648240)
Proteína ligante de saliva/SitC/MntC
Esta é uma proteína transportadora ABC que é um homólogo
de adesina PsaA em S. pneumoniae. É uma lipoproteína elevadamente
20 imunogênica de 32kDa que está distribuída em toda a parede celular
bacteriana (Cockayne et al. Infect. Immun. 1998 66; 3767). É expressada em
S. aureus e S. epidermidis como uma lipoproteína de 32kDa e um
homólogo de 40kDa está presente em S. hominis. Em S. epidermidis, é um
componente de um operon regulado por ferro. Mostra homologia considerável
25 com ambas adesinas incluindo FimA de Streptococcus parasanguis,
e com lipoproteínas de uma família de transportadores ABC com funções de
transporte de ferro metálico putativo ou provado. Portanto SitC está
incluída como uma proteína ligante extracelular e como um transportador de
íon ferro.
18
A proteína ligante de saliva descrita em US5.801.234 também
é uma forma de SitC e pode ser incluída em uma composição imunogênica da
invenção.
CTfA e ClfB
5 Ambas estas proteínas possuem atividade de ligação de
fibrinogênio e acionam S. aureus para formar agrupamentos na presença de
plasma. Contêm um motivo LPXTG comum às proteínas associadas à parede.
CTfA é descrita em US6008341 e ClfB é descrita em WO
99/27109.
10 Coagulase (FbpA)
Esta é uma proteína ligante de fibrinogênio que aciona S.
aureus para formar agrupamentos na presença de plasma. É descrita em
referências relacionadas com Coagulase : Phonimdaeng et al. (J. Gen.
Microbio. 1988, 134:75-83), Phonimdaeng et al. (Mol Microbiol 1990; 4:393-
15 404), Cheung et al. (Infect Immun 1995; 63:1914-1920) e Shopsin et al. (J.
CLin. Microbiol. 2000; 38:3453-3456). Em uma modalidade, fragmentos
para inclusão na composição imunogênica da invenção incluem a proteína
madura na qual o peptídeo de sinal tem sido removido (aminoácidos 27 à
terminação-C).
20 Coagulase possui três domínios distintos. Aminoácidos 59-297
que são uma região de espiral enrolada, aminoácidos 326-505 que são uma
região rica em prolina e glicina, e o domínio C-terminal do aminoácido 506 a
645 que possui uma conformação de folha beta. Cada um destes domínios é
um fragmento que pode ser incorporada na composição imunogênica da
25 invenção.
SdrG
Esta proteína é descrita em WO 00/12689. SdrG é encontrada
em estafilococos negativos para coagulase e é um proteína associada à parede
celular contendo uma seqüência LPXTG.
19
SdrG contém um peptídeo de sinal (aminoácidos 1-51), uma
região contendo sítios de ligação de fibrinogênio e sítios de ligação de
colágeno (aminoácidos 51-825), dois domínios CnaB (aminoácidos 627-698 e
738-809), uma região de repetição de SD (aminoácidos 825-1000) e um
5 domínio de âncora (aminoácidos 1009-1056).
Em uma modalidade fragmentos de SdrG incluem
polipeptídeos nos quais o peptídeo de sinal e/ou as repetições de SD e o
domínio de âncora têm sido removidos. Estes incluem polipeptídeos
compreendendo ou consistindo de aminoácidos 50-825, aminoácidos 50-633,
10 aminoácidos 50-597 (SEQ ID NO 2 de WO 03/76470), aminoácidos 273-597
(SEQ ID NO 4 de WO 03/76470), aminoácidos 273-577 (SEQ ID NO 6 de
WO 03/76470) aminoácidos 1-549, aminoácidos 219-549, aminoácidos
225-549, aminoácidos 219-528, aminoácidos 225-528 of SEQ ID NO: 70 ou
20 ou 21.
15 Opcionalmente, um polipeptídeo SdrG possuindo uma
seqüência pelo menos 80%, 85%, 90%, 92%, 95%, 97%, 98%, 99% ou 100%
homóloga à seqüência de SEQ ID NO: 70, 20 ou 21 é incorporado na
composição imunogênica da invenção.
As composições da invenção opcionalmente compreendem um
20 fragmento dos polipeptídeos SdrG descritos acima.
Em uma modalidade fragmentos possuem o peptídeo de sinal
e/ou o domínio de repetição de SD e/ou o domínio de âncora deletados. Por
exemplo seqüências correspondendo aos aminoácidos 1713, 1-549, 225-549,
225-529, 24-717, 1-707, 1-690, 1-680, 1-670, 1-660, 1-650, 1-640, 1-630, 1-
25 620, 1-610, 1-600, 34-707, 44-697, 36-689 de SEQ ID 70 ou seqüências
possuindo 85%, 90%, 92%, 95%, 97%, 98%, 99% ou 100% de identidade em
relação à SEQ ID 70 ou 20 ou 21.
Em uma modalidade, fragmentos com o peptídeo de sinal
deletado possuem um resíduo de metionina na terminação-N do fragmento
20
para garantir tradução correta.
Em uma modalidade, o fragmento possui a seguinte seqüência:
MEENSVQDVICDSNTDDELSDSNDQSSDEEKNDVINNNQS INTDDNNQ I IKKEETNNYDGIEKRS EDRTEST TN
VDENEATFLQKTPQDNTHLTEEEVKES S SVESSNS S IDTAQQPSHTTINREESVQTSDNVEDSHVSDFANSKI
ICESNTESGKEENTIEQPNKVKEDSTTSQPSGYTNIDEKISNQDE
LLNLPINEYENKARPLSTTSAQPS IICRVTVNQLAAEQGSNVNHL IKVTDQS ITEGYDDS EGVI KAHDAENL I Y
DVTFEVDDKVKSGDTMTVD IDKNTVPSDLTDS FT I PKI ICDNSGE I IATGTYDNKNKQITYTFTDYVDKYENIK
AHLICLTSYIDKS KVPNNNTKLDVEYKTALSSVNKTITVEYQRPNENRTANLQSM FTNIDTKNHTVEQT I Y INP
LRY SAKETNVN I S GNGD EG ST
I IDD ST I IKVYKVGDNQNL PDSNRIYDYSEYEDVTNDDYAQLGNNNDVNINFGN IDS PYI IKVISKYDPNICDD
YTTIQQTVTMQTTINEYTGEFRTASYDNTIAFSTS SGQGQGDLPPEKTYKIGDYVWEDVDICDGIQNTNDNEKP
LSNVLVTLTYPDGTSKSVRTDEDGICYQFDGLKNGLTYKITFETPEGYTPTLICHSGTNPALDSEGNSVWVTING
QDDMTIDSGFYQTPKYSLGNY
VWYDTNKDGIQGDDEKGISGVICVTLICDENGNIISTTTTDENGKYQFDNLNSGNYIVHFDKPSGMTQTTTDSGD
DDEQDADGEEVHVT I TDHDD F S I DNGY YDDE
EbhA e EbhB
EbhA e EbhB são proteínas que são expressadas em ambas S.
5 aureus e S. epidermidis (Clarke e Foster Infect. Immun. 2002, 70; 6680,
Williams et al. Infect. Immun. 2002, 20; 6805) e que se ligam em
fibronectina. Visto que fibronectina é um componente importante de matrix
extracelular, EbhA e EbhB possuem uma função importante em aderência de
estafilococos em matriz extracelular de hospedeiro.
10 As proteínas Ebh são grandes, possuindo um peso molecular
de 1,1 megadaltons. É vantajoso o uso de um fragmento da proteína Ebh em
vez de a seqüência completa devido à facilidade de produção e de formulação.
A região central da proteína contém repetições imperfeitas que contêm sítios
de ligação de fibronectina. Fragmentos contendo um ou mais dos domínios
15 repetidos descritos abaixo são alguns fragmentos adequados para
incorporação na composição imunogênica da invenção.
Proteínas Ebh contêm unidades de repetição imperfeitas de
127 aminoácidos em comprimento que são caracterizadas por conterem a
seqüência de consenso:
L.G.{10}A.{13}Q.{26}L...m..L.{33}A
20 ou
21
.{19}L.G.{1o}A.{13}Q.{26}L...m..L.{33}A.{12}
ou
I/V..A...I/V..AK.ALN/DG..NL..AK..A.{6}L..LN.AQK..L..QI/V..A..V..
V.{6}A..LN/D.AM..L...I/V.D/E...TK.S.NY/F.N/DAD..K..AY/F..AV..A..I/V.N
/D
Onde '.' significa qualquer aminoácido e '.{10}' significa
quaisquer 10 aminoácidos e I/V indica escolhas alternativas de aminoácido.
Por referência à seqüência descrita em Kuroda et al. (2001)
5 Lancet 357; 1225-1240, e Tabela 2, as seqüências repetidas dentro de
proteínas Ebh são prontamente deduzidas.
Em uma modalidade, fragmentos a serem incluídos na
composição imunogênica da invenção incluem proteínas contendo de uma,
duas, três, quatro, cinco, seis, sete, oito, nove, dez ou mais do que 10 das
10 unidades repetidas de 127 aminoácidos. Tais fragmentos podem consistir de
1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 ou mais repetições da região repetida de 127
aminoácidos e podem consistir de 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 ou mais
repetições com resíduos de aminoácido adicionais presentes em qualquer uma
das ou em ambas as extremidades do fragmento. Opcionalmente o fragmento
15 é o polipeptídeo H2 de cerca de 44kDa abarcando três repetições
(aminoácidos 3202-3595) como descrito em Clarke et al. Infection and
Immunity 70, 66806687, 2002. Tais fragmentos opcionalmente serão capazes
de se ligarem em fibronectina e/ou de produzirem anticorpos que são reativos
contra a proteína Ebh inteira.
20 As proteínas Ebh são capazes de se ligarem em fibronectina.
Em uma modalidade, fragmentos destas seqüências de polipeptídeos retêm a
capacidade para se ligarem em fibronectina. Ligação em fibronectina pode ser
avaliada por ELISA como descrito por Clarke et al. (Infection and Immunity
70; 6680-6687 2002).
25 Em uma modalidade, o fragmento é um que compreende um
epitopo de célula-T auxiliadora ou célula-B, por exemplo aqueles
22
fragmentos/peptídeos descritos em Tabelas 3 e 4.
TABELA 2 Seqüências de repetição da seqüência de
comprimento total de Ebh.
A seqüência de comprimento total de Ebh é descrita em
5 Kuroda et al. (2001) Lancet 357; 12251240. A seguinte tabela mostra os
resíduos de aminoácido nos quais repetições de 127 aminoácidos começam e
terminam dentro da seqüência de comprimento total.Início Término
1 3204 33302 3331 34573 3457 35834 3583 37095 3709 38356 3835 39617 3961 40878 4200 43269 4326 445210 4452 457811 4578 470412 4704 483013 4830 495614 4956 508215 5082 520816 5208 533417 5334 546018 5460 558619 5585 571120 5711 583721 5837 596322 5963 608923 6089 621524 6215 634125 6341 646726 6467 659327 6593 671928 6719 684529 6845 697130 6971 709731 7097 722332 7223 734933 7349 747534 7475 760135 7601 772736 7727 785337 7852 7978
23
38 7978 810439 8104 823040 8230 835641 8356 848242 8482 860843 8604 873044 8858 8984
Tabela 3 Predição de epitopo de célula-B para uma repetição
de 127 aminoácidos:
A seqüência de comprimento total é descrita em Kuroda et al.
(2001) Lancet 357; 1225-1240. Uma destas repetições, codificada pelos
5 aminoácidos 3204-3331 da seqüência de comprimento total foi escolhida para
realizar a predição de epitopo:
MDVNTVNQKAASVKSTKDALDGQQN LQRAKTEATNAITHASDLNQAQKNALTQQVNSAQNVHAVNDIKQTTQSLNTAMTGLKRGVANHNQWQSDNYVNADTNKKNDYNNAYNHANDIINGNAQHPVI
Início TérminoSeqüência de epitopo Iniciação Terminação5 10 TVNQKA 3208 321314 19 KSTKDA 3217 322221 33 DGQQNLQRAKTEA 3224 323642 51 DLNQAQKNAL 3245 325466 74 DIKQTTQSL 3269 3277100 112 ADTNKKNDYNNAY 3303 3315117 123 DIINGNA 3320 3326
- As colunas "Início" e "Término" apresentam a posição dos
epitopos de célula-B preditos na repetição de 127 aminoácidos.
- As colunas "Iniciação" e "Terminação" apresentam a posição
10 dos epitopos de célula-B preditos na seqüência de comprimento total de Ebh
Tabela 4 Predição de epitopo de célula-T auxiliadora em Ebh:
A seqüência de comprimento total é descrita no bando de
dados TrEMBL, referência de seqüência Q8NWQ6. Uma destas repetições,1 . 1,1 dl ,"/ 1 1 • • "codificada pelc
• 1
•MDVNTVNQKAASVKSTKDALDGQQNLQRAKTEATNAITHASDLNQAQKNALTQQ'
15 foi escolhida p sAQNVHAVNDIKQTTQSLNTAMTGLKRGVANHNQVVQSDNYVNADTNKKNDYNNHANDIINGNAQHPVI
Posição na repetição Seqüência de epitopo Posição na seqüência1 MDVNTVNQK 32043 VNTVNQKAA 3206
24
6 VNQKAASVK 320926 LQRAKTEAT 322937 ITHASDLNQ 324043 LNQAQKNAL 324651 LTQQVNSAQ 325455 VNSAQNVHA 325861 VHAVNDIKQ 326464 VNDIKQTTQ 326767 IKQTTQSLN 327074 LNTAMTGLK 327778 MTGLKRGVA 328181 LKRGVANHN 328485 VANHNQWQ 328891 WQSDNYVN 329492 VQSDNYVNA 329597 YVNADTNKK 330198 VNADTNKKN 3302108 YNNAYNHAN 3311112 YNHANDIIN 3315118 IINGNAQHP 3321119 INGNAQHPV 3322
- A coluna "Posição na repetição ' apresenta a posição dos
epitopos de célula-T preditos na repetição
- A coluna "Posição na seqüência" apresenta a posição dos
epitopos de célula-T preditos na seqüência de comprimento total de Ebh
5 Fragmentos das proteínas da invenção podem ser
empregados para produzir o polipeptídeo de comprimento total
correspondente por síntese de peptídeo; portanto, estes fragmentos
podem ser empregados como intermediários para produzir as proteínas de
comprimento total da invenção.
10 Em uma modalidade, são usadas variantes nas quais vários, 5-
10, 1-5, 1-3, 1-2 ou 1 aminoácidos são substituídos, deletados, ou adicionados
em qualquer combinação.
Proteína ligante de elastina (EbpS)
EbpS é uma proteína contendo 486 aminoácidos com um peso
15 molecular de 83kDa. Está associada com a membrana citoplasmática de S.
aureus e possui três regiões hidrofóbicas que mantêm a proteína na membrana
(Downer et al. 2002, J. Biol. Chem. 277; 243; Park et al. 1996, J. Biol. Chem.
25
271; 15803).
Duas regiões entre aminoácidos 1-205 e 343-486 estão
expostas na superfície sobre a face externa da membrana citoplásmica. O
domínio de ligação de ligante de EbpS está localizado entre os resíduos 14-34
5 na terminação-N (Park et al. 1999, J. Biol. Chem. 274; 2845).
Em uma modalidade, o fragmento a ser incorporado na
composição imunogênica da invenção é o fragmento exposto na superfície
contendo a região de ligação de elastina (aminoácidos 1-205). Opcionalmente
os fragmentos não contêm a alça exposta inteira mas devem conter a região de
10 ligação de elastina (aminoácidos 14-34). Um fragmento alternativo que
poderia ser usado consiste de aminoácidos formando a segunda alça exposta
na superfície (aminoácidos 343-486). Fragmentos alternativos contendo até 1,
2, 5, 10, 20, 50 aminoácidos menos em uma ou ambas as extremidades
também são possíveis.
15 Receptores de laminina
O receptor de laminina de S. aureus desempenha um papel
importante em patogenicidade. Uma feição característica da infecção é
invasão de corrente sanguínea que permite formação de abscesso metastático
disseminada. Invasão de corrente sanguínea requer a capacidade para
20 extravasar através da membrana basal vascular. Isto é realizado através da
ligação em laminina por intermédio do receptor de laminina (Lopes et al.
Science 1985, 229; 275).
Receptores de laminina estão expostos em superfície e estão
presentes em muitas cepas de estafilococos incluindo S. aureus e S.
25 epidermidis.
SBI
Sbi é uma segunda proteína ligante de IgG em adição à
proteína A e é expressada na maioria das cepas de S. aureus (Zhang et al.
1998, Microbiology 144; 985).
26
A terminação-N da seqüência de Sbi possui uma seqüência de
sinal típica com um sítio de clivagem após aminoácido 29. Portanto um
fragmento de Sbi que poderia ser usado em uma composição imunogênica da
invenção inicia no resíduo de aminoácido 30, 31, 32 ou 33 e continua até a
5 terminação-C de Sbi, por exemplo de SEQ ID NO: 26.
O domínio ligante de IgG de Sbi tem sido identificado como
uma região na direção de terminação-N da proteína dos aminoácidos 41-92.
Este domínio é homólogo aos domínios ligantes de IgG de proteína A.
O domínio ligante de IgG mínimo de Sbi contém a seguinte
10 seqüência:
QTTQNNYVTDQQKAFYQVLHLKGITEEQRNQYIKTLREHPERAQEVFSESLK
** *** * *** * *
* - denota aminoácidos que são similares entre os domínios
ligantes de IgG
Em uma modalidade, um fragmento de Sbi a ser incluído na
composição imunogênica da invenção contém um domínio ligante de IgG.
15 Este fragmento contém a seqüência de consenso para um domínio ligante de
IgG como designado por como mostrado na seqüência acima.
Opcionalmente o fragmento contém ou consiste da seqüência completa
mostrada acima. Opcionalmente, o fragmento contém ou consiste de
aminoácidos 30-92, 33-92, 30-94, 33-94, 30-146, 33-146, 30-150, 33-150, 30-
20 160, 33-160, 33-170, 33-180, 33-190, 33-200, 33-205 ou 33-210 de Sbi, por
exemplo de SEQ ID NO:26.
Um fragmento pode conter 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10
substituições de aminoácido das seqüências indicadas.
Um fragmento pode conter repetições múltiplas (2, 3, 4, 5, 6,
25 7,8, 9 ou 10) do domínio ligante de IgG.
EFB - FIB
Fib é uma proteína ligante de fibrinogênio de 19kDa que é
27
secretada para dentro do meio extracelular por S. aureus. É produzida por
todos os isolados de S. aureus testados (Wastfelt e Flock 1995, J. Clin.
Microbiol. 33; 2347).
S. aureus agrupa-se na presença de fibrinogênio e liga-se em
5 superfícies revestidas com fibrinogênio. Esta capacidade facilita a
colonização estafilocepa estafilocócica de cateteres e células endoteliais.
Fib contém uma seqüência de sinal na terminação-N da
proteína com um sítio de clivagem putativo a cerca do aminoácido 30. Em
uma modalidade, a composição imunogênica da invenção compreende ou
10 consiste da seqüência da proteína madura (de cerca de aminoácido 30 até a
terminação-C da proteína).
Fbe - EfB/FIG
Fbe é uma proteína ligante de fibrinogênio que é encontrada
em muitos isolados de S. epidermidis e possui um peso molecular deduzido de
15 119 kDa (Nilsson et al. 1998. Infect. Immun. 66; 2666). Sua seqüência está
relacionada com aquela do fator de agrupamento de S. aureus (CTfA).
Anticorpos contra Fbe podem bloquear a ligação de S. epidermidis em placas
revestidas com fibrinogênio e em cateteres (Pei e Flock 2001, J. Infect. Dis.
184; 52).
20 Fbe possui uma seqüência de sinal putativa com um sítio de
clivagem entre aminoácidos 51 e 52. Portanto um fragmento potencial de Fbe
contém a forma madura de Fbe se estendendo do aminoácido 52 até a
terminação-C (aminoácido 1.092).
O domínio de Fbe do aminoácido 52 até o aminoácido 825 é
25 responsável pela ligação de fibrinogênio. Em uma modalidade, o fragmento
de Fbe consiste de ou contém aminoácidos 52825.
A região entre aminoácido 373 e 516 de Fbe mostra a
conservação maior entre Fbe e CTfA. Em uma modalidade, o fragmento
contém aminoácidos 373-516 de Fbe.
28
Aminoácidos 825 - 1041 de Fbe contêm uma região
elevadamente repetitiva composta de resíduos de ácido aspártico e de serina
serialmente repetidos.
IsaA/PisA
5 IsaA é uma proteína de 29kDa, também conhecida como PisA
que, como tem sido mostrado, é uma proteína estafilocócica imunodominante
durante sepsia em pacientes hospitalizados (Lorenz et al. 2000, FEMS
Immunol. Med. Microb. 29; 145).
Os primeiros 29 aminoácidos da seqüência de IsaA são
10 considerados como sendo uma seqüência de sinal. Em uma modalidade, o
fragmento de IsaA a ser incluído em uma composição imunogênica da
invenção contém resíduos de aminoácido 30 em diante, até o final da
seqüência codificada.
Proteína ligante de fibronectina
15 Proteína A ligante de fibronectina contém vários domínios que
estão envolvidos em ligação de fibronectina (WO 94/18327). Estes são
chamados de Dl, D2, D3 e D4. Em uma modalidade fragmentos de proteína
A ou B ligante de fibronectina compreendem ou consistem de Dl, D2, D3,
D4, Dl-D2, D2-D3, D3-D4, Dl-D3, D2-D4 ou Dl-D4.
20 Proteína ligante de fibronectina contém uma seqüência de sinal
de 36 aminoácidos. Por exemplo:
VKNNLRYGIRKFIKLGAASVFLGTMIVVGMGQDKEAA
Opcionalmente, a proteína madura omitindo esta seqüência de
sinal é incluída na composição imunogênica da invenção.
25 Proteínas transportadoras
A parede celular de bactérias Gram-positivas atua como uma
barreira prevenindo a difusão livre de metabólitos para dentro da bactéria.
Uma família proteínas orquestra a passagem de nutrientes essenciais para
dentro da bactéria e são portanto essenciais para a viabilidade da bactéria. O
29
termo proteína transportadora cobre proteínas envolvidas na etapa inicial de
ligação em metabólitos tal como ferro bem como aquelas envolvida em
transporte real do metabólito para dentro da bactéria.
Ferro molecular é um co-fator essencial para crescimento
5 bacteriano. São secretados sideróforos que se ligam em ferro livre e então são
capturados por receptores de superfície bacteriana que liberam ferro para
transporte através da membrana citoplásmica. Aquisição de ferro é crítica
para o estabelecimento de infecções humanas de modo que a geração de uma
resposta imune contra esta classe de proteínas leva a uma perda de viabilidade
10 estafilocepa estafilocócica.
Exemplos de proteínas transportadoras incluem transportador
Imunodominante ABC (Burnie et al. 2000 Infect. Immun. 68; 3200), IsdA
(Mazmanian et al. 2002 PNAS 99; 2293), IsdB (Mazmanian et al. 2002 PNAS
99; 2293), IsdC (WO 06/59247), transportador de Mg2+, SitC (Wiltshire e
15 Foster 2001 Infect. Immun. 69; 5198) e transportador Ni ABC.
Transportador Imunodominante ABC
Transportador Imunodominante ABC é uma proteína bem
conservada que pode ser capaz de gerar uma resposta imune que é protetora
cruzada contra diferentes cepas estafilocócicas (Mei et al. 1997, Mol.
20 Microbiol. 26; 399). Anticorpos contra esta proteína têm sido encontrados em
pacientes com septicemia (Burnie et al. 2000, Infect. Immun. 68; 3200).
Fragmentos opcionais de transportador imunodominante ABC
incluirão os peptídeos DRHFLN, GNYD, RRYPF, KTTLLK, GVTTSLS,
VDWLR, RGFL, KIKVYVGNYDFWYQS, TV1VVSHDRHFLYNNV e/ou
25 TETFLRGFLGRWILFS porque estas seqüências contêm epitopos que são
reconhecidos pelo sistema imune humano.
IsdA-IsdB
Os genes isd (determinante de superfície regulado por ferro) de
S. aureus codificam proteínas responsáveis pela ligação de hemoglobina e
30
passagem de ferro de hemoglobina para o citoplasma, onde atua como um
nutriente essencial. IsdA e IsdB estão localizadas na parede celular de
estafilococos . IsdA parece estar exposta sobre a superfície de bactéria porque
é suscetível à digestão por proteinase K. IsdB foi parcialmente digerida
5 sugerindo que está parcialmente exposta sobre a superfície da bactéria
(Mazmanian et al. 2003 Science 299; 906).
IsdA e IsdB são ambas proteínas de 29kDa que se ligam em
hemoglobina. Sua expressão é regulada pela disponibilidade de ferro via o
repressor Fur. Sua expressão será alta durante infecção em um hospedeiro
10 onde a concentração de ferro será baixa.
Também são conhecidas como FrpA e FrpB (Morrissey et al.
2002, Infect. Immun. 70; 2399). FrpA e FrpB são as proteínas de superfície
maiores com uma carga alta. Tem sido mostrado que proporcionam uma
contribuição maior para adesão em plástico.
15 Em uma modalidade, a composição imunogênica da invenção
compreende um fragmento de IsdA e/ou IsdB que é descrito em WO
01/98499 ou WO 03/11899.
Toxinas e reguladores de virulência
Membros desta família de proteínas incluem toxina tais como
20 alfa-toxina, hemolisina, enterotoxina B e TSST-1 bem como as proteínas que
regulam a produção de toxinas tal como RAP.
Alfa-toxina (Fila)
Alfa-toxina é um determinante de virulência importante
produzido pela maioria das cepas de S. aureus. É uma toxina formadora de
25 poro com atividade hemolítica. Tem sido mostrado que anticorpos contra alfa-
toxina neutralizam os efeitos prejudiciais e letais de alfa-toxina em modelos
animais (Adlam et al. 1977 Infect. Immun. 17; 250). Plaquetas, células
endoteliais e células mononucleares de humano são suscetíveis aos efeitos de
alfa-toxina.
31
A toxicidade alta de alfa-toxina requer que ela deve ser
destoxificada antes de ser usada como um imunógeno. Isto pode ser realizado
por tratamento químico, por exemplo por tratamento com formaldeído,
glutaraldeído de outros reagentes reticulantes ou por conjugação química dela
5 em polissacarídeos bacterianos como descrito abaixo.
Uma outra maneira de remover a toxicidade é introduzir mutações
pontuais que removem a toxicidade ao mesmo tempo retendo a antigenicidade da
toxina. A introdução de uma mutação pontual em aminoácido 35 de alfa-toxina
onde um resíduo de histidina é substituído por um resíduo de leucina resulta na
10 remoção de toxicidade simultaneamente restando a imunogenicidade (Menzies e
Kernodle 1996; Infect. Immun. 64; 1839). Histidina 35 parece ser crítica para
oligomerização apropriada requerida para formação de poro e mutação deste
resíduo leva à perda de toxicidade.
Quando incorporada em composições imunogênicas da
15 invenção, alfa-toxina é opcionalmente destoxificada por mutação de His 35,
por exemplo por substituição de His 35 por Leu ou Arg. Em uma modalidade
alternativa, alfa-toxina é destoxificada por conjugação em outros
componentes da composição imunogênica, por exemplo polissacarídeos
capsulares ou PNAG, opcionalmente em polissacarídeo de tipo 5 de S. aureus
20 type e/ou PNAG e/ou polissacarídeo de tipo 8 de S. aureus.
Proteína ativadora de RNA III (RAP)
RAP em si mesma não é uma toxina, mas é uma reguladora da
expressão de fatores de virulência. RAP é produzida e secretada por
estafilococos. Ativa o sistema regulatório agr de outros estafilococos e ativa a
25 expressão e a subseqüente liberação de fatores de virulência tais como
hemolisina, enterotoxina B e TSST-1.
Outras proteínas imunodominantes
Proteína associada à acumulação (Aap)
Aap é uma proteína de 140kDa que é essencial para a
32
acumulação de cepas de S. epidermidis sobre superfícies (Hussain et al.
Infect. Immun. 1997, 65; 519). Cepas expressando esta proteína produziram
quantidades significativamente maiores de biofilme e Aap parece estar
envolvida em formação de biofilme. Anticorpos contra Aap são capazes de
5 inibir a formação de biofilme e de inibir a acumulação de S. epidermidis.
Antígeno secretório estafilocepa estafilocócica SsaA
SsaA é uma proteína fortemente imunogênica de 30kDa
encontrada em ambas S. aureus e S. epidermidis (Lang et al. 2000 FEMS
Immunol. Med. Microbiol. 29; 213). Sua expressão durante endocardite
10 sugeriu um papel de virulência específico para as patogêneses da doença
infecciosa.
SsaA contém uma seqüência líder N-terminal e um sítio de
clivagem por peptídade se sinal. O peptídeo líder é seguido por uma região
hidrofilica de aproximadamente 100 aminoácidos do resíduo 30 até o resíduo
15 130.
Um fragmento opcional de SsaA a ser inserido na composição
imunogênica da invenção é composto da proteína madura (aminoácidos 27 até
terminação-C ou aminoácidos 30 até terminação-C).
Um outro fragmento opcional contém a área hidrofilica de
20 SsaA desde o aminoácido 30 até o aminoácido 130.
Combinações
Infecções estafilocócicas progridem através de vários estágios
diferentes. Por exemplo, o ciclo de vida estafilocepa estafilocócica envolve
colonização comensal, iniciação de infecção pelo acesso aos tecidos
25 conjuntivos ou à corrente sanguínea, multiplicação anaeróbica no sangue,
interação entre determinantes de virulência de S. aureus e os mecanismos de
defesa do hospedeiro e indução de complicações incluindo endocardite,
formação de abscesso metastático e síndrome de sepsia. Moléculas diferentes
sobre a superficie da bactéria estarão envolvidas em diferentes etapas do ciclo
33
de infecção. Pela seleção da resposta imune contra uma combinação de
antígenos particulares envolvidos em processos diferentes de infecção
estafilocócica, múltiplos aspectos de função estafilocepa estafilocócica são
afetados e isto pode resultar em boa eficácia de vacina.
5 Em particular, combinações de certos antígenos de classes
diferentes, alguns dos quais estão envolvidos em adesão em células
hospedeiras, alguns dos quais estão envolvidos em aquisição de ferro ou
outras funções de transporte, alguns dos quais são toxinas ou reguladores de
virulência e antígenos imunodominantes podem produzir uma resposta imune
10 que protege contra os múltiplos estágios de infecção.
Algumas combinações de antígenos são particularmente
efetivas em indução de uma resposta imune. Esta pode ser medida por
qualquer um dos ensaios de modelo animal como descrito nos exemplos e/ou
usando um ensaio opsonofagocítico como descrito nos exemplos. Sem o
15 desejo de estar ligado à teoria, considera-se que tais combinações efetivas de
antígenos são permitidas por numerosas características da resposta imune à
combinação de antígenos. Os próprios antígenos são normalmente expostos
sobre a superfície de células estafilocócicas, tendem a ser conservados mas
também tendem a não estarem presentes em quantidade suficiente sobre a
20 superfície celular para uma resposta bactericida ótima ocorrer usando
anticorpos produzidos contra o antígeno único. Combinação dos antígenos da
invenção pode resultar na formulação produzindo uma combinação vantajosa
de anticorpos que interagem com a célula estafilocepa estafilocócica além de
um limite crítico. Neste nível crítico, anticorpos suficientes de qualidade
25 suficiente se ligam na superfície da bactéria para permitirem quer extermínio
eficiente por complemento quer neutralização da bactéria. Isto pode ser
medido quer em modelo de desafio animal quer em um ensaio de opsonização
como descrito nos exemplos.
Composições imunogênicas da invenção preferidas
34
compreendem uma pluralidade de proteínas selecionadas de pelo menos duas
categorias diferentes de proteína, possuindo funções diferentes dentro de
estafilococos. Exemplos de tais categorias de proteínas são proteínas ligantes
extracelulares, proteínas transportadoras tais como proteínas de aquisição de
5 Fe, toxinas ou reguladores de virulência e outras proteínas imunodominantes.
Em uma modalidade preferida, a composição imunogênica da
invenção adicionalmente compreende um número de proteínas igual a ou
maior do que 2, 3, 4, 5 ou 6 selecionadas de 2, 3 ou 4 grupos diferentes
selecionados de:
10 • Grupo a) proteínas ligantes de componente extracelular;
• Grupo b) proteínas transportadoras;
• Grupo c) toxinas ou reguladores de virulência
• Grupo d) proteínas estruturais.
Em uma modalidade preferida, a composição imunogênica da
15 invenção adicionalmente compreende um número de proteínas igual a ou
maior do que 2, 3, 4, 5 ou 6 selecionadas de 2, 3 ou 4 dos seguintes grupos:
• grupo a) - pelo menos uma proteína ligante de componente
extracelular estafilocepa estafilocócica ou seu fragmento selecionada do
grupo consistindo de receptor de laminina, proteína ligante de
20 salivalSitC/MntC, EbhA, EbhB, proteína ligante de Elastina (EbpS), EFB
(FM), SBI, CTfA, SdrC, SdrD, SdrE, SdrG, SdrH, SasF, lipase GehD, SasA,
SasB, SasC, SasD, SasK, FnbA, FnbB, Cna, ClfB, FbpA, Npase, IsaA/PisA,
SsaA, EPB, SSP-1, SSP-2, HBP, proteína ligante de Vitronectina, proteína
ligante de fibrinogênio, coagulase, Fig e MAP;
25 • grupo b) - pelo menos uma proteína transportadora
estafilocepa estafilocócica ou seu fragmento selecionada do grupo consistindo
de transportador Imunodominante ABC, IsdA, IsdB, IsdC, transportador de
Mg2+, HarA, SitC e transportador Ni ABC;
• grupo c) - pelo menos um regulador de virulência
35
estafilocepa estafilocócica, toxina ou seu fragmento selecionado do grupo
consistindo de alfa-toxina (Hla), mutante H35R de alfa-toxina, proteína
ativadora de RNA III (RAP);
• grupo d) - pelo menos uma proteína estrutural estafilocepa
5 estafilocócica ou seu fragmento imunogênico selecionada do grupo
consistindo de MRPII e autolisina.
Em uma modalidade preferida, a composição imunogênica da
invenção compreende um número de proteínas igual a ou maior do que 2, 3,
4, 5 ou 6 selecionadas de 2 ou 3 dos seguintes grupos:
10 • grupo a) - pelo menos uma proteína ligante de componente
extracelular estafilocepa estafilocócica ou seu fragmento imunogênico
selecionada do grupo consistindo de receptor de laminina, proteína ligante de
saliva/SitC/MntC, EbhA, EbhB, proteína ligante de Elastina (EbpS), EFB
(FIB), SBI, autolisina, CTfA, SdrC, SdrD, SdrE, SdrG, SdrH, SasF, Lipase
15 GehD, SasA„ SasB, SasC, SasD, SasK, FnbA, FnbB, Cna, ClfB, FbpA,
Npase, IsaA/PisA, SsaA, EPB, SSP-1, SSP-2, HBP, proteína ligante de
Vitronectina, proteína ligante de fibrinogênio, coagulase, Fig e MAP;
• grupo b) - pelo menos uma proteína transportadora
estafilocepa estafilocócica ou seu fragmento imunogênico selecionada do
20 grupo consistindo de transportador Imunodominante ABC, IsdA, IsdB, IsdC,
HarA, transportador de Mg2÷, SitC e transportador Ni ABC;
• grupo c) - pelo menos um regulador de virulência
estafilocepa estafilocócica, toxina ou seu fragmento imunogênico selecionado
do grupo consistindo de alfa-toxina (Hla), mutante H35R de alfa-toxina,
25 proteína ativadora de RNA III (RAP).
Em uma modalidade preferida, a composição imunogênica da
invenção contém pelo menos uma proteína selecionada de grupo a) e uma
proteína adicional selecionada de grupo b) e/ou grupo c).
Em uma outra modalidade, a composição imunogênica da
36
invenção contém pelo menos um antígeno selecionado de grupo b) e uma
proteína adicional selecionada de grupo c) e/ou grupo a).
Em uma outra modalidade, a composição imunogênica da
invenção contém pelo menos um antígeno selecionado de grupo c) e uma
5 proteína adicional selecionada de grupo a) e/ou grupo b).
Uma combinação opcional de proteínas na composição
imunogênica da invenção compreende receptor de laminina e 1, 2, 3, 4 ou 5
outros antígenos selecionados do grupo consistindo de transportador
imunodominante ABC, IsdA, IsdB, IsdC, HarA, transportador de Mg2+, SitC,
10 transportador Ni ABC, alfa-toxina, mutante H35R ou H35L de alfa-toxina,
RAP, Aap e SsaA.
Uma outra combinação de proteínas na composição
imunogênica da invenção compreende SitC e 1, 2, 3, 4 ou 5 outros antígenos
selecionados do grupo consistindo de transportador imunodominante ABC,
15 IsdA, IsdB, IsdC, HarA, transportador de Mg2+, SitC, transportador Ni ABC,
alfa-toxina, mutante H35R ou H35L de alfa-toxina, RAP, Aap e SsaA.
Uma outra combinação de proteínas na composição
imunogênica da invenção compreende EbhA e 1, 2, 3, 4 ou 5 outros antígenos
selecionados do grupo consistindo de transportador imunodominante ABC,
20 IsdA, IsdB, IsdC, HarA, transportador de Mg2+, SitC, transportador Ni ABC,
alfa-toxina, mutante H35R ou H35L de alfa-toxina, RAP, Aap e SsaA.
Uma outra combinação de proteínas na composição
imunogênica da invenção compreende EbhB e 1, 2, 3, 4 ou 5 outros antígenos
selecionados do grupo consistindo de transportador imunodominante ABC,
25 IsdA, IsdB, IsdC, HarA, transportador de Mg2+, SitC, transportador Ni ABC,
alfa-toxina, mutante H35R ou H35L de alfa-toxina, RAP, Aap e SsaA.
Uma outra combinação de proteínas na composição
imunogênica da invenção compreende EbpS e 1, 2, 3, 4 ou 5 outros antígenos
selecionados do grupo consistindo de transportador imunodominante ABC,
37
IsdA, IsdB, IsdA, HarA, transportador de Mg2+, SitC, transportador Ni ABC,
alfa-toxina, mutante H35R ou H35L de alfa-toxina, RAP, Aap e SsaA.
Uma outra combinação de proteínas na composição
imunogênica da invenção compreende EFB(FIB) e 1, 2, 3, 4 ou 5 outros
5 antígenos selecionados do grupo consistindo de transportador
imunodominante ABC, IsdA, IsdB, IsdC, HarA, transportador de Mg2+, SitC,
transportador Ni ABC, alfa-toxina, mutante H35R ou H35L de alfa-toxina,
RAP, Aap e SsaA.
Uma outra combinação de proteínas na composição
10 imunogênica da invenção compreende SBI e 1, 2, 3, 4 ou 5 outros antígenos
selecionados do grupo consistindo de transportador imunodominante ABC,
IsdA, IsdB, IsdC, HarA, transportador de Mg2÷, SitC, transportador Ni ABC,
alfa-toxina, mutante H35R ou H35L de alfa-toxina, RAP, Aap e SsaA.
Uma outra combinação de proteínas na composição
15 imunogênica da invenção compreende autolisina e 1, 2, 3, 4 ou 5 outros
antígenos selecionados do grupo consistindo de transportador
imunodominante ABC, IsdA, IsdB, IsdC, HarA, transportador de Mg2+, SitC,
transportador Ni ABC, alfa-toxina, mutante H35R ou H35L de alfa-toxina,
RAP, Aap e SsaA.
20 Uma outra combinação de proteínas na composição
imunogênica da invenção compreende CTfA e 1, 2, 3, 4 ou 5 outros antígenos
selecionados do grupo consistindo de transportador imunodominante ABC,
IsdA, IsdB, IsdC, HarA, transportador de Mg2+, SitC, transportador Ni ABC,
alfa-toxina, mutante H35R ou H35L de alfa-toxina, RAP, Aap e SsaA.
25 Uma outra combinação de proteínas na composição
imunogênica da invenção compreende SdrC e 1, 2, 3, 4 ou 5 outros antígenos
selecionados do grupo consistindo de transportador imunodominante ABC,
IsdA, IsdB, IsdC, HarA, transportador de Mg2+, SitC, transportador Ni ABC,
alfa-toxina, mutante H35R ou H35L de alfa-toxina, RAP, Aap e SsaA.
38
Uma outra combinação de proteínas na composição
imunogênica da invenção compreende SdrD e 1, 2, 3, 4 ou 5 outros antígenos
selecionados do grupo consistindo de transportador imunodominante ABC,
IsdA, IsdB, IsdC, HarA, transportador de Mg2+, SitC, transportador Ni ABC,
5 alfa-toxina, mutante H35R ou H35L de alfa-toxina, RAP, Aap e SsaA.
Uma outra combinação de proteínas na composição
imunogênica da invenção compreende SdrE e 1, 2, 3, 4 ou 5 outros antígenos
selecionados do grupo consistindo de transportador imunodominante ABC,
IsdA, IsdB, IsdC, HarA, transportador de Mg2+, SitC, transportador Ni ABC,
10 alfa-toxina, mutante H35R ou H35L de alfa-toxina, RAP, Aap e SsaA.
Uma outra combinação de proteínas na composição
imunogênica da invenção compreende SdrG e 1, 2, 3, 4 ou 5 outros antígenos
selecionados do grupo consistindo de transportador imunodominante ABC,
IsdA, IsdB, IsdC. HarA, transportador de Mg2+, SitC, transportador Ni ABC,
15 alfa-toxina, mutante H35R ou H35L de alfa-toxina e RAP.
Uma outra combinação de proteínas na composição
imunogênica da invenção compreende SdrH e 1, 2, 3, 4 ou 5 outros antígenos
selecionados do grupo consistindo de transportador imunodominante ABC,
IsdA, IsdB, IsdC, HarA, transportador de Mg2+, SitC, transportador Ni ABC,
20 alfa-toxina, mutante H35R ou H35L de alfa-toxina, RAP, Aap e SsaA.
Uma outra combinação de proteínas na composição
imunogênica da invenção compreende SasF e 1, 2, 3, 4 ou 5 outros antígenos
selecionados do grupo consistindo de transportador imunodominante ABC,
IsdA, IsdB, IsdC, HarA, transportador de Mg2+, SitC, transportador Ni ABC,
25 alfa-toxina, mutante H35R ou H35L de alfa-toxina, RAP, Aap e SsaA.
Uma outra combinação de proteínas na composição
imunogênica da invenção compreende Lipase GehD e 1, 2, 3, 4 ou 5 outros
antígenos selecionados do grupo consistindo de transportador
imunodominante ABC, IsdA, IsdB, IsdC, HarA, transportador de Mg2+, SitC,
39
transportador Ni ABC, alfa-toxina, mutante H35R ou H35L de alfa-toxina,
RAP, Aap e SsaA.
Uma outra combinação de proteínas na composição
imunogênica da invenção compreende SasF e 1, 2, 3, 4 ou 5 outros antígenos
5 selecionados do grupo consistindo de transportador imunodominante ABC,
IsdA, IsdB, IsdC, HarA, transportador de Mg2+, SitC, transportador Ni ABC,
alfa-toxina, mutante H35R ou H35L de alfa-toxina, RAP, Aap e SsaA.
Uma outra combinação de proteínas na composição
imunogênica da invenção compreende FnbA e 1, 2, 3, 4 ou 5 outros antígenos
10 selecionados do grupo consistindo de transportador imunodominante ABC,
IsdA, IsdB, IsdC, HarA, transportador de Mg2+, SitC, transportador Ni ABC,
alfa-toxina, mutante H35R ou H35L de alfa-toxina, RAP, Aap e SsaA.
Uma outra combinação de proteínas na composição
imunogênica da invenção compreende FnbB e 1, 2, 3, 4 ou 5 outros antígenos
15 selecionados do grupo consistindo de transportador imunodominante ABC,
IsdA, IsdB, IsdC, HarA, transportador de Mg2+, SitC, transportador Ni ABC,
alfa-toxina, mutante H35R ou H35L de alfa-toxina, RAP, Aap e SsaA.
Uma outra combinação de proteínas na composição
imunogênica da invenção compreende Cna e 1, 2, 3, 4 ou 5 outros antígenos
20 selecionados do grupo consistindo de transportador imunodominante ABC,
IsdA, IsdB, IsdC, HarA, transportador de Mg2+, SitC, transportador Ni ABC,
alfa-toxina, mutante H35R ou H35L de alfa-toxina, RAP, Aap e SsaA.
Uma outra combinação de proteínas na composição
imunogênica da invenção compreende ClfB e 1, 2, 3, 4 ou 5 outros antígenos
25 selecionados do grupo consistindo de transportador imunodominante ABC,
IsdA, IsdB, IsdC, HarA, transportador de Mg2+, SitC, transportador Ni ABC,
alfa-toxina, mutante H35R ou H35L de alfa-toxina, RAP, Aap e SsaA.
Uma outra combinação de proteínas na composição
imunogênica da invenção compreende FbpA e 1, 2, 3, 4 ou 5 outros antígenos
40
selecionados do grupo consistindo de transportador imunodominante ABC,
IsdA, IsdB, IsdC, HarA, transportador de Mg2+, SitC, transportador Ni ABC,
alfa-toxina, mutante H35R ou H35L de alfa-toxina, RAP, Aap e SsaA.
Uma outra combinação de proteínas na composição
5 imunogênica da invenção compreende Npase e 1, 2, 3, 4 ou 5 outros antígenos
selecionados do grupo consistindo de transportador imunodominante ABC,
IsdA, IsdB, IsdC, HarA, transportador de Mg2+, SitC, transportador Ni ABC,
alfa-toxina, mutante H35R ou H35L de alfa-toxina, RAP, Aap e SsaA.
Uma outra combinação de proteínas na composição
10 imunogênica da invenção compreende IsaA/PisA e 1, 2, 3, 4 ou 5 outros
antígenos selecionados do grupo consistindo de transportador
imunodominante ABC, IsdA, IsdB, IsdC, HarA, transportador de Mg2+, SitC,
transportador Ni ABC, alfa-toxina, mutante H35R ou H35L de alfa-toxina,
RAP, Aap e SsaA.
15 Uma outra combinação de proteínas na composição
imunogênica da invenção compreende SsaA e 1, 2, 3, 4 ou 5 outros antígenos
selecionados do grupo consistindo de transportador imunodominante ABC,
IsdA, IsdB, IsdC, HarA, transportador de Mg2+, SitC, transportador Ni ABC,
alfa-toxina, mutante H35R ou H35L de alfa-toxina, RAP, Aap e SsaA.
20 Uma outra combinação de proteínas na composição
imunogênica da invenção compreende EPB e 1, 2, 3, 4 ou 5 outros antígenos
selecionados do grupo consistindo de transportador imunodominante ABC,
IsdA, IsdB, IsdC, HarA, transportador de Mg2+, SitC, transportador Ni ABC,
alfa-toxina, mutante H35R ou H35L de alfa-toxina, RAP, Aap e SsaA.
25 Uma outra combinação de proteínas na composição
imunogênica da invenção compreende SSP-1 e 1, 2, 3, 4 ou 5 outros antígenos
selecionados do grupo consistindo de transportador imunodominante ABC,
IsdA, IsdB, IsdC, HarA, transportador de Mg2+, SitC, transportador Ni ABC,
alfa-toxina, mutante H35R ou H35L de alfa-toxina, RAP, Aap e SsaA.
41
Uma outra combinação de proteínas na composição
imunogênica da invenção compreende SSP-2 e 1, 2, 3, 4 ou 5 outros antígenos
selecionados do grupo consistindo de transportador imunodominante ABC,
IsdA, IsdB, IsdC, HarA, transportador de Mg2+, SitC, transportador Ni ABC,
5 alfa-toxina, mutante H35R ou H35L de alfa-toxina, RAP, Aap e SsaA.
Uma outra combinação de proteínas na composição
imunogênica da invenção compreende HPB e 1, 2, 3, 4 ou 5 outros antígenos
selecionados do grupo consistindo de transportador imunodominante ABC,
IsdA, IsdB, IsdC, HarA, transportador de Mg2+, SitC, transportador Ni ABC,
10 alfa-toxina, mutante H35R ou H35L de alfa-toxina, RAP, Aap e SsaA.
Uma outra combinação de proteínas na composição
imunogênica da invenção compreende proteína ligante de Vitronectina e 1, 2,
3, 4 ou 5 outros antígenos selecionados do grupo consistindo de transportador
imunodominante ABC, IsdA, IsdB, IsdC, HarA, transportador de Mg2+, SitC,
15 transportador Ni ABC, alfa-toxina, mutante H35R ou H35L de alfa-toxina,
RAP, Aap e SsaA.
Uma outra combinação de proteínas na composição
imunogênica da invenção compreende proteína ligante de fibrinogênio e 1, 2,
3, 4 ou 5 outros antígenos selecionados do grupo consistindo de transportador
20 imunodominante ABC, IsdA, IsdB, IsdC, HarA, transportador de Mg2+, SitC,
transportador Ni ABC, alfa-toxina, mutante H35R ou H35L de alfa-toxina,
RAP, Aap e SsaA.
Uma outra combinação de proteínas na composição
imunogênica da invenção compreende coagulase e 1, 2, 3, 4 ou 5 outros
25 antígenos selecionados do grupo consistindo de transportador
imunodominante ABC, IsdA, IsdB, IsdC, HarA, transportador de Mg2+, SitC,
transportador Ni ABC, alfa-toxina, mutante H35R ou H35L de alfa-toxina,
RAP, Aap e SsaA.
Uma outra combinação de proteínas na composição
42
imunogênica da invenção compreende Fig e 1, 2, 3, 4 ou 5 outros antígenos
selecionados do grupo consistindo de transportador imunodominante ABC,
IsdA, IsdB, IsdC, HarA, transportador de Mg2+, SitC, transportador Ni ABC,
alfa-toxina, mutante H35R ou H35L de alfa-toxina, RAP, Aap e SsaA.
5 Uma outra combinação de proteínas na composição
imunogênica da invenção compreende MAP e 1, 2, 3, 4 ou 5 outros antígenos
selecionados do grupo consistindo de transportador imunodominante ABC,
IsdA, IsdB, IsdC, HarA, transportador de Mg2+, SitC, transportador Ni ABC,
alfa-toxina, mutante H35R ou H35L de alfa-toxina, RAP, Aap e SsaA.
10 Uma outra combinação de proteínas na composição
imunogênica da invenção compreende transportador imunodominante ABC e
1, 2, 3, 4 ou 5 outros antígenos selecionados do grupo consistindo de receptor
de laminina, proteína ligante de saliva/SitC/MntC, EbhA, EbhB, proteína
ligante de Elastina (EbpS), EFB (FIB), SBI, autolisina, CTfA, SdrC, SdrD,
15 SdrE, SdrG, SdrH, Lipase GehD, SasA, FnbA, FnbB, Cna, CTfA, C1fB,
FbpA, Npase, IsaA/PisA, SsaA, EPB, SSP-1, SSP-2, HBP, proteína ligante de
Vitronectina, proteína ligante de fibrinogênio, coagulase, Fig, MAP, alfa-
toxina, mutante H35R ou H35L de alfa-toxina, RAP, Aap e SsaA.
Uma outra combinação de proteínas na composição
20 imunogênica da invenção compreende IsdA e 1, 2, 3, 4 ou 5 outros antígenos
selecionados do grupo consistindo de receptor de laminina, proteína ligante de
saliva/SitC/MntC, EbhA, EbhB, proteína ligante de Elastina (EbpS), EFB
(FIB), SBI, autolisina, CTfA, SdrC, SdrC, SdrE, SdrG, SdrH, SasF, Lipase
GehD, SasA, FnbA, FnbB, Cna, CTfA, C1FB, FbpA, Npase, IsaA/PisA, SsaA,
25 EPB, SSP-1, SSP-2, HBP, proteína ligante de Vitronectina, proteína ligante
de fibrinogênio, coagulase, Fig, MAP, alfa-toxina, mutante H35R ou H35L de
alfa-toxina, RAP, Aap e SsaA.
Uma outra combinação de proteínas na composição
imunogênica da invenção compreende IsdB e 1, 2, 3, 4 ou 5 outros antígenos
43
selecionados do grupo consistindo de receptor de laminina, proteína ligante de
saliva/SitC/MntC, EbhA, EbhB, proteína ligante de Elastina (EbpS), EFB
(FIB), SBI, autolisina, CTfA, SdrC, SdrG, SdrH, SasF, Lipase GehD, SasA,
FnbA, FnbB, Cna, CTfA, ClfB, FbpA, Npase, IsaA/PisA, SsaA, EPB, SSP-1,
5 SSP-2, HBP, proteína ligante de Vitronectina, proteína ligante de
fibrinogênio, coagulase, Fig, MAP, alfa-toxina, mutante H35R ou H35L de
alfa-toxina, RAP, Aap e SsaA.
Uma outra combinação de proteínas na composição
imunogênica da invenção compreende SitC e 1, 2, 3, 4 ou 5 outros antígenos
10 selecionados do grupo consistindo de receptor de laminina, Proteína ligante
de saliva/SitC/MntC, EbhA, EbhB, proteína ligante de Elastina (EbpS), EFB
(FIB), SBI, autolisina, CTfA, SdrC, SdrD, SdrE, SdrG, SdrH, SasF, Lipase
GehD, SasA, FnbA, FnbB, Cna, CTfA, ClfB, FbpA, Npase, IsaA/PisA, SsaA,
EPB, SSP-1, SSP-2, HBP, proteína ligante de Vitronectina, proteína ligante
15 de fibrinogênio, coagulase, Fig, MAP, alfa-toxina, mutante H3 5R ou H3 5L de
alfa-toxina, RAP, Aap e SsaA.
Uma outra combinação de proteínas na composição
imunogênica da invenção compreende alfa-toxina e 1, 2, 3, 4 ou 5 outros
antígenos selecionados do grupo consistindo de receptor de laminina, proteína
20 ligante de saliva/SitC/MntC, EbhA, EbhB, proteína ligante de Elastina
(EbpS), EFB (FIB), SBI, autolisina, CTfA, SdrC, SdrD, SdrE, SdrG, SdrH,
SasF, Lipase GehD, SasA, FnbA, FnbB, Cna, ClfB, FbpA, Npase, IsaA/PisA,
SsaA, EPB, SSP-1, SSP-2, HBP, proteína ligante de Vitronectina, proteína
ligante de fibrinogênio, coagulase, Fig, MAP, transportador imunodominante
25 ABC, IsdA, IsdB, IsdC, HarA, transportador de Mg2÷, SitC, transportador Ni
ABC, Aap e SsaA.
Uma outra combinação de proteínas na composição
imunogênica da invenção compreende variante H35L ou H35R dealfa-toxina
e 1, 2, 3, 4 ou 5 outros antígenos selecionados do grupo consistindo de
44
receptor de laminina, proteína ligante de saliva/SitC/MntC, EbhA, EbhB,
proteína ligante de Elastina (EbpS), EFB (FIB), SBI, autolisina, CTfA, SdrC,
SdrD, SdrE, SdrG, SdrH, SasF, Lipase GehD, SasA, FribA, FnbB, Cna, ClfB,
FbpA, Npase, IsaA/PisA, SsaA, EPB, SSP-1, SSP-2, HBP, proteína ligante de
5 Vitronectina, proteína ligante de fibrinogênio, coagulase, Fig, MAP,
transportador imunodominante ABC, IsdA, IsdB, IsdC, HarA, transportador
de Mg2+, SitC, transportador Ni ABC, Aap e SsaA.
Uma outra combinação de proteínas na composição
imunogênica da invenção compreende RAP e 1, 2, 3, 4 ou 5 outros antígenos
10 selecionados do grupo consistindo de receptor de laminina, proteína ligante de
saliva/SitC/NIntC, EbhA, EbhB, proteína ligante de Elastina (EbpS), EFB
(FIB), SBI, autolisina, CTfA, SdrC, SdrD, SdrE, SdrG, SdrH, SasF, Lipase
GehD, SasA, FnbA, FnbB, Cna, ClfB, FbpA, Npase, IsaA/PisA, SsaA, EPB,
SSP-1, SSP-2, HBP, proteína ligante de Vitronectina, proteína ligante de
15 fibrinogênio, coagulase, Fig, MAP, transportador imunodominante ABC,
IsdA, IsdB, IsdC, HarA, transportador de Mg2+, SitC, transportador Ni ABC,
Aap e SsaA.
Outras combinações de proteína na composição imunogênica
da invenção compreendem IsdA e IsdB; IsdA e CTfA; IsdA e ClfB; IsdA e
20 SdrC; IsdA e SdrD; IsdA e SdrE; IsdA e SdrG; IsdA e SasF;IsdB e CTfA;
IsdB e ClfB; IsdB e SdrC; IsdB e SdrD; IsdB e SdrE; IsdB e SdrG; IsdB e
SasF; CTfA e ClfB; CTfA e SdrC; CTfA e SdrD; CTfA e SdrE; CTfA e SasF;
ClfB e SdrC; ClfB e SdrD; ClfB e SdrE; ClfB e SasF; SdrC e SdrD; SdrC e
SdrE; SdrC e SasF; SdrD e SdrE; SdrD e SasF; SdrE e SasF.
25 Nas combinações acima e abaixo, as proteínas especificadas
podem estar opcionalmente presentes na composição imunogênica da
invenção como um fragmento ou uma proteína de fusão como descrito acima.
Combinações de três proteínas
Em uma modalidade, a composição imunogênica da invenção
45
adicionalmente compreende três componentes de proteína em uma
combinação de alfa-toxina, uma proteína ligante de componente extracelular
(por exemplo uma adesina) e uma proteína transportadora (por exemplo uma
proteína ligante de ferro).
5 Em uma tal combinação, a alfa-toxina pode ser quimicamente
destoxificada ou geneticamente destoxificada por introdução de mutação(ões)
pontual(ais), por exemplo a mutação pontual de His35Leu. A alfa-toxina está
presente como uma proteína livre ou alternativamente está conjugada em um
componente polissacarídeo ou PNAG da composição imunogênica.
10 Exemplos de combinações incluem:
Uma composição imunogênica compreendendo alfa-toxina,
IsdA e uma proteína ligante de componente extracelular selecionada do grupo
consistindo de receptor de laminina, proteína ligante de saliva/SitC/MntC,
EbhA, EbhB, proteína ligante de Elastina (EbpS), EFB (FIB), SBI, autolisina,
15 CTfA, SdrC, SdrG, SdrH, Lipase GehD, SasA, FnbA, FnbB, Cna, ClfB,
FbpA, Npase, IsaA/PisA, SsaA, EPB, SSP-1, SSP-2, HBP, proteína ligante de
Vitronectina, proteína ligante de fibrinogênio, coagulase, Fig e MAP.
Uma composição imunogênica compreendendo alfa-toxina,
IsdB e uma proteína ligante de componente extracelular selecionada do grupo
20 consistindo de receptor de laminina, proteína ligante de saliva/SitC/MntC,
EbhA, EbhB, proteína ligante de Elastina (EbpS), EFB (FIB), SBI, autolisina,
CTfA, SdrC, SdrD, SdrE, SdrG, SdrH, Lipase GehD, SasA, FnbA, FnbB,
Cna, ClfB, FbpA, Npase, IsaA/PisA, SsaA, EPB, SSP-1, SSP-2, HBP,
proteína ligante de Vitronectina, proteína ligante de fibrinogênio, coagulase,
25 Fig e MAP.
Uma composição imunogênica compreendendo alfa-toxina,
IsdA e uma adesina selecionada do grupo consistindo de receptor de laminina,
EbhA, EbhB, proteína ligante de Elastina (EbpS), EFB (FIB), CTfA, SdrC,
SdrD, SdrE, SdrG, SdrH, autolisina, FnbA, FnbB, Cna, ClfB, FbpA, Npase,
46
SSP-1, SSP-2, proteína ligante de Vitronectina, proteína ligante de
fibrinogênio, coagulase, Fig e MAP.
Uma composição imunogênica compreendendo alfa-toxina,
IsdB e uma adesina selecionada do grupo consistindo de receptor de laminina,
5 EbhA, EbhB, proteína ligante de Elastina (EbpS), EFB (FIB), autolisina,
CTfA, SdrC, SdrD, SdrE, SdrG, SdrH, FnbA, FnbB, Cna, ClfB, FbpA, Npase,
SSP-1, SSP-2, proteína ligante de Vitronectina, proteína ligante de
fibrinogênio, coagulase, Fig e MAP.
Uma composição imunogênica compreendendo alfa-toxina,
10 IsdA e receptor de laminina.
Uma composição imunogênica compreendendo alfa-toxina,
IsdA e EbhA.
Uma composição imunogênica compreendendo alfa-toxina,
IsdA e EbhB.
15 Uma composição imunogênica compreendendo alfa-toxina,
IsdA e EbpS.
Uma composição imunogênica compreendendo alfa-toxina,
IsdA e EFB (FIB).
Uma composição imunogênica compreendendo alfa-toxina,
20 IsdA e SdrG.
Uma composição imunogênica compreendendo alfa-toxina,
IsdA e CTfA.
Uma composição imunogênica compreendendo alfa-toxina,
IsdA e ClfB.
25 Uma composição imunogênica compreendendo alfa-toxina,
IsdA e FnbA.
Uma composição imunogênica compreendendo alfa-toxina,
IsdA e coagulase.
Uma composição imunogênica compreendendo alfa-toxina,
47
IsdA e Fig.
IsdA e SdrH.
5 IsdA e SdrC.
IsdA e SdrD.
IsdA e SdrE.
10
IsdA e MAP.
Uma composição imunogênica compreendendo alfa-toxina,
Uma composição imunogênica compreendendo alfa-toxina,
Uma composição imunogênica compreendendo alfa-toxina,
Uma composição imunogênica compreendendo alfa-toxina,
Uma composição imunogênica compreendendo alfa-toxina,
Uma composição imunogênica compreendendo IsaA e Sbi.
Uma composição imunogênica compreendendo IsaA e IsdB.
Uma composição imunogênica compreendendo IsaA e IsdA.
15 Uma composição imunogênica compreendendo IsaA e SdrC.
Uma composição imunogênica compreendendo IsaA e Ebh ou
seu fragmento como descrito acima.
Uma composição imunogênica compreendendo Sbi e SdrC.
Uma composição imunogênica compreendendo Sbi e Ebh ou
20 seu fragmento como descrito acima.
Uma composição imunogênica da invenção compreendendo
IsaA, Sbi ou SdrC.
Seleção de antígenos expressados em linhagens clonais
diferentes
25 Análise da ocorrência de fatores de virulência em relação com
a estrutura de população de Staphylococcus aureus mostrou presença variável
de genes de virulência em populações naturais de S. aureus.
Dentre os isolados clínicos de Staphylococcus aureus, foi
mostrado que pelo menos cinco linhagens clonais são elevadamente
48
prevalentes (Booth et al., 2001 Infect Immun. 69(1):345-52). Foi mostrado
que alfa-hemolisina (hla), proteína A ligante de fibronectina (fnbA) e fator A
agrupante (c1fA) estão presentes na maioria dos isolados de identidade de
linhagem, sugerindo um papel importante destas proteínas na sobrevivência
5 de S. aureus (Booth et al., 2001 Infect Immun. 69(1):345-52). Além disso, de
acordo com Peacock et al. 2002 pareceu que as distribuições de fnbA, ctfA,
coagulase, spa, map, pvl (leucocidina de Panton-Valentine), hlg (gama-
toxina), alfa-toxina e ica não estão relacionadas com a estrutura clonal
subjacente sugerindo transferência horizontal considerável destes genes.
10 Em contrário, outros genes de virulência tal como proteína B
ligante de fibronectina (fnbB), beta-hemolisina (hlb), proteína ligante de
colágeno (cna), TSST-1 (tst) e gene de resistência a meticilina (mecA) estão
fortemente associados com linhagens específicas (Booth et al., 2001 Infect.
Immun. 69(1):345-52). Similarmente, Peacock et al. 2002 (Infect. Immun.
15 70(9):4987-96) mostraram que as distribuições das enterotoxinas, tst, das
exfolatinas (eta e etb), beta- e delta-toxinas, dos genes sdr (sdrD, sdrE e bbp),
cna, ebpS e efb dentro da população estão todas elevadamente
significativamente relacionadas com complexos clonais derivados de MLST.
Dados de NILST não proporcionam evidência de que cepas
20 responsáveis por doença nosocomial representam uma subpopulação distinta
das cepas causadoras de doença adquirida em comunidade ou cepas
recuperadas de veículos assintomáticos (Feil et al., 2003 J Bacteriol.
185(11):3307-16).
Em uma modalidade, composições imunogênicas da invenção
25 são efetivas contra estafilococos de linhagens clonais diferentes.
Em uma modalidade, a composição imunogênica compreende
1, 2, 3, 4, ou pelo menos 1 proteína que é expressada na maioria dos isolados
de estafilococos. Exemplos de tais proteínas incluem alfa-hemolisina (hla),
proteína A ligante de fibronectina (fnbA) e fator A agrupante (ctfA),
49
coagulase, spa, map, pvl (leucocidina de Panton-Valentine), hlg (gama-
toxina), ica, transportador imunodominante ABC, RAP, autolisina (Rupp et
al. 2001, J. Infect. Dis. 183; 1038), receptores de laminina, SitC, IsaA/PisA,
SPOIIIE O, SsaA, EbpS, SasF (Roche et al. 2003, Microbiology 149; 643),
5 EFB(FIB), SBI, C1fB, IsdA, IsdB, FnbB, Npase, EBP, proteína II ligante sialo
de Osso, IsaB/PisB (Lorenz et al. FEMS Immuno. Med. Microb. 2000, 29;
145), SasH (Roche et al. 2003, Microbiology 149; 643), MRPI, SasD (Roche
et al. 2003, Microbiology 149; 643), SasH (Roche et al. 2003, Microbiology
149; 643), precursor aureolisina (AUR)/Seppl e autolisina nova.
10 Em uma modalidade alternativa, 2 ou mais proteínas que são
expressadas em conjuntos diferentes de cepas clonais são incluídas na
composição imunogênica da invenção. Opcionalmente a combinação de
antígenos permitirá que seja gerada uma resposta imune que é efetiva contra
múltiplas cepas clonais, ou contra todas as cepas clonais. Por exemplo
15 combinações incluem FnbB e beta-hemolisina, FnbB e Cna, FnbB e TSST-1,
FnbB e mecA, FnbB e SdrD, FnbB e SdrF, FnbB e EbpS, FnbB e Efb, beta-
hemolisina e Cna, beta-hemolisina e TSST-1, beta-hemolisina e mecA, beta-
hemolisina e SdrD, beta-hemolisina e SdrF, beta-hemolisina e EbpS, beta-
hemolisina e Efb, Cna e TSST-1, Cna e mecA, Cna e SdrD, Cna e SdrF, Cna
20 e EbpS, Cna e Efb, TSST-1 e mecA, TSST-1 e SdrD, TSST-1 e SdrF, TSST-1
e EbpS, TssT-1 e Efb, MecA e SdrD, MecA e SdrF, MecA e EbpS, MecA e
Efb, SdrD e SdrF, SdrD e EbpS, SdeD e Efb, SdrF e EbpS, SdrF e Efb, e,
EbpS e Efb.
As combinações descritas acima podem ser combinadas com
25 componentes adicionais descritos acima.
Proteção contra S. aureus e S. epidermidis
Em uma modalidade da invenção a composição imunogênica
proporciona uma resposta imune efetiva contra mais do que uma cepa de
estafilococos, por exemplo contra cepas de ambas S. aureus e S. epidermidis.
50
Por exemplo, uma resposta imune protetora é gerada contra sorotipos de tipos
5 e 8 de S. aureus.
Um uso da composição imunogênica da invenção é prevenir
infecções nosocomiais, por exemplo em pacientes eletivos para cirurgia, por
5 inoculação antes do tratamento hospitalar. Neste estágio, é dificil predizer
acuradamente a quais cepas estafilocócicas o paciente será exposto. Portanto é
vantajosa a inoculação com uma vacina que é capaz de gerar uma resposta
imune efetiva contra várias cepas de estafilococos.
Uma resposta imune efetiva é definida como uma resposta
10 imune que dá proteção significativa em um modelo de desafio de
camundongo ou ensaio de opsonofagocitose como descrito nos exemplos.
Proteção significativa em um modelo de desafio de camundongo, -por
exemplo aquele do exemplo 5, é definida como um aumento na LD50 em
comparação com os camundongos inoculados com veículo de pelo menos
15 10%, 20%, 50%, 100% ou 200%. Proteção significativa em um modelo de
desafio de rato de algodão, por exemplo aquele de exemplo 8, é definida
como um decréscimo de LogCFU/nariz médio observado de pelo menos 10%,
20%, 50%, 70% ou 90%. É sabido que a presença de anticorpos de
opsonização está correlacionada com a proteção, portanto proteção
20 significativa é indicada por um decréscimo na contagem bacteriana de pelo
menos 10%, 20%, 50%, 70% ou 90% em um ensaio de opsonofagocitose, por
exemplo aquele de exemplo 7.
Várias das proteínas incluindo transportador imunodominante
ABC, proteína ativadora de RNA III, receptores de laminina, SitC, IsaA/PisA,
25 SsaA, EbhA/EbhB, EbpS e Aap estão bem conservadas entre S. aureus e S.
epidermidis e exemplo 8 mostra que IsaA, CTfA, IsdB, SdrG, HarA, FnbpA e
Sbi podem gerar resposta imune reativa cruzada (por exemplo reativa cruzada
entre pelo menos uma cepa de S. aureus e pelo menos uma cepa de S.
epidermidis). PIA também está bem conservada entre S. aureus e S.
51
epidermidis.
Portanto em uma modalidade, a composição imunogênica da
invenção compreenderá PNAG e polissacarídeos dos tipos 5 e 8 e uma, duas,
três ou quatro das proteínas acima.
5 Vacinas
Em uma modalidade, a composição imunogênica da invenção
é misturada com um excipiente farmaceuticamente aceitável, e opcionalmente
com um adjuvante para formar uma vacina.
As vacinas da presente invenção podem ser adjuvantadas,
10 particularmente quando intencionadas para uso em uma população idosa mas
também para emprego em populações infantis. Adjuvantes adequados
incluem um sal de alumínio tal como gel de hidróxido de alumínio ou fosfato
de alumínio ou alume, mas também podem ser outros sais de metal tais como
aqueles de cálcio, de magnésio, de ferro ou de zinco, ou podem ser uma
15 suspensão insolúvel de tirosina acilada, ou açúcares acilados, sacarídeos
catiônica ou anionicamente derivados, ou polifosfazenos.
É preferido que o adjuvante seja selecionado para ser um
indutor preferencial de um tipo TH1 de resposta. Tais níveis altos de citocinas
de tipo Thl tendem a favorecer a indução de respostas imunes mediadas por
20 célula a um dado antígeno, enquanto que níveis altos de citocinas de tipo Th2
tendem a favorecer a indução de respostas imunes humorais ao antígeno.
A distinção de resposta imune dos tipos Thl e Th2 não é
absoluta. Em realidade um indivíduo suportará uma resposta imune que é
descrita como sendo predominantemente Thl ou predominantemente Th2.
25 Contudo, muitas vezes é conveniente considerar as famílias de citocinas em
termos do que descrito em clones de célula CD4 +ve T murina por Mosmann
e Coffman (Mosmann, T.R. e Coffman, R.L. (1989) "TH1 e TH2 cells:
different patterns of lymphokine secretion lead to different functional
properties" (Annual Review of Immunology, 7, p145-1'73). Tradicionalmente,
52
as respostas de tipo Thl estão associadas com a produção das citocinas INF-y
e IL-2 por linfócitos-T. Outras citocinas muitas vezes diretamente associadas
com a indução de respostas imunes de tipo Thl não são produzidas por
células-T, tal como IL-12. Em contraste, respostas de tipo Th2 estão
5 associadas com a secreção de IL-4, IL-5, IL-6, IL-10. Sistemas adjuvantes
adequados que promovem uma resposta predominantemente Thl incluem:
Monofosforil-lipídeo A ou um seu derivado (ou lipídeo A destoxificado em
geral - veja por exemplo W02005107798), particularmente monofosforil-
lipídeo A 3-de-0-acilado (3D-MPL) (para sua preparação veja GB 2220211
10 A); e uma combinação de monofosforil-lipídeo A, preferivelmente
monofosforil-lipídeo A 3-de-O-acilado, junto com quer um sal de alumínio
(por exemplo fosfato de alumínio ou hidróxido de alumínio) ou uma emulsão
de óleo-em-água. Em tais combinações, antígeno e 3D-MPL estão contidos
nas mesmas estruturas particuladas, permitindo liberação mais eficiente de
15 sinais antigênicos e imunoestimulatórios. Estudos têm mostrado que 3D-MPL
é capaz de adicionalmente intensificar a imunogenicidade de um antígeno
absorvido em alume [Thoelen et al. Vaccine (1998) 16:708-14; EP 689454-
B1].
Um sistema intensificado envolve a combinação de um
20 monofosforil-lipídeo A e um derivado de saponina, particularmente a
combinação de QS21 e 3D-MPL como descrito em WO 94/00153, ou uma
composição menos reatogênica onde o QS21 é extinto com colesterol como
descrito em WO 96/33739. Uma formulação adjuvante particularmente
potente envolvendo QS21, 3D-MPL e tocoferol em uma emulsão de óleo-em-
25 água é descrita em WO 95/17210. Em uma modalidade a composição
imunogênica adicionalmente compreende uma saponina, que pode ser QS21.
A formulação também pode compreender uma emulsão de óleo-em-água e
tocoferol (WO 95/17210). CpG não-metilado contendo oligonucleotídeos
(WO 96/02555) e outros oligonucleotídeos imunomodulatórios (W00226757
53
e W003507822) também são indutores preferenciais de uma resposta TH1 e
são adequados para uso na presente invenção.
Adjuvantes particulares são aqueles selecionados do grupo de
sais de metal, emulsões de óleo-em-água, agonista de receptores semelhantes
5 a Toll, (em particular agonista de receptor 2 semelhante a Toll, agonista de
receptor 3 semelhante a Toll, agonista de receptor 4 semelhante a Toll,
agonista de receptor 7 semelhante a Toll, agonista de receptor 8 semelhante a
Toll e agonista de receptor 9 semelhante a Toll), saponinas ou suas
combinações.
10 Um adjuvante que pode ser usado com as composições de
vacina da invenção são preparações de vesícula de membrana externa ou
bolha de cepas de bactérias Gram-negativas tais como aquelas ensinadas por
W002/09746 - particularmente bolhas de N meningitidis . Propriedades
adjuvantes de bolhas podem ser melhoradas pela retenção de LOS
15 (lipooligossacarídeo) sobre sua superfície (e.g. através de extração com
concentrações baixas de detergente [por exemplo desoxicolato 0-0,1% d]).
LOS pode ser destoxificado através de mutações msbB(-) ou htrB(-)
discutidas em W002/09746. Propriedades adjuvantes também podem ser
melhoradas pela retenção de PorB (e opcionalmente remoção de PorA) de
20 bolhas estafilocócicas. Propriedades adjuvantes também podem ser
melhoradas por truncamento da estrutura de sacarídeo de núcleo externo de
LOS sobre bolhas estafilocócicas - por exemplo via a mutação IgtB(-)
discutida em W02004/014417. Alternativamente, o LOS acima mencionado
(e.g. idolado de uma cepa msbB(-) e/ou IgtB(-)) pode ser purificado e usado
25 como um adjuvante nas composições da invenção.
Um outro adjuvante que pode ser usado com as composições
da invenção pode ser selecionado do grupo: uma saponina, lipídeo A ou um
seu derivado, um oligonucleotídeo imunoestimulatório, um alquil-
glicosaminida-fosfato, uma emulsão de óleo-em-água ou suas combinações.
54
Um outro adjuvante preferido é um sal de metal em combinação com outro
adjuvante. É preferido que o adjuvante seja um agonista de receptor
semelhante a Toll em particular um agonista de um receptor 2, 3, 4, 7, 8 ou 9
semelhante a Toll, ou uma saponina, em particular Qs21. É adicionalmente
5 preferido que o sistema adjuvante compreenda dois ou mais adjuvantes da
lista acima. Em particular as combinações preferivelmente contêm uma
saponina (em particular Qs21) adjuvante e/ou um agonista de receptor 9
semelhante a Toll tal como um oligonucleotídeo imunoestimulatório contendo
CpG. Outras combinações preferidas compreendem uma saponina (em
10 particular QS21) e um agonista de receptor 4 semelhante a Toll tal como
monofosforil-lipídeo A ou seu derivado 3-desacilado, 3 D-MPL, ou uma
saponina (em particular QS21) e um ligante de receptor 4 semelhante a Toll
4ta1 como um alquil-glicosaminida-fosfato.
Adjuvantes particularmente preferidos são combinações de
15 3D-MPL e QS21 (EP 0.671.948 B1), emulsões de óleo-em-água
compreendendo 3D-MPL e QS21 (WO 95/17210, WO 98/56414), ou 3D-
MPL formulado com outros veículos (EP 0.689.454 B1). Outros sistemas
adjuvantes preferidos compreendem uma combinação de 3 D MPL, QS21 e
um oligonucleotídeo CpG como descrito em US6558670, US6544518.
20 Em uma modalidade o adjuvante é um ligante de receptor 4
semelhante a Toll (TLR), preferivelmente um antagonista tal como um
derivado de lipídeo A particularmente monofosforil-lipídeo A ou mais
particularmente monofosforil-lipídeo A 3-desacilado (3D-MPL).
3D-MPL está disponível na GlaxoSmithKline Biologicals
25 North America e primariamente promove respostas de células CD4+ T com
um fenótipo de IFN-g (Th1). Pode ser produzido de acordo com os métodos
descritos em GB 2.220.211 A. Quimicamente é uma mistura de monofosforil-
lipídeo A 3-desacilado com 3, 4, 5 ou 6 cadeias aciladas. Preferivelmente nas
composições da presente invenção é usado 3D-MPL de partícula pequena.
55
3D-MPL de partícula pequena possui um tamanho de partícula tal que pode
ser esterilmente filtrado através de um filtro de 0,22 gm. Tais preparações
estão descritas em Pedido de Patente Internacional de No. WO 94/21292.
Derivados sintéticos de lipídeo A são conhecidos e considerados em serem
5 agonistas de TLR 4 incluindo, mas não limitados a:
0M174 (2-desóxi-6-o-[2-desóxi-2-[(R)-3-dodecanoil-óxi-
tetradecanoil-amino]-4-o-fosfono-P-D-glicopiranosil]-2-[(R)-3-hidróxi-
tetradecanoil-amino]-a-D-glicopiranosil-di-hidrogeno-fosfato), (WO
95/14026)
10 OM 294 DP (3S, 9 R) -3-[(R)-dodecanoil-óxi-tetradecanoil-
amino]-4-oxo-5-aza-9(R)-[(R)-3-hidróxi-tetradecanoil-amino] -decan-1,10-
dio1,1,10-bis(di-hidrogeno-fosfato) (W099 /64301 e WO 00/0462 )
OM 197 MP-Ac DP (3S-, 9R)-3-[(R)-dodecanoil-óxi-
tetradecanoil-amino]-4-oxo-5-aza-9[(R)-3-hidróxi-tetradecanoil-amino]-
15 decan-1,10-diol, 1-di-hidrogeno-fosfato 10-(6amino-hexanoato) (WO
01/46127)
Outros ligantes TLR4 que podem ser usados são alquil-
glicosaminida-fosfatos (AGPs) tais como aqueles descritos em W09850399
ou US6303347 (processes para a preparação de AGPs também são descritos),
20 ou sais farmaceuticamente aceitáveis de AGPs como descrito em US6764840.
Alguns AGPs são agonistas de TLR4, e alguns são antagonistas de TLR4.
Ambos são considerados como adjuvantes úteis.
Outro imunoestimulante preferido para uso na presente
invenção é Quil A e seus derivados. Quil A é uma preparação de saponina
25 isolada da árvore sul-americana Quilaja Saponaria Molina e foi primeiro
descrita como possuindo uma atividade adjuvante por Dalsgaard et al. Em
1974 ("Saponin adjuvants", Archiv. fiir die gesamte Virusforschung, Vol. 44,
Springer Verlag, Berlin, p243-254). Têm sido isolados por HPLC fragmentos
purificados de Quil A que retêm atividade adjuvante sem a toxicidade
56
associada com Quil A (EP 0.362.278), por exemplo QS7 e QS21 (também
conhecidas como QA7 e QA21). QS-21 é uma saponina natural derivada da
casca de Quillaja saponaria Molina que induz as células-T citotóxicas CD8+
(CTLs), células Thl e uma resposta de anticorpo IgG2a predominante e é uma
5 saponina preferida no contexto da presente invenção.
Têm sido descritas formulações particulares de QS21 que são
particularmente preferidas, estas formulações compreendem um esterol
(W096/33739). As saponinas formando parte da presente invenção podem ser
separadas na forma de micelas, micelas mistas (preferencialmente, mas não
10 exclusivamente com sais biliares) ou podem estar na forma de matrizes de
ISCOM (EP 0.109.942 B1), lipossomos ou estruturas coloidais relacionadas
tais como complexos multiméricos semelhantes a anel ou semelhantes a
verme ou estrutura em camadas/lipídicas e lamelas quando formuladas com
colesterol e lipídeo, ou em uma emulsão de óleo-em-água (por exemplo como
15 em WO 95/17210). As saponinas podem estar preferivelmente associadas
com um sal metálico, tal como hidróxido de alumínio ou fosfato de alumínio
(WO 98/15287).
Preferivelmente, a saponina é apresentada na forma de um
lipossomo, ISCOM ou uma emulsão de óleo-em-água.
20 Um sistema intensificado envolve a combinação de um
monofosforil-lipídeo A (ou lipídeo A destoxificado) e um derivado de
saponina, particularmente a combinação de QS21 e 3D-MPL como descrito
em WO 94/00153, ou uma composição menos reatogênica onde a QS21 está
extinta com colesterol como descrito em WO 96/33739. Uma formulação de
25 adjuvante particularmente potente envolvendo tocoferol com ou sem QS21
e/ou 3D-MPL em uma emulsão de óleo-em-água é descrita em WO 95/17210.
Em uma modalidade a composição imunogênica compreende uma saponina,
que pode ser QS21.
Oligonucleotídeos imunoestimulatórios ou qualquer outro
57
agonista de receptor 9 semelhante a Toll (TLR) também podem ser usados.
Os oligonucleotídeos preferidos para uso em adjuvantes ou vacinas da
presente invenção são oligonucleotídeos contendo CpG, preferivelmente
contendo dois ou mais motivos CpG de dinucleotídeo separados por pelo
5 menos três, mais preferivelmente pelo menos seis ou mais nucleotídeos. Um
motivo CpG é um nucleotídeo citosina seguido por um nucleotídeo guanidina.
Os oligonucleotídeos CpG da presente invenção são tipicamente
desoxinucleotídeos. Em uma modalidade preferida o internucleotídeo no
oligonucleotídeo é uma ligação fosforoditioato, ou mais preferivelmente uma
10 ligação fosforotioato, embora ligações fosfodiéster e outras ligações de
internucleotídeo estão dentro do escopo invenção. Também estão incluídos
dentro do escopo da invenção os oligonucleotídeos com ligações de
internucleotídeo. Métodos para produzir oligonucleotídeos de fosforotioato ou
fosforoditioato são descritos em US5.666.153, US5.278,302 e W095/26204.
15 Exemplos de oligonucleotídeos preferidos possuem as
seguintes seqüências. As seqüências preferivelmente contêm ligações de
internucleotídeo modificadas com fosforotioato.
OLIGO 1(SEQ ID NO:1): TCC ATG ACG TTC CTG ACG TT
(CpG 1826)
OLIGO 2 (SEQ ID NO:2): TCT CCC AGC GTG CGC CAT (CpG
1758)
OLIGO 3(SEQ ID NO:3): ACC GAT GAC GTC GCC GGT GAC
GGC ACC ACG
OLIGO 4 (SEQ ID NO:4): TCG TCG TTT TGT CGT TTT GTC
GTT (CpG 2006)
OLIGO 5 (SEQ ID NO:5): TCC ATG ACG TTC CTG ATG CT
(CpG 1668)
OLIGO 6 (SEQ ID NO:6): TCG ACG TTT TCG GCG CGC GCC
G (CpG 5456)
58
Oligonucleotídeos CpG alternativos podem compreender as
seqüências preferidas acima pelo fato de que possuem adições ou deleções
inconseqüentes nas mesmas.
Os oligonucleotídeos CpG utilizados na presente invenção
5 podem ser sintetizados por qualquer método conhecido na arte (por exemplo
veja EP 468520). Convenientemente, tais oligonucleotídeos podem ser
sintetizados utilizando um sintetizador automático.
O adjuvante pode ser uma emulsão de óleo-em-água ou pode
compreender uma emulsão de óleo-em-água em combinação com outros
10 adjuvantes. A fase oleosa do sistema de emulsão preferivelmente compreende
um óleo metabolizável. O significado do termo óleo metabolizável é bem
conhecido na arte. Metabolizável pode ser definido como "sendo capaz de ser
transformado por metabolismo" (Dorland's Illustrated Medical Dictionary,
W.B. Sanders Company, 25a edição (1974)). O óleo pode ser qualquer óleo
15 vegetal, óleo de peixe, óleo animal ou óleo sintético, que é não tóxico para o
recipiente e é capaz de ser transformado por metabolismo. Nozes, sementes, e
grãos são fontes comuns de óleos vegetais. Óleos sintéticos também são parte
desta invenção e podem incluir óleos comercialmente disponíveis tal como
NEOBEE® e outros. Esqualeno (2,6,10,15,19, 23-Hexametil-2,6,10,14,18,22-
20 tetracosa-hexaeno) é um óleo insaturado que é encontrado em grandes
quantidades em óleo de fígado de tubarão, e em quantidades menores em
azeite de oliva, óleo de germe de trigo, óleo de farelo de arroz, e levedura, e é
um óleo particularmente preferido para uso nesta invenção. Esqualeno é um
óleo metabolizável em virtude do fato de que é um intermediário na
25 biossíntese de colesterol (Merck Index, loa Edição, entrada no.8619).
Tocóis (e.g. vitamina E) também são muito usados em
adjuvantes de emulsões de óleo (EP 0.382.271 B1; US5667784; WO
95/17210). Tocóis utilizados em emulsões de óleo (preferivelmente emulsões
de óleo-em-água) da invenção podem ser formulados como descrito em EP
59
0.382.271 B 1, pelo fato de que tocóis podem ser dispersões de gotículas de
tocol, opcionalmente compreendendo um emulsificador, de preferivelmente
menor do que 1 micrômetro em diâmetro. Alternativamente, os tocóis podem
ser usados em combinação com outro óleo, para formar a fase oleosa de uma
5 emulsão de óleo. Exemplos de emulsões de óleo que podem ser usadas em
combinação com o tocol são aqui descritos, tais como os óleos metabolizáveis
descritos acima.
Tem sido sugerido que os adjuvantes de emulsão de óleo-em-
água são por si úteis como composições adjuvantes (EP 0.399.843B), também
10 combinações de emulsões de óleo-em-água e outros agentes ativos têm sido
descritos como adjuvantes para vacinas (WO 95/17210; WO 98/56414; WO
99/12565; WO 99/11241). Outros adjuvantes de emulsão de óleo têm sido
descritos, tais como emulsões de água-em-óleo (US 5.422.109; EP 0.480.982
B2) e água em óleo em emulsões aquosas (US 5,424,067;EP O 480 981 B).
15 Todos os quais formam os sistemas preferidos de emulsão de óleo (em
particular quando incorporando tocóis) para formar adjuvantes e composições
da presente invenção.
Mais preferivelmente a emulsão de óleo (por exemplo
emulsões de óleo-em-água) adicionalmente compreende um emulsificador tal
20 como TWEEN 80 e/ou um esterol tal como colesterol.
Uma emulsão de óleo preferida (preferivelmente emulsão de
óleo-em-água) compreende um óleo não-tóxico, metabolizável, tal como
esqualano, esqualeno ou um tocoferol tal como alfa-tocoferol (e
preferivelmente ambos esqualeno e alfa-tocoferol) e opcionalmente um
25 emulsificador (ou tensoativo) tal como Tween 80. Um esterol
(preferivelmente colesterol) também pode ser incluído.
O método de produzir emulsões de óleo-em-água é bem
conhecido pelo homem experiente na arte. Comumente, o método
compreende misturar a fase oleosa contendo tocol com um tensoativo tal
60
como uma solução de PBS/TWEEN80Tm, seguido por homogeneização
usando um homogeneizador, estaria claro para um homem experiente na arte
que um método compreendendo passar a mistura duas vezes através de uma
agulha de seringa seria adequado para homogeneizar volumes pequenos de
5 líquido. Igualmente, o processo de emulsificação em microfluidizador
(máquina M1105 Microfluidics, máximo de 50 passagens, por um período de
2 minutos na pressão de entrada máxima de 600 kPa (pressão de saída de
cerca de 85.000 kPa)) poderia ser adaptado pelo homem experiente na arte
para produzir volumes menores ou maiores de emulsão. A adaptação poderia
10 ser realizada por experimentação rotineira compreendendo a medição da
emulsão resultante até que fosse obtida uma preparação com gotículas de óleo
do diâmetro requerido em uma emulsão de óleo-em-água, o óleo e o
emulsificador devem estar em um veículo aquoso. O veículo aquoso pode ser,
por exemplo, solução salina tamponada com fosfato.
15 O tamanho das gotículas de óleo verificado dentro da emulsão
de óleo-em-água estável é preferivelmente menor do que 1 micrômetro, pode
estar dentro da faixa de substancialmente 30-600 nm, preferivelmente
substancialmente ao redor de 30-500 nm em diâmetro, e mais preferivelmente
substancialmente 150-500 nm em diâmetro, e em particular cerca de 150 nm
20 em diâmetro conforme medido por espectroscopia de correlação de fóton.
Com relação a isto, 80% em número das gotículas de óleo devem estar dentro
das faixas preferidas, mais preferivelmente mais do que 90% e muito mais
preferivelmente mais do que 95% em número das gotículas de óleo estão
dentro das faixas de tamanho definidas. As quantidades dos componentes
25 presentes nas emulsões de óleo da presente invenção estão
convencionalmente dentro da faixa de 0,5-20% ou 2 a 10% de óleo (do
volume de dose total), tal como esqualeno; e quando presente, de 2 a 10% de
alfa-tocoferol; e de 0,3 a 3% de tensoativo, tal como monooleato de
polioxietileno-sorbitana. Preferivelmente a razão de óleo (preferivelmente
61
esqualeno): tocol (preferivelmente a-tocoferol) é igual a ou menor do que 1
porque esta proporciona uma emulsão mais estável. Um emulsificador, tal
como Tween80 ou Span 85 também pode estar presente em um nível de cerca
de 1%. Em alguns casos pode ser vantajoso que as vacinas da presente
5 invenção adicionalmente contenham um estabilizador.
Exemplos de sistemas de emulsão preferidos são descritos em
WO 95/17210, WO 99/11241 e WO 99/12565 que descrevem adjuvantes de
emulsão baseados em esqualeno, a-tocoferol, e TWEEN 80, opcionalmente
formulados com os imunoestimulantes QS21 e/ou 3D-MPL. Assim em uma
10 modalidade particularmente preferida da presente invenção, o adjuvante da
invenção pode adicionalmente compreender outros imunoestimulantes, tais
como LPS ou seus derivados, e/ou saponinas. Exemplos de outros
imunoestimulantes são aqui descritos e em "Vaccine Design - The Subunit
and Adjuvant Approach" 1995, Pharmaceutical Biotechnology, Volume 6,
15 Eds. Powell, M.F., e Newman, M.J., Plenum Press, New York e London,
ISBN 0-306-44867-X.
Em um aspecto preferido o adjuvante e as composições
imunogênicas de acordo com a invenção compreendem uma saponina
(preferivelmente QS21) e/ou um derivado de LPS (preferivelmente 3D-MPL)
20 em uma emulsão de óleo descrita acima, opcionalmente com um esterol
(preferivelmente colesterol). Adicionalmente a emulsão de óleo
(preferivelmente a emulsão de óleo-em-água) pode conter span 85 e/ou
lecitina e/ou tricaprilina. Adjuvantes compreendendo uma emulsão de óleo-
em-água, um esterol e uma saponina são descritos em WO 99/12565.
25 Tipicamente para administração humana a saponina
(preferivelmente QS21) e/ou o derivado de LPS (preferivelmente 3D-MPL)
estará presente em uma dose para humano da composição imunogênica dentro
da faixa de 1µg - 200µg, tal como 10-100µg, preferivelmente 10µg - 50µg
por dose. Tipicamente a emulsão de óleo (preferivelmente a emulsão de óleo-
62
em-água) compreenderá de 2 a 10% de óleo metabolizável. Preferivelmente
compreenderá de 2 a 10% de esqualeno, de 2 a 10% de alfa-tocoferol e de 0,3
a 3% (preferivelmente 0,4 - 2%) de emulsificador (preferivelmente tween 80
[monooleato de polioxietileno-sorbitana]). Onde ambos esqualeno e alfa-
5 tocoferol estão presentes, preferivelmente a razão de esqualeno: alfa-tocoferol
é igual a ou menor do que 1 porque esta proporciona uma emulsão mais
estável. Span 85 (trioleato de sorbitana) também pode estar presente em um
nível de 0,5 a 1% nas emulsões usadas na invenção. Em alguns casos pode ser
vantajoso que as composições imunogênicas e vacinas da presente invenção
10 adicionalmente conterão um estabilizador, por exemplo outros
emulsificadores/tensoativos, incluindo ácido caprílico (Merck Index 10th
Edition, entrada no. 1739), dos quais Tricaprilina é particularmente preferida.
Onde esqualeno e uma saponina (preferivelmente QS21) estão
incluídos, é também benéfica a inclusão de um esterol (preferivelmente
15 colesterol) na formulação porque isto permitirá uma redução no nível total de
óleo na emulsão. Isto acarreta um custo reduzido de manufatura, melhoria do
conforto total da vacinação, e também melhorias qualitativas e quantitativas
das respostas imunes resultantes, tal como produção de IFN-y melhorada.
Conseqüentemente, o sistema adjuvante da presente invenção tipicamente
20 compreende uma razão de óleo metabolizável:saponina (p/p) dentro da faixa
de 200:1 a 300:1, também a presente invenção pode ser usada em uma forma
"baixa em óleo" cuja faixa preferida é de 1:1 a 200:1, preferivelmente 20:1 a
100:1, e mais preferivelmente substancialmente 48:1, esta vacina retém as
propriedades adjuvantes benéficas de todos os componentes, com um perfil de
25 reatogenicidade muito reduzida. Conseqüentemente, as modalidades
particularmente preferidas possuem uma razão de esqualeno:QS21 (p/p)
dentro da faixa de 1:1 a 250:1, também uma faixa preferida é 20:1 a 200:1,
preferivelmente 20:1 a 100:1, e mais preferivelmente substancialmente 48:1.
Preferivelmente um esterol (mais preferivelmente colesterol) também está
63
incluído em uma razão de saponina:esterol como aqui descrita.
Os sistemas de emulsão da presente invenção preferivelmente
possuem um tamanho de gotícula de óleo pequeno na faixa submicrométrica.
Mais preferivelmente os tamanhos de gotícula de óleo estarão dentro da faixa
5 de 120 a 750 nm, e mais preferivelmente de 120-600nm em diâmetro.
Uma formulação adjuvante particularmente potente (para
combinação final com AiPO4 nas composições imunogênicas da invenção)
envolve uma saponina (preferivelmente QS21), um derivado de LPS
(preferivelmente 3D-MPL) e uma emulsão de óleo (preferivelmente
10 esqualeno e alfa-tocoferol em uma emulsão de óleo-em-água) como descrito
em WO 95/17210 ou em WO 99/12565 (em particular formulação adjuvante
11 em Exemplo 2, Tabela 1).
Exemplos de um agonista de TLR 2 incluem peptidoglicano ou
lipoproteína. Imidazoquinolinas, tais como Imiquimod e Resiquimod são
15 agonistas de TLR7 conhecidos. RNA de fita única também é um agonista de
TLR conhecido (TLR8 em humanos e TLR7 em camundongos), enquanto que
DNA de fita dupla e poli IC (ácido poliinosínico-policitidílico - um mimético
comercial de RNA virai) são exemplos de agonistas de TLR 3. 3D-MPL é um
exemplo de um agonista de TLR4 enquanto que CPG é um exemplo de um
20 agonista de TLR9.
A composição imunogênica pode compreender um antígeno e
um imunoestimulante adsorvidos sobre um sal de metal. Formulações de
vacina baseadas em alumínio nas quais o antígeno e o imunoestimulante
monofosforil-lipídeo A 3-de-O-acilado (3D-MPL), estão adsorvidos sobre a
25 mesma partícula são descritas em EP 0.576.478 B 1, EP 0.689.454 B 1, e EP
0.633.784 B1. Nestes casos então antígeno é primeiro adsorvido sobre o sal
de alumínio seguido por adsorção do imunoestimulante 3D-NfPL sobre as
mesmas partículas de sal de alumínio. Tais processos primeiro envolvem a
suspensão de 3D-MPL por sonificação em um banho de água até que as
64
partículas alcancem um tamanho de entre 80 e 500 nm. O antígeno é
tipicamente adsorvido sobre sal de alumínio por uma hora na temperatura
ambiente sob agitação. A suspensão de 3DMPL é então adicionada no
antígeno adsorvido e a formulação é incubada na temperatura ambiente por 1
5 hora, e então mantida a 4°C até o uso.
Em outro processo, o imunoestimulante e o antígeno estão
sobre partículas de metal separadas, como descrito em EP 1126876. O
processo melhorado compreende a adsorção de imunoestimulante, sobre uma
partícula de sal metálico, seguida pela adsorção do antígeno sobre outra
10 partícula de sal metálico, seguida pela misturação das partículas metálicas
discretas para formar uma vacina. O adjuvante para uso na presente invenção
pode ser uma composição adjuvante compreendendo um imunoestimulante,
adsorvido sobre uma partícula de sal metálico, caracterizado pelo fato de que
a partícula de sal metálico está substancialmente livre de outro antígeno.
15 Ademais, são proporcionadas vacinas pela presente invenção as quais são
caracterizadas pelo fato de que o imunoestimulante é adsorvido sobre
partículas de sal metálico que estão substancialmente livres de outro antígeno,
e pelo fato de que as partículas de sal metálico que adsorvem o antígeno estão
substancialmente livres de outro imunoestimulante.
20 Conseqüentemente, a presente invenção proporciona uma
formulação adjuvante compreendendo imunoestimulante que tem sido
adsorvido sobre uma partícula de um sal metálico, caracterizada pelo fato de
que a composição está substancialmente livre de outro antígeno. Além disso,
esta formulação adjuvante pode ser uma intermediária que, se um tal
25 adjuvante for usado, é requerida para a manufatura da vacina.
Conseqüentemente é proporcionado um processo para a manufatura de uma
vacina compreendendo misturar uma composição adjuvante que é um ou mais
imunoestimulantes adsorvidos sobre uma partícula de metal com um antígeno.
Preferivelmente, o antígeno tem sido pré-adsorvido sobre uma partícula de
65
metal. O citado sal metálico pode ser idêntico ou similar ao sal metálico que é
adsorvido sobre o imunoestimulante. Preferivelmente o sal de metal é um sal
de alumínio, por exemplo fosfato de alumínio ou hidróxido de alumínio.
A presente invenção adicionalmente proporciona uma
5 composição de vacina compreendendo imunoestimulante adsorvido sobre
uma primeira partícula de um sal metálico, e antígeno adsorvido sobre um sal
metálico, caracterizada pelo fato de que as primeira e segunda partículas de
sal metálico são partículas separadas.
Mutações ou derivados de LOS ou LPS ou derivados de
10 lipídeo A aqui descritos são planejados para serem menos tóxicos (e.g. 3D-
MPL) do que os lipopolissacarídeos nativos e são equivalentes
intercambiáveis com respeito a quaisquer usos destes grupos aqui descritos.
Em uma modalidade o adjuvante usado nas composições da
invenção compreende um veículo lipossomo (preparado por técnicas
15 conhecidas a partir de fosfolipídeos (tal como dioleoil-fosfatidil-colina
[DOPC]) e opcionalmente um esterol [tal como colesterol]). Tais veículos
lipossomo podem trazer derivados de lipídeo A [tal como 3D-MPL - veja
acima] e/ou saponinas (tal como QS21 - veja acima). Em uma modalidade o
adjuvante compreende (por dose de 0,5 mL) 0,1-10mg, 0,2-7, 0,3-5, 0,4-2, ou
20 0,5-1 mg (e,g, 0,4-0,6, 0,9-1,1, 0,5 ou 1 mg) de fosfolipídeo (por exemplo
DOPC), 0,025-2,5, 0,05-1,5, 0,075-0,75, 0,1-0,3, ou 0,125-0,25 mg (e,g, 0,2-
0,3, 0,1-0,15, 0,25 ou 0,125 mg) de esterol (por exemplo colesterol), 5-60, 10-
50, ou 20-30 µg (e,g, 5-15, 40-50, 10, 20, 30, 40 ou 50 µg) de derivado de
lipídeo A (por exemplo 3DMPL), e 5-60, 10-50, ou 20-30 µg (e,g, 5-15, 40-
25 50, 10, 20, 30, 40 ou 50 µg) de saponina (por exemplo QS21).
Em uma modalidade o adjuvante usado nas composições da
invenção compreende uma emulsão de óleo-em-água preparada a partir de um
óleo metabolizável (tal como esqualeno), um emulsificador (tal como Tween
80) e opcionalmente um tocol (tal como alfa-tocoferol). Em uma modalidade
66
o adjuvante compreende (por dose de 0,5 mL) 0,5-15, 1-13, 2-11, 4-8, ou 5-
6mg (e,g, 2-3, 5-6, ou 10-11 mg) de óleo metabolizável (tal como esqualeno),
0,1-10, 0,3-8, 0,6-6, 0,9-5, 1-4, ou 2-3 mg (e,g, 0,9-1,1, 2-3 ou 4-5 mg) de
emulsificador (tal como Tween 80) e opcionalmente 0,5-20, 115, 2-12, 4-10,
5 5-7 mg (e,g, 11-13, 5-6, ou 2-3 mg) de tocol (tal como alfa-tocoferol).
Este adjuvante pode opcionalmente adicionalmente
compreender 5-60, 10-50, ou 20-30 µg (e.g. 5-15, 40-50, 10, 20, 30, 40 ou 50
µg) de derivado de lipídeo A (por exemplo 3D-MPL).
Este adjuvante pode opcionalmente conter 0,025-2,5, 0,05-1,5,
10 0,075-0,75, 0,1-0,3, ou 0,1250,25 mg (e,g, 0,2-0,3, 0,1-0,15, 0,25 ou 0,125
mg) de esterol (por exemplo colesterol), 5-60, 10-50, ou 20-30 µg (e,g, 5-15,
40-50, 10, 20, 30, 40 ou 50 µg) de derivado de lipídeo A (por exemplo 3D-
MPL), e 5-60, 10-50, ou 20-30 µg (e,g, 5-15, 40-50, 10, 20, 30, 40 ou 50 µg)
de saponina (por exemplo QS21).
15 Em uma modalidade o adjuvante usado nas composições da
invenção compreende fosfato de alumínio e um derivado de lipídeo A (tal
como 3D-MPL). Este adjuvante pode compreender (por dose de 0,5 mL) 100-
750, 200-500, ou 300-400 µg Al como fosfato de alumínio, e 5-60, 10-50, ou
20-30 µg (e.g. 5-15, 40-50, 10, 20, 30, 40 ou 50 µg) de derivado de lipídeo A
20 (por exemplo 3D-MPL).
As preparações de vacina da presente invenção podem ser
usadas para proteger ou tratar um mamífero suscetível à infecção, por meio de
administração de citada vacina via rota sistêmica ou mucosal. Estas
administrações podem incluir injeção via as rotas intramuscular,
25 intraperitoneal, intradermal ou subcutânea; ou via administração mucosal nos
tratos oral/alimentar, respiratório, genitourinário. Administração intranasal de
vacinas para o tratamento de pneumonia ou otite média é preferida (porque o
transporte nasofaringeal de pneumococos pode ser mais efetivamente
prevenido, atenuando assim a infecção em seu estágio mais inicial). Embora a
67
vacina da invenção possa ser administrada como uma dose única, os seus
componentes também podem ser co-administrados juntos ao mesmo tempo ou
em tempos diferentes (por exemplo polissacarídeos pneumocócicos poderiam
ser administrados separadamente, ao mesmo tempo ou 1-2 semanas após a
5 administração de qualquer componente de proteína bacteriana da vacina para
coordenação ótima das respostas imunes uma com relação à outra). Para co-
administração, o adjuvante Thl opcional pode estar presente em qualquer
uma ou em todas as administrações diferentes, por exemplo, pode estar
presente em combinação com o componente proteína bacteriana da vacina.
10 Por exemplo, polissacarídeos podem ser administrados IM (ou ID) e proteínas
bacterianas podem ser administradas IN (ou ID). Em adição, as vacinas da
invenção podem ser administradas IM para doses iniciais e IN para doses de
reforço.
A quantidade de antígeno conjugado em cada dose de vacina é
15 selecionada como uma quantidade que induz uma resposta imunoprotetora
sem efeitos colaterais adversos, significativos, em vacinas típicas. Tal
quantidade variará dependendo de qual imunógeno específico é empregado e
como é apresentado. Geralmente, é esperado que cada dose compreenda 0,1-
100 µg de polissacarídeo, tipicamente 0,1-50 µg, 0,1-10µg, 1-10µg ou 1-5µg
20 para conjugados de polissacarídeo.
O conteúdo de antígenos de proteína na vacina estará
tipicamente dentro da faixa de 1-100µg, 550µg ou 5 - 25µg. Após uma
vacinação inicial, os indivíduos podem receber uma ou mais imunizações de
reforço adequadamente espaçadas.
25 Preparação de vacina é geralmente descrita em Vaccine
Design ("The subunit and adjuvant approach" (eds Powell M.F. & Newman
M.J.) (1995) Plenum Press New York). Encapsulação com lipossomos é
descrita por Fullerton, Patente US 4.235.877.
As vacinas da presente invenção podem ser armazenadas em
68
solução ou liofilizadas. Opcionalmente a solução é liofilizada na presença de
um açúcar tal como sacarose, trealose ou lactose. É típico que sejam
liofilizadas e extemporaneamente reconstituídas antes do uso. Liofilização
pode resultar em uma composição (vacina) mais estável.
5 Métodos
A invenção também inclui método de preparação das
composições imunogênicas e vacinas da invenção.
Em uma modalidade, o processo da invenção, é um método
para preparar uma vacina compreendendo as etapas de misturar antígenos
10 para preparar a composição imunogênica da invenção e adicionar um
excipiente farmaceuticamente aceitável.
Métodos de tratamento
A invenção também inclui método de tratamento de infecção
estafilocócica, particularmente de infecções nosocomiais adquiridas em
15 hospital.
Esta composição imunogênica ou vacina da invenção é
particularmente vantajosa em casos de cirurgia eletiva. Tais pacientes saberão
antecipadamente a data da cirurgia e poderão ser inoculados
antecipadamente. Visto que não é sabido se o paciente será exposto à infecção
20 por S. aureus ou S. epidermidis, é preferido inocular com uma vacina da
invenção que protege contra ambas, como descrito acima. Tipicamente
adultos acima de 16 aguardando cirurgia eletiva são tratados com as
composições imunogênicas e vacinas da invenção. Alternativamente crianças
de 3-16 anos de idade aguardando cirurgia eletiva são tratadas com as
25 composições imunogênicas e vacinas da invenção.
Também é possível inocular trabalhadores de cuidado da saúde
com a vacina da invenção.
As preparações de vacina da presente invenção podem ser
usadas para proteger ou tratar um mamífero suscetível à infecção, por meio de
69
administração de citada vacina via rota sistêmica ou mucosal. Estas
administrações podem incluir injeção via as rotas intramuscular,
intraperitoneal, intradermal ou subcutânea; ou via administração aos tratos
oral/alimentar, respiratório, genitourinários.
5 A quantidade de antígeno em cada dose de vacina é
selecionada como uma quantidade que induz uma resposta imunoprotetora
sem efeitos colaterais adversos, significativos em vacinas típicas. Tal
quantidade variará dependendo do imunógeno específico empregado e de
como ele é apresentado. O conteúdo de proteína da vacina tipicamente estará
10 dentro da faixa de 1-100µg, 5-50µg, tipicamente dentro da faixa de 10-25p,g.
Uma quantidade ótima para uma vacina particular pode ser determinada por
estudos padrão envolvendo observação de respostas imunes apropriadas em
indivíduos. Após uma vacinação inicial, indivíduos podem receber uma ou
mais imunizações de reforço adequadamente espaçadas.
15 Embora vacinas da presente invenção possam ser
administradas por qualquer rota, administração das vacinas desejadas para
dentro da pele (ID) forma uma modalidade da presente invenção. Pele
humana compreende uma cutícula externa "córnea", chamada de stratum
corneum, que reveste a epiderme. Sob esta epiderme está uma camada
20 chamada de derme, que por sua vez reveste o tecido subcutâneo.
Pesquisadores têm mostrado que injeção de uma vacina na pele, e em
particular na derme, estimula uma resposta imune, que também pode estar
associada com um número de vantagens adicionais. Vacinação intradermal
com as vacinas aqui descritas forma uma característica opcional da presente
25 invenção.
A técnica convencional de injeção intradermal, o
"procedimento mantoux", compreende etapas de limpar a pele, e então esticar
com uma mão, e com o bisel de uma agulha de calibre estreito (calibre 26-31)
faceando para cima a agulha é inserida em um ângulo entre 10° e 15°. Uma
70
vez o bisel da agulha é inserido, o cilindro da agulha é abaixado e
adicionalmente avançado enquanto proporciona uma ligeira pressão para
elevar a agulha sob a pele. O líquido é então injetado muito lentamente
formando deste modo uma bolha ou um inchaço sob a superficie da pele,
5 seguido por remoção lenta da agulha.
Mais recentemente, dispositivos que são especificamente
projetados para administrar agentes líquidos para dentro ou através da pele
têm sido descritos, por exemplo os dispositivos descritos em WO 99/34850 e
EP 1092444. Também dispositivos de injeção de jato descritos por exemplo
10 em WO 01/13977; US 5.480.381, US 5.599.302, US 5.334.144, US
5.993.412, US 5.649.912, US 5.569.189, US 5.704.911, US 5.383.851, US
5.893.397, US 5.466.220, US 5.339.163, US 5.312.335, US 5.503.627, US
5.064.413, US 5.520. 639, US 4.596.556, US 4.790.824, US 4.941.880, US
4.940.460, WO 97/37705 e WO 97/13537. Métodos alternativos de
15 administração intradermal das preparações de vacina podem incluir seringas e
agulhas convencionais, ou dispositivos projetados para liberação balística de
vacinas sólidas (WO 99/27961), ou emplastros transdermais (WO 97/48440;
WO 98/28037); ou aplicadas sobre a superfície da pele (liberação transdermal
ou transcutânea WO 98/20734 ; WO 98/28037).
20 Quando as vacinas da presente invenção são para serem
administradas à pele, ou mais especificamente para dentro da derme, a vacina
está em um volume de líquido pequeno, particularmente um volume de entre
cerca de 0,05 mL e 0,2 mL.
O conteúdo de antígenos nas vacinas intradermais ou de pele
25 da presente invenção pode ser similar às doses convencionais como
encontradas em vacinas intramusculares (veja acima). Contudo, é uma
característica das vacinas intradermais ou de pele que as formulações podem
ser de "dose baixa". Conseqüentemente os antígenos de proteína em vacinas
de "dose baixa" estão opcionalmente presentes em tão pouco quanto 0,1 a 10
71
µg, opcionalmente 0,1 a 5 µg por dose; e os antígenos de polissacarídeo
(opcionalmente conjugado) podem estar presentes dentro da faixa de 0,01-
1µg, e opcionalmente entre 0,01 e 0,5 µg de polissacarídeo por dose.
Como aqui usado, o termo "liberação intradermal" significa a
5 liberação de vacina para a região da derme na pele. Contudo, a vacina não
necessariamente estará localizada exclusivamente na derme. A derme é a
camada na pele localizada entre cerca de 1,0 e cerca de 2,0 mm da superfície
na pele humana, mas há uma certa quantidade de variação entre indivíduos e
em partes diferentes do corpo. Em geral, pode ser esperado alcançar a derme
10 indo-se 1,5 mm abaixo da superfície da pele. A derme está localizada entre o
stratum corneum e a epiderme na superfície e a camada subcutânea abaixo.
Dependendo do modo de liberação, a vacina pode finalmente
estar localizada apenas ou primariamente dentro da derme, ou pode ser
finalmente distribuída dentro da epiderme e a derme.
15 Uma modalidade da invenção é um método de prevenção ou
de tratamento de infecção ou doença estafilocepa estafilocócica
compreendendo a etapa de administrar uma composição imunogênica ou
vacina da invenção a um paciente em necessidade da mesma.
Uma outra modalidade da invenção é um uso da composição
20 imunogênica da invenção na manufatura de uma vacina para o tratamento ou
a prevenção de doença ou infecção estafilocócica, opcionalmente de infecção
estafilocócica após cirurgia.
O termo 'infecção estafilocócica' inclui infecção causada por S.
aureus e/ou S. epidermidis e outras cepas estafilocócicas capazes de causarem
25 infecção em um hospedeiro mamífero, opcionalmente hospedeiro humano.
Os termos "compreendendo", "compreendem" e "compreende"
aqui são intencionados pelos inventores para serem opcionalmente
substituíveis pelos termos "consistindo de", "consistem de" e "consiste de",
respectivamente, em cada caso.
72
Todas as referências ou pedidos de patente citados dentro deste
relatório descritivo de patente são aqui incorporadas como referências.
Com o propósito de que esta invenção possa ser melhor
entendida, os seguintes exemplos são mostrados. Estes exemplos são apenas
5 para propósitos de ilustração, e não são para serem entendidos de nenhum
modo como limitantes do escopo da invenção.
Exemplos
Exemplo 1 Construção de plasmídeo para expressar
proteínas recombinantes
10 A: Clonagem.
Sítios de restrição apropriados engenhados em
oligonucleotídeos específicos para o gene estafilocepa estafilocócica
permitiram clonagem direcional do produto de PCR no plasmídeo pET24d ou
pQE-30 de expressão em E. coli de tal modo que uma proteína pudesse ser
15 expressada como uma proteína de fusão contendo um marcador de
cromatografia de afinidade (His)6 na terminação-N ou -C.
Os iniciadores usados foram:
Alfa-toxina - 5'-CGCGGATCCGCAGATTCTGATATTAATATTAA
AAC-3' e
5' CCCAAGCTTTTAATTTGTCATTTCTTCTTTTTC-3'
EbpS - 5'-CGCGGATCCGCTGGGTCTAATAATTTTAAAGATG-3' e
5'CCCAAG CTTTTATG GAATAACGATTTGTTG-3'
CTfA - 5'-CGCGGATCCAGTGAAAATAGTGTTACGCAATC-3, e
5'C C CAAG CTTTTACTCTG GAATTG GTTCAATTTC-3'
FnbpA - 5'-CGCGGATCCACACAAACAACTGCAACTAACG-3' e
5'CCCAAGCTTTTATG CTTTGTGATTCTTTTTCAAAC3'
Sbi - 5'-CGCGGATCCAACACGCAACAAACTTC-3' e
5' G GAACTG CAGTTATTTC CAGAATGATAATAAATTAC-3'
SdrC - 5'-CGCGGATCCGCAGAACATACGAATGGAG-3' e
73
5'CCCAAGCTTTTATGTTTCTTCTTCGTAGTAGC-3'
SdrG - 5'-CGCGGATCCGAGGAGAATTCAGTACAAG-3' e
5' CC CAAG CTTTTATTCGTCATCATAGTATC CG-3'
Ebh - 5'-AAAAGTACTCACCACCACCACCACC-3' e
5 ,AAAAGTACTCACTTGATTCATCGCTTCAG-3 '
Aaa - 5'-GCGCGCCATGGCACAAGCTTCTACACAACATAC-3' e
5'G C G CG CTCGAGATG GATGAATG CATAG CTAGA-3,
IsaA - 5'-CATCCATGGCACCATCACCATCACCACGAAGTAAAC
GTTGATCAAGC-3' e
5'-AGCACTCGAGTTAGAATCCCCAAGCACCTAAACC-3'
HarA - 5'-GCACCCATGGCAGAAAATACAAATACTTC-3' e
5'TTTTCTCGAGCATTTTAGATTGACTAAGTTG-3'
Autolisina glicosaminidase - 5'-CAAGTCCCATGGCTGAGACGAC
ACAAGATCAAC-3' e
5 '-CAGTCTCGAGTTTTACAGC TGTTTTTGGTTG-3 '
Autolisina amidase - 5'-AGCTCATATGGCTTATACTGTTACTAA
ACC-3' e
5'GCGCCTCGAGTTTATATTGTGGGATGTCG-3'
IsdA - 5'-CAAGTCCCATGGCAACAGAAGCTACGAACGCAAC-3' e
5'ACCAGTCTCGAGTAATTCTTTAG CTTTAGAG CTTG-3'
IsdB - 5'-TATTCTCGAGGCTTTGAGTGTGTCCATCATTTG-3' e
5'-GAAG C CAT G G CAG CAG CTGAAGAAACAG GT G G-3'
MRPII - 5'-GATTACACCATGGTTAAACCTCAAGCGAAA-3' e
5 'AGGTGTC TCGAGTGCGATTGTAGCTTCATT-3 '
Os produtos de PCR foram primeiro introduzidos no vetor de
clonagem pGEM-T (Novagen) usando células bacterianas Top10, de acordo
com as instruções do fabricante. Este construto intermediário foi preparado
para facilitar clonagem adicional em um vetor de expressão. Transformantes
5 contendo o inserto de DNA foram selecionados por análise com enzima de
74
restrição. Após digestão, uma alíquota de —20 µI, da reação foi analisada por
eletroforese em gel de agarose (0,8 % de agarose em um tampão Tris-acetato-
EDTA (TAE)). Fragmentos de DNA foram visualizados por iluminação UV
após eletroforese em gel e coloração com brometo de etídio. Um padrão de
5 tamanho molecular de DNA (escada de 1 kb, Life Technologies) foi
submetido à eletroforese em paralelo com as amostras de teste e foi usado
para estimar o tamanho dos fragmentos de DNA. Plasmídeo purificado dos
transformantes selecionados para cada clonagem foi então seqüencialmente
digerido até completitude com enzimas de restrição apropriadas como
10 recomendado pelo fabricante (Life Technologies). O fragmento de DNA
digerido foi então purificado usando colunas spin baseadas em gel de sílica
antes da ligação com o plasmídeo pET24d ou pQE-30. Clonagem de Ebh
(fragmento H2), AaA, IsdA, IsdB, HarA, Atl-amidase, Atl-glicosamina,
MRPII, IsaA foi realizada usando o plasmídeo pET24d e clonagem de CTfA,
15 SdrC, SdrE, FnbpA, SdrG/Fbe, alfa-toxina e Sbi foi realizada usando o
plasmídeo pQE-30.
B: Produção de vetor de expressão.
Para preparar o plasmídeo de expressão pET24d ou pQE-30
para ligação, ele foi similarmente digerido até a completitude com enzimas de
20 restrição apropriadas. Um excesso molar de aproximadamente 5 vezes dos
fragmentos digeridos em relação ao vetor preparado foi usado para programar
a reação de ligação. Uma reação de ligação padrão de —20 iit (-16°C, —16
horas), usando métodos bem conhecidos na arte, foi realizada usando T4
DNA ligase (-2,0 unidades/reação, Life Technologies). Uma alíquota da
25 ligação (-5 p.L) foi usada para transformar células eletro-competentes
M15(pREP4) ou BT21::DE3 de acordo com métodos bem conhecidos na arte.
Após um período de desenvolvimento de —2-3 horas a 37°C em —1,0 mL de
caldo LB, as células transformadas foram plaqueadas sobre placas de ágar LB
contendo ampicilina (100 µg/mL) e/ou canamicina (30µg/mL). Anticorpos
75
foram incluídos na seleção. Placas foram incubadas durante a noite a 37°C
por —16 horas. Colônias individuais ApR/KanR foram selecionadas com
palitos e usadas para "patch" inocular placas frescas LB ApR/KanR bem
como uma cultura de caldo LB Ap/Kan de —1,0 mL. Ambas as placas patch e
5 a cultura de caldo foram incubadas durante a noite a 37°C em uma incubadora
padrão (de placas) ou em um banho de água agitado. Uma análise de PCR
baseada em célula inteira foi empregada para verificar que transformantes
continham o inserto de DNA. Aqui, a cultura de caldo LB Ap/Kan de —1,0
mL noturna foi transferida para um tubo de polipropileno de 1,5 mL e as
10 células foram colhidas por centrifugação em uma microcentrífuga Beckmann
(-3 min., temperatura ambiente, —12.000 X g). A pelota celular foi suspensa
em —200 µL de água estéril, e uma alíquota de —10 µL foi usada para
programar uma reação PCR de volume final de —50 µL contendo os
iniciadores de amplificação tanto diretos quanto inversos. A etapa de
15 desnaturação inicial a 95°C foi aumentada para 3 minutos para garantir
rompimento térmico das células bacterianas e liberação de DNA plasmídeo.
Um ciclador térmico ABI Model 9700 e um perfil de amplificação térmica de
três etapas, de 32 ciclos, i.e. 95°C, 45 s; 55-58°C, 45 s, 72°C, 1 min., foram
usados para amplificar o fragmento BASB203 das amostras de transformante
20 lisado. Após amplificação térmica, uma alíquota de —' 20 µL da reação foi
analisada por eletroforese em gel de agarose (0,8 % de agarose em um tampão
Tris-acetato-EDTA (TAE)). Fragmentos de DNA foram visualizados por
iluminação UV após eletroforese em gel e coloração com brometo de etídio
Um padrão de tamanho molecular de DNA (escada de 1 kb, Life
25 Technologies) foi submetido à eletroforese em paralelo com as amostras de
teste e foi usado para estimar o tamanho dos produtos de PCR.
Transformantes que produziram o produto de PCR de tamanho esperado
foram identificados como cepas contendo um construto de expressão de
proteína. Cepas contendo plasmídeo de expressão foram então analisadas para
76
a expressão induzível de proteína recombinante.
C: Análise de expressão de transformantes positivos para PCR.
Uma alíquota da cultura de semente noturna (-1,0 mL) foi
inoculada em um frasco Erlenmeyer de 125 mL contendo —25 mL de caldo
5 LB Ap/Kan e foi crescida a 37°C com agitação (-250 rpm) até que a
turbidez da cultura alcançasse 0.D.600 de —0,5, i.e. fase mid-log
(normalmente cerca de 1,5 - 2,0 horas). Neste momento aproximadamente
metade da cultura (-12,5 mL) foi transferido para um segundo frasco de
125 mL e expressão de proteína recombinante foi induzida pela adição de
10 IPTG (solução de estoque 1,0 M preparada em água estéril, Sigma) para
uma concentração final de 1,0 mM. Incubação de ambas culturas não-
induzidas e induzidas por IPTG continuou por um adicional de —4 horas a
37°C com agitação. Amostras (-1,0 mL) de ambas as culturas não-induzida
e induzida foram removidas após o período de indução e as células foram
15 coletadas por centrifugação em uma microcentrífuga na temperatura
ambiente por —3 minutos. Pelotas celulares individuais foram suspensas em
—50 µL de água estéril, então misturadas com um volume igual de tampão
de amostra 2X Laemelli SDS-PAGE contendo 2-mercapto-etanol, e
deixadas em banho de água fervente por —3 min para desnaturar a proteína.
20 Volumes iguais (15µL) de ambos os lisados celulares brutos induzidos
por IPTG e não-induzidos foram carregados em duplicada sobre gel de
poliacrilamida glicerina/Tris 12% (espessura de 1 mm Mini-gels, Novex).
As amostras de lisado induzido e não-induzido foram submetidas à
eletroforese juntas com marcadores de peso molecular pré-corados
25 (SeeBlue, Novex) sob condições convencionais usando um tampão de
corrida padrão de SDS/Tris/glicina(BioRad). Após eletroforese, um gel foi
corado com azul brilhante coommassie R250 (BioRad) e então descorada
para visualizar a(s) proteína(s) nova(as) induzível(eis) por IPTG. O
segundo gel foi electroblotted sobre membrana de PVDF (tamanho de poro
77
de 0,45 micrômetro, Novex) por —2 horas a 4°C usando uma aparelhagem
de blotting BioRad Mini-Protean II e tampão de transferência de metanol
de Towbin (20 %). Bloqueio da membrana e incubações de anticorpo foram
realizados de acordo com métodos bem conhecidos na arte. Um anticorpo
5 monoclonal anti-RGS (His)3, seguido por um segundo anticorpo de coelho
anti-camundongo conjugado em HRP (QiaGen), foram usados para
confirmar a expressão e a identidade da proteína recombinante.
Visualização do padrão reativo de anticorpo anti-His foi realizada quer
usando um substrato insolúvel ABT quer usando um Hyperfilm com o
10 sistema quimioluminescente Amersham ECL.
Exemplo 2 Produção de proteína recombinante
Cepa bacteriana
Uma cepa de expressão recombinante de E. coli M15(pREP4)
contendo um plasmídeo (pQE30) ou BL21::DE3 contendo plasmídeo pET24d
15 codificador de proteína estafilocócica foi usada para produzir massa celular
para purificação de proteína recombinante.
Meio
O meio de fermentação usado para a produção de proteína
recombinante consistiu de caldo 2X YT (Difco) contendo 100µg/mL de Ap
20 e/ou 30 pg/mL de Km. Antiespumante foi adicionado no meio para o
fermentador a 0,25 mL/L (Antifoam 204, Sigma). Para induzir expressão da
proteína recombinante, IPTG (Isopropil-(3-D-Tiogalactopiranosídeo) foi
adicionado no fermentador (1 mM, final).
Produção de proteínas recombinantes
25 Sob condições nativas
IPTG foi adicionado em uma concentração final de 1 mM e a
cultura foi crescida por 4 horas adicionais. A cultura foi então centrifugada a
6.000 rpm por 10 minutos e a pelota foi ressuspensa em tampão fosfato
(KH2PO4, K2HPO4 50 mM, pH 7) incluindo um coquetel de inibidor de
78
protease. Esta amostra foi submetida à lise de pressão francesa usando pressão
de 150.000 kPa (2 corridas). Após centrifugação por 30 minutos a 15.000
rpm, o sobrenadante foi reservado para purificação adicional e NaCl foi
adicionado para 0,5 M. A amostra foi então carregada em uma resina Ni-
5 NTA (coluna XK 16 Pharmacia, resina Ni-NTA Qiagen) condicionada em
KH2PO4, K2HPO4 50 mM, pH 7. Após carregamento da amostra, a coluna foi
lavada com Tampão A (NaH2PO4 0,2 M pH7, NaCl 0,3 M, glicerol 10%).
Para eluir a proteína ligada, uma gradiente escalonado foi usado no qual
proporções diferentes de tampão B (NaH2PO4 0,2 M pH7, NaCl 0,3 M,
10 glicerol 10% e imidazol 200 mM) foram adicionadas no tampão A. A
proporção de tampão B foi gradualmente aumentada de 10% para 100%.
Após purificação, a fração eluída contendo a proteína foi reunida, concentrada
e dialisada contra KH2PO4/K2HPO4 0,002 M pH7, NaCl 0,15 M.
Este método foi usado para purificar CTfA, SdrG, IsdA, IsaB,
15 HarA, Atl-glicosamina e alfa-toxina.
Sob condições desnaturantes
IPTG foi adicionado para uma concentração final de 1 mM e a
cultura foi crescida por 4 horas adicionais. A cultura foi então centrifugada a
6.000 rpm por 10 minutos e a pelota foi ressuspensa em tampão fosfato
20 (K2HPO4, KH2PO4 50 mM pH 7) incluindo um coquetel de inibidor de
protease. Esta amostra foi submetida à lise de pressão francesa usando pressão
de 150.000 kPa (2 corridas). Após centrifugação por 30 minutos a 15.000
rpm, a pelota foi lavada com tampão fosfato incluindo uréia 1 M. A amostra
foi centrifugada por 30 min a 15.000 rpm e a pelota foi ressuspensa em uréia
25 8 M, NaH2PO4 0,1 M, NaC1 0,5M, Tris-HC1 0,01 M pH 8 e mantida durante a
noite na temperatura ambiente. A amostra foi centrifugada por 20 minutos a
15.000 rpm e o sobrenadante foi coletado para purificação adicional. A
amostra foi então carregada em uma resina Ni-NTA (coluna XK 16
Pharmacia, resina Ni-NTA Qiagen) condicionada em uréia 8 M, NaH2PO4 0,1
79
M, NaC1 0,5 M, Tris-HC1 0,01 M pH 8. Após passagem do fluxo, a coluna foi
lavada sucessivamente com tampão A (uréia 8 M, NaH2PO4 0,1 M, NaCl 0,5
M, Tris 0,01 M, pH 8.0), tampão C (uréia 8 M, NaH2PO4 0,1 M, 0.5M NaCl,
Tris 0,01 M, pH 6,3), tampão D (uréia 8 M, NaH2PO4 0,1 M, NaC1 0,5 M,
5 Tris 0,01 M, pH 5.9) e tampão E (uréia 8 M, NaH2PO4 0,1 M, NaCl 0,5 M,
Tris 0,01 M, pH 4.5). A proteína recombinante foi eluída da coluna durante as
lavagens com tampão D e E. A proteína recombinante desnaturada pôde ser
solubilizada em solução destituída de uréia. Para este propósito, a proteína
desnaturada contida em uréia 8 M foi sucessivamente dialisada contra uréia 4
10 M, Na2PO4 0,1 M, Tris-HC1 0,01 M, pH 7,1, uréia 2 M, NaH2PO4 0,1 M, Tris-
HC1 0,01 M, pH 7,1, arginina 0,5 Me KH2PO4/K2HPO4 0,002 M pH7,1, NaC1
0,15 M, arginina 0,5 M.
Este método foi usado para purificar Ebh (fragmento H2),
AaA, SdrC, FnbpA, Sbi, Atl-amidase e IsaA.
15 As proteínas purificadas foram dialisadas por SDS-PAGE. Os
resultados de uma proteína purificada sob condições nativas (alfa-toxina) e de
uma proteína purificada sob condições desnaturantes (SdrC) são mostrados
em Figuras 3 e 4.
Exemplo 3 Preparação de conjugados de polisssacarídeo
20 capsular de S. aureus usando CDAP
Química de ativação e copulação para PS8 nativo usando
CDAP:
SA08-TT004
Ativação e copulação foram realizadas na temperatura
25 ambiente sob agitação contínua. 10 mg de polissacarídeo nativo foram
dissolvidos para obter uma concentração de PS final de 2,5 mg/mL em NaC1
0,2 M. A solução foi então ajustada para pH 6,0+/-0,2 antes da etapa de
ativação.
No tempo 0, 50 jat de uma solução de CDAP (100 mg/mL
80
recém-preparado em acetonitrila /WFI, 50/50) foram adicionados
manualmente para alcançar uma razão apropriada de CDAP/PS (0,5/1).
Após 1,5 minutos o pH foi elevado para pH 9,00+/-0,05 por
adição de NaOH 0,5 M.
5 Adição de NaOH demora cerca de 1 minutos e pH é
estabelecido em pH 9,00+/-0,05 até adição de veículo.
No tempo de 4,5 minutos, 1,5 mL de TT (10 mg/mL em NaC1
0,2 M) foram adicionados para alcançar a razão apropriada de Proteína /PS
(1,5/1); pH foi imediatamente ajustado para pH de copulação de 9,00+/0,05.
10 A solução é deixada por uma hora sob regulação de pH manual.
Após a etapa de copulação, 0,5 mL de glicina 2 M (razão
gly/PS (p/p): 7,5/1) foi adicionado; pH foi imediatamente ajustado para
9,00+/-0,05. A solução foi deixada por 30 minutos sob regulação de pH
manual. Então o conjugado foi clarificado usando um filtro Minisart de 5µm
15 e injetado em Sephacryl S400HR (XK16/100). A vazão de fluxo foi fixada
em 30 mL/h, usando NaC1 150 mIVI.
As frações de eluição foram analisadas por resorcina e por
OCA. Frações de interesse foram reunidas e filtradas sobre Sterivex 0,22 pm.
O conjugado resultante teve uma razão deTT/PS (p/p) final de
20 1,05 como avaliado pelos ensaios de resorcinol e de Lowry.
Exemplo 4 Preparação de conjugados de polissacarídeo
capsular de S. aureus usando CDAP em polissacarídeos de tamanho
ajustado
Química de ativação e copulação para PS8 de tamanho
25 ajustado usando CDAP
PS é pesado tendo por base conteúdo de umidade teórico de
10%. 2 g de PS úmido, nativo foram dissolvidos durante a noite em WFI em
uma concentração inicial de 10 mg/mL. Antes do ajuste de tamanho, a
solução de PS nativo foi clarificada em um filtro de corte de 5 gm.
81
Uma aparelhagem homogeneizadora EMLILSIFLEX C-50, na
qual a célula de homogeneização foi substituída por uma câmara de interação
Microfluidics F20Y-0.75µm, foi usada para reduzir o peso molecular e a
viscosidade do polissacarídeo antes da etapa de ativação.
5 A redução de tamanho foi realizada a 68.948 kPa durante os
10 primeiros ciclos e então a 103.421 kPa para os 60 ciclos seguintes. O
progresso da redução de tamanho foi seguido em processo pela medição da
viscosidade. O ajuste de tamanho foi interrompido após 70 ciclos quando o
alvo de 2,74 ± 0,2 mPa.s foi alcançado.
10 Ativação e copulação foram realizadas na temperatura
ambiente sob agitação contínua.
50 mg de polissacarídeo 8 de tamanho ajustado foram diluídos
para obter uma concentração final de PS de 5 mg/mL em NaCl 0,2 M.
No tempo 0, 375 µL de uma solução de CDAP (100 mg/mL
15 recém-preparada em acetonitrila/WFI, 50/50) foram adicionados
manualmente para alcançar a razão apropriada de CDAP/PS (0,75/1).
Após 1 minuto o pH foi elevado para pH 9,00+/-0,05 pela
adição de NaOH 0,5 M.
No tempo 2,5 minutos, 10 mL de TT a 10 mg/mL em NaC1 0,2
20 M NaCl foram adicionados para alcançar a razão apropriada de Proteína/PS
(2/1); pH foi imediatamente ajustado para pH de copulação de 9,00+/0,05. A
solução foi deixada por 55 minutos sob regulação de pH manual.
Após etapa de copulação, 2,5 mL de glicina 2 M (razão de
gly/PS (p/p): 7,5/1) foram adicionados; pH foi imediatamente ajustado para
25 9,00+/-0,05 pelo regulador. A solução foi deixada por 30 minutos sob
regulação de pH manual.
Então o conjugado foi clarificado usando um filtro Minisart de
5 µm e injetado em Sephacryl S400HR (XK26/100). A vazão de fluxo foi
fixada em 60 mL/h.
82
As frações de eluição foram analisadas por resorcinol e por
dosagem de proteína. Frações de interesse foram reunidas e filtradas em
Millipack200 de 0,22 µm.
O conjugado resultante possui uma razão final de TT/PS de
5 1,94.
Exemplo 5 Preparação de conjugados de polissacarídeo
capsular de S. aureus usando EDAC
Química de ativação e copulação usando EDAC:
Conjugado de polissacarídeo capsular de tipo 8 - TT de S.
10 aureu:
Derivação de PS
Ativação e copulação foram realizadas em temperatura
ambiente sob agitação contínua.
30 mg de polissacarídeo nativo foram diluídos para obter uma
15 concentração final de polissacarídeo de 5 mg/mL em água. A solução foi
ajustada para pH 4,5-5,0 com HCl 0,5 N e então 66 µg de ADH foram
adicionados (2,2 mg/mg PS). Após dissolução completa, 60 mg de EDAC
foram adicionados (2 mg/mg PS). Após 70 min o pH foi elevado para pH 7,5
com NaOH 1 N para interromper a reação. ADH livre foi removido por
20 purificação em Sephacryl S 1 00HR (XI( 16/40). A vazão de fluxo foi fixada
em 60 mL/h usando NaC1 0,2 M como tampão de eluição. Uma redução de
tamanho foi feita por sonificação de 15 min permitindo uma filtração em filtro
millex (0,22 µm).
Copulação
25 Toxóide de tétano foi adicionado em 5 a 10 mg de
polissacarídeo derivado em NaC1 0,2 M e o pH foi ajustado para pH 5,0 ou
pH 6,0 pela adição de HC1 0,5 N. EDAC foi dissolvido em tampão Tris 0,1 M
pH 7,5 e então adicionado durante um período de 10 min (1/5 vol cada 2
min). De acordo com as condições usadas (veja Tabela 6), a reação foi
83
interrompida após entre 30 e 180 minutos pela adição de Tris-HC11M de pH
7,5. Antes da purificação em Sephacryl S400HR, o conjugado foi clarificado
usando um filtro Minisart 5 µm . Alternativamente, o conjugado foi
clarificado por uma etapa de sonificação de 5 minutos. O conjugado foi então
5 injetado em Sephacryl S400HR (X1(16/100). A vazão de fluxo foi fixada em
30 mL/h usando NaCl 150 mM como tampão de eluição. A combinação de
eluição foi selecionada baseando-se em perfis de resorcinol e 1113CA (que
medem dosagem de polissacarídeo e de proteína respectivamente). O
conjugado foi filtrado em uma membrana de esterilização de 0,22 p.m
10 (Millipack 20) a 10 mL/min.
Tabela 5Conjugado Tempo de
copulação[PS (AH)](mg/mL)
[TT (AH)](mg/mL)
[reagente MAC](mg,/mg PS)
SA08-TT011 40 min 3,58 6,45 0,5/15A08-TT015* 180 min 2 4,0 0,25/15A08-TT017 30 min 3,75 7,5 0,25/15A08-TT018 50 min 3,75 7,5 0,10/1
Tabela 5: copulação feita em pH 6,0
Os conjugados resultantes possuem as seguintes características
mostradas em Tabela 6:
Tabela 6Conjugado razão inicial de
TT/PS (p/p)razão final deTT/PS (p/p)
Rendimento derecuperação de
PS (%)
Rendimento nafiltração (%)
5A08-TT011 2/1 2,43/1 48 995A08-TT015 2/1 2,40/1 53 1045A08-TT017 2/1 2,41/1 44 107SA08-TT018 2/1 2,40/1 42 106
15 Polissacarídeo de tipo 8 de S. aureus também foi tratado por
microfluidização antes de derivação com ADH
Derivação de PS
Ativação e copulação foram realizadas em temperatura
ambiente sob agitação contínua.
20 200 mg de polissacarídeo de tamanho ajustado são diluídos
para obter uma concentração final de PS de 10 mg/mL em água. Então 440
84
mg de ADH foram adicionados (2,2 mg/mg PS). A solução foi ajustada
para pH 4,7 com HC1 1 N antes da adição de 400 mg de EDAC (2 mg/mg
PS). Após 60 min o pH foi elevado para pH 7,5 com NaOH 5 M
para interromper a reação. A mistura foi concentrada em Amicon Ultra
5 (corte de 10.000 MWCO). Antes da purificação em Sephacryl S200HR
(X1(16/100), o conjugado foi clarificado usando um filtro Minisart de 5 pm.
A vazão de fluxo foi fixada em 30 mL/h usando NaC1 0,150 M como tampão
de eluição.
Copulação
10 100 mg de TT foram adicionados em 50 mg de polissacarídeo
derivado em NaCl 0,2 Ml. O pH foi ajustado para pH 5,0 ± 0,02 pela adição
de HC1 0,3 N. EDAC foi dissolvido em tampão Tris 0,1M de pH 7,5 e então
adicionado durante um período de 10 min (1/10 vol cada minuto). De acordo
com as condições usadas (veja Tabela 8), a reação foi interrompida após entre
15 30 e 180 minutos pela adição de Tris-HC1 1 M pH 7,5. Antes da purificação
em Sephacryl S400HR, o conjugado foi clarificado usando um filtro Minisart
de 5 1.1m . O conjugado foi então injetado em Sephacryl S400HR
(XK50/100). A vazão de fluxo foi fixada em 60 mL/h usando NaCl 150 mNI
como tampão de eluição. A combinação de eluição foi selecionada
20 tendo por base perfis de resorcinol e pBCA (que medem a dosagem de
polissacarídeo e de proteína respectivamente). Então, o conjugado foi
filtrado em uma membrana de esterilização de 0,22 pm (Millipack 20)
a 10 mL/min.
Tabela 7Conjugado Tempo de
copulação[PS-AH](mg/mL)
[TT] (mg/mL) [EDAC] (mg/mg PS)
5A08-TT045 65 min 3,83 7,66 0,1SA08-TT046 45 min 3,75 7,5 0,25A08-TT047 30 min 5,0 15,0 0,25A08-TT048 120 min 5,0 10,0 0,055A08-TT049* 50 min 5,0 10,0 0,1
* EDAC adicionado em "uma vez"
25
85
Tabela 8Conjugado Razão inicial de
TT/PS (p/p)Razão final deTT/PS (p/p)
Rendimento derecuperação de
PS (%)
Rendimento nafiltração (%)
SA08-TT045 2/1 2,20/1 57 1015A08-TT046 2/1 2,80/1SA08-TT047 3/1 Não purificado
por gel- -
5A08-TT048 2/1 3,35 30 1015A08-TT049 2/1 3,5 24 106
Exemplo 6 Preparação de conjugados de polissacarídeo
capsular de S. aureus Capsular usando EDAC em polissacarídeo 8 de S.
aureus de-O-acetilado
5 De-O-acetilação
NaOH 0,1 N foi adicionado em 16 mL de PS de
tamanho ajustado (10 mg/mL) para obter uma concentração final de
PS de 9 mg/mL e uma concentração final de NaOH de 0,1 N. Após um
tratamento de 1 ou 2 h a 37°C, o PS teve um nível de 0-acetilação de 35 e
10 12% (dosagem de Hestrin) respectivamente em comparação com o PS não
tratado.
NaOH 0,1 N foi adicionado em 19 mL de PS de
tamanho ajustado (10 mg/mL) para obter uma concentração final de PS
de 9,5 mg/mL e uma concentração final de NaOH de 0,05 N. Após um
15 tratamento de 1 ou 2 h a 37°C, PS teve um nível de 0-acetilação de 78
e 58% (dosagem de Hestrin) respectivamente em comparação com o PS não
tratado.
A etapa de derivação foi realizada como mostrado previamente
para um PS não tratado.
20 Tabela 9Conjugado Nível de 0-acetila ADH/PS p/p*5A08-TT056 35 9,35A08-TT057 12 13,1SA08-TT058 78 5,35A08-TT059 58 8,2
* ensaio TNBS
86
Remoção dos grupos 0-acetila resultou em uma
disponibilidade aumentada de grupos carboxílico reativos. De fato, o nível de
derivação de um PS possuindo apenas 12% de grupos 0-acetila foi ± 2,5-
vezes superior ao daquele possuindo 78% de grupos 0-acetila.
5 Copulação foi realizada como mostrado previamente para um
PS não tratado.
Tabela 10Conjugado Nível de O-
acetilaTempo decopulação
[PS-AH](mg/mL)
[TT](mg/mL)
[MAC](mg/mg PS)
SA08-TT056 35 45 min 2,87 5,74 0,55A08-TT057 12 30 min 2,62 5,24 0,55A08-TT058 78 50 min 3,16 6,32 0,55A08-TT059 58 40 min 2,53 5 0,5
Tabela 11Conjugado Razão inicial
de TT/PS (p/p)Razão final deTT/PS (p/p)
Rendimento derecuperação de PS
(%)
Rendimento nafiltração (%)
SA08-TT056 2/1 1,70/1 51,3 100SA08-TT057 2/1 1,78/1 63,0 105,45A08-TT058 2/1 2,08/1 46,3 99,65A08-TT059 2/1 1,86/1 50,8 99,2
Exemplo 7 Conjugação de dPNAG
10 Ativação e copulação de dPNAG:
Conjugados de dPNAG-TT
Os seguintes conjugados foram produzidos usando as
abordagens descritas aqui abaixo:
dPNAG-TT010: dPNAG-S-GMBS + DTT tratado TT-LC-SPDP
dPNAG-TT011: dPNAG-S-GMBS + DTT tratado TT-LC-SPDP
dPNAG-TT012: dPNAG-S-GMBS + DTT tratado TT-SPDP
dPNAG-TT014: dPNAG-SPDP + DTT tratado TT-SPDP
dPNAG-TT017:DTT tratado dPNAG-SPDP + TT-LC-SPDP
dPNAG-TT019: dPNAG-S-GMBS + DTT tratado TT-SPDP
dPNAG-TT020: dPNAG-S-GMBS +DTT tratado TT-SPDP
dPNAG
15 1 g de PNAG foi dissolvido em HC1 5 N em uma concentração
87
de 20mg/mL e foi incubado por 1 hora. Foi então neutralizado com NaOH 5
N. A solução foi clarificada em uma membrana de 5µm e purificada em
Sephacryl S400HR. Frações de interesse, correspondendo ao "tamanho
molecular médio" (veja, Infection e Immunity, 70: 4433-4440 (2002)), foram
5 reunidas e concentradas antes do tratamento de de-N-acetilação.
A solução foi ajustada em NaOH 1 M e deixada 24 horas a
37°C. Após neutralização, o produto foi submetido à diálise e concentração.
Ativação de dPNAG
S-GMBS (N-(y-Maleimido-butiriloxi)-sulfo-succimida, Pierce)
10 foi adicionada em dPNAG em NaCl 0,2 M (razão de S-GMBS/PS (p/p):1/1) e
incubado 2h na temperatura ambiente em pH 7,0 (regulação de pH usando
NaOH 1 M). GMBS em excesso e subprodutos foram removidos por
purificação em Toyopearl HW-40F usando PBS, EDTA 10 mM, NaC150 mM
pH 7,2 como tampão de eluição com uma vazão de fluxo fixada em 60 mL/h.
15 A combinação de eluição foi selecionada em função da densidade óptica
(UV=206 nm) e então concentrada em tubos Vivaspin 3.000 MWCO ou
Amicon Ultra 10.000 MWCO.
Copulação
dPNAG ativado por GMBS e TT-SPDP reduzido por DTT
20 foram misturados na temperatura ambiente. De acordo com as condições
usadas a reação foi interrompida após 20-120 min pela adição de cisteína (4
mg/mL em tampão fosfato de Na de pH 8,0) por 30 minutos. O conjugado foi
clarificado em um filtro de 5 gin e injetado em resina Sephacryl S300HR
(XK16/100) para purificação. Eluição foi realizada em NaC1 200 mM com
25 uma vazão de fluxo fixada em 30 mL/h. As frações de eluição foram
analisadas por hexosamina e por dosagem de proteína. Frações de interesse
foram reunidas e filtradas em Sterivex 0,22 p,m. O conjugado final foi testado
para composição de polissacarídeo (dosagem de hexosamina) e de proteína
(dosagem de Lowry).
88
Tabela 12Conjugado Nível de N-
acetilação[dPNAG]mg/mL
[TT]mg/mL
Escala PS(mg)
Tempo decopulação (min)
dPNAG-TT 010 10* 15 15 30 120dPNAG-TT 011 10* 12 24 20 120dPNAG-TT 012 10* 17,5 35 22 80dPNAG-TT 019 34 5 10 10 20dPNAG-TT 020 34 2 2 10 20
*Não realizado no lote usado na conjugação mas estimado em um lote prévio por NMRusando o mesmo método de N-acetilação.
Tabela 13Conjugado Razão inicial de
TT/PS (p/p)Razão final deTT/PS (p/p)
Rendimento derecuperação de
PS (%)
Rendimento nafiltração (%)
dPNAG-TT010 1/1 1,86/1 43 99dPNAG-TT011 2/1 2,86/1 56 99dPNAG-TT012 2/1 2,29/1 61 108dPNAG-TT019 2/1 1,45/1 81 97dPNAG-TT020 1/1 0,89/1 82 109
dPNAG-SPDP:
Um excesso molar de 5 vezes de SPDP (N-Succinimidil-3-(2-
5 Piridilditio)Propionato, MW: 312,4, Pierce) dissolvido em DMSO (dimetil-
sulfóxido, Merck) foi adicionado em 100 mg de dPNAG a 5mg/mL em
fosfato de Na 100 mM, pH 7,2) e incubado 1 h na temperatura ambiente.
Antes da purificação em Sephacryl S 100HR (XK16/40) a mistura reacional
foi concentrada para ± 6 mL em Amicon Ultra 10.000 MWCO (centrifugação
10 a 3000 rpm durante 28 min). Eluição foi realizada em tampão fosfato pH 7,4
com uma vazão de fluxo fixada em 60 mL/h. As frações de interesse (lidas em
206 nm) foram reunidas e concentradas para 1,1 mL em Amicon Ultra 10.000
MWCO (centrifugação a 3000 rpm durante 30 min).
TT-SPDP:
15 Um excesso molar de 15 vezes de SPDP (Pierce) dissolvido
em DMSO (dimetil-sulfóxido, Merck) foi adicionado em 1 g de TT (50
mg/mL) em fosfato de Na 100 mM, pH 7,2 e incubado 80 min na temperatura
ambiente. Então o produto foi injetado em Sephacryl S 100HR (XK16/40) e
eluído em acetato de Na 100 mM = pH 5,6, NaC1 100 mM, EDTA 1 mM com
89
uma vazão de fluxo fixada em 60 mL/h. A combinação de eluição foi
selecionada em função da densidade óptica (UV=280nm) e então concentrada
para 19,6 mL em Amicon Ultra 10.000 MWCO (centrifugação a 3000 rpm
durante 75 min).
5 TT-LC-SPDP foi produzido como TT-SPDP mas usando LC-
SPDP (6[3-(2piridilditio)-propionamidol-hexanoato de succinimidila, Pierce)
e em um tempo de incubação de 60 min.
TT-SH ou TT-LC-SH
DTT foi adicionado em TT-SPDP ou TT-LC-SPDP em uma
10 razão de DTT/TT (mg/mg) de 0,7/1. Após 2 h na temperatura ambiente, a
liberação de piridina-2-tiona foi seguida por sua absorbância característica em
343 nm. A proteína tiolada foi purificada de DTT em excesso por filtração em
gel (PD-10, Amersham). Após concentração em Amicon Ultra 10.000
MWCO, o conteúdo de proteína foi estimado por dosagem de Lowry.
15 dPNAG-SPDP + TT-SH ou TT-LC-SH (dPNAG-11014 e 016)
Copulação foi realizada na temperatura ambiente sob
condições de agitação e com uma razão inicial de TT/PS (p/p) de 2/1.
dPNAG e TT-SH foram misturados com o objetivo de obter
uma concentração final de PS de 20 mg/mL e uma concentração final de
20 proteína de40 mg/mL. Após 30 min, grupos sulfidrila não reagidos foram
extintos pela adição de 2-iodo-acetamida (Merck).
dPNAG e TT-LC-SH foram misturados com o objetivo de
obter uma concentração final de PS de 10 mg/mL e uma concentração final de
proteína de20 mg/mL. Após 75 min, grupos sulfidrila não reagidos foram
25 extintos pela adição de 2-iodo-acetamida (Merck).
Então o conjugado é clarificado usando um filtro Minisart de 5
µ,m e injetado em Sephacryl S300HR (XK16/100). Eluição foi realizada em
NaC1 200 mM com uma vazão de fluxo fixada em 30 mL/h.
As frações de eluição foram analisadas por dosagem de
90
hexosamina e por dosagem de proteína. Frações de interesse foram reunidas e
filtradas em Sterivex 0,22 p,m.
Os conjugados resultantes possuem uma razão final de TT/PS
(p/p) de 2,18 (TT-SH) e 2,24 (TT-LCSH).
5 Tiolação de dPNAG
11,6 mg de DTT (1,4-Ditiotreitol, Boerhinger Mannheim,
MW: 154,24) foram adicionados em 16,5 mg de dPNAG-SPDP. Após 2 h na
temperatura ambiente, a liberação de piridina-2-tiona foi seguida por sua
absorbância característica em 343 nm. O PS tiolado foi purificado do DTT em
10 excesso por filtração em gel (Toyopearl HW40F) e então concentrado para
860 µI, em Amicon Ultra 10.000 MWCO.
dPNAG-SH + TT-SPDP (dPNAG-TT017)
Copulação foi realizada na temperatura ambiente sob agitação
contínua e com uma razão inicial de relação TT/PS (p/p) de 1,7/1.
15 dPNAG-SH e TT-SPDP foram misturados com o objetivo de
obter uma concentração final de PS de 7,73 mg/mL e uma concentração final
de proteína de13,3 mg/mL. Após 90 min, grupos sulfidrila não reagidos foram
extintos pela adição de 2-iodo-acetamida (Merck).
Então o conjugado foi clarificado usando um filtro Minisart de
20 5µm e injetado em Sephacryl S300HR (XK16/100). Eluição foi realizada em
NaC1200 mM com uma vazão de fluxo fixada em 30 mL/h.
As frações de eluição são analisadas por dosagem de
hexosamina e por dosagem de proteína. Frações de interesse foram reunidas e
filtradas em Sterivex 0,22
25 O conjugado resultante possui uma razão final de TT/PS (p/p) de
2,74.
Exemplo 8 Formulação
Composições de adjuvante
Os conjugados foram inoculados quer não adjuvantados quer
91
adjuvantados com adjuvante A, possuindo a seguinte composição:
Composição de Adjuvante A
Qualitativa Quantitativa (por dose de 0,5 mL)
Lipossomos:
5 - DOPC 1 mg
- colesterol 0,25 mg
3DMPL 50 lig
QS21 50 µg
Tampão KH2PO4 13,124 mg
10 Tampão Na2HPO4 10,290 mg
NaC1 2,922 mg
(100 mM)
Solvente WFI q.s. ad 0,5 mL
pH 6,1
15 1. Concentração total de PO4 = 50 mM
Exemplo 9
Experimentos em animais.
Camundongos fêmeas CD-1, de 8 a 10 semanas de idade, são
obtidos de Charles River Laboratories, Kingston, Mass. Para estudos de
20 letalidade, cinco grupos de 9 a 11 camundongos CD-1 são desafiados
intraperitonealmente (i.p.) com diluições seriais de S. aureus crescida sobre
placas de CSA. Os tamanhos inoculares variam de -4010 a 108
CFU/camundongo. Mortalidade é avaliada em uma base diária por 3 dias. As
doses letais 50% (LD50s) são estimadas pelo uso de um modelo de probit da
25 relação de dose-resposta. A hipótese nula de LD50s comuns foi testada pelo
teste de taxa de probabilidade. Bacteremia subletal é iniciada por desafio dos
grupos de 8 a 20 pela rota intravenosa (i.v.) com — 2 x 108 CFU/camundongo
ou pela rota i.p. com — 2 x 107 CFU/camundongo. Após inoculação grupos de
animais separados são sangrados da cauda em tempos específicos, e os níveis
92
de bacteremia são estimados por contagens de placa quantitativa realizadas
em duplicata sobre placas de ágar de soja tríptica com sangue de ovelha 5%
(Becton Dickinson Microbiology Systems). Significância estatística é
determinada pela modificação de Welch do teste t de Student não-pareado.
5 Exemplo 10
Imunogenicidade de conjugados de dPNAG-TT e PS8-TT
de S. aureus
Grupos de 30 camundongos foram inoculados
subcutaneamente com conjugado de PS8-TT de S. aureus em uma dose de
10 sacarídeo de 3 µg, quer adjuvantado quer combinado com adjuvante A, nos
dias 0, 14, 28 e 42. No dia 0, os camundongos receberam uma primeira dose
de sacarídeo incluindo entre 0,001 e 0,013 µg. As outras três imunizações
foram feitas com uma dose de 0,3 µg em solução salina. No dia 55 soro foi
coletado dos camundongos e cada amostra de soro foi testada por ELISA para
15 avaliar a resposta imune contra PS8. Grupos de 10 camundongos foram
usados nos grupos de controle e estes foram inoculados com quer solução
salina quer solução salina contendo adjuvante A.
O PS8 purificado foi revestido a 2 µg/mL em solução salina
tamponada com fosfato (PBS) sobre placas de microtítulo de ligação alta
20 (Nunc Maxisorp) durante a noite a 4°C. As placas foram bloqueadas com
PBS-BSA 1% por 30 min na temperatura ambiente com agitação. Os anti-
soros de camundongos foram pré-diluídos 1/100, então diluições adicionais
duplas foram realizadas em microplacas que foram incubadas a 37°C por 1
hora. Após lavagem, anticorpo murino lavado foi detectado usando IgG
25 (H+L) de Cabra Anti-Camundongo affiniPure conjugada com peroxidase de
Jackson ImmunoLaboratories inc. (ref: 115-035-003) diluída 1:5.000 em
PBS-tween 0,05%. Os anticorpos de detecção foram incubados por 30
minutos na temperatura ambiente com agitação. A cor foi revelada usando 4
mg de OPD (Sigma) + 5 µL de H202 por 10 mL de tampão citrato 0,1 M de
93
pH 4,5 por 15 minutos no escuro na temperatura ambiente. A reação foi
interrompida com 50 µL de HC1, e a densidade óptica foi lida a 490 nm em
relação a 650 nm.
Os resultados foram expressados em títulos de ponto-médio e
5 o GMT foi calculado para 30 amostras (10 para controles). Os resultados são
mostrados em Tabela 14 abaixo.
Tabela 14
Conjugado Título de anti-PS8 (GMT)
não-adsorvido
Título de anti-PS8 (GMT)
Adjuvante A
SA08-TT011 4714 2109
SA08-TT015 2806 5631
SA08-TT017 3770 4396
SA08-TT018 5349 4748
Controle 50 50
Grupos de 30 camundongos foram inoculados
subcutaneamente com conjugados de dPNAG-TT de S. aureus (contendo
10 dPNAG que estava entre 10% e 30% N-acetilado) em uma dose de
sacarídeo de 0,31 µg em NaC1 200 mM, quer não-adjuvantado quer
combinado com adjuvante A. Os camundongos receberam três
inoculações nos dias 0, 14 e 28. No dia 41 ou 42 soro foi coletado dos
camundongos e cada amostra de soro foi testada por ELISA para avaliar a
15 resposta imune contra PNAG. Grupos de 10 camundongos foram usados
nos grupos de controle e estes foram inoculados com solução salina ou
com apenas adjuvante.
Anti-PNAG ELISA:
PNAG purificado (2,5 µg/mL) misturado com HSA metilado
20 (2,5 n/mL) diluído em solução salina tamponada com fosfato (PBS) foi
revestido sobre placas de microtítulo de ligação alta (Nunc Maxisorp) durante
a noite a 4°C.
As placas foram bloqueadas com PBS-BSA 1%, 30 min na
RT com agitação. Os anti-soros de camundongos foram pré-diluídos
94
1/100, então diluições adicionais duplas foram feitas em microplacas e
incubadas na temperatura ambiente com agitação por 1 hora. Após
lavagem, anticorpo murino lavado foi detectado usando IgG (H+L) de
Cabra Anti-Camundongo affiniPure conjugada com peroxidase de Jackson
5 ImmunoLaboratories inc. (ref: 115-035-003) diluída 1:5.000 em PBS-
BSA 0,2%-tween 0,05%. Os anticorpos de detecção foram incubados por
30 minutos na temperatura ambiente com agitação. A cor foi revelada
usando 4 mg de OPD (Sigma) + 5µL de H202 por 10 mL de tampão
citrato 0,1 M de pH 4,5 por 15 minutos no escuro na temperatura
10 ambiente. A reação foi interrompida com 50 p,L de HC1, e a densidade
óptica foi lida a 490 nm em relação a 650 nm.
Um GMT foi calculado para 30 amostras (10 para controles).
Tabela 15Conjugado Anti-PNAG GMT não-
adsorvidoAnti-PNAG GMT
Adjuvante A
dPNAG-TT010 1371 28465
dPNAG-TT011 1133 40899
dPNAG-TT019 425 13429
dPNAG-TT020 656 10080
dPNAG-TT014 342 9806
dPNAG-TT017 203 8094
dPNAG-TT012 398 40509
dPNAG-TT016 719 7937
Controle 50 50
Exemplo 11 Imunogenicidade de conjugados de PS*-TT
15 preparados pelo método de CDAP
Resultados
Tabela 16Conjugado Anti PS8 GMT após três
inoculações em camundongosAnti-PS8 GMT após duas
inoculações em camundongosSAPS8-TT-04 Specol 207068 41326
SAPS8-TT-04 Adjuvante A 47405 15577SAPS8-TT-04 A1PO4 7380 4510
Specol 50Adjuvante A 50AIPO,' 50
95
Exemplo 12
Ensaio de opsonofagocitose.
O extermínio opsonofagocítica in vitro de S. aureus por
leucócitos polimorfonucleares de humano (PMNs) é realizada como descrito
5 em Xu et al. 1992 Infect. Immun. 60; 1358. PMNs de humano são preparados
de sangue heparinizado por sedimentação em dextrano T250 3%. A mistura
reacional opsônica (1 mL) contém — 106 PMNs em meio RPMI 1640
suplementado com 10% de soro fetal bovino termicamente inativado, —108
CFU de S-aureus, e 0,1 mL de soro de teste ou de preparação de IgG. Soro de
10 coelho hiper-imunizado é usado como um controle positivo, e 0,1 mL de soro
de coelho não-imune foi usado como uma fonte completa para as amostras de
IgG. As misturas reacionais são incubadas a 37°C, e amostras bacterianas são
transferidas a 0, 60, e 120 min para dentro de água e subseqüentemente
diluídas, espalhadas sobre placas de ágar de soja tríptica, e inoculadas a 37°C
15 para contagem bacteriana após incubação durante a noite.
Exemplo 13
Imunogenicidade de proteínas estafilocócicas em
camundongos e coelhos
Animais foram imunizados com proteínas estafilocócicas
20 purificadas com o propósito de gerar soros hiper-imunes. Camundongos
foram imunizados três vezes (dias 0, 14 e 28) com 10 µg de cada uma das
proteínas adjuvantadas em Specol. Coelhos foram imunizados três vezes (dias
0, 21 e 42) com 20 µg de cada uma das proteínas adjuvantadas em Specol.
Soros imunes foram coletados e avaliados em ELISA de anti-células inteiras
25 mortas e anti-proteína.
ELISA anti-proteína:
A proteína purificada foi revestida a 1 µg/mL em solução
salina tamponada com fosfato (PBS) sobre placas de microtítulo de ligação
alta (Nunc Maxisorp) durante a noite a 4°C. As placas foram bloqueadas com
96
PBS-BSA 1%, por 30 min na RT com agitação. As amostras de teste foram
então diluídas 1/1.000 e incubadas na temperatura ambiente por 1 hora com
agitação. Após lavagem, anticorpo de coelho ou murino foi detectado usando
IgG (H+L) de Cabra Anti-Camundongo AffiniPure conjugada com
5 peroxidase (ref: 115-035-003) ou IgG (H+L) de Cabra Anti-Coelho
AffiniPure (ref: 11-035-003) de Jackson ImmunoLaboratories inc. diluída
1:5000 em PBS-tween 0,05%. Os anticorpos de detecção foram incubados por
30 min. na temperatura ambiente com agitação. A cor foi revelada usando 4
mg de OPD (Sigma) + 5 µL H202 por 10 mL de tampão citrato 0,1 M de pH
10 4,5 por 15 minutos no escuro na temperatura ambiente. A reação foi
interrompida com 50 vtL de HC1, e a densidade óptica foi lida a 490 nm em
relação a 650 nm.
A O.D. para uma diluição de 1/1.000 de Pós III foi comparada
com a O.D. obtida com a mesma diluição de soros Pré-imunes.
15 Resultados gerados com soros de camundongos e de coelhos
são apresentados em Figura 5. Uma soroconversão boa contra cada antígeno
foi observada. Avaliação de soros direcionados contra SBI foi prejudicada
devido à atividade de ligação de Ig desta proteína.
ELISA anti-células inteiras mortas:
20 Células inteiras mortas (inativadas por calor ou formaldeído)
de S. aureus tipos 5 e 8 ou S. epidermidis cepa Hay foram revestidas a 20
µg/mL em solução salina tamponada com fosfato (PBS) sobre placas de
microtítulo de ligação alta (Nunc Maxisorp) durante a noite a 4°C com
evaporação. As placas foram bloqueadas com PBS-BSA 1% 30 min na
25 temperatura ambiente com agitação. Proteína A foi neutralizada pela adição
de 10 µg/mL de Anti-Proteína A de Galinha Purificada por Afinidade (ICL
ref: CPA-65A-2) diluída em PBS-tween 0,05% seguido por incubação por 1
hora na temperatura ambiente. As amostras de teste foram então diluídas duas
vezes sobre a microplaca em PBS-0,05% a partir de uma diluição inicial a
97
1/10 e incubadas por 1 hora na temperatura ambiente com agitação. Após
lavagem, anticorpo de coelho ou murino foi detectado usando IgG (H+L) de
Cabra Anti-Camundongo AffiniPure conjugada com peroxidase (ref: 115-
035-003) ou IgG (H+L) de Cabra Anti-Coelho AffiniPure (ref: 11-035-003)
5 de Jackson ImmunoLaboratories inc. diluída 1:5000 em PBS-tween 0,05%.
Os anticorpos de detecção foram incubados por 30 min. na temperatura
ambiente com agitação. A cor foi revelada usando 4 mg de OPD (Sigma) + 5
µI, H202 por 10 mL de tampão citrato 0,1 M de pH 4,5 for 15 minutos no
escuro, na temperatura ambiente. A reação foi interrompida com 50 ilL de
10 HC1, e a densidade óptica foi lida a 490 nm em relação a 650 nm.
Deve ser notado que os níveis de expressão de proteínas em
estafilococos variarão dependendo das condições de cultura. Portanto um
resultado negativo pode refletir a escolha de condições de cultura incorretas
em vez de uma falta de imunogenicidade.
15 Os resultados usando soros de camundongos são mostrados em
Tabela 17 e alguns dos gráficos são mostrados em figura 6. Um
reconhecimento fraco de S. aureus cepa 5 é observado com soros
direcionados contra SdrC, FnbpA, Ebh, Sbi e IsaA. Reconhecimento de S.
aureus cepa 8 é apenas observado com soro direcionado contra Sbi.
20 Reconhecimento fraco de S. epidermidis Hay é observado com soros
direcionados contra Atl amidase, MRPII, IsdA, lsaA, Ebh, Aaa e Sbi.
Uma seleção de resultados gerados usando soros de coelho é
mostrada em figura 7 e resumida em Tabela 18. Reconhecimento muito bom
das três cepas foi observado com IsaA e IsdB. Um reconhecimento fraco das
25 três cepas foi observado com HarA embora animais apenas receberam uma
injeção em vez de três injeções usadas para as outras proteínas.
Tabela 17Nome da proteína Reage sobre SA5 Reage sobre SA8 Reage sobre SE Hay
IsaA (+) (+) (+)
CTfA - (+) (+)Atl amidase - - ++
98
SdrG - - -Glicosamidase - - -
IsdA - - ++Alfa-toxina - - -
SrdC ++ (+) -Ebh + - +AaA - - ++MRPII - - ++
Sbi ++ ++ +++
FnbpA + + (+)
Tabela 18Nome da proteína Reage sobre SA5 Reage sobre SA8 Reage sobre SE Hay
IsaA -I--H- -Hf* -H-E
CTfA + ++ ++Atl amidase - ++ +
IsdB +++ +++ +++
SdrG + + +Glicosamidase - - -HarA (1 inject.) + + +
IsdA - - -Alfa-toxina - - +
SrdC - - -Ebh - + -AaA - - -MRPII - - ++Sbi - -+++
FnbpA - ++ ++
Exemplo 14
Eficácia de combinações de proteínas estafilocócicas em
um modelo de colonização nasal.
5 Quinze grupos de ratos de algodão foram inoculados com
combinações de oito antígenos estafilocócicos e cinco ratos de algodão que
atuaram como controles não foram tratados com antígeno. Estes dezesseis
grupos são os seguintes:
Grupo 1 - Atl-glicosamina, Atl-amidase, AAA, alfa-toxina, SdrC,
10 SdrG, Ebh, Sbi
Grupo 2 - Atl-glicosamina, Atl-amidase, IsdA, IsdB, CTfA, SdrC,
Ebh, FnbpA
Grupo 3 - Atl-glicosamina, Atl-amidase, HarA, IsdA, MRPII, IsdB,
AAA, alfa-toxina
99
Grupo 4 - Atl-glicosamina, HarA, IsdA, AAA, CTfA, IsaA, Ebh,
Sbi
FnbpA
5 Grupo 6 - IsdA, IsdB, AAA, alfa-toxina, CTfA, SdrG, Sbi, FnbpA
Grupo 7 - Atl-aminidase, IsdA, MRPII, AAA, IsaA, SdrG, Ebh,
FnbpA
Grupo 5 - HarA, MRPI1, AAA, alfa-toxina, CTfA, SdrC, Ebh,
Grupo 8 - Controle
Grupo 9 - Atl-glicosamina, IsdA, MRPII, alfa-toxina, IsaA, SdrC,
10 Sbi, FnbpA
Grupo 10 - Atl-glicosamina, MRPII, IsdB, AAA, CTfA, IsaA,
SdrC, SdrG
Grupo 11- Atl-aminidase, MRPII, IsdB, alfa-toxina, CTfA, IsaA,
Ebh, Sbi
15 Grupo 12 - Atl-glicosamina, HarA, IsdB, alfa-toxina, IsaA, SdrG,
Ebh, FnbpA
Grupo 13 - Atl-amidase, HarA, IsdB, AAA, IsaA, SdrC, Sbi,
FnbpA
Grupo 14 -Atl-glicosamina, Atl-amidase, HarA, MRPII, CTfA,
20 SdrG, Sbi, FnbpA
Grupo 15 - Atl-amidase, HarA, IsdA, alfa-toxina, CTfA, IsaA,
SdfC, SdrG
Grupo 16 - HarA, IsdA, MRPII, IsdB, SdrC, SdrG, Ebh, Sbi
Cada mistura de antígenos continha 3 µg de cada antígeno
25 misturados com um adjuvante feito de lipossomos contendo MPL e QS21. Os
ratos de algodão foram inoculados três vezes nos dias 1, 14 e 28 do
experimento. Duas semanas após inoculação, as eficácias das imunizações
foram ensaiadas usando um ensaio de colonização nasal como descrito em
Kokai-Kun et al. (2003) Antimicrob. Agents. Chemother. 47; 1589-1597.
100
Análise de regressão linear múltipla clássica foi realizada
sobre os dados usando programa de computador "Design Expert 6". A
presença de um antígeno foi codificada como +1 e a ausência de um antígeno
por -1. Usando a equação do modelo foi possível determinar quais antígenos
5 foram os antígenos chave que produziram um decréscimo grande no número
de colônias por nariz.
Resultados
Os resultados do ensaio de colonização nasal são mostrados
em Tabela 19. O grupo de controle teve um logCFU/nariz médio de 3,51335 e
10 um decréscimo em colonização nasal pôde ser visto para todos os grupos de
ratos de algodão com proteínas estafilocócicas. Grupos 4, 9 e 13 mostraram o
decréscimo mais alto em colonização nasal com um decréscimo de mais de 2
logs em CFU/nariz. Grupos 12 e 16 também deram bons resultados,
mostrando um decréscimo de cerca de logs em CFU/nariz.
15 Tabela 19Grupo LogCFU/nariz médio observado LogCFU/nariz predito
1 1,77527 2,035602 2,90435 2,526843 1,96556 2,230334 1,27748 1,218725 1,67304 1,931286 2,79745 2,981937 2,21481 2,307058 3,51355 3,473179 1,22480 1,4408010 2,03085 1,9320411 2,02522 1,8158112 1,53402 1,7099613 1,36063 1,4910014 2,31201 1,7390915 2,22979 1,9822316 1,58109 1,44004
A contribuição de antígenos específicos dentro da mistura de
antígenos foi calculada usando análise de regressão múltipla dos dados de
colonização nasal. O modelo final contém os sete melhores antígenos.
Resultados para estes antígenos são mostrados em Tabela 20. Dentro do
101
contexto da mistura de proteínas, a inclusão de HarA deu o decréscimo mais
alto em colonização nasal, seguido por IsaA, Sbi, SdrC, autolisina-
glicosamina, MRPII e Ebh.
Tabela 20 Efeitos em diferença de loqCFU/nariz e razão de
5 CFU/nariz para os sete melhores antígenos no modelo e valores de p
correspondentes. antígeno prob >F Estimativa de
efeitoRazão deredução
Efeitocumulativo
Razãocumulativa
HarA 0,033 -0,596 3,9 -0,596 3,9IsaA 0,046 -0,558 3,6 -1,154 14,3Sbi 0,077 -0,491 3,1 -1,645 44,2SdrC 0,22 -0,337 2,2 -1,982 96,0
Atl-glucos 0,238 -0,324 2,1 -2,306 202,2MRPII 0,239 -0,323 2,1 -2,629 425,3Ebh 0,297 -0,286 1,9 -2,914 821,0
1
REIVINDICAÇÕES
1. Composição imunogênica, caracterizada pelo fato de
compreender oligossacarídeo ou polissacarídeo capsular de Tipos 5 e/ou 8 de
S. aureu, em que o oligossacarídeo ou polissacarídeo capsular de Tipo 5 está
5 entre 30% e 100% 0-acetilado.
2. Composição imunogênica, caracterizado pelo fato de
compreender oligossacarídeo ou polissacarídeo capsular de Tipos 5 e/ou 8 de
S. aureus, em que o polissacarídeo ou oligossacarídeo capsular de Tipo 8 está
entre 30% e 100% 0-acetilado.
10 3. Composição imunogênica de acordo com a reivindicação 2,
caracterizada pelo fato de que o oligossacarídeo ou polissacarídeo capsular de
Tipo 5 está entre 30% e 100% 0-acetilado.
4. Composição imunogênica de acordo com qualquer uma das
reivindicações 1 a 3, caracterizada pelo fato de compreender PNAG
15 estafilocepa estafilocócica.
5. Composição imunogênica de acordo com a reivindicação 4,
caracterizada pelo fato de que o PNAG está menos do que 40% N-acetilado.
6. Composição imunogênica de acordo com qualquer uma das
reivindicações 1 a 5, caracterizada pelo fato de compreender adicionalmente
20 oligossacarídeo ou polissacarídeo capsular de Tipo 1, e/ou Tipo II e/ou Tipo
III de S. epidermidis.
7. Composição imunogênica de acordo com qualquer uma das
reivindicações de 1 a 6, caracterizada pelo fato de compreender
adicionalmente um antígeno 336 de S. aureus 336.
25 8. Composição imunogênica de acordo com qualquer uma das
reivindicações 1 a 7, caracterizada pelo fato de compreender adicionalmente
uma proteína estafilocócica ou seu fragmento.
9. Composição imunogênica de acordo com a reivindicação 8,
caracterizada pelo fato de que a proteína estafilocócica ou seu fragmento é
2
uma proteína ligante de componente extracelular selecionada do grupo
consistindo de receptor de laminina, proteína ligante de saliva/SitC/MntC,
EbhA, EbhB, proteína ligante de Elastina (EbpS), EFB (FIB), SBI, autolisina,
CTfA, SdrC, SdrD, SdrE, SdrG, SdrH, Lipase GehD, SasA, FnbA, FnbB,
5 Cna, ClfB, FbpA, Npase, IsaA/PisA, SsaA, EPB, SSP-1, SSP-2, HBP,
proteína ligante de Vitronectina, proteína ligante de fibrinogênio, coagulase,
Fig e MAP.
10. Composição imunogênica de acordo com a reivindicação
8, caracterizada pelo fato de que a proteína estafilocócica ou seu fragmento é
10 uma proteína transportadora selecionada do grupo consistindo de
transportador Imunodominante ABC, IsdA, IsdB, IsdC, HarA, transportador
de Mg2+, SitC e transportador Ni ABC.
11. Composição imunogênica de acordo com a reivindicação
8, caracterizada pelo fato de que a proteína estafilocócica ou seu fragmento é
15 uma toxina ou regulador de virulência selecionada do grupo consistindo de
alfa-toxina (HIa), mutante H35R de alfa-toxina, proteína ativadora de RNA
III (RAP).
12. Composição imunogênica de acordo com qualquer uma
das reivindicações 8 a 11, caracterizada pelo fato de compreender 2 ou mais
20 proteínas estafilocócicas selecionadas de pelo menos 2 grupos diferentes
selecionados de:
a) pelo menos uma proteína ligante de componente
extracelular estafilocepa estafilocócica ou seu fragmento selecionada do
grupo consistindo de receptor de laminina, proteína ligante de
25 salivalSitC/MntC, EbhA, EbhB, proteína ligante de Elastina (EbpS), EFB
(FIB), SBI, autolisina, CTfA, SdrC, SdrD, SdrE, SdrG, SdrH, Lipase GehD,
SasA, FnbA, FnbB, Cna, ClfB, FbpA, Npase, IsaA/PisA, SsaA, EPB, SSP-1,
SSP-2, proteína ligante de Vitronectina, proteína ligante de fibrinogênio,
coagulase, Fig e MAP;
3
b) pelo menos uma proteína transportadora estafilocepa
estafilocócica ou seu fragmento selecionada do grupo consistindo de
transportador imunodominante ABC, IsdA, IsdB, IsdC, HarA, transportador
de Mg2+, SitC e transportador Ni ABC;
5 c) pelo menos um regulador de virulência estafilocepa
estafilocócica, toxina ou seu fragmento selecionada do grupo consistindo de
alfa-toxina (Hla), mutante H35R de alfa-toxina, proteína ativadora de RNA III
(RAP).
13. Composição imunogênica de acordo com qualquer uma
10 das reivindicações 1 a 12, caracterizada pelo fato de que um polissacarídeo
estafilocepa estafilocócica está conjugado em um carreador protéico.
14. Composição imunogênica de acordo com qualquer uma
das reivindicações 4 a 13, caracterizada pelo fato de que o PNAG está
conjugado em uma proteína carreadora.
15 15. Composição imunogênica de acordo com a reivindicação
13 ou 14, caracterizada pelo fato de que a proteína carreadora compreende
uma proteína estafilocócica ou seu fragmento selecionada do grupo
consistindo de receptor de laminina, proteína ligante de saliva/SitC/MntC,
EbhA, EbhB, proteína ligante de Elastina (EbpS), EFB (FIB), SBI, autolisina,
20 CTfA, SdrC, SdrD, SdrE, SdrG, SdrH, Lipase GehD, SasA, FnbA, FnbB,
Cna, C1fB, FbpA, Npase, IsaA/PisA, SsaA, EPB, SSP-1, SSP-2, HBP,
proteína ligante de Vitronectina, proteína ligante de fibrinogênio, coagulase,
Fig, MAP, transportador Imunodominante ABC, IsdA, IsdB, IsdC,
transportador de Mg2+, SitC e transportador Ni ABC, alfa-toxina (Hla),
25 mutante H35R de alfa-toxina e proteína ativadora de RNA III (RAP).
16. Composição imunogênica de acordo com a reivindicação
13 ou 14, caracterizada pelo fato de que a proteína carreadora é toxóide de
tétano, toxóide de difteria, CRM197, proteína D de Haemophilus influenzae,
exoproteína A de Pseudomonas aeruginosa, alfa-toxóide e pneumolisina
4
pneumocepa estafilocócica.
17. Composição imunogênica de acordo com a reivindicações
de 1 a 16, caracterizada pelo fato de que uma resposta imune é gerada contra
ambas S. aureus e S. epidermidis.
5 18. Vacina, caracterizada pelo fato de compreender a
composição imunogênica como definida nas reivindicações 1 a 17 e um
excipiente farmaceuticamente aceitável.
19. Método para preparar a vacina, caracterizado pelo fato de
compreender as etapas de misturar a composição imunogênica como definida
10 em as reivindicações 1 a 18 e adicionar um excipiente farmaceuticamente
aceitável.
20. Método para prevenir ou tratar infecção estafilocócica,
caracterizado pelo fato de compreender a etapa de administrar a vacina como
definida na reivindicação 18 a um paciente em necessidade da mesma.
15 21. Uso da composição imunogênica como definida nas
reivindicações 1 a17, caracterizado pelo fato de ser para a manufatura da
vacina para o tratamento ou a prevenção de infecção estafilocócica.
22. Processo para conjugar oligossacarídeo ou polissacarídeo
capsular de Tipo 5 ou 8 de S. aureus, caracterizado pelo fato de compreender
20 as etapas de:
a) dissolver o oligossacarídeo ou polissacarídeo de Tipo 5 ou 8
em água ou em uma solução salina;
b) adicionar um agente de cianilação (por exemplo CDAP)
para formar um polissacarídeo ou oligossacarídeo ativado;
25 c) adicionar uma proteína carreadora de modo que grupos
amino reajam com o polissacarídeo ativado para formar uma ligação
covalente de isouréia.
23. Processo de acordo com a reivindicação 22, caracterizado
pelo fato de que o oligossacarídeo ou polissacarídeo capsular de Tipo 5 está
5
entre 30% e 100% 0-acetilado.
1/68
FIGURA 1
SEQ ID NO:1 seqüência de polipeptídeoML QVTDVS LRFGDRKL FEDVNI KFTEGNCYGL I GANGAGK S T FLK I L S GE LD S QTGHVS LGKNERLAVL KQDHYAYEDER
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SEQ ID NO:2 seqüência de polipeptídeoMLQVTDVSLRFGDRICLFEDVNIKFTEGNCYGLIGANGAGKSTFLKILSGE IDSQTGHVSLGKDERLAVLKQDHFAYEDER
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EGEFSVLDQVS IDICMMIQLDGTHNKGICLGANAILGVS IAVARAAADLLGQPLYKYL GGFNGKQL PVPMMN IVNGGSHS DA
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TDRIAKYNQLLRIEDELYETAKFEGIKSFYNLDK
SEQ ID NO:5 seqüência de polipeptídeoMKKIVTAT IATAGLAT IAFAGHDAQAAEQNNNGYNSNDAQ S YS YTYT I DAQGNYHYTWTGNWNPSQLTQNNTYYYNNYNT
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SEQ ID NO:6 seqüência de polipeptídeoMKKIATATIATAGFATIAIASGNQAHASEQDNYGYNPNDPTSYSYTYTIDAQGNYHYTWKGNWHPSQLNQDNGYYSYYYY
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SEQ ID NO:7seqüência de polipeptídeoMKKIATATIATAGIATFAFAHHDAQAAEQNNDGYNPNDPYSYSYTYTIDAEGNYHYTWKGNWS PDRVNTSYNYNNYNNYN
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2/68
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SWSYEAANGQTAGFSNVAGADYTTSYNQGSDVQSVSYNAQSSNSNVEAVSAPTYHNYSTSTTSSSVRLSNGNTAGATGSS
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SEQ ID NO:llseqüência de polipeptídeoMKKTVIASTLAVS LG IAGYGL SGHEAHAS ETTNVDICAHLVDLAQHNP E ELNAKPVQAGAYD I HFVDNGY QYNFT SNG S E W
S WS YAVAGSDADYTES SSNQEVSANTQSSNTNVQAVSAPTSSESRSYSTSTTSYSAP SHNYSSHSSSVRLSNGNTAGSVG
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SEQ ID NO:12 seqüência de polipeptídeoMNYRDKI QKF S IRKYTVGTFS TV IATLVFLG FNT S QAHAAETNQPAS VVKQKQQSNNE QTENRESQVQNS QNS QNSQS LS
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3/68
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TAVNNANGVINATNNPNMDANAINDMANQVNT TKAALNGAQNLAQAKTNATNT INNAQDLNQKQKDALKTQVNNAQRVSD
ANNVQHTATELNGAMTAL KAAIADKERT KAS GNYVNADQE KRQAYD S KVTN AEN I INGTPNATLTVNDVNSAASQVNAAK
TALNGDNNLRVAKEHANNT I DGLAQLNNVQ KAICL KE QVQ SAT T LDGVQTVKN S S QTLNTAM KG LRD S I ANEAT I KAGQNY
TDASPNNRNEYDSAVTAAKAI INQTSNPTMEPNT I TQATS QVTTKEHALNGAQNLAQAKT TAKNNLNNLT S INNAQICD AL
TRN IDGATTVAGVNQ E TAKATE LNNAMH S L QNG I NDE TQTKQ TQKYLDAE P S KICS AYDQAVNAAKA I LT KAS GQNVD KAA
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SGTP TPTLTP SDVTNAATQVTNAKTQLNGNHNLEVAKQNANTAIDGLTSLNGPQKAKLKEQVGQATTLPNVQTVRDNAQT
LNTAMKGLRDS IANEAT I KAGQNY TDAS QNKQND YNNAVTAAKAI I GQ TT S P SMIAQE INQAICD QVTAKQQALNGQENL R
TAQTNAKQHLNGLS D L TNAQ KDAAKRQ I E GATHVNEVTQAQNNADALNTAM TNL KNG I QDQNT I KQGVN F TDADEAKRNA
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7/68
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DSDSDSDSDSDSDSDSDSDSDSDSDSDSDSDSDSDSDSDSDSDSDSDSDSDSDSDSDSDSDSDSDSDSDSDSDSDSDSDS
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8/68
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SDSDSDSDSDSDSDSDSDSDSDSDSDSDSDSDSDSDSDSDNDSDLGNSSDKS TKDKLPDTGANEDYGSKGTLLGTLFAGL
GALLLGKRRKNRKNKN
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SEQ ID NO:24 seqüência de polipeptídeoMKN KLIAKS LLT IAAIG I TTTT IAS TADASEGYGPREKKPVS INBNIVEYNDGTFKYQSRPKFNSTPKYI KFKHDYNILE
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SEQ ID NO:25 seqüência de polipeptídeoMKTR I VS SVT TT L LLGS I LMNPVANAADS D IN I KTGT TD I GSNT TVKTGDLVTYDKENGMHKICVFYS F I DD KNHNICKL LV
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SEQ ID NO:26 seqüência de polipeptídeoMHMKNKYIS KL LVGAAT I TLATM ISNGEAKAS ENT QQT S TKHQT TQNNYVTDQQICAFYQVLHLKG I TEE QRNQYI KTL RE
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SEQ ID NO:27 seqüência de polipeptídeoMT ICHY LNSKYQS EQRS SAMICK ITMGTAS I I LGSLVYIGADSQQVNAATEATNATNNQSTQVSQATSQPINFQVQKDGS SE
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DTTKDQTKTQTAHTVICTAQTAQEQNKVQTPVICDVATAKSESNNQAVSDNKSQQTNKVTKHNETPKQASKAKELPICTGLTS
VDNFISTVAFATLALLGSLSLLLFKRKESK
SEQ ID NO:28 seqüência de polipeptídeoMNKQQKE FKS F YS I RKS S LGvASVAI STLLLLMSNGEAQAAAEETGGTNTEAQPICTEAVASPTTTSEKAPETKPVANAVS
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E QQF YHYAS S VKPARV I FTD S KP E IELGL Q SGQFwRKFEVYEGDICKL P I KLVS YD TVICD YAY I RFS VSNGT KAVK I VS S T
9/68
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LDEQVICSAITEFQNVQPTNEKMTDLQDTKYVVYESVENNESMMDTFVICHP IKTGMLNGKKYMVMETTNDDYWKDFMVEGQ
RVRT I SKDAKNNTRT I I FPYVE GKTLYDA IVKVHVKT IDYDGQYHVRIVDICEAFTICANTDKSNKKEQQDNSAKKEATPAT
PSKPTP S PVE ICE SQ KQDS QICDDNKQLPSVEKENDASSESGKDICTPATKPTKGEVESSSTTPTICVVSTTQNVAKPTTASSK
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SEQ ID NO:29 seqüência de polipeptídeoMNNKKTATNRKGMI PNRLNKFS I RKYS VGTAS I LVGTTL I FGLSGHEAKAAEHTNGELNQS KNETTAP SENKTTEICVDS R
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TT I KQRALNRMAVNTVAAP QQ GTNVNDKVH FTNIDIAIDKGHVNKTTGNTE FWAT S SDVL KL KANYT IDDSVKE GDT FTF
IÇYG QY FR PGS VRL P S QTQNLYNAQ GN I IAKG I YDS KTNTTTYT FTNYVDQ YTNVS GS FE QVA FAICRENATTDKTAYKMEV
TLGNDTYSKDVIVDYGNQKGQQL IS STNY INNEDLSRNMTVYVNQPKKTYTICETFVTNLTGYKFNPDAKNFKIYEVTDQN
Q FVDS FT PDT S KL KDVTGQ FDVI YSNDNKTATVDLLNGQS SSDKQY I I QQVAY PDNS S TDNG KIDYTLETQNG KS SWSNS
YSNVNGS S TANGDQ KKYNLGDYVWEDTN1CDGKQDANE KG I KGVYVILKDSNGKELDRTTTDENGKYQFTGLSNGTYSVEF
S T PAGYTP TTANAGTDDAVD S DGL TTTGVI ICDADNMT LDSGFYKTP KYS LGDYVWYD SNICDGKQDS TEKG I KGVKVTLQN
E KGEVIGTTETDENGKYR FDNLD SGKY KVI FEKPAGLTQTGTNTTEDDKDADGGEVDVT I TDHDD FT LDNGYYEEETSDS
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SEQ ID NO:30 seqüência de polipeptídeoMNMKICICE KHAIRKKS IGVASVLVGTL I GFGLL S S KEADAS ENS VTQSDSASNE S KS NDS S SVS AAP KTDD TNVSDTKTS S
NTNNGETSVAQNPAQQETTQS S S TNATTE E T PVTGEATTTTTNQANT PAT TQ S SNTNAE E LVNQT SNETT SND TNTVS S V
NSPQNS TNAENVSTTQDTS TEATPSNNESAPQNTDASNKDVVS QAVNP S TP RMRAF S LAAVAADAPAAGTD I TNQ LTDVK
VTIDSGTTVYPHQAGYVICINYGFSVPNSAVKGDTFKITVPKELNLNGVTS TAKVP P IMAGD QVLANGVIDS DGNVI YT FT
DYVDNKENVTANITMPAY IDPENVTKTGNVTLTTGIGTNTASKTVL IDYEKYGQFHNL S I KGT IDQ IDKTNNTYRQT I YV
NPSGDNVVLPALTGNL I PNT KSNAL IDAKNTD I KVYRVDNANDL SESYYVNP SDFEDVTNQVR I S F PNANQYKVE FPT.DD
DQ ITTPYIVVVNGHIDPASTGDLALRSTFYGYDSNFIWRSMSWDNEVAFNNGSGSGDGIDKPVVPEQPDEPGE IEP I PED
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SESDSDSDSDSDSESDSDSDSDSDSDSASDSDSGSDSDS SSDSDSDSTSDTGSDNDSDSDSNSDSESGSNNITVVPPNS PK
NGTNASNKNEAKDSKEPLPDTGSEDEANTSL IWGLLAS LGSLLLFRRKKENKDKK
SEQ ID NO:31 seqüência de polipeptídeoMKNNLRYG I RKHICLGAAS VF LGTM I VVGMGQDKEAAAS E Q KTTTVEENGNS ATDNKT S E TQ TTATNVNH I EETQSYNATV
TEQPSNATQVTTEEAPKAVQAPQTAQPANVETVKEEEKPQVKETTQPQDNSGNQRQVDLT PKKVTQNQGTETQVEVAQPR
TAS ES KP RVTRS ADVAEAKEASDVS EVKGTDVTSKVTVESGS I EAPQGNKVE PHAGQRVVLKY KL KFADGLKRGDY FDFT
LSNNVNTYGVS TARKV PE I KNGSVVMATGE ILGNGNI RYT FTNEI EHKVEVTANLE INL F IDPKTVQSNGEQKITS KLNG
EETEKT IPVVYNPGVSNSYTNVNGS I ETFNKESNKF THIAY I KPMNGNQ SNTVSVTGTL TEGSNLAGGQP TVICVY EYLGK
ICDELPQSVYANTSDTNKFICDVTICEMNGKLSVQDNGSYS LNLDKLDKTYVIHYTGEYLQGSDQVNFRTELYGYPERAYKSY
YVYGGYRLTWDNGLVLY SNKADGNGKNGQ I I QDNDF EYKED TAKGTM SGQYDAKQ I I E TEENQDNT P LD IDYHTAI DGEG
GYVDGY I ET IEETDS SAID IDYHTAVDSEVGHVGGYTES SEESNP IDFEES THENSICHHADVVEYEEDTNPGGGQVTTES
NLVEFDEESTKGIVTGAVSDHTTIEDTKEYTTESNL I ELVDE LPE EHGQAQG P I EE I TENNHHI SHSGLGTENGHGNYGV
I EE IEENSHVD IKSELGYEGGQNSGNQS FEEDTEEDKPKYEQGGNIVDIDFDSVPQ I HG QN KGDQS FEEDTEKDKPKYEH
GGNI IDIDFDSVPQ I HGFNKHNE I I EEDTNKDKPNYQ FGGHNS VDF EEDTLP KVS GQNE GQQT I EEDTT P PT P PTP EVP S
EPETPMP PT PEVP SEPETPTP PTPEVP SEPETPTP PT PEVP SEPETPTPPTPEVP SEP ETPT PPTPEVPAEPGKPVP PAK
EEPICKPSKPVEQGKVVTPVI E INEKVKAVAPTKKAQS KKSEL PETGGE ES TNKGML FGGL F S ILGLALLRRNKKNNKA
SEQ ID NO:32 seqüência de polipeptídeoMKKRIDYLSNKQNKYS I RRFTVGT TSVI VGAT I L FG I GNHQAQASEQSNDTTQ SS KNNASADS EKNNMI ETPQLNTTAND
TS D I SANTNSANVDSTTKPMSTQTSNTTTTEPASTNETPQPTAIKNQATAAKMQDQTVPQEANS QVDNKTTNDANSIATN
SELKNS QTLDLPQSS PQT I SNAQGTSKPSVRTRAVRSLAVAEPVVNAADAKGTNVNDKVTASNFICLIEKTTFDPNQSGNTF
MAANFTVTDKVKS GDY FTAKL PD S L TGNGDVDY S NS NNTMP I AD I KS TNGDVVAKATYD I LTICTYT FVF TDYVNNKEN I N
GQFSLPL FTDRAKAPKSGTYDANINIADEMFNNKITYNYSSP IAGIDKPNGAN IS SQ I IGVDTASGQNTYKQTVFVNPKQ
RV LGNTWVY I KGYQD KI EES S GKVSATDTICLR I FEVNDTS KL SDSYYAD PNDSNLICEVTDQ F KNRI YY EH PNVAS I KFGD
I TKTYVVLVEGHYDNTGKNLIÇTQVIQENVDPVTNRDYS I FGWNNENVVRYGGGSADGDSAVNPKDPTPGP PVDPEP S PD P
EP EPTPDP EPS PDPEPE P S PDPDPDSDSDSDSGSDSD SGSDSDSESDSDSDSDSD SD SDSD SE SD SDSESDSD SDS DSDS
DSDSDSESDSDSDSDSDSDSDSDSESDSDSESDSESDSDSDSDSDSDSDSDSDSDSDSDSDSDSDSDSDSDSESDSDSDS
10/68
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DSDSRVTPPNNEQICAPSNPKGEVNHSNKVSKQHKTDALPETGDKSENTNATLFGAMMALLGSLLLFRKRKQDHKEICA
SEQ ID NO:33 seqüência de polipeptídeoMICKQ I I SLGALAVAS SL FTWDNKADAIVTKDYS KESRVNEKS ICKGATVS DYYYWKI IDS LEAQFTGAIDLL EDYKYGDP I
YKEAKDRLMTRVLGEDQYLLKKKIDEY ELYKKWYKS SNKNTNMLTFH ICYNLYNL TMNEYND I FNSLKDAVYQ FNKEVKE I
EHENVDL KQ FDICDGED KAT ICEVYDLVS E I DTLVVTYYADKDYGEHAKELRAICLDL I L GDTDNPHK I TNER I KKEM I DDLN
S I IDDFFMETKQNRPNS ITKYDPTKHNFKEKSENKPNFDKLVEETKKAVICEADESWICNKTVKKYEETVTKSPVVKEEKKV
EEPOLPKVGNQQEVKTTAGICAEETTQPVAQPLVKIPQETIYGETVKGPEYPTMENKTLQGE I VQGPDFLTME QNRPSLSD
NYTQPTTPNPILEGLEGSSSICLE I KPQGTESTL KG IQGE SSD I EVKPQATE TTEAS QYGPRPQ FNKTPKYVKYRDAGTG I
REYNDGTFGYEARPRFNKPSETNAYNVTTNQDGTVSYGARPTQNKPSETNAYNVTTHANGQVSYGARPTQKKPSKTNAYN
VTTHANGQVSYGARPTQKKPSKTNAYNVTTHANGQVSYGARPTYKKPSETNAYNVTTHANGQVSYGARPTQKKPSETNAY
NVTTHADGTATYGPRVTK
SEQ ID NO:67 seqüência de polipeptídeoMKSNLRYG I RKH ICLGAAS VFLGTM IVVGMGQEKEAAAS EQNNTTVEE SGS SATE S KAS E TQTTTNNVNT
IDETQSYSAT STEQP S KS TQVTTEEAPTTVQAP KVE TEMKSQEDLP SEKVADKET TGTQVD IAQPSNVS
E IKPRMKRSADVTAVSEKEVAEEAKATGTDVTNICVEVTESSLEGHNKDSNIVNPHNAQRVTLKYKWKFG
EGI KAGDY FDFTL SDNVE THG I S TLRKVP E I KS
STEDICVMANGQVINERT I RYT FTDY INNKKDLTAELNLNL F IDPTTVT KQGSQICVEVT LGQNKVS KEFD
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GY EGGQNS GNQ S F E EDTE EDKP KY EQGGN IVD I
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11/68
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SEQ ID NO:70 seqüência de polipeptídeoMAETTQDQTTNKNVLDSNKVICATTEQAKAEVKNPTQN I SGTQVYQDPAIVQPKTANNKTG
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SGWVSKAYLAVPAAP KKAVAQPKTAVK
SEQ ID NO: 71 seqüência de polipeptídeoMAYTVT KP QTTQTVS KI AQVKPNNTG I RASVY EKTAKNGAICYADRT FYVT KERAHGNETY
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EL I KYNQTGMTLNQVAQ I QAGLQYKPQVQRVPGKWTDAICFNDVICHAMDTKRLAQD PALKY
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SEQ ID NO: 73 seqüência de polipeptídeoAS TQHTVQSGES LWS IAQKYNTSVES I KQNNQLDNNLVF PGQVISVGGSDA QNT SNTS PQ
AGS AS SHTVQAGE S LN I I AS RYGVSVD QLMAANNLRGYL IMPNQTLQ I PNGGSGGTTPTA
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H
12/68
SEQ ID NO: 74 seqüência de polipeptídeoMNNKICTATNRKGM I PNRLNKFS IRKYSVGTAS I LVGTTL I FGLSGHEAKAAEHTNGELNQ
SICNETTAPSENKTTKICVDSRQLKDNTQTATADQPKVTMSDSATVKETSSNMQSPQNATAN
QSTTICTSNVTTNDKSSTTYSNETDKSNLTQA1CDVSTTPKTTTI KPRTLNRMAVNTVAAPQ
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AYVNQPKNTYTKQTFVTNLTGYKFNPNAKNFKIYEVTDQNQFVDSFTPDTSKLKDVTDQF
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YSNVNGSSTANGDQKKYNLGD YVWED TNICDGKQDANE KG I KGVYVI L1CDSNGKELDRTTT
DENGICYQFTGLSNGTYSVEFSTPAGYTPTTANVGTDDAVDSDGLTTTGVIICDADNMTLDS
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DSDSDSDSDSDSDSDSDSDSDSDSDSDSDSDSDSDSDSDSDSDSDSDSDSDSDSDSDSDS
DSDSDSDSDSDSDSDSDNDSDSDSDSDSDSDSDSDSDSDSDSDSDSDSDSDSDSDSDSDS
DSDSDSDSDSDSDSDSDSDSDSDNDSDSDSDSDSDAGKHTPAKPMSTVKDQHKTAKALPE
TGSENNNSNNGTLFGGLFAALGSLLLFGRRKKQNK
SEQ ID NO: 75 seqüência de polipeptídeoMNLLICKNICYS I RKY KVG I FS TL IGTVLLLSNPNGAQALTTDNNVQSDTNQATPVNSQDKD
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AEPASNRP KKRSRRAAPADPNATPADPAAAAVGNGGAPVAITAPYTPTTDPNANNAGQNA
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AENAVNKKVDQMEDLVNQNDELTDEEKQAAIQVIEEHKNE I I GN I GDQTTDDGVTR I KDQ
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TLKNRALTD IGVTS TTAMVNS IRDDAVNQ IGAVQPHVTKKQTATGVLNDLATAKKQEINQ
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LDTTQDERDVAIDTLNKI VNT I END IAQNKTNAEVDR TE TDGNDNI KVILPKVQVKPAAR
QSVGVKAEAQNAL IDQSDLSTEEERLAAKEILVEQALNQAIDQ INHADKTAQVNQDS INAQ
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SEQ ID NO: 76 seqüência de polipeptídeoEENSVQDVKDSNTDDELSDSNDQSSDEEKNDVINNNQS INTDDNNQ I I KKEE TNNYDG IE
13/68
KRS EDRTE STTNVDENEATFLQKTPQDNTHLTEEEVKES S SVESSNSS IDTAQQP SHTT I
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DE KI SNQDE LLNL P INEYENKARPLSTTSAQPS I ICRVTVNQLAAEQGSNVNHL I KVTDQS
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KDNSGE I IATGTYDNKNKQITYTFTDYVDKYEN I KAHLKLTS Y I DKS KVPNNNTKLDVE Y
KTALS SVNKT I TVEYQRPNENRTANLQS MFTN I DTICNHTVEQT I YI NPLRYSAKETNVN I
S GNGDEGST I IDDS TI I ICVYKVGDNONL PDSNRIYDYS EYEDVTNDDYAQLGNNNDVNIN
FGNIDS PYI I KVI S KYDPNICDD YTT IQQTVTMQTTINE YTGEFRTAS YDNT IAFS TS SGQ
GQGDLP PE KTY K I GDYVW EDVDKDG I QNTNDNE KPL S NVLVTL TYPDGT S KSVRTDEDGK
YQFDGLKNGLTYK I TFETPEGYTPTLICES GTNPALDS EGNSVWVT I NGQDDMT I D SG FYQ
TP KYS LGNYVWYDTNICDG IQGDDE KG I S GVKVTLKDENGN I I S TTTTDENGKYQ FDNLNS
GNY IVH FD KP SGMTQTTTDS GDDDEQDADGEEVHVT I TDHDD FS I DNGYYDDE
SEQ ID NO: 87 seqüência de polipeptídeo
MI NRDNICKAI TKKGMI SNRLNKF S I RKYTVGTA S I ',varri., I FGLGNQEAKAAENTSTENAKQDDATTSDNKEVVSETENNSTTENDSTNP I KKETNTDS Q PEAICEESTTSSTQQQQNNV
TATTETKPQNI EKENVKP S TDKTATEDTS VILEEKKA PNYTNNDVTTKP S T SE I QTICPTT
PQESTN I ENS QPQ PT P S KVDNQVTDATNPKE PVNVS KEELKNNP EKLICELVRNDNNTDRS
TKPVATAPT S VAPICRLNAKMRFAVAQPAAVASNNVNDL ITVTKQT IKVGDGICDNVAAAHD
GKDI EYDTE FT I DNKVKKGDTMT INYDICNVI PSDLTDKNDPID ITD PS GE VIAKGTFDKA
TKQITYTFTDYVDKYEDI KARLTLYSYIDKQAVPNETSLNLTFATAGKETSQNVSVDYQD
PMVIIGDSNI Q S I FTICLDENKQTIEQQ I YVNPLIUCTATNTICVDIAGSQVDDYGNIKI,GNGS
T I IDQNTE I KVYKVNPNQQLPQSNRIYDFSQYEDVTSQFDNKKSFSNNVATLDFGDINSA
YI IKVVSKYTPT SDGELDIAQGTSMRTTDKYGYYNYAGYSNF I VT SNDTGGGDGTVICPEE
KLYKIGDYVWEDVDICDGVQGTDSKEKPMANVLVTLTYPDGTTKSVRTDANGHYEFGGLKD
GETYTVKFETPAGYLPTKVNGTTDGEKDSNGSSITVKINGKDDMSLDTGFYKE PICYNLGD
YVINT EDTHKDGIQDANEP GI KDVKVTLICDSTGKVIGTTTTDASGKYKFTDLDNGNYIVEF E
TPAGYTPTVRNTTAEDICDSNGLTTTGVIKDADNMTLDSGFYKTPKYSLGDYVWYDSNICDG
KQDSTEKGI KDVKVTLLNEKGEVIGTTKTDENGKYRFDNLDSGICYICVIF EKPAGLTQTVT
NTTEDDKDADGGEVDVT ITDHDDF I LDNGYFEEDTSDSDSDSDSDSDSDSDSDSDSDSDS
DSDSDSDSDSDSDSDSDSDSDSDSDSDSDSDSDSDSDSDSDSDSDSDSDSDSDSDSDSDS
DSDSDSDSDSDSDSDSDSDSDSDSDSDSDSDSDSDSDSDSDSDSDSDSDSDSDSDSDSDS
DAGICHTPVKPMSTTICDHHNICAKALPETGSENNGSNNATLFGGLFAALGSLLLFGRRICICQN
K
SEQ ID NO: 89 seqüência de polipeptídeo
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NEATTSASDNQSSDKVDMQQLNQEDNTENDNQICEMVSSQGNETTSNGNICL I E KE SVQSTT
GNKVE VS TAKSDEQAS P KS TNEDLNT KQT I SNQEALQ PDL QENKSVVNVQ PTNEENKKVD
AKTE STTLNVKSDAI KSNDETLVDNNSNSNNENNAD I IL P KS TAPKRLNTRMR IAAVQPS
STEAKNVNDL ITS NTTLTVVDAD KNNK IVPAQDYL S L KSQITVDDKVKS GDYFT I KYSDT
VQVYGLNPED I KN I GD I ICDPNNGET IATAKHDTANNL I TYTFTDYVDR FNSVQMG I NYS I
YNDADT I PVS KNDVE FNVT I GNTTTKTTAN I QYPDYVVNE KNS I G SAFTE'TVSHVGNKEN
PGYYKQTIYVNP SENSLTNAKLKVQAYHS S YPNNI GQINKDVTD I KIYQVP KGYT LNKG Y
DVNT KE LTDVTNQYLQKI TYGDNNSAVID FGNAD SAYVVMVNTKFQYTNS E S PTLVQMAT
LSSTGNKSVSTGNALGFTNNQSGGAGQEVYKIGNYVWEDTNKNGVQELGEKGVGNVTVTV
FDNNTNTKVGEAVTKEDGS YL I PNL PNGDYRVE F SNL P KGYEVT P S KQGNNEE LD SNGLS
SVI TVNGICDNLSADLG I YKP KYNLGDYVWEDTNKNG I QD QDE KG I S GVTVTLKDENGNVL
KTVTTDADGKYKFTDLDNGNYKVEFTTPEGYTPTTVTSGSDIEKDSNGLTTTGVINGADN
MTLDS GFYKTP KYNLGNYVWEDTNKDGKQD S TE KG I SGVTVTLKNENGEVLQTTKTDKDG
KYQFTGLENGTYKVEFETPSGYTPTQVGSGTDEGIDSNGTSTTGVIKDKDNDTIDSGFYK
PTYNLGDYVWEDTNI<NGVQDKDE KG I S GVTVTLKDENDKVL KTVTTDENGKYQ FTDLNNG
TYKVE F ET P S GYT PT SVTS GNDT EKDSNGLTTTGVI ICDADNMT LDS GF YKT P KYS LGDYV
WYDSNKDGKQD STE KG I KDVKVTLLNE KGEVIGTTKTDENGKYC FDNLDS GKYKVI FE KP
AGLTQTVTNTTEDDKDADGGEVDVT ITDHDDFT LDNGYFEEDTSDSDSDSDSDSDSD SDS
DSDSDSDSDSDSDSDSDSDSDSDSDSDSDSDSDSDSDSDSDSDSDSDSDSDSDSDSDSDS
DSDSDSDSDSDSDSDSDSDSDSDSDSDSDSDSDSDSDSDSDSDSDSDSDSDSDSDSDSDS
DSDSDSDSDSDSDSDSDSDSDSDSDSDSDAGICEITPVKPMSTTKDHHNICAKALPETGSENN
G SNNATLFGGL FAALGS LLL FGRRKKQNK
SEQ ID NO: 91 seqüência de polipeptídeo
14/68
MAKYRGKPFQLYVKLS CS TMMATS I I LTNI L PYDAQAAS EKDTEI TKE I LSKQDL LDICVDKAI RQ I EQLKQL SAS S KEHY
KAQ LNEAKTAS Q I DE I I 1CRANELDS KDNKSSHTEMNGQSDIDS KLDQLLICDLNEVSSNVDRGQQSGEDDLNAMICNDMSQT
ATTKHGEKDDICNDEAMVNICALEDLDHLNQQIHKSKDASKDTSEDPAVSTTDNNHEVAKTPNNDGSGHVVLNKFLSNEENQ
SHSNRLTDICLQGSDK INHAMIEKLAICSNASTQHYTYHKLNTLQSLDQRIANTQLPKNQKSDLMSEVNICTICER I KSQRNI I
LEELARTDDKKYATQS I LES I FNEDEAVKI L1CD I RVDGKTD QQ IADQ I TRHIDQLS LTTSDDLLT SLIDQS QDKS LL I SQ
I LQT KLGICARADICLAKDIMIKGLSNRQ I VDQLKICHFASTGDTSSDDILICA I LNNAKDICKQAIET I LATRI ERQKAICLLAD
L I TK I ETDQNK I FNLVICSALNGKADDLLNLQKRLNQTKKDIDY I LS P IVNRPSLLDRLNKNGKTTDLNKLANLMNTQGSDL
LDS I PDI PT PKPEKTLTLGKGNGLLSGLLNADGNVSLP1CAGET I KEHWL P I SVIVGAMGVLMIWLSRRNKLKNKA
SEQ ID NO: 93 seqüência de polipeptídeo
MKKLATVGSL IVTSTLVFSSMPFQNAHADTTSMNVSNKQSQNVQNHRPYGGVVPQGM
TQAQYTELEKALPQL SAGSNMQDYNNKLYDATQN IADKYNVI I TTNVGVFKPHAVRD
MNGHALPLTKDGNFYQTNVDANGVNHGGSEMVQNKTGHMSQQGHMNQNTHMNQQPHM
QQGHMQSSNHQMMSPKANMHS SNHQMNQ SNKKVL PAAGE S MT S S I LTAS I AALLLVS
GLFLAFRRRSTNK
15/68
FIGURA 2
SEQ ID NO:34 seqüência de polinucleotídeoATGTTACAAGTAACTGATGTGAGTITACGTTTTGGAGATCGTAAACTATTTGAAGATGTAAATATTAAATTTACAGAAGG
TAATTGTTATGGATTAATTGGTGCGAATGGTGCAGGTAAATCAACATTCTTAAAAATATTATCTGGTGAATTAGATTCTC
AAACAGGACATGTTTCATTAGGTAAAAATGAACGTCTAGCTGTTTTAAAACAGGACCACTATGCTTATGAAGATGAACGC
GTGCTTGATGTTGTAATTAAAGGTCACGAACGTCTTTATGAGGTTATGAAAGAAAAAGATGAAATCTATATGAAGCCAGA
TTTCAGTGATGAAGATGGTATCCGTGCTGCTGAACTTGAAGGTGAATTTGCAGAAATGAATGGTTGGAATGCTGAAGCTG
ATGCTGCTAACCTTTTATCTGGTTTAGGTATCGATCCAACTTTACACGATAAAAAAATGGCTGAATTAGAAAACAACCAA
AAAATTAAAGTATTATTAGCGCAAAGTTTATTCGGTGAACCAGACGTACTATTACTGGATGAGCCTACTAACGGTCTCGA
TATTCCAGCAATCAGTTGGTTAGAAGATTTCTTAATTAACTTTGATAATACTGTTATCGTAGTATCGCATGACCGTCATT
TCTTAAATAATGTATGTACTCATATCGCTGATTTAGACTTCGGTAAAATTAAAGTTTATGTTGGTAACTATGATTTTTGG
TATCAATCTAGTCAGTTAGCTCAAAAGATGGCTCAAGAACAAAACAAGAAAAAAGAAGAAAAAATGAAAGAGTTACAGGA
CTTTATTGCACGTTTCTCAGCTAACGCTTCTAAATCTAAACAAGCAACAAGTCGTAAAAAACAACTTGAGAAAATTGAAT
TAGATGATATTCAACCATCATCAAGAAGATATCCTTTCGTTAAATTCACGCCTGAGCGTGAGATTGGTAACGACTTATTA
ATCGTTCAAAATCTTTCTAAAACAATTGACGGCGAAAAAGTATTAGATAATGTATCATTCACAATGAATCCAAATGATAA
AGCGATTTTAATTGGAGATAGTGAAATTGCAAAAACAACATTACTTAAAATATTAGCTGGCGAAATGGAACCAGACGAAG
GTTCATTTAAATGGGGTGTTACTACATCATTAAGTTACTTCCCTAAAGATAACTCAGAGTTCTTTGAGGGTGTAAATATG
AATCTCGTTGATTGGTTAAGACAATATGCTCCTGAAGATGAACAAACAGAAACATTTTTACGTGGTTTCTTAGGTCGTAT
GTTATTTAGTGGTGAAGAAGTTAAGAAAAAAGCTAGTGTGCTTTCAGGTGGAGAAAAAGTACGTTGTATGCTAAGTAAAA
TGATGTTATCAAGTGCGAATGTACTTTTACTTGACGAACCTACTAACCACTTAGACTTAGA.AAGTATTACTGCTGTCAAT
GATGGTCTTAAATCATTTAAAGGTTCTATCATCTTTACTTCTTATGACTTCGAATTTATCAACACGATTGCAAACCGTGT
TATCGATTTAAATAAACAAGGCGGCGTTTCAAAAGAAATTCCATATGAAGAATACTTGCAAGAAATCGGCGTTTTAAAAT
AA
SEQ ID NO:35 seqüência de polinucleotídeoATGTTACAAGTAACTGATGTAAGTTTACGTTTTGGTGATCGTAAACTATTTGAAGATGTAAATATAAAATTTACAGAGGG
TAATTGTTATGGATTAATTGGTGCAAATGGTGCTGGGAAATCTACATTCTTGAAGATTTTATCAGGCGAAATTGATTCAC
AGACTGGTCATGTATCTCTAGGTAAAGATGAGCGTTTGGCTGTGTTAAAACAAGATCATTTTGCTTATGAAGATGAACGT
GTTTTAGATGTTGTGATTAAAGGACATGAACGTTTGTATCAAGTGATGAAAGAGAAAGATGAAATTTATATGAAACCTGA
TTTCAGCGATGAGGACGGTATTCGCGCTGCAGAACTTGAAGGAGAATTTGCAGAAATGAACGGTTGGAATGCTGAAGCTG
ATGCTGCTAACTTATTATCAGGATTAGGCATAGAACCTGACTTACATGATAAAAATATGTCTGAACTTGAAA.ATAATCAA
AAAGTTAAGGTATTGTTAGCTCAAAGTTTATTTGGTGATCCTGACGTTCTTTTACTAGATGAGCCTACCAATGGTTTAGA
TATACCAGCAATAAGTTGGTTAGAAGACTTTTTAATTAATTTTGAAAATACTGTCATTGTCGTTTCGCATGACCGTCACT
TCTTAAATAATGTTTGTACTCATATTGCTGATTTAGACTTTGGCAAAATTAAACTTTATGTTGGTAACTATGATTTTTGG
TATCAATCAAGTCAATTAGCACAAAAAATGGCACAAGAACAAAATAAGAAAAAAGAAGAAAAAATGAAAGAGTTACAGGA
TTTCATCGCACGCTTCTCAGCAAATGCTTCTAAATCTAAACAGGCAACAAGTCGTAAGAAACAATTAGAAAAAATTGAAT
TAGATGATATCCAGCCATCATCTCGTAGATACCCTTACGTGAAATTTACTCCTGAACGTGAAATTGGAAATGATTTACTT
ACAGTAGAAAATCTTTCTAAAACAATTGACGGCGAAAAAGTACTAGACAATGTTTCATTCACTATGAATCCTAATGATAA
AGCTATTTTAGTTGGTGATAGCGAAATTGCTAAAACAACATTGTTAAAAATTTTAGCTGGAGAAATGGAACCAGATGAAG
GTACATTTAAATGGGGTGTAACGACATCTTTAAGTTACTTCCCTAAAGATAACTCTGAGTTCTTTGATGGTGTCGATATG
AATTTAGTTGAATGGTTACGTCAATACGCTCCAGAAGATGAACAAACTGAAACATTTTTACGTGGTTTCTTAGGTCGCAT
GTTATTTAGTGGTGAGGAAGTTAAGAAAAAAGCAAGCGTGCTTTCAGGTGGAGAAAAAGTACGTTGCATGTTAAGTAAAA
TGATGTTATCAAGTGCTAACGTACTTTTACTTGATGAGCCAACAAACCATTTAGATTTGGAAAGTATCACTGCTGTAAAT
GACGGATTAAAATCATTTAAAGGTTCTATCATCTTCACTTCTTATGATTTTGAATTTATTAATACAATCGCAAATCGAGT
GATTGACTTGAATCAAGCTGGTGCCCTTTCTAAAGAAGTACCTTATGAGGAATACTTACAAGAAATTGGTGTATTACAAA
ATAATTAA
SEQ ID NO:36 seqüência de polinucleotídeoATGCCAATTATTACAGATGTTTACGCTCGCGAAGTCTTAGACTCTCGTGGTAACCCAACTGTTGAAGTAGAAGTATTAAC
TGAAAGTGGCGCATTTGGTCGTGCATTAGTACCATCAGGTGCTTCAACTGGTGAACACGAAGCTGTTGAATTACGTGATG
GAGACAAATCACGTTATTTAGGTAAAGGTGTTACTAAAGCAGTTGAAAACGTTAATGAAATCATCGCACCAGAAATTATT
GAAGGTGAATTTTCAGTATTAGATCAAGTATCTATTGATAAAATGATGATCGCATTAGACGGTACTCCAAACAAAGGTAA
ATTAGGTGCAAATGCTATTTTAGGTGTATCTATCGCAGTAGCACGTGCAGCAGCTGACTTATTAGGTCAACCACTTTACA
AATATTTAGGTGGATTTAATGGTAAGCAGTTACCAGTACCAATGATGAACATCGTTAATGGTGGTTCTCACTCAGATGCT
CCAATTGCATTCCAAGAATTCATGATTTTACCTGTAGGTGCTACAACGTTCAAAGAATCATTACGTTGGGGTACTGAAAT
TTTCCACAACTTAAAATCAATTTTAAGCAAACGTGGTTTAGAAACTGCAGTAGGTGACGAAGGTGGTTTCGCTCCTAAAT
TTGAAGGTACTGAAGATGCTGTTGAAACAATTATCCAAGCAATCGAAGCAGCTGGTTACAAACCAGGTGAAGAAGTATTC
16/68
TTAGGATTTGACTGTGCATCATCAGAATTCTATGAAAATGGTGTATATGACTACAGTAAGTTCGAAGGCGAACACGGTGC
AAAACGTACAGCTGCAGAACAAGTTGACTACTTAGAACAATTAGTAGACAAATATCCTATCATTACAATTGAAGACGGTA
TGGACGAAAACGACTGGGATGGTTGGAAACAACTTACAGAACGTATCGGTGACCGTGTACAATTAGTAGGTGACGATTTA
TTCGTAACAAACACTGAAATTTTAGCAAAAGGTATTGAAAACGGAATTGGTAACTCAATCTTAATTAAAGTTAACCAAAT
CGGTACATTAACTGAAACATTTGATGCAATCGAAATGGCTCAAAAAGCTGGTTACACAGCAGTAGTTTCTCACCGTTCAG
GTGAAACAGAAGATACAACAATTGCTGATATTGCTGTTGCTACAAACGCTGGTCAAATTAAAACTGGTTCATTATCACGT
ACTGACCGTATTGCTAAATACAATCAATTATTACGTATCGAAGATGAATTATTTGAAACTGCTAAATATGACGGTATCAA
ATCATTCTATAACTTAGATAAATAA
SEQ ID NO:37 seqüência de polinucleotídeoATGCCAATTATTACAGATGTTTACGCTCGCGAAGTCTTAGACTCACGTGGTAACCCAACAGTTGAAGTTGAAGTATTAAC
TGAAAGCGGTGCTTTCGGACGTGCATTAGTACCTTCTGGTGCTTCTACTGGTGAACATGAAGCAGTTGAATTACGTGATG
GAGATAAATCACGTTATTTAGGTAAAGGTGTGACTAAAGCGGTAGAAAATGTTAACGAAATGATCGCACCAGAAATCGTT
GAAGGTGAATTTTCAGTTTTAGATCAAGTATCTATTGATAAAATGATGATTCAATTAGACGGTACACACAACAAAGGTAA
ATTAGGTGCAAATGCCATTTTAGGTGTTTCTATTGCCGTAGCTCGTGCAGCTGCTGACTTATTAGGTCAACCATTATATA
AATATTTAGGTGGATTTAATGGTAAACAATTGCCAGTACCTATGATGAATATTGTTAATGGTGGTTCTCACTCAGATGCA
CCAATTGCTTTCCAAGAGTTCATGATTTTACCTGTAGGTGCTGAGTCATTCAAAGAATCATTACGTTGGGGTGCAGAAAT
CTTCCATAACCTTAAATCAATCTTAAGTGAACGTGGTTTAGAAACTGCAGTAGGTGATGAAGGTGGTTTCGCTCCTAGAT
TTGAAGGCACTGAAGACGCTGTAGAAACTATTATTAAAGCTATCGAAAAAGCAGGATACAAACCAGGTGAAGATGTATTC
TTAGGATTTGACTGTGCTTCTTCTGAATTCTATGAAAATGGTGTTTATGATTACACTAAATTCGAAGGTGAACACGGTGC
TAAACGTAGTGCAGCAGAGCAAGTTGACTACTTAGAAGAATTAATTGGTAAATATCCAATCATCACTATTGAAGATGGTA
TGGATGAAAACGATTGGGAAGGTTGGAAACAATTAACTGATCGTATCGGTGATAAAGTTCAATTAGTTGGTGATGATTTA
TTCGTAACTAACACTGAAATTTTATCTAAAGGTATCGAACAAGGTATTGGTAACTCAATCTTAATCAAAGTAAACCAAAT
CGGTACATTAACTGAAACATTCGATGCTATTGAAATGGCTCAAAAAGCTGGATATACTGCGGTTGTATCTCACCGTTCTG
GTGAAACTGAAGATACTACAATTGCTGATATCGCAGTTGCTACAAATGCAGGCCAAATTAAAACAGGTTCATTATCTAGA
ACTGACCGTATTGCTAAATACAATCAATTATTACGTATTGAAGATGAATTATACGAAACAGCTAAATTTGAAGGAATTAA
ATCTTTCTACAATTTAGATAAATAA
SEQ ID NO:38 seqüência de polinucleotídeoATGAAAAAAATCGTTACAGCTACAATCGCTACAGCAGGACTTGCCACTATCGCATTTGCAGGACATGATGCACAAGCCGC
AGAACAAAATAACAATGGATATAATTCTAATGACGCTCAATCATACAGCTATACGTATACAATTGATGCACAAGGTAATT
ATCATTACACTTGGACAGGAAATTGGAATCCAAGTCAATTAACGCAAAACAACACATACTACTACAACAACTACAATACT
TATAGTTATAACAATGCATCTTACAATAACTACTATAATCATTCATATCAATACAATAACTATACAAACAATAGCCAAAC
AGCAACAAATAACTATTATACTGGTGGTTCAGGTGCAAGTTATAGCACAACAAGTAATAATGTTCATGTGACTACAACTG
CAGCGCCATCTTCAAATGGTCGTTCAATTTCTAATGGTTATGCATCAGGAAGTAACTTATATACTTCAGGACAATGTACT
TATTATGTATTTGATCGTGTTGGTGGGAAAATTGGTTCAACATGGGGTAACGCAAGTAATTGGGCTAACGCAGCTGCATC
ATCTGGCTATACAGTGAACAATACACCAAAAGTTGGTGCTATCATGCAAACAACACAAGGCTATTACGGTCATGTTGCTT
ACGTTGAAGGCGTTAACAGCAACGGTTCTGTTCGTGTTTCAGAAATGAACTATGGACATGGTGCTGGTGTGGTTACGTCT
CGTACAATTTCAGCAAACCAAGCAGGTTCATATAATTTCATTCATTAA
SEQ ID NO:39 seqüência de polinucleotídeoATGAAGAAAATCGCTACAGCTACTATCGCAACTGCAGGATTCGCTACAATCGCAATTGCATCAGGAAATCAAGCTCATGC
TTCTGAGCAAGATAACTACGGTTATAATCCAAACGACCCAACATCATATAGCTATACTTACACTATTGATGCACAAGGTA
ACTACCATTACACATGGAAAGGTAACTGGCATCCAAGTCAATTAAACCAAGATAATGGCTACTACAGCTATTACTACTAC
AATGGCTACAATAACTACAACAATTACAACAATGGTTATAGCTACAATAATTACAGCCGTTACAACAACTACTCAAATAA
TAATCAATCATATAACTACAATAACTATAATAGTTACAACACAAACAGCTACCGTACTGGTGGTTTAGGTGCAAGCTACA
GCACTTCAAGCAACAATGTTCAAGTAACTACAACTATGGCTCCATCATCAAATGGCCGTTCAATCTCAAGTGGTTATACT
TCAGGACGTAACTTATACACTTCTGGTCAATGTACATACTACGTATTTGATCGTGTAGGTGGTAAAATCGGTTCAACTTG
GGGCAATGCAAGTAACTGGGCTAACGCAGCTGCAAGAGCTGGTTACACAGTGAACAATACACCAAAAGCTGGTGCAATTA
TGCAAACAACTCAAGGTGCATACGGTCACGTTGCATACGTTGAAAGTGTTAACAGCAATGGTTCAGTAAGAGTTTCAGAA
ATGAACTATGGTTATGGCCCAGGTGTTGTAACTTCACGTACAATCTCAGCTAGCCAAGCTGCTGGTTATAACTTCATTCA
CTAA
SEQ ID NO:40 seqüência de polinucleotídeoATGAAAAAAATCGCTACAGCTACAATTGCAACTGCAGGAATCGCTACTTTCGCATTTGCACACCATGACGCACAAGCAGC
AGAACAAAATAATGATGGGTACAATCCAAACGACCCTTATTCATATAGCTACACTTACACAATCGATGCTGAAGGTAACT
ACCACTACACTTGGAAAGGTAACTGGAGTCCAGATCGTGTAAATACTTCATATAACTATAATAATTATAATAACTACAAC
TACTATGGTTACAATAACTATAGCAACTACAATAACTACAGTAATTACAACAATTACAACAACTATCAATCAAACAACAC
GCAATCACAAAGAACAACTCAACCGACTGGTGGTTTAGGCGCAAGCTATTCAACATCAAGTAGTAATGTTCACGTTACAA
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CAACTTCTGCGCCATCATCAAACGGTGTATCTTTATCAAACGCTCGCTCAGCATCTGGTAACTTATACACTTCAGGTCAA
TGTACATATTATGTATTTGACAGAGTAGGTGGCAAAATCGGTTCAACGTGGGGTAACGCAAACAACTGGGCAAACGCTGC
AGCACGTTCTGGTTACACAGTAAACAATTCGCCTGCTAAAGGTGCAATCTTACAAACGTCACAAGGTGCATACGGACACG
TAGCATACGTTGAAGGTGTAAACAGCAATGGTTCAATCAGAGTTTCAGAAATGAACTACGGTCACGGTGCAGGTGTTGTC
ACTTCACGTACAATCTCTGCGAGCCAAGCTGCTTCATATAACTATATTCACTAA
SEQ ID NO:41 seqüência de polinucleotídeoATGAAAAAATTAGTACCTTTATTATTAGCCTTATTACTTCTAGTTGCTGCATGTGGTACTGGTGGTAAACAAAGCAGTGA
TAAGTCAAATGGCAAATTAAAAGTAGTAACGACGAATTCAATTTTATATGATATGGCTAAAAATGTTGGTGGAGACAACG
TCGATATTCATAGTATTGTACCTGTTGGTCAAGATCCTCATGAATATGAAGTTAAACCTAAAGATATTAAAAAGTTAACT
GACGCTGACGTTATTTTATACAACGGATTAAATTTAGAGACTGGTAACGGTTGGTTTGAAAAAGCCTTAGAACAGGCTGG
TAAATCATTAAAAGATAAAAAAGTTATCGCAGTATCAAAAGATGTTAAACCTATCTATTTAAACGGTGAAGAAGGCAACA
AAGATAAACAAGATCCACACGCATGGTTAAGTTTAGATAATGGTATTAAATACGTAAAAACAATTCAACAAACATTTATC
GATAACGACAAAAAACATAAAGCAGATTATGAAAAGCAAGGTAACAAATACATTGCTCAATTGGAAAAATTAAATAATGA
CAGTAAAGACAAATTTAATGACATTCCAAAAGAACAACGTGCCATGATTACAAGTGAAGGTGCCTTCAAGTACTTCTCAA
AACAATACGGTATTACACCAGGTTATATTTGGGAAATTAACACTGAAAAACAAGGTACACCTGAACAAATGAGACAAGCT
ATTGAGTTTGTTAAAAAGCACAAATTAAAACACTTATTAGTAGAAACAAGTGTTGATAAGAAAGCAATGGAAAGTTTATC
TGAAGAAACGAAGAAAGATATCTTTGGTGAAGTGTACACAGATTCAATCGGTAAAGAAGGCACTAAAGGTGACTCTTACT
ACAAAATGATGAAATCAAATATTGAAACTGTACACGGAAGCATGAAATAA
SEQ ID NO:42 seqüência de polinucleotídeoGTGAAAAAAATTCTCGCTTTAGCAATAGCATTTTTAATTATCCTTGCCGCATGTGGGAATCACAGTAACCATGAACATCA
CTCACATGAAGGAAAATTAAAAGTTGTAACTACAAACTCTATTCTCTATGACATGGTTAAACGTGTCGGTGGAAATAAGG
TCGATGTTCATAGCATCGTTCCAGTAGGACAAGACCCACATGAATATGAGGTTAAACCTAAAGATATTAAAGC.ATTAACA
GATGCTGACGTTGTATTTTATAACGGTTTAAACCTAGAAACTGGAAATGGTTGGTTTGAAAAAGCACTTGACCAAGCAGG
AAAATCAACAAAAGATAAAAATGTGATAGCAGCATCAAATAATGTTAAACCAATATACTTAAATGGTGAGGAAGGTAACA
AAAACAAACAAGATCCACATGCATGGTTAAGTTTAGAGAATGGAATTAAATACGTAAAAACAATACAAAAATCACTAGAA
CATCATGATAAAAAAGATAAGTCTACATATGAAAAACAAGGGAATGCATATATATCAAAATTAGAAGAACTTAATAAAGA
TAGTAAAAATAAATTTGATGACATACCCAAAAATCAACGTGCCATGATGACAAGTGAAGGTGCATTTAAATATTTTGCTC
AACAATTCGATGTTAAACCAGGTTATATTTGGGAGATAAACACAGAAAAACAAGGTACACCTGGTCAAATGAAACAAGCC
ATTAAATTTGTTAAAGATAATCATTTAAAACATTTATTAGTCGAAACAAGCGTAGATAAAAAAGCTATGCAAAGTTTATC
AGAAGAAACTAAGAAAGATATTTATGGTGAAGTATTTACCGACTCTATAGGTAAGGAAGGTACTAAAGGTGACTCATACT
ATAAAATGATGAAATCTAATATTGATACAATACATGGTAGTATGAAATAA
SEQ ID NO:43 seqüência de polinucleotídeoATGAAAAAGACAATTATGGCATCATCATTAGCAGTGGCATTAGGTGTAACAGGTTACGCAGCAGGTACAGGACATCAAGC
ACACGCTGCTGAAGTAAACGTTGATCAAGCACACTTAGTTGACTTAGCGCATAATCACCAAGATCAATTAAATGCAGCTC
CAATCAAAGATGGTGCATATGACATCCACTTTGTAAAAGATGGTTTCCAATATAACTTTACTTCAAATGGTACTACATGG
TCATGGAGCTATGAAGCAGCTAATGGTCAAACTGCTGGTTTCTCAAACGTTGCAGGTGCAGACTACACTACTTCATACAA
CCAAGGTTCAGATGTACAATCAGTAAGCTACAATGCACAATCAAGTAACTCAAACGTTGAAGCTGTTTCAGCTCCAACTT
ACCATAACTACAGCACTTCAACTACTTCAAGTTCAGTGAGATTAAGCAATGGTAATACTGCAGGTGCTACTGGTTCATCA
GCAGCTCAAATCATGGCTCAACGTACTGGTGTTTCAGCTTCTAC.ATGGGCTGCAATCATCGCTCGTGAATCAAATGGTCA
AGTAAATGCTTACAACCCATCAGGTGCTTCAGGTTTATTCCAAACTATGCCAGGTTGGGGTCCGACAAACACTGTTGACC
AACAAATCAACGCAGCTGTTAAAGCATACAAAGCACAAGGTTTAGGTGCTTGGGGATTCTAA
SEQ ID NO:44 seqüência de polinucleotídeoATGAAAAAAACAGTTATCGCTTCTACATTAGCAGTATCTTTAGGAATTGCAGGTTACGGTTTATCAGGACATGAAGCACA
CGCTTCAGAAACTACAAACGTTGATAAAGCACACTTAGTAGATTTAGCACAACATAATCCTGAAGAATTAAATGCTAAAC
CAGTTCAAGCTGGTGCTTACGATATTCATTTCGTAGACAATGGATACCAATACAACTTCACTTCAAATGGTTCTGAATGG
TCATGGAGCTACGCTGTAGCTGGTTCAGATGCTGATTACACAGAATCATCATCAAACCAAGAAGTAAGTGCAAATACACA
ATCTAGTAACACAAATGTACAAGCTGTTTCAGCTCCAACTTCTTCAGAAAGTCGTAGCTACAGCACATCAACTACTTCAT
ACTCAGCACCAAGCCATAACTACAGCTCTCACAGTAGTTCAGTAAGATTATCAAATGGTAATACTGCTGGTTCTGTAGGT
TCATATGCTGCTGCTCAAATGGCTGCACGTACTGGTGTATCTGCTTCAACATGGGAACACATCATTGCTAGAGAATCAAA
TGGTCAATTACATGCACGTAATGCTTCAGGTGCTGCTGGATTATTCCAAACTATGCCAGGTTGGGGTTCAACTGGTTCAG
TAAATGATCAAATCAATGCCGCTTATAAAGCATATAAAGCACAAGGTTTATCTGCTTGGGGTATGTAA
SEQ ID NO:45 seqüência de polinucleotídeoGTGAATTATCGTGATAAAATTCAAAAGTTTAGTATTCGTAAATATACAGTTGGTACATTTTCAACTGTCATTGCGACATT
GGTATTTTTAGGATTCAATACATCACAAGCACATGCTGCTGAAACAAATCAACCAGCAAGCGTGGTTAAACAGAAACAAC
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AAAGTAATAATGAACAGACTGAGAATCGAGAATCTCAAGTACAAAATTCTCAAAATTCACAAAATAGTCAATCATTATCC
GCTACTCATGAAAATGAGCAACCAAATAATAGTCAAGCTAATTTAGTAAATCAAAAAGTAGCGCAATCATCTACTACTAA
TGATGAACAACCAGCATCTCAAAATGTAAATACAAAGAAAGATTCGGCAACGGCTGCGACAACACAACCAGATAAAGAAG
AAAGTAAGCATAAACAAAACGAAAGTCAATCTGCTAATAAAAATGGAAACGACAATAGAGCGGCTCATGTAGAAAATCAT
GAAGCAAATGTAGTAACAGCTTCAGATTCATCTGATAATGGTAACGTACAACATGACCGAAATGAATTACAAGCATTTTT
TGATGCAAATTATCATGATTATCGCTTTATTGACCGTGAAAATGCAGATTCTGGCACATTTAACTATGTAAAAGGCATTT
TTGACAAGATTAATACTTTATTAGGCAGTAATGATCCAATTAACAATAAAGACTTGCAACTTGCATACAAAGAATTGGAA
CAAGCTGTTGCTTTAATTCGTACAATGCCTCAACGTCAACAAACTAGCCGTCGATCAAACAGAATTCAAACGCGTTCTGT
TGAGTCTAGAGCTGCAGAGCCTAGATCAGTATCAGACTATCAAAATGCAAATTCATCATATTATGTTGAAAATGCTAATG
ATGGTTCAGGATATCCTGTAGGTACATATATCAATGCTTCTAGTAAAGGGGCGCCATATAATTTACCAACTACACCATGG
AATACATTGAAGGCCTCTGACTCAAAGGAAATTGCTCTTATGACAGCGAAACAAACTGGAGATGGCTACCAATGGGTTAT
TAAGTTTAATAAAGGACATGCTCCACATCAAAATATGATTTTCTGGTTTGCATTACCAGCAGACCAAGTGCCAGTAGGAA
GAACTGACTTTGTAACAGTTAATTCAGATGGAACAAATGTACAATGGAGTCATGGAGCAGGAGCAGGTGCAAATAAACCA
CTTCAACAAATGTGGGAATATGGAGTAAATGATCCTGATCGTTCACATGACTTTAAAATAAGAAATAGAAGTGGCCAAGT
AATATATAGCTGGCCAACTGTCCATGTTTATTCTTTAGAAGATTTATCTAGAGCGAGTGATTATTTTAGTGAAGCTGGAG
CGACACCTGCTACTAAAGCATTTGGTAGACAAAATTTTGAATATATTAATGGTCAAAAACCTGCTGAATCACCGGGTGTT
CCTAAAGTTTATACTTTCATCGGTCAAGGTGATGCAAGTTATACAATTTCATTTAAAACACAAGGTCCAACrGTTAATAA
ATTGTATTATGCAGCAGGTGGGCGTGCTTTAGAGTACAATCAATTATTTATGTACAGTCAACTATACGTCGAATCAACGC
AAGACCATCAACAACGTCTTAATGGTTTAAGACAAGTGGTTAATCGTACATATCGCATAGGTACAACTAAACGTGTAGAA
GTGAGTCAAGGAAATGTACAAACGAAAAAGGTATTAGAAAGTACAAACCTAAA.TATAGATGATTTTGTTGATGATCCTTT
AAGTTATGTTAAGACGCCGAGTAATAAAGTGTTAGGTTTTTACCCAACTAATGCAAATACTAACGCTTTTAGACCGGGGG
GCGTTCAAGAATTAAATGAATATCAATTAAGTCAATTATTTACTGATCAAAAATTACAAGAAGCAGCAAGAACTAGAAAC
CCAATAAGATTAATGATTGGTTTCGACTATCCTGATGGTTATGGTAATAGTGAAACTTTAGTTCCTGTTAACTTAACGGT
ATTACCTGAAATCCAACATAATATTAAATTCTTTAAAAATGACGATACTCAAAATATTGCTGAAAAACCATTTTCAAAAC
AAGCTGGGCATCCAGTTTTCTATGTATATGCAGGTAACCAAGGGAATGCTTCCGTGAATTTAGGTGGTAGCGTAACATCT
ATTCAACCATTACGTATTAATTTAACAAGTAATGAGAATTTTACAGATAAAGATTGGCAAATTACAGGTATTCCGCGTAC
ATTACACATTGAAAACTCGACAAATAGAACTAATAATGCTAGAGAACGTAACATTGAACTTGTTGGTAATTTATTACCAG
GGGATTACTTTGGTACGATACGTTTTGGACGTAAAGAACAATTATTTGAAATTCGTGTTAAACCACATACACCAACAATT
ACAACGACAGCTGAGCAATTAAGAGGTACAGCATTACAAAAAGTGCCTGTTAATAITTCGGGAATACCGTTGGATCCATC
GGCATTGGTTTATTTAGTTGCACCAACAAATCAAACTACGAATGGTGGTAGTGAGGCAGATCAAATACCATCTGGTTATA
CGATACTTGCGACTGGTACACCTGATGGGGTGCATAATACAATTACTATACGACCGCAAGATTATGTTGTATTCATACCA
CCTGTAGGTAAACAAATTAGAGCAGTAGTTTATTATAATAAAGTAGTTGCATCTAATATGAGTAATGCTGTTACTATTTT
GCCAGATGACATTCCACCAACAATCAATAATCCTGTTGGAATAAATGCCAAATACTATCGAGGCGACGAAGTCAACTTTA
CAATGGGAGTCTCTGATAGACATTCTGGTATAAAAAATACAACTATTACTACTTTGCCAAGTGGTTGGACATCAAATTTA
ACTAAATCCGACAACAAAAACGGCTCATTAGCTATTACAGGTAGAGTCTCTATGAATCAGGCATTTAACAGTGATATTAC
ATTTAAAGTATCAGCGACAGACAATGTCAATAATACGACAAATGATAGTCAATCTAAACATGTGTCAATTCATGTAGGTA
AAATTAGTGAAGATGCTCATCCGATTGTATTAGGAAATACTGAGAAAGTTGTAGTAGTCAATCCGACTGCTGTATCTAAT
GATGAAAAGCAAAGCATAATTACTGCCTTTATGAATAAAAACCAAAATATAAGAGGATATTTAGCATCAACTGATCCAGT
AACTGTCGATAATAATGGTAACGTCACATTACATTACCGTGATGGCTCATCAACAACGCTTGATGCTACAAATGTGATGA
CATACGAACCAGTTGTGAAATCTGAATATCAAACTGCCAATGCTGCTAAAACAGCAACGGTAACGATTGCTAAAGGACAA
TCATTTAATATTGGTGATATTAAACAATATTTTACTTTAAGTAATGGACAAGCTATTCCAAATGGCACATTTACAAATAT
TACATCTGATAGAACTATTCCAACTGCACAAGAAGTTAGTCAAATGAATGCAGGTACGCAGTTATATCATATAGTTGCTT
CAAATGCATATCATAAAGACACTGAAGATTTCTATATTAGTTTAAAAATCGTTGATGTGAAACAACCTGAAGGCGATCAA
CGTGTCTATCGTACGTCAACATATGATTTAACCACTGATGAAATCTCAAAAGTAAAACAAGCTTTTATTAATGCAAATAG
AGATGTAATTACGCTTGCCGAAGGTGATATTTCAGTTACAAATACACCTAATGGTGCTAATGTAAGTACTATTACAGTAA
ATATTAATAAAGGTCGATTAACGAAATCATTCGCGTCTAACCTAGCTAATATGAATTTCTTGCGTTGGGTTAATTTCCCA
CAAGATTATACAGTGACATGGACGAATGCAAAAATTGCAAACAGACCAACAGATGGTGGTTTATCATGGTCCGATGACCA
TAAATCTTTAATTTATCGTTATGATGCTACATTAGGCACACAAATTACAACTAATGATATTTTAACGATGCTAAAAGCGA
CTACTACAGTGCCTGGATTGCGTAATAATATTACTGGTAATGAAAAAGCACAAGCAGAAGCAGGTGGAAGACCAAACTAT
AGAACAACTGGTTATTCACAATCAAATGCGACAACTGATGGTCAACGTCAATTTACGTTGAATGGTCAAGTGATTCAAAT
ATTAGACATCATCAACCCTTCAAACGGTTATGGTGGGCAACCTGTTACAAATTCAAATACTCGTGCAAACCATAGTAACT
CAACTGTTGTTAACGTAAACGAACCGGCAGCTAATGGTGCTGGCGCATTTACAATTGACCACGTTGTAAAAAGTAATTCT
ACACATAATGCAAGTGATGCAGTTTATAAAGCGCAGTTATACTTAACGCCATATGGTCCAAAACAATATGTTGAACATTT
AAATCAAAATACAGGAAATACTACTGACGCTATTAACATTTATTTTGTACCAAGTGACTTAGTGAATCCAACAATTTCAG
TAGGTAATTACACTAATCATCAAGTGTTCTCAGGTGAAACATTTACAAATACGATTACAGCGAATGATAACTTTGGTGTG
CAATCGGTAACTGTACCAAATACATCACAAATTACAGGTACTGTTGATAATAACCATCAACATGTTTCTGCAACGGCACC
AAATGTGACATCAGCAACTAGTAAGACAATCAATTTATTAGCAACTGATACAAGTGGTAATACAGCTACAACTTCATTCA
ATGTAACAGTGAAACCTTTGCGTGATAAATATCGAGTTGGTACTTCATCAACGGCTGCTAATCCTGTTAGAATTGCCAAT
ATTTCGAATAATGCGACAGTATCACAAGCTGATCAAACGACAATTATTAATTCGTTAACGTTTACAAGTAATGCACCAAA
TAGAAACTATGCAACAGCAAGCGCAAATGAAATCACTAGTAAAACAGTTAGTAATGTCAGTCGTACTGGAAATAATGCCA
ATGTCACAGTAACTGTTACTCATCAAGATGGAACAACATCAACAGTGACTGTACCTGTAAAGCATGTCATTCCAGAAATC
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GTTGCACATTCGCATTACACTGTACAAGGCCAAGACTTCCCAGCAGGTAATGGTTCTAGTGCAGCAGATTACTTTAAGTT
ATCTAATGGTAGTGCCATTCCAGATGCAACGATTACATGGGTAAGTGGACAAGCGCCAAATAAAGATAATACACGTATTG
GTGAAGATATAACAGTAACTGCACATATCTTAAT'TGATGGCGAAACAACGCCGATTACGAAAACAGCAACATATAAAGTA
GTAAGAACTGTACCGAAACATGTCTTTGAAACAGCCAGAGGTGTTTTATACCCAGGTGTTTCAGATATGTATGATGCGAA
ACAATATGTTAAGCCAGTAAATAATTCTTGGTCGACAAATGCGCAACATATGAATTTTCAATTTGTTGGAACATATGGTC
CTAACAAAGATGTTGTAGGTATATCAACGCGTCTTATTAGAGTGACTTATGATAATAGACAAACTGAAGATTTAACTATT
TTATCTAAAGTTAAACCTGACCCACCAAGAATTGACGCAAACTCTGTGACATATAAAGCAGGTCTTACAAACCAAGAAAT
TAAAGTTAATAACGTATTAAATAACTCGTCAGTAAAATTATTTAAAGCAGATAATACACCATTAAATGTCACAAATATTAcTCATGGTAGTGGTTTTAGTTCGGTTGTGACAGTAAGTGACGCGTTACCAAATGGCGGAATTAAAGCAAAATCTTcAATT
TCAATGAACAATGTGACGTATACGACGCAAGACGAACATGGTCAAGTTGTTACAGTAACAAGAAATGAATCTGTTGATTC
AAATGATAGTGCTTCTGTTACAGTAACACCACAATTACAAGCAACTACTGAAGGCGCTGTATTTATTAAAGGTGGCGACG
GTTTTGATTTCGGTCATGTAGAACGATTTATTCAAAATCCGCCACATGGGGCAACGGTCGCATGGCATGATAGTCCAGAT
ACATGGAAGAATACAGTCGGCAACACACATAAAACTGCGGTTGTAACATTACCTAGTGGTCAAGGTACGCGTAATGTTGA
AGTTCCAGTCAAAGTTTATCCAGTTGCTAATGCTAAGGCGCCATCACGTGATGTGAAAGGTCAAAATTTGACACATGGTA
CAAACGCTATTGATTACATTACATTTGATCCAAATACTAATACGAATGGTATTACAGCAGCATGGGCAAATAGACAACAA
CCAAATAACCAGCAAGCAGGCGTTCAACATTTAAATGTCGATGTCACATATCCAGGTATTTCAGCTGCTAAACGAGTTCC
TGTAACTGTGAACGTATATCAATTTGAATTCCCTCAAACTACTTATACAACAACAGTTGGTGGCACTTTAGCAAGTGGTA
CGCAAGCATCAGGATATGCACATATGCAAAACGCTTCAGGTTTACCAACAGATGGATTTACGTATAAATGGAATCGTGAT
ACTACGGGTACAAACGATGCAAACTGGGCAGCAATGAATAAACCAAATACTGCACAAGTCGTTAATGCAAAATATGATGT
CATCTATAATGGACATACATTTGCAACATCTTTACCAGCGAAATTTGTAGTAAAAGATGTTCAACCAGCGAAACCAACTG
TCACTGAAACAGCGGCAGGAGCGATTACAATTGCACCTGGTGCGAACCAAACAGTCAATACTCATGCTGGTAATGTTACG
ACATATGCTGACAAATTAGTTATTAAACGTAATGGAAATGTTGTAACGACATTTACACGTCGTAATAATACGAGCCCATG
GGTGAAAGAAGCATCAGCAGATAATGTAACAGGTATTGTTGGAACTAATAATGGTATTACTGTGGCAGCAGGTACTTTCA
ATCCTGCTGATACAATTCAAGTTGTTGCAACACAAGGTAGTGGCGAAACAATCAGTGACGAGCAACGTAGTGATGATTTC
ACAGTTGTCGCACCACAACCGAACCAAGCGACTACGAAAATTTGGCAAAATGGTCATATTGATATCACGCCTAATAATCC
ATCAGGACATTTAATTAATCCAACACAAGCAATGGATATTGCTTACACTGAAAAAGTGGGTAATGGTGCAGAACATAGTA
AGACAATTAATGTTGTTCGTGGTCAAAATAATCAATGGACAATTGCGAATAAGCCTGACTATGTAACGTTAGATGCACAA
ACTGGTAAAGTGACGTTCAATGCCAATACTATAAAACCAAATTCATCAATCACAATTACTCCGAAAGCAGGTACAGGTCA
CTCAGTAAGTAGTAATCCAAGTACATTAACTGCACCGGCAGCTCATACTGTCAACACAACTGAAATTGTGAAAGATTATG
GTTCAAATGTAACAGCAGCTGAAATTAACAATGCAGTTCAAGTTGCTAATAAACGTACTGCAACGATTAAAAATGGCACA
GCAATGCCTACTAATTTAGCTGGTGGTAGCACAACGACGATTCCTGTGACAGTAACTTACAATGATGGTAGTACTGAAGA
AGTACAAGAGTCCATTTTCACAAAAGCGGATAAACGTGAGTTAATCACAGCTAAAAATCATTTAGATGATCCAGTAAGCA
CTGAAGGTAAAAAGCCAGGTACAATTACGCAGTACAATAATGCAATGCATAATGCGCAACAACAAATCAATACCGCGAAA
ACAGAAGCACAACAAGTGATTAATAATGAGCGTGCAACACCACAACAAGTTTCTGACGCACTAACTAAAGTTCGTGCAGC
ACAAACTAAGATTGATCAAGCTAAAGCATTACTTCAAAATAAAGAAGATAATAGCCAATTAGTAACGTCTAAAAATAACT
TACAAAGTTCTGTGAACCAAGTACCATCAACTGCTGGTATGACGCAACAAAGTATTGATAACTATAATGCGAAGAAGCGT
GAAGCAGAAACTGAAATAACTGCAGCTCAACGTGTTATTGACAATGGCGATGCAACTGCACAACAAATTTCAGATGAAAA
ACATCGTGTCGATAACGCATTAACAGCATTAAACCAAGCGAAACATGATTTAACTGCAGATACACATGCCTTAGAGCAAG
CAGTGCAACAATTGAATCGCACAGGTACAACGACTGGTAAGAAGCCGGCAAGTATTACTGCTTACAATAATTCGATTCGT
GCACTTCAAAGTGACTTAACAAGTGCTAAAAATAGCGCTAATGCTATCATTCAGAAGCCAATAAGAACAGTGCAAGAGGT
ACAATCTGCGTTAACAAATGTAAATCGTGTCAATGAGCGATTAACGCAAGCAATTAATCAATTAGTACCTTTAGCTGATA
ATAGTGCTTTAAGAACTGCTAAGACGAAACTTGATGAAGAAATCAATAAATCAGTAACTACTGATGGTATGACACAATCA
TCAATCCAAGCATATGAAAATGCTAAACGTGCAGGTCAAACAGAAACAACAAATGCACAAAATGTTATTAACAATGGTGA
CGCGACAGACCAACAAATTGCCGCAGAAAAAACAAAAGTAGAAGAAAAATATAATAGCTTAAAACAAGCAATTGCTGGAT
TAACACCAGACTTGGCACCATTACAAACTGCAAAAACTCAGTTGCAAAATGATATTGATCAGCCAACGAGTACGACTGGT
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CAAACAGGTTCCAATTCAGATAAAGCAGCAGTTGACCGTGCATTACAACAAGTAACAAGTACGAAAGATGCATTGAATGG
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CTGCGTTAGAAGGTCAAATCAATCAAGCGACGACTGTTGATGGCGTTAATACTGTAAAAACAAATGCCAATACATTAGAC
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AAATCAAGTCAATACAACAAAAGCAGCGTTAAATGGTGCACAAAACTTAGCTCAAGCTAAAACAAATGCGACGAACACAA
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GCAAATAACGTTCAACATACAGCTACTGAATTGAACGGTGCGATGACAGCACTTAAAGCAGCTATTGCGGATAAAGAAAG
AACAAAAGCAAGCGGTAATTATGTCAATGCTGATCAAGAAAAACGTCAAGCGTATGATTCAAAAGTGACTAACGCTGAAA
ATATCATTAATGGTACACCAAATGCGACATTAACAGTCAATGACGTAAATAGTGCGGCATCACAAGTCAATGCGGCTAAA
ACAGCATTAAATGGTGATAACAACTTACGTGTAGCGAAAGAGCATGCTAACAATACAATTGACGGCTTAGCACAATTGAA
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CTCAAACGTTGAATACAGCGATGAAAGGCTTAAGAGATAGTATTGCGAATGAAGCAACGATTAAAGCAGGTCAAAACTAC
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ACTTAGCTCAAGCTAAGACAACAGCGAAAAACAACTTGAATAACTTAACATCAATTAACAATGCACAAAAAGATGCGTTA
ACGCGTAACATTGATGGTGCAACTACAGTAGCTGGTGTAAATCAAGAAACTGCAAAAGCAACAGAATTAAATAACGCAAT
GCACAGTTTACAAAATGGTATCAATGATGAGACACAAACAAAACAAACTCAGAAATACCTAGATGCTGAGCCAAGTAAGA
AATCAGCTTATGATCAAGCAGTAAATGCAGCAAAAGCAATTTTAACAAAAGCTAGTGGTCAAAATGTAGACAAAGCAGCA
GTTGAACAAGCATTACAAAATGTGAACAGTACGAAGACGGCGTTGAACGGTGATGCGAAATTAAATGAAGCTAAAGCTGC
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GCTTCGGACTTAAATACAAAACAAAAAGAAGCATTGAAAGCACAAGTAACAAGTGCAGGACGCGTATCTGCAGCAAATGG
TGTTGAACATACTGCGACTGAATTAAATACTGCGATGACAGCTTTAAAACGTGCCATTGCTGATAAAGCTGACACAAAAG
CTAGTGGTAATTATGTCAATGCTGATGCGAATAAACGCCAAGCATATGATGAAAAAGTGACAGCTGCAGAACATATCGTT
AGTGGTACACCAACACCAACGTTAACACCATCAGATGTTACAAATGCAGCAACGCAAGTAACGAATGCGAAGACGCAGTT
AAACGGTAATCATAATTTAGAAGTAGCGAAACAAAATGCTAACACAGCAATTGATGGTTTAACTTCTTTAAATGGTCCGC
AAAAAGCAAAACTTAAAGAACAAGTGGGTCAAGCGACGACGTTGCCAAATGTTCAAACTGTTCGTGATAATGCACAAACA
TTAAACACTGCAATGAAAGGTCTACGAGATAGCATTGCGAATGAAGCAACGATTAAAGCAGGTCAAAACTACACAGATGC
AAGTCAAAACAAACAAAATGACTACAACAATGCAGTCACTGCAGCAAAAGCAATCATTGGTCAAACAACTAGTCCATCAA
TGATTGCGCAAGAAATTAATCAAGCGAAAGACCAAGTGACAGCTAAACAACAAGCGTTAAACGGTCAAGAAAACTTAAGA
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TGAAAAATGGTATTCAAGATCAAAATACGATTAAGCAAGGTGTTAACTTCACTGATGCAGATGAAGCGAAACGTAATGCA
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TGCGTTACAAAATGTACAACGTGCTAAAAACGAATTGAACGGTAATCAAAATGTTGCGAACGCTAAGACAACTGCGAAAA
ATGCATTGAATAACCTTACATCAATTAATAATGCACAAAAAGCAGCATTGAAATCACAAATTGAAGGTGCGACAACAGTT
GCAGGTGTAAATCAAGTGTCTACAATGGCATCTGAATTAAATACTGCAATGAGCAACTTACAACGTGGTATTAATGACGA
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TTTAACTAATGCTCAAAAAGCAAACTTAACAGAACAAATTGAACGTGGTACAACTGTTGCTGGTGTTCAAGGCATCCAAG
CAAATGCTGGTACTTTAAATCAAGCAATGAATCAATTAAGACAAAGTATTGCTTCTAAAGATGCGACTAAATCAAGCGAA
GATTATCAAGACGCGAATGCAGATTTACAAAATGCATACAATGATGCGGTAACTAATGCTGAAGGTATTATTAGTGCAACGAATAACCCTGAAATGAATCCTGATACAATTAACCAAAAAGCGAGCCAAGTGAACAGTGCGAAGTCTGCATTGAACGGTG
ATGAAAAATTAGCAGCAGTAAAACAAACTGCGAAATCAGATATCGGTCGTTTGACAGACTTGAACAATGCACAACGAACT
GCGGCAAATGCTGAAGTGGATCAAGCACCAAATCTTGCAGCTGTCACAGCGGCTAAAAATAAAGCAACATCGTTAAACAC
AGCGATGGGTAATTTGAAACATGCACTTGCTGAAAAGGATAATACGAAACGTAGTGTCAATTACACAGATGCGGATCAAC
CAAAACAACAAGCGTATGATACTGCAGTTACACAAGCAGAAGCAATTACTAATGCAAATGGCAGTAACGCGAATGAAACA
CAAGTTCAAGCAGCGCTTAACCAATTGAATCAAGCTAAAAACGACTTGAATGGTGATAATAAAGTTGCTCAAGCGAAAGA
AACAGCAAAACGTGCATTAGCTTCATATAGTAACTTGAATAACGCGCAATCAACTGCAGCAACTAGTCAAATTGACAATG
CAACGACAGTAGCAGACGTAACTGCTGCACAAAATACTGCTAATGAATTAAATACAGCAATGGGTCAACTTCAAAATGGT
ATTAATGACCAAAACACTGTTAAACAACAAGTGAACTTTACAGATGCTGACCAAGGTAAGAAAGATGCTTACACAAATGC
TGTTACGAATGCTCAAGGTATTTTAGATAAAGCAAACGGTCAAAATATGACAAAAGCACAAGTTGAAGCTGCATTAAATC
AAGTAACGACTGCTAAGAATGCTTTAAACGGTGATGCAAATGTAAGACAAGCAAAATCAGATGCGAAAGCAAACTTAGGT
ACATTAACACACTTAAATAATGCACAAAAACAAGATTTAACATCACAAATCGAAGGTGCAACAACAGTCAACGGTGTAAA
TAGTGTTAAAACGAAAGCACAAGACTTAGATGGTGCAATGCAACGATTAGAGTCAGCAATCGCAAATAAAGATCAAACTA
AAGCGAGCGAAAACTACATTGACGCAGATCCAACTAAGAAAACAGCATTTGATAATGCCATCACACAAGCTGAATCTTAC
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TTACAAATGCAGCAGATGTTACTGCGGCAACACAACGTGTCAATAATGCTGAAACAAGTTTAAATGGTGATACAAACTTA
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GCATACAATACAGCAGTTACAAGTGCTGAAAATATCATTAATGCAACGAGTCAGCCAACACTTGATCCATCTGCAGTAAC
ACAAGCAGCTAATCAAGTGAACACTAACAAAACTGCGCTTAATGGTGCGCAAAACTTAGCAAATAAAAAGCAAGAAACAA
CTGCTAACATCAACCGATTAAGTCATTTAAACAATGCTCAAAAGCAAGATTTAAATACACAAGTGACAAATGCACCAAAT
ATTAGCACAGTAAATCAAGTGAAAACTAAAGCTGAACAATTAGATCAAGCAATGGAACGTTTAATCAACGGAATCCAAGA
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CTGCTGAAAATATTATTAATCAAGCAAATGGTACAAATGCGAACCAATCACAAGTTGAAGCAGCACTTTCAACTGTAACA
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TTCAAACCGCTCAGGAACTGAATACAGCGATGGGTAACTTGAAAAATAGCTTGAATGATAAAGACACTACACTTGGCAGT
CAAAACTTTGCAGATGCAGATCCAGAGAAGAAAAATGCATACAATGAAGCGGTTCGTAATGCTGAAAATATTTTAAATAA
ATCTACAGGTACGAACGTGCCTAAAGATCAAGTTGAAGCAGCTATGAATCAAGTGAATACTACAAAAGCAGCGCTTAATG
GTACTCAAAACCTTGAAAAAGCGAAACAACACGCAAATACAGCAATTGACGGTTTAAGCCATTTAACAAATGCACAAAAA
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TGCAGCAATGGACAAATTACGTCAAAGTATTGCAGATAATGCGACAACAAAACAAAACCAAAATTATACTGATGCAAGTC
CGAATAAAAAGGATGCGTACAATAATGCTGTCACAACTGCACAAGGTATTATTGATCAAACTACAAACCCTTCATTAGAT
CCGACTGTTATCAATCAAGCTGCTGGACAAGTAAGCACGTCTAAAAATGCTTTAAATGGTAATGAAAACTTAGAGGCAGC
GAAGCAACAAGCAACGCAATCTTTAGGTTCATTAGACAACTTAAATAATGCGCAAAAACAAGCTGTTACTAATCAAATTA
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CAAGCGATAGCTGATAAAGATGCTACGAAAGCAACAGTTAACTTCACTGATGCAGATCAAGCAAAACAACAAGCATATAA
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ATTAATAACTCTAATGATCTTAACCAAGCACAGAAAGATGCATTAAAACAACAAGTACAAAATGCAACTACTGTAGCTGG
TGTAAACAATGTTAAACAAACGGCGCAAGAGTTAAACAATGCGATGACACAATTAAAACAAGGCATTGCAGATAAAGAAC
AAACAAAAGCTGATGGTAACTTTGTCAATGCAGATTCTGACAAGCAAAATGCATATAATCAAGCAGTAGCGAAAGCTGAA
GCATTAATTAGTGGTACGCCTGATGTTGTCGTTACACCTAGCGAAATTACTGCAGCGTTAAATAAAGTTACGCAAGCTAA
AAATGATTTAAATGGTAATACAAACTTAGCAACGGCGAAACAAAATGTTCAACATGCTATTGATCAATTGCCAAACTTAA
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GCAACAACGCTTAATGACGCGATGACACAATTGAAACAAGGTATTGCGAATAAAGCACAAATTAAAGGTAGCGAGAACTA
TCACGATGCTGATACTGACAAGCAAACAGCATATGATAATGCAGTAACAAAAGCAGAAGAATTGTTAAAACAAACAACAA
ATCCAACAATGGATCCAAATACAATTCAACAAGCATTAACTAAAGTGAATGACACAAATCAAGCACTTAACGGTAATCAA
AAATTAGCTGATGCCAAACAAGATGCTAAGACAACACTTGGTACACTAGATCATTTAAATGATGCTCAAAAACAAGCGCT
AACAACTCAAGTTGAACAAGCACCAGATATTGCAACAGTTAATAATGTTAAGCAAAATGCTCAAAATCTGAATAATGCTA
TGACTAACTTAAACAATGCATTACAAGATAAAACTGAGACATTAAATAGCATTAACTTTACTGATGCAGATCAAGCTAAG
AAAGATGATTATACTAATGCGGTTTCACATGCAGAAGGTATTTTATCTAAAGCAAATGGCAGCAATGCAAGTCAAACTGA
AGTGGAACAAGCGATGCAACGTGTGAACGAAGCGAAACAAGCATTGAATGGTAATGACAATGTACAACGTGCAAAAGATG
CAGCGAAACAAGTAATTACAAATGCAAATGATTTAAATCAAGCGCAAAAAGATGCATTAAAACAACAAGTCGATGCTGCG
CAAACTGTTGCAAATGTAAACACGATTAAGCAAACAGCACAAGATTTAAATCAAGCAATGACACAATTGAAACAAGGTAT
TGCAGATAAAGACCAAACTAAAGCAAATGGTAACTTTGTCAATGCTGATACTGATAAGCAAAATGCATATAACAATGCGG
TAGCGCATGCTGAACAAATCATTAGTGGTACACCAAATGCAAACGTGGATCCACAACAAGTGGCTCAAGCGTTACAACAA
GTGAATCAAGCTAAGGGTGATTTAAACGGTAACCACAACTTACAAGTTGCTAAAGACAATGCAAATACAGCCATTGATCA
GTTACCAAACTTAAATCAACCACAAAAAACAGCATTAAAAGACCAAGTGTCGCATGCAGAACTTGTTACAGGTGTTAATG
CTATTAAGCAAPATGCTGATGCGTTAAATAATGCAATGGGTACGTTGAAACAACAAATTCAAGCGAATAGTCAAGTACCA
CAATCAGTTGACTTTACACAAGCGGATCAAGACAAACAACAAGCTTATAACAATGCAGCTAACCAAGCGCAACAAATCGC
AAATGGCACACCAACACCTGTATTGGCGCCTGATACAGTAACAAAAGCAGTTACAACTATGAATCAAGCGAAAGATGCAT
TAAACGGTGATGAAAAATTAGCGCAAGCGAAACAAGATGCTTTAGCAAATCTTGATACGTTACGTGACTTAAATCAACCA
CAACGTGATGCATTACGAAACCAAATCAATCAAGCACAAGCTTTAGCTACAGTTGAACAAACTAAACAAAATGCACAAAA
TGTGAATACAGCAATGGGTAACTTGAAACAAGGTATTGCAAATAAAGATACTGTGAAAGCAAGTGAGAACTACCACGATG
CTGATGTCGATAAGCAAACAGCATATACAAATGCAGTGTCTCAAGCGGAAGGTATTATCAATCAAACGACAAATCCAACG
CTTAACCCAGATGACATTACTCGTGCATTAACTCAAGTGACTGATGCTAAAAATAGCTTAAACGGTGAAGCTAAATTAG C
CACTGAAAAGCAAAATGCTAAAGATGCCGTAAGTGGAATGACGCATTTAAACGATGCTCAAAAACAAGCATTAAAAGGTC
AAATCGATCAATCGCCTGAAATTGCTACAGTGAACCAAGTTAAACAAACAGCAACGAGCCTAGATCAAGCAATGGATCAA
TTATCACAAGCTATTAATGATAAAGATCAAATATTAGCGGACGGTAATTACTTAAATGCAGATCCTGACAAACAAAATGC
GTATAAACAGGCAGTAGCAAAAGCTGAAGCATTATTGAATAAACAAAGTGGTACTAATGAAGTACAAGCACAAGTTGAAA
GCATCACTAATGAAGTGAACGCAGCGAAACAAGCATTAAATGGTAATGACAATTTGGCAAATGCAAAACAACAAGCAAAA
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CAACAATTGGCGAACTTAACACACTTAAATGATGCACAAAAACAATCATTTGAAAGTCAAATTACACAAGCGCCACTTGT
TACAGATGTCACTACGATTAATCAAAAAGCACAAACGTTAGATCATGCGATGGAATTATTAAGAAATAGTGTTGCGGATA
ATCAAACGACATTAGCGTCTGAAGATTATCATGATGCAACTGCGCAAAGACAAAATGACTATAACAAAGCTGTAACAGCT
GCTAATAATATCATTAATCAAACTACATCGCCTACGATGAATCCAGATGATGTTAATGGTGCAACGACACAAGTGAATAA
TACGAAAGTTGCATTAGATGGTGATGAAAACCTTGCAGCAGCTAA.ACAACAAGCAAACAACAGACTTGATCAATTAGATCATTTGAATAATGCGCAAAAGCAACAGTTACAATCACAAATTACGCAATCATCTGATATTGCTGCAGTTAATGGTCACAAA
CAAACAGCAGAATCTTTAAATACTGCGATGGGTAACTTAATTAATGCGATTGCAGATCATCAAGCCGTTGAACAACGTGG
TAACTTCATCAATGCTGATACTGATAAACAAACTGCTTATAATACAGCGGTAAATGAAGCAGCAGCAATGATTAACAAAC
AAACTGGTCAAAATGCGAACCAAACAGAAGTAGAACAAGCTATTACTAAAGTTCAAACAACACTTCAAGCGTTAAATGGA
GATCATAATTTACAAGTTGCTAAAACAAATGCGACGCAAGCAATTGATGTTTTAACAAGCTTAAATGATCCTCAAAAAAC
AGCATTAAAAGACCAAGTTACAGCTGCAACTTTAGTAACTGCAGTTCATCAAATTGAACAAAATGCGAATACGCTTAACC
AAGCAATGCATGGTTTAAGACAGAGCATTCAAGATAACGCAGCAACTAAAGCAAATAGCAAATATATCAACGAAGATCAA
CCAGAGCAACAAAACTATGATCAAGCTGTTCAAGCCGCAAATAATATTATCAATGAACAAACTGCAACATTAGATAATAA
TGCGATTAATCAAGTAGCGGCAACTGTGAATACAACGAAAGCAGCATTACATGGTGATGTGAAATTACAAAATGATAAAG
ATCATGCTAAACAAACGGTTAGCCAATTAGCACATCTAAACAATGCACAAAAACATATGGAAGATACGTTAATTGATAGT
GAAACAACTAGAACAGCAGTTAAGCAAGATTTGACTGAAGTACAAGCATTAGATCAACTTATGGATGCATTACAACAAAG
TATTGCTGACAAAGATGCAACACGTGCGAGCAGTGCATATGTCAATGCAGAACCGAATAAAAAACAAGCCTATGATGAAG
CAGTTCAAAATGCTGAGTCTATCATTGCAGGATTAAATAATCCAACTATCAATAAAGGTAATGTATC.AAGTGCGACTCAA
GCAGTAATATCATCTAAAAATGCATTAGATGGTGTTGAACGATTAGCTCAAGATAAGCAAACTGCTGGAAATTCTCTAAA
TCATTTAGATCAATTAACACCAGCTCAACAACAAGCGCTAGAAAATCAAATTAATAATGCAACAACTTGTGATAAAGTGG
CTGAAATCATTGCACAAGCGCAAGCATTAAATGAAGCGATGAAAGCATTAAAAGAAAGTATTAAGGATCAACCACAAACT
GAAGCAAGTAGTAAATTTATTAACGAGGATCAAGCGCAAAAAGATGCATATACGCAAGCAGTACAACACGCGAAAGATTT
GATTAACAAAACAACTGATCCTACATTAGCTAAATCAATCATTGATCAAGCGACACAGGCAGTGACTGATGCTAAAAACA
ATTTACATGGTGATCAAAAACTAGCTCAAGATAAGCAACGTGCAACAGAAACGTTAAATAACTTGTCTAACTTGAATACA
CCACAACGTCAAGCACTTGAAAATCAAATCAATAATGCAGCAACTCGTGGTGAAGTAGCACAAAAATTAACTGAAGCACA
AGCACTTAACCAAGCAATGGAAGCTTTACGTAATAGCATTCAAGATCAACAACAAACAGAATCTGGTAGCAAGTTTATTA
ATGAAGATAAACCGCAAAAAGATGCTTACCAAGCAGCAGTTCAAAATGCAAAAGATTTAATTAACCAAACAGGTAATCCA
ACGCTTGATAAAGCACAAGTTGAACAATTGACACATGCTTTTAAACAAGCTAAAGATAACCTACACGGTGATCAAAAACT
TGCAGACGATAAACAACATGCGGTTACTGATTTAAATCAATTAAATGGTTTGAATAATCCGCAACC-TCAAGCACTTGAAA
GCCAAATAAACAACGCAGCAACTCGTGGCGAAGTAGCGCAAAAATTAGCTGAAGCAAAAGCGCTTGATCAAGCAATGCAA
GCATTACGAAATAGTATTCAAGATCAACAACAAACGGAAGCGGGTAGCAAGTTTATCAATGAAGATAAACCGCAAAAAGA
TGCTTACCAAGCAGCAGTTCAAAATGCAAAAGATTTAATTAACCAAACAGGTAATCCAACACTCGACAAATCACAAGTAG
AACAATTAACACAAGCAGTAACAACTGCAAAAGATAATCTACATGGTGATCAAAAACTTGCTCGTGATCAACAACAAGCA
GTAACAACTGTAAATGCATTGCCAAACTTAAATCATGCACAACAACAAACATTAACTGATGCTATAAATGCAGCGCCTAC
AAGAACAGAGGTTGCACAACATGTTCAAACTGCTACTGAACTTGATCACGCGATGGAAACATTGAAAAATAAAGTTGATC
AAGTGAATACAGATAAGGCTCAACCAAATTACACTGAAGCGTCAACTGATAAAAAAGAAGCAGTAGATCAAGCGTTACAA
GCTGCACAAAGCATTACAGATCCAACTAATGGTTCAAATGCGAATAAAGACGCTGTAGAACAAGCATTAACTAAGCTTCA
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GTAGATCAAGCAACGCAATTGAACCAATCAATGGATCAATTACAACAAGCAGTTAATGAACATGCTAACGTTGAGCAAAC
TATAGATTACACACAAGCAGATTCAGATAAGCAAAAGGCTTATAAACAAGCGATTGCTGATGCTGAAAATGTATTGAAAC
AAAATGCGAATAAGCAACAAGTGGATCAAGCACTTCAAAATATTTTAAATGCAAAACAAGCATTAAATGGTGATGAACGT
GTAGCACTTGCTAAAACAAATGGTAAACATGACATCGACCAATTGAATGCATTAAACAATGCTCAACAAGATGGATTTAA
AGGTCGCATCGATCAATCAAACGATTTAAATCAAATCCAACAAATTGTAGATGAGGCTAAGGCACTTAATCGTGCAATGG
ATCAATTGTCACAAGAAATCACTGGCAATGAAGGACGCACGAAAGGTAGCACGAACTATGTCAATGCAGATACACAAGTC
AAACAAGTATATGATGAAGCGGTTGATAAAGCGAAACAAGCACTTGATAAATCGTCTGGGCAAAACTTAACTGCAGAACA
AGTTATCAAATTAAATGATGCAGTCACTGCAGCTAAGAAAGCATTAAATGGTGAAGAAAGACTTAATAATCGTAAAGCTG
AAGCATTACAAAGATTGGATCAATTAACACATCTAAACAATGCTCAAAGACAATTAGCAATCCAACAAATTAATAATGCT
GAAACGCTAAATAAAGCATCTCGAGCAATTAATAGAGCAACTAAATTAGATAATGCAATGGGTGCAGTACAACAATATAT
TGACGAACAGCACCTTGGTGTTATCAGCAGCACAAATTACATCAATGCAGATGACAATTTGAAAGCAAATTATGATAATG
CAATTGCGAATGCAGCACATGAGTTAGATAAAGTGCAAGGTAATGCAATTGCAAAAGCTGAAGCAGAGCAATTGAAACAA
AATATTATCGATGCTCAAAATGCATTAAATGGAGACCAAAACCTTGCAAATGCCAAAGATAAAGCAAATGCGTTTGTTAA
TTCGTTAAATGGATTAAATCAACAGCAACAAGATCTTGCACATAAAGCAATTAACAATGCCGATACTGTATCAGATGTAA
CAGATATTGTTAATAATCAAATTGACTTAAATGATGCAATGGAAACATTGAAACATTTAGTTGACAATGAAATTCCAAAT
GCAGAGCAAACTGTCAATTACCAAAACGCTGACGATAATGCTAAAACAAACTTCGATGATGCCAAACGTCTAGCAAATAC
ATTGCTAAATAGTGATAACACAAATGTGAATGATATCAATGGCGCAATCCAAGCAGTCAATGATGCAATCCATAATCTTA
ATGGTGATCAACGACTACAAGATGCTAAAGACAAGGCAATTCAATCAATTAATCAAGCTTTAGCTAATAAGCTAAAAGAA
ATCGAAGCTTCAAATGCGACGGATCAAGACAAGCTTATTGCGAAAAATAAAGCAGAAGAATTGGCAAACAGCATCATCAA
CAACATTAATAAAGCAACAAGTAATCAGGCTGTATCTCAAGTTCAAACAGCAGGCAACCACGCGATTGAACAAGTGCATG
CTAATGAAATACCAAAAGCAAAAATTGATGCCAATAAAGACGTTGATAAGCAAGTTCAAGCATTAATTGACGAAATTGAT
CGAAATCCAAATCTAACAGATAAGGAAAAACAAGCACTTAAAGATCGTATTAATCAAATACTTCAACAAGGTCATAACGA
24/68
CATTAACAATGCGCTGACTAAAGAAGAAATTGAACAAGC TAAAGCACAACTTGCGCAAGCATTACAAGACATCAAAGATT
TAGTGAAAGCTAAAGAAGATGCGAAACAAGATGTTGATAAACAAGTTCAAGCATTAATTGACGAAATCGATCAAAATC CA
AATCTAACAGATAAGGAAAAACAAGCACTTAAAGATCGTATTAATCAAATACTTCAACAAGGTCATAACGGCATTAACAA
TGCGATGACTAAAGAAGAAATTGAACAAGCCAAAGCACAACTTGCACAAGCATTAAAAGAAATTAAAGATTTAGTGAAAG
CTAAAGAAAATGCGAAACAAGATGTTGATAAACAAGTTCAAGCATTAATTGACGAAATCGATCAAAATCCAAATCTAACA
GATAAGGAAAAACAAGCGCTTAAAGATCGAATCAATCAAATACTGCAACAAGGTCATAACGACATTAACAATGCGATGAC
TAAAGAAGAAATTGAACAAGCCAAAGCACAACTTGCACAAGCATTACAAGACATCAAAGATTTAGTGAAAGCTAAAGAAG
ATGCGAAAAATGCAATAAAAGCCTTAGCTAATGCGAAGCGTGATCAAATCAATTCAAATCCAGATTTAACACCTGAGCAA
AAAGCAAAAGCGCTCAAAGAAATTGACGAAGCTGAAAAACGAGCACTACAAAACGTTGAGAATGCTCAAAC TATAGATCA
ATTAAATCGAGGATTAAACTTAGGTTTAGATGACATTAGAAATACACATGTATGGGAGGTTGATGAACAACCTGCTGTAA
ATGAAATTTTTGAAGCAACACCTGAGCAAATCCTAGTTAATGGTGAACTCATTGTACATCGTGATGACATCATTACAGAA
CAAGATATTCTTGCACACATAAACTTAATTGATCAGCTTTCAGCAGAAGTTATTGATACACCATCAACTGCAACGATTTC
TGATAGCTTAACAGCAAAAGTTGAAGTTACATTGCTTGATGGATCAAAAGTGATTGTTAATGTTCCTGTAAAAGTTGTAG
AAAAAGAATTGTCAGTAGTCAAACAACAGGCAATTGAATCAATCGAAAATGCGGCACAACAAAAGATTGATGAAATCAAT
AATAGTGTGACATTAACACTGGAACAAAAAGAAGCTGCAATTGCAGAAGTTAATAAGCTTAAACAACAAGCAATTGATCA
TGTTAACAATGCACCTGATGTTCATTCAGTTGAAGAAATTCAACAACAAGAACAAGCGTATATTGAACAATTTAATCCAG
AACAATTTACGATTGAACAAGCAAAATCAAATGCAATTAAATCGATTGAAGATGCAATTCAACATATGATTGATGAAATC
AAAGCTCGTACTGATCTAACAGATAAAGAGAAGCAAGAAGC TATTGCTAAGTTAAATCAATTAAAAGAACAAGCAATTCA
AGCGATTCAACGTGCGCAAAGCATCAGTGAAATAACTGAGCAATTGGAACAATTTAAAGCTCAAATGAAAGCAGCTAATC
CAACAGCAAAAGAACTAGCTAAACGCAAGCAAGAAGCTATTAGTAGAATTAAAGACTTTTCAAATGAAAAAATAAATAGT
ATTCGAAATAGTGAAATTGGCACAGCTGATGAAAAACAAGCAGCAATGAATCAAATTAACGAAATTGTGCTTGAAACAAT
TAGAGATATTAATAATGCGCATACATTACAGCAAGTTGAGGCTGCAT TGAACAATGGTATTGCTCGAATTTCAGCAGTAC
AAATTGTAATATCTGATCGTGCTAAACAATCGTCAAGTACTGGAAATGAATCTAATAGCCATTTAACAATTGGTTATGGA
ACTGCAAATCATCCATTTAACAGTTCGACTATTGGACATAAAAAGAAACTTGATGAAGATGATGACATTGATCCAC TTCA
TATGCGTCACTTTAGTAATAATTTCGGTAATGTTATTAAAAACGCTATTGGTGTGGTGGGTATCTC TGGCTTACTAGCTA
GTTTCTGGTT CTTCATTGCCAAACGTCGTCGTAAAGAAGATGAAGAGGAAGAATTAGAAATAAGAGATAATAATAAAGAT
TCAATAAAAGAGACTTTAGACGATACAAAACATTTACCACTTTTATTTGCGAAACGTCGCAGAAAAGAAGATGAAGAAGA
TGTTACTGTTGAAGAAAAAGATTCGCTAAATAATGGCGAGTCACTCGATAAAGTTAAACATACGCCGTTCTTCTTACCAA
AACGTCGTCGTAAAGAAGATGAAGAAGATGTGGAAGTTACAAATGAAAACACAGATGAAAAAGTGTTGAAAGATAACGAA
CATTCACCACTCTTATTCGCAAAACGACGCAAAGATAAAGAGGAAGATGTTGAAACAACAACTAGTATTGAATCTAAAGA
TGAGGACGTTCCTTTATTATTGGCTAAAAAGAAAAATCAAAAAGATAACCAATCCAAAGACAAAAAGTCAGCATCAAAAA
ATACTTCTAAAAAGGTAGCAGCTAAAAAGAAGAAAAAGAAATCTAAGAAAAATAAAAAA
SEQ ID NO:47 seqüência de polinucleotídeoTTGAATAATCGTGATAAATTACAAAAATTTAGTATTCGAAAATACGCAATTGGAACATTTTCTACTGTGATTGCAACACT
TGTGTTCATGGGTATCAATACAAACCATGCAAGTGCCGACGAGTTGAA TCAAAATCAAAAGTTAATTAAACAATTAAATC
AAACAGATGATGATGATTCGAATACGCATAGTCAAGAAATCGAAAATAACAAACAAAATTCTAGTGGGCAGACTGAATCA
TTACGTTCATCAACTAGTCAAAATCAAGCAAATGCACGACTGTCGGATCAATTCAAAGACACTAATGAAACATCGCAACA
ATTACCTACAAATGTTTCGGATGATAGTATCAATCAATCGCATAGTGAAGCAAATATGAATAACGAACCATTGAAAGTTG
ATAATAGTACTATGCAAGCACATAGTAAAATAGTAAGCGATAGCGATGGGAATGCTTCTGAAAATAAACATCATAAACTA
ACAGAAAATGTACTTGCAGAAAGCCGAGCAAGTAAAAATGACAAAGAGAAAGAGAATCTACAAGAGAAAGATAAATCGCA
GCAAGTACATCCACCATTAGATAAAAATGCATTACAAGCTTTTTTTGACGCATCATATCACAATTACAGAATGATTGATA
GAGATCGTGCGGATGCAACAGAATATCAAAAAGTCAAATCTACT TTTGACTACGTCAATGACTTACTAGGTAATAATCAA
AATATTCCTTCAGAACAGCTTGTTTCGGCATATCAACAATTAGAGAAAGCATTAGAACTTGCACGTACGTTACCACAACA
ATCTACTACAGAAAAACGTGGTAGAAGAAGTACGAGAAGTGTTGTTGAGAAT CGTTCATCAAGAAGCGATTACTTAGATG
CTAGAACTGAATATTATGTTTCAAAAGACGATGATGATTCTGGTTTCCCTCCTGGTACTTTCTTCCATGCTTCAAATAGA
AGATGGCCTTATAATTTACCAAGATCTAGGAACATCTTACGTGCTTCTGATGTACAAGGTAATGCTTATATCACTACAAA
ACGACTTAAAGATGGATATCAATGGGATATTTTATTTAATAGTAATCATAAAGGGCATGAATATATGTACTATTGGTTTG
GACTTCCAAGTGATCAAACACCAACTGGTCCAGTAACTTTCACTATTATCAACCGTGATGGTTCAAGTACATCTACTGGT
GGCGTTGGATTTGGATCAGGTGCACCACTACCTCAATTTTGGAGATCAG CAGGTGCTATTAATTCTAGCGTAGCGAATGA
TTTTAAACATGGCTCCGCTACAAATTATGCATTTTATGATGGTGTTAATAATTTTTCTGACTTTGCTAGAGGGGGAGAAT
TATACTTCGACAGAGAAGGCGCTACACAAACTAATAAATATTATGGCGATGAAAACTTCGCATTGCTAAATAGTGAGAAA
CCAGATCAAATAAGAGGATTAGATACAATATATAGTTTTAAAGG TAGTGGTGATGTAAGTTATCGTATTTCATTTAAAAC
TCAAGGAGCTCCAACTGCAAGATTGTATTATGCTGCTGGCGCGCGTTCTGGTGAATATAAACAAGCAACGAACTATAACC
AACTCTATGTCGAACCTTATAAGAATTATCGAAATCGAGTACAGTCAAATGTCCAAGTTAAAAATCGTACACTTCATTTA
AAAAGAACAATCAGACAATTCGATCCTACATTACAGAGAACTACTGATGTTCCTATTTTGGATAGTGACGGTTCCGGAAG
TATTGATTCGGTATACGACCCATTAAGTTATGTAAAGAATGTGACTGGTACAGTCCTAGGTATTTATCCATCTTATCTTC
CTTATAATCAGGAAAGATGGCAGGGAGCTAATGCAATGAATGCCTATCAAATTGAAGAACTTTTTTCACAAGAAAATCTT
CAAAATGCAGCACGTTCAGGCCGTCCAATTCAATTTCTTGTAGGTTTTGATGTTGAAGATAGCCATCATAACCCTGAAAC
TCTTTTACCAGTAAATTTATATGTAAAACCTGAGTTAAAACATACAATTGAGTTATATCACGATAATGAAAAACAAGATA
GAAAGGAATTTTCAGTATCGAAA
25/68
SEQ ID NO:48 seqüência de polinucleotídeoATGAGTGGAACGCTTCATAACACTGTAGGATCAGGAATATTACCTTATCAACAAGAGATACGTATCAAACTTACTAGTAA
TGAACCAATTAAAGATAGTGAATGGTCTATTACAGGATATCCTAACACGCTTACATTACAAAACGCTGTGGGTAGAACAA
ATAATGCTACTGAAAAAAACTTAGCTCTTGTTGGTCATATTGATCCAGGAAATTATTTCATCACTGTTAAGTTTGGTGAT
AAAGTAGAACAATTTGAAATTAGATCAAAACCAACTCCACCAAGAATCATTACAACTGCTAATGAATTACGTGGAAATCC
TAACCATAAGCCTGAAATAAGAGTAACAGATATACCAAATGATACTACTGCTAAAATCAAACTTGTGATGGGCGGAACCG
ATGGCGATCATGATCCAGAAATAAATCCATATACTGTCCCTGAAAACTACACAGTAGTTGCAGAAGCATACCATGATAAT
GATCCAAGTAAAAATGGGGTCTTAACATTCCGTTCATCAGACTACCTTAAAGATCTACCATTAAGCGGTGAATTAAAGGC
AATTGTTTATTACAATCAATATGTACAATCAAACTTTAGTAAAAGCGTTCCGTTTAGTAGCGATACAACACCACCTACAA
TTAATGAACCGGCAGGACTAGTTCATAAGTATTACAGGGGAGATCATGTAGAAATTACTCTTCCAGTCACTGATAATACT
GGCGGTTCAGGTTTAAGAGATGTAAACGTCAATTTACCTCAAGGTTGGACAAAAACCTTTACAATCAATCCTAATAATAA
TACTGAGGGTACGCTTAAGTTAATTGGTAATATACCTAGTAATGAAGCATATAATACGACATATCATTTCAATATTACTG
CAACCGATAATTCTGGAAATACAACAAATCCAGCTAAAACCTTTATTTTAAATGTTGGTAAGTTGGCTGATGATTTAAAT
CCAGTCGGATTATCTAGAGATCAACTACAATTAGTGACAGACCCTTCTTCATTATCTAATTCCGAACGAGAAGAGGTAAA
AAGAAAAATAAGTGAAGCAAATGCTAATATAAGATCATATTTATTACAAAATAACCCAATACTCGCTGGAGTAAACGGCG
ATGTTACATTTTATTATAGAGATGGTTCTGTAGATGTTATTGATGCTGAAAATGTAATCACATATGAGCCCGAAAGAAAA
TCCATTTTCAGTGAAAATGGTAATACAAATAAAAAAGAAGCAGTAATCACTATTGCTAGAGGACAAAACTATACCATTGG
TCCAAACTTAAGAAAATATTTCTCATTAAGTAATGGTTCGGATTTACCTAATAGAGATTTCACCTCTATATCAGCTATTG
GATCTTTACCTTCATCGAGTGAAATTAGTCGACTCAATGTTGGAAATTATAACTATAGAGTTAATGCTAAAAATGCTTAT
CATAAGACTCAACAAGAACTTAATTTAAAACTTAAAATAGTAGAGGTTAATGCACCTACTGGTAATAATCGTGTATATAG
AGTTAGTACTTATAATTTAACTAA'TGATGAAATCAATAAAATCAAACAAGCATTTAAAGCAGCTAATTCTGGACTTAATT
TAAACGATAACGATATCACTGTTTCGAATAACTTTGACCATAGAAATGTTAGTAGTGTGACAGTAACTATACGTAAGGGC
GATTTGATAAAAGAGTTTTCATCAAATCTCAATAATATGAATTTCTTACGTTGGGTTAATATAAGGGATGATTATACCAT
TTCGTGGACTTCTAGTAAGATTCAAGGTAGAAATACAGATGGTGGATTAGAATGGTCACCAGATCATAAATCACTTATTT
ATAAATATGATGCAACATTAGGTAGACAAATAAATACTAATGACGTGTTAACTTTACTTCAAGCAACAGCTAAAAACTCA
AATTTACGTTCAAATATCAATAGTAATGAAAAACAGTTAGCAGAACGAGGGTCTAATGGGTATTCTAAATCTATAATTAG
AGATGATGGCGAGAAATCTTATTTACTTAACTCAAATCCTATTCAAGTATTAGACTTAGTAGAACCAGATAATGGTTACG
GTGGACGTCAAGTCAGTCATTCTAACGTTATATATAATGAAAAAAATTCTTCTATCGTAAATGGTCAAGTTCCAGAAGCT
AATGGGGCATCCGCTTTTAATATTGATAAAGTTGTTAAAGCTAATGCGGCAAATAATGGTATTATGGGTGTTATCTATAA
GGCACAATTATACTTAGCACCATACAGTCCAAAAGGTTACATTGAAAAATTAGGCCAAAATTTAAGCAATACCAATAACG
TGATTAATGTTTATTTTGTGCCTTCTGATAAAGTAAATCCTAGTATAACTGTAGGTAATTACGACCATCATACGGTATAT
TCTGGTGAAACATTTAAAAATACTATCAATGTAAATGATAATTATGGATTAAATACAGTAGCTTCTACAAGTGATAGTGC
AATTACTATGACCAGAAACAACAACGAGTTAGTAGGTCAGGCTCCTAATGTTACTAATAGCATAAATAAAATTGTAAAAG
TTAAAGCCACAGATAAAAGTGGAAATGAAAGTATTGTTTCTTTCACAGTAAATATAAAACCATTAAACGAGAAATATAGA
ATAACAACTTCATCAAGTAATCAAACACCAGTGAGAATTAGTAATATTCAAAACAATGCTAACCTTTCAATTGAAGATCA
AAATAGAGTAAAATCTTCACTCAGCATGACTAAAATTTTAGGTACAAGAAATTATGTCAATGAGTCAAATAATGACGTTC
GTAGTCAAGTTGTAAGTAAAGTAAATAGAAGTGGGAACAATGCTACAGTTAATGTTACAACTACATTTTCTGATGGTACA
ACTAATACAATAACCGTTCCAGTTAAACATGTGTTATTAGAAGTTGTACCTACTACTAGAACAACAGTAAGAGGACAACA
ATTTCCAACCGGCAAAGGAACTTCCCCAAATGATTTCTTTAGTTTAAGAACGGGAGGTCCAGTTGATGCGAGAATAGTTT
GGGTTAATAATCAGGGACCCGATATAAATAGTAATCAAATTGGTAGAGATTTAACATTACACGCTGAAATATTCTTTGAT
GGTGAAACAACACCAATTAGAAAAGATACTACTTACAAACTTAGTCAATCTATTCCAAAGCA.AATATATGAAACAACTAT
CAATGGTCGATTTAATTCATCAGGTGATGCATATCCAGGAAATTTTGTTCAAGCAGTAAATCAATATTGGCCAGAACATA
TGGACTTCAGATGGGCCCAAGGATCAGGCACACCAAGTTCTCGTAATGCAGGTTCATTTACTAAAACAGTTACGGTAGTT
TATCAAAACGGCCAAACTGAAAACGTTAATGTACTATTCAAAGTCAAACCAAATAAACCTGTTATTGATAGTAATAGTGT
GATTTCAAAAGGACAATTAAATGGTCAACAAATTTTAGTTCGAAATGTTCCACAAAATGCACAAGTCACTCTATATCAAT
CAAATGGAACTGTTATTCCTAATACAAATACAACTATAGATTCTAATGGTATAGCTACTGTAACAATTCAAGGCACTCTA
CCAACCGGAAATATTACTGCTAAAACCTCAATGACAAATAATGTAACGTACACTAAACAAAATAGTAGTGGAATTGCTTC
AAATACAACTGAAGATATAAGTGTTTTTTCAGAAAACAGTGATCAAGTAAATGTTACCGCTGGCATGCAAGCTAAAAATG
ATGGTATTAAAATAATTAAAGGTACAAACTATAATTTTAATGACTTCAATAGTTTCATAAGTAATATACCAGCCCATTCT
ACTCTTACATGGAACGAGGAGCCTAATAGTTGGAAAAACAACATCGGTACTACAACAAAAACTGTTACAGTTACTCTACC
TAATCATCAAGGTACGAGAACTGTAGATATTCCAATAACAATCTATCCAACAGTTACAGCTAAGAATCCAGTAAGAGATC
AAAAAGGACGAAACTTAACCAATGGTACTGACGTTTATAATTATATTATTTTTGAAAATAATAACCGTCTTGGAGGAACA
GCTTCTTGGAAAG.ACAATCGTCAACCTGATAAAAACATAGCCGGTGTACAAAA'TTTAATTGCACTTGTTAATTATCCTGG
CATATCTACACCATTAGAAGTTCCTGTTAAAGTGTGGGTATATAATTTTGATTTCACTCAACCTATCTACAAAA'TTCAAG
TAGGAGATACATTCCCTAAAGGAACATGGGCAGGCTATTACAAACATCTTGAAAATGGAGAGGGATTACCAATAGATGGT
TGGAAATTTTATTGGAACCAGCAAAGTACAGGAACTACTAGTGATCAATGGCAATCATTAGCATATACTAGAACTCCTTT
TGTTAAAACTGGTACTTATGATGTCGTTAATCCTAGCAACTGGGGTGTTTGGCAAACATCACAATCAGCTAAATTTATAGTTACAAATGCTAAACCTAATCAACCAACCATAACTCAGTCTAAAACTGGTGATGTAACAGTAACACCTGGTGCTGTGCGT
AATATACTAATAAGTGGGACAAATGATTATATCCAAGCATCTGCAGATAAGATTGTTATTAATAAAAATGGAAATAAATT
AACTACATTTGTTAAAAATAATGATGGTCGTTGGACTGTTGAAACTGGGTCACCTGACATAAATGGTATCGGACCAACAA
26/68
ATAACGGAACTGCTATATCTTTAAGTCGATTAGCAGTTAGACCTGGGGATTCAATAGAAGCAATAGCGACTGAAGGTTCC
GGAGAAACTATAAGTACTTCAGCAACTAGTGAAATTTATATTGTCAAAGCTCCACAACCTGAACAAGTAGCAACTCATAC
TTATGATAATGGAACATTCGATATATTACCTGACAATTCACGTAATTCTTTAAATCCAACTGAACGTGTCGAAATTAATT
ACACTGAAAAATTAAATGGCAATGAAACACAAAAATCATTCACTATTACTAAAAATAACAACGGCAAATGGACGATAAAT
AATAAACCAAATTATGTCGAGTTCAATCAGGATAATGGTAAAGTTGTATTTTCGGCCAATACAATTAAACCTAATTCTCA
AATTACAATAACTCCTAAAGCAGGTCAGGGTAACACTGAAAACACAAATCCTACTGTAATTCAAGCACCTGCGCAACATA
CT'TTAACAATCAATGAAATTGTTAAAGAACAGGGTCAAAATGTGACTAATGATGATATTAATAATGCGGTTCAAGTGCCA
AATAAAAATAGAGTTGCGATTAAACAAGGAAACGCTCTTCCAACAAATTTAGCTGGTGGTAGTACATCACATATTCCAGT
AGTTATTTATTACAGTGATGGAAGTTCTGAAGAAGCTACTGAGACTGTTAGAACTAAAGTTAATAAAACCGAATTAATCA
ATGCTCGTCGTCGACTAGATGAAGAAATTAGTAAAGAGAACAAAACACCATCAAGTATCAGAAACTTTGATCAAGCTATG
AATCGTGCTCAATCACAAATTAATACAGCTAAAAGTGATGCTGACCAAGTTATAGGCACAGAATTTGCAACACCTCAACA
AGTAAATTCAGCTTTATCTAAAGTTCAAGCGGCACAAAATAAAATAAATGAAGCTAAAGCATTATTACAAAACAAGGCTG
ATAATAGTCAACTTGTGAGAGCAAAAGAACAATTACAACAATCGATTCAACCAGCCGCTTCAACTGATGGTATGACTCAA
GATAGCACAAGGAACTACAACAATAAACGCCAAGCAGCTGAACAAGCAATACAACATGCAAATAGCGTTATAAATAATGG
AGATGCAACATCCCAACAAATTAATGATGCTAAAAACACAGTTGAACAGGCACAGAGAGATTATGTTGAAGCTAAAAGCA
ACTTACGTGCTGATAAGTCACAGTTACAAAGCGCTTATGATACGTTAAATAGAGATGTTTTAACAAATGATAAAAAGCCA
GCATCTGTAAGACGCTATAATGAAGCCATTTCAAATATTAGAAAAGAATTAGATACAGCTAAAGCGGATGCAAGTAGTAC
TTTGCGAAACACCAATCCTTCCGTTGAACAAGTTAGAGACGCTTTAAATAAAATAAATACTGTTCAACCTAAAGTGAATC
AAGCAATTGCTTTACTTCAACCAAAAGAAAATAATTCAGAACTTGTACAAGCTAAAAAACGTTTACAAGACGCTGTAAAT
GACATACCTCAAACACAAGGTATGACACAACAAACAATTAATAATTATAATGACAAACAACGTGAAGCTGAAAGAGCACT
TACATCTGCACAAAGAGTGATTGATAATGGGGATGCTACAACTCAAGAAATTACTTCTGAAAAATCTAAAGTAGAGCAAG
CAATGCAAGCTTTAACTAATGCTAAAAGTAATCTGAGAGCTGATAAGAATGAGTTACAGACTGCATATAACAAATTAATT
GAGAACGTATCTACCAATGGTAAAAAACCGGCGAGTATACGTCAATACGAAACAGCCAAAGCCAGAATACAAAATCAAAT
TAATGATGCTAAAAATGAAGCGGAGCGAATTTTAGGTAATGATAATCCACAAGTATCACAAGTAACTCAAGCATTGAACA
AAATCAAAGCTATTCAACCAAAATTAACAGAAGCTATCAACATGCTTCAAAACAAAGAAAATAATACAGAATTAGTCAAT
GCTAAAAACAGACTTGAAAATGCAGTAAATGATACAGATCCAACACACGGTATGACTCAAGAAACAATTAATAATTACAA
CGCTAAAAAGCGAGAAGCTCAAAATGAAATACAAAAAGCGAACATGATTATTAATAATGGAGATGCTACTGCTCAAGATA
TTTCTTCTGAAAAATCTAAAGTAGAGCAAGTATTACAAGCATTACAAAATGCTAAGAATGACTTAAGAGCTGATAAAAGA
GAATTACAGACTGCATACAATAAACTTATACAAAATGTTAATACCAATGGTAAAAAACCATCTAGTATTCAAAACTATAA
GTCTGCAAGACGAAATATCGAAAACCAATATAATACCGCTAAAAATGAAGCACATAATGTTCTTGAAAATACAAACCCTA
CTGTAAATGCAGTAGAAGATGCTTTACGTAAGATAAATGCAATTCAACCAGAGGTTACAAAAGCTATTAATATACTTCAA
GATAAAGAAGATAATAGCGAACTTGTTAGAGCAAAAGAAAAATTAGATCAAGCGATTAATAGTCAACCATCACTAAATGG
TATGACTCAAGAATCTATTAATAATTACACAACAAAACGTAGAGAAGCACAAAATATAGCAAGTTCTGCTGACACTATTA
TTAATAATGGGGATGCATCTATTGAACAAATAACAGAAAATAAAATTCGAGTTGAAGAGGCAACTAATGCACTTAACGAA
GCAAAACAACATTTAACGGCAGATACAACTTCTTTAAAAACTGAAGTACGGAAATTAAGTAGGAGAGGCGACACAAACAA
CAAAAAGCCTAGCAGTGTTAGTGCTTATAACAATACTATTCATTCGCTACAATCTGAAATTACACAGACTGAAAATAGAG
CAAATACTATCATCAATAAGCCTATTCGTTCTGTTGAAGAAGTAAATAATGCATTGCATGAAGTAAACCAATTGAACCAA
CGCTTAACAGATACAATTAACTTATTACAACCTTTAGCGAATAAAGAAAGCTTAAAAGAAGCTCGTAATCGACTTGAAAG
TAAAATTAATGAAACCGTTCAAACAGACGGTATGACTCAACAATCTGTTGAGAATTATAAGCAAGCTAAAATAAAAGCTC
AAAATGAATCTAGTATTGCACAAACTCTTATTAATAATGGTGATGCATCTGATCAAGAAGTTTCTACAGAAATAGAAAAA
TTAAATCAAAAGCTGTCTGAATTAACAAATTCAATCAATCACTTAACAGTTAATAAAGAACCTTTAGAAACTGCCAAAAA
TCAGTTACAAGCAAATATTGACCAAAAACCTAGCACTGATGGTATGACGCAACAATCTGTACAAAGCTATGAACGTAAAC
TACAAGAAGCCAAAGATAAAATAAACTCAATTAATAATGTCTTAGCTAACAATCCAGATGTTAATGCTATCAGAACAAAC
AAAGTTGAGACGGAACAAATCAATAATGAATTAACACAGGCGAAACAAGGTCTTACTGTTGATAAACAACCATTGATTAA
TGCAAAAACTGCTTTGCAACAAAGTCTAGATAATCAACCAAGTACTACTGGTATGACTGAAGCAACAATTCAAAATTATA
ACGCTAAACGTCAAAAAGCAGAGCAAGTTATACAAAATGCAAATAAAATTATTGAAAACGCTCAACCTAGTGTACAACAA
GTGTCTGATGAGAAATCTAAGGTAGAGCAAGCACTCAGTGAATTGAACAACGCCAAATCAGCGCTTAGAGCTGATAAACA
AGAATTACAGCAAGCATATAATCAGTTGATTCAACCAACGGATTTAAATAATAAGAAACCAGCTTCTATCACTGCGTACA
ATCAAAGATATCAACAATTTAGTAACGAATTGAACAGCACTAAAACAAATACAGATCGCATTTTAAAAGAGCAAAATCCA
AGTGTAGCTGATGTCAACAATGCACTAAATAAAGTAAGAGAAGTACAACAAAAATTAAACGAAGCCAGAGCACTTTTACA
AAATAAAGAAGATAATAGTGCACTAGTTCGAGCCAAAGAACAACTTCAACAGGCAGTTGACCAAGTCCCTTCAACAGAAG
GTATGACGCAACAAACTAAAGATGATTACAATTCAAAACAACAAGCTGCTCAACAAGAAATATCAAAAGCACAACAAGTT
ATCGATAATGGCGATGCGACTACACAACAAATTTCTAACGCCAAAACAAATGTTGAACGCGCTTTAGAAGCATTAAATAA
TGCAAAAACTGGTTTAAGAGCAGATAAAGAGGAACTTCAAAATGCATATAATCAATTAACTCAAAATATTGATACGAGCG
GTAAAACGCCTGCAAGTATCAGGAAATACAATGAAGCTAAGTCACGTATTCAAACTCAAATTGATTCAGCTAAAAATGAA
GCAAACAGTATTTTAACAAATGACAATCCTCAAGTATCACAAGTGACTGCTGCGTTAAACAAAATAAAAGCTGTTCAACC
TGAAT'TAGATAAAGCGATAGCAATGCTTAAAAATAAAGAGAATAATAATGCATTGGTTCAAGCGAAACAACAACTTCAAC
AAATTGTTAATGAAGTAGATCCAACACAAGGCATGACAACAGATACTGC TAATAACTATAAATCAAAAAAACGTGAAGCT
GAAGATGAAATACAAAAAGCTCAACAAATCATTAACAATGGCGATGCCACTGAGCAACAAATTACTAACGAAACAAATAG
AGTAAATCAAGCGATTAATGCAATAAACAAAGCCAAAAACGATTTACGTGCTGATAAGTCTCAATTGGAAAATGCTTATA
ACCAATTAATACAAAATGTTGATACAAATGGTAAAAAACCTGCTAGTATTCAACAATACCAAGCTGCTCGACAAGCTATT
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GAGACGCAATACAATAACGCTAAATCAGAAGCACATCAAATTCTTGAAAATAGTAACCCTTCAGTTAATGAAGTAGCACA
AGCATTACAAAAAGTTGAAGCTGTACAACTTAAAGTTAATGACGCGATTCATATACTTCAAAATAAAGAGAATAATAGTG
CACTTGTCACAGCTAAAAATCAACTTCAGCAATCAGTTAATGATCAACCATTAACAACAGGTATGACTCAAGATTCTATT
AATAACTATGAAGCTAAGAGAAATGAGGCTCAAAGTGCTATCAGAAATGCAGAAGCTGTCATCAACAATGGCGATGCAAC
TGCAAAACAAATTTCAGACGAGAAATCTAAAGTTGAACAAGCACTAGCACATTTGAATGATGCTAAACAGCAATTAACTG
CAGATACTACTGAATTACAAACAGCAGTTCAACAATTAAACAGAAGAGGCGATACAAATAATAAAAAGCCAAGAAGTATC
AATGCATATAATAAAGCAATTCAATCATTAGAAACACAAATTACTTCTGCTAAAGATAATGCCAACGCTGTGATACAAAA
ACCTATACGTACTGTTCAAGAGGTAAATAATGCATTACAACAAGTAAATCAGTTGAATCAACAATTAACTGAAGCAATTA
ATCAACTTCAACCGCTATCAAATAATGATGCATTAAAAGCTGCAAGATTAAATTTAGAAAATAAAATTAATCAAACTGTA
CAAACTGATGGTATGACACAACAATCTATAGAGGCTTATCAAAACGCTAAACGCGTAGCCCAAAATGAATCTAACACTGC
TTTAGCATTAATTAATAACGGCGATGCCGATGAACAACAAATTACAACTGAAACAGACCGAGTCAATCAGCAAACTACAA
ACTTAACTCAAGCAATTAACGGGTTAACAGTTAATAAAGAACCATTAGAAACCGCTAAAACAGCGTTACAAAATAACATC
GACCAGGTACCTAGTACAGATGGTATGACTCAGCAATCTGTTGCAAATTATAATCAAAAACTACAAATAGCTAAAAACGA
AATTAACACAATTAATAACGTTTTAGCGAACAATCCAGATGTTAATGCAATCAAAACGAATAAAGCAGAAGCGGAACGAA
TCAGTAACGATTTAACACAAGCTAAGAATAACTTACAAGTTGATACTCAACCTTTAGAAAAAATAAAAAGACAACTTCAA
GATGAAATTGATCAAGGTACTAACACAGATGGAATGACTCAAGATTCAGTGGATAATTACAATGATAGCTTAAGTGCAGC
AATTATAGAAAAAGGCAAAGTAAATAAATTACTTAAACGTAATCCGACAGTAGAACAAGTTAAAGAGAGCGTTGCTAATG
CACAACAAGTCATACAAGATTTACAAAATGCTCGAACTTCACTTGTTCCAGACAAAACTCAACTTCAAGAAGCTAAAAAT
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AGCAAAAGCTAGACAAAACCTTGAAAAAATATCTAAAGTTTTAGGTGGTCAACCTACTGTAGCTGAAATTAGACAAAATA
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TACTTTAGAAACGATTAAAAATAAGGCTGATACTTTAAATCAATCTATGACAGCATTAAGTGAAAGTATTGCAGATTACG
AAAATCAAAAACAACAAGAAAATTATTTAGATGCATCTAACAATAAACGTCAAGACTATGACAATGCAGTCAATGCGGCT
AAAGGTATTTTAAACCAAACTCAAAGTCCGACAATGAGTGCTGATGTGATTGATCAAAAAGCTGAAGATGTTAAACGTAC
GAAAACTGCGTTAGATGGAAATCAAAGATTAGAAGTTGCTAAACAACAAGCACTTAATCATTTAAATACCTTAAATGATT
TAAACGATGCTCAGCGACAAACTTTAACTGATACTATAAATCACTCTCCAAACATCAATTCAGTGAATCAAGCTAAAGAA
AAAGCTAATACTGTTAACACAGCAATGACTCAACTGAAACAAACTATTGCTAACTATGACGATGAATTGCATGACGGCAA
TTACATTAATGCAGATAAAGACAAAAAAGATGCTTATAATAACGCTGTTAACAATGCTAAACAACTGATTAATCAATCTG
ATGCTAATCAAGCACAACTTGATCCAGCTGAAATTAATAAAGTTACACAAAGAGTCAATACGACTAAAAATGATCTAAAT
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TAACAAAGCTAAAGAAAATGTAGGCAAAGCTTCTACAAAAACAAATATTACGAGTCAGTTACAAGATTACAATCAATTGA
ATATTGCTATGCAAGCATTACGTAACAGTGTGAACGACGTTAACAATGTTAAAGCAAATAGCAATTATATAAATGAAGAT
AATGGTCCAAAAGAAGCTTACAATCAAGCCGTTACTCATGCTCAAACATTGATAAATGCACAATCTAACCCTGAAATGAG
CCGTGACGTAGTAAATCAAAAAACACAAGCAGTAAATACTGCCCATCAGAATTTACATGGACAACAAAAGTTAGAACAAG
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AATAGTAAACAAACTCGTACGGAAGTACAAGAACAACTTAACCAAGCTAAGTCACTAGATAGTTCTATGGGCACGTTAAA
ATCATTAGTTGCTAAACAACCTACAGTACAAAAAACAAGTGTTTATATTAACGAAGATCAACCTGAGCAATCTGCCTACA
ATGATTCCATTACAATGGGACAAACTATAATTAATAAAACAGCTGATCCAGTACTTGATAAAACTTTAGTTGATAACGCA
ATCAGTAACATTTCAACTAAAGAGAATGCACTGCATGGTGAACAAAAATTAACAACTGCTAAAACGGAAGCAATTAATGC
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ATGTAACTGCAGAGCAAA.GTAAGGCTAATCAAATAAATAGTGCAATGCACACGTTGAGACAAAACATTTCTGACAACGAA
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AGAAATAGTTAATGAACAACAAGCCACTCTTGATGCCAATTCAATTAACCAAAAAGCACAAGCGATTCTTACTACTAAAA
ATGCTTTAGATGGTGAAGAACAATTACGTCGTGCTAAAGAAAATGCCGATCAAGAAATCAATACGTTAAATCAATTGACTGATGCGCAAAGAAATAGTGAAAAAGGTTTAGTCAACAGTTCTCAAACTAGAACAGAAGTTGCTTCTCAATTAGCAAAAGC
TAAAGAACTAAATAAGGTGATGGAACAACTGAATCACCTTATCAATGGTAAAAACCAAATGATAAATAGCAGTAAATTTA
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CCTGAATTAGATAAAGTAACAATTGAACAAGCAATTAATAATATTAATTCTGCAATTAACAATCTAAACGGTGAAGCTAA
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ATCAAGCCGTTAATGGCGCTCAAACTAGAGACCAAGTTGCTAATAAATTACGTGATGCTGAAGCATTAGATCAATCAATGCAAACATTACGTGACTTAGTTAACAATCAAAATGCAATACATTCAACAAGTAATTATTTTAACGAGGATTCAACTCAAAA
GAATACTTATGATAATGCAATTGATAATGGCTCGACATATATAACTGGTCAACACAATCCAGAATTAAATAAATCTACTA
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GCTAATCAAGAAATTGGACAATTAGGTTATTTAAATGACCCTCAAAAATCTGGTGAGGAATCCTTAGTCAACGGTTCAAA
TACACGTTCTGAAGTAGAAGAGCATCTTAATGAAGCTAAATCATTAAATAATGCAATGAAACAATTAAGAGATAAAGTAG
CTGAAAAGACTAATGTCAAACAAAGTAGCGATTACATTAATGATTCAACTGAACATCAACGTGGGTATGATCAAGCACTT
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TTACAGCATTAAATGATGCACAACGTCAAAAAGCAATTGAAAATGTTCAAGCACAGCAGACAATCCCAGCAGTTAATCAA
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28/68
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AATCAACGCCGAAAAAGATTTAGTCAATCAAGCTAAAACAAGAACAGATGTTGCTCAAAAGTTAGCTG CAGCTAAAGAAA
TAAATTCTGCTATGAGTAATTTAAGAGATGGCATTCAAAATAAAGAGGACATCAAACGTAGCAGTGCATATATCAACGCA
GATCCGACTAAAGTTACAGCTTACGATCAAGCACTACAGAACGCAGAAAATAT CATCAATGCCACA.CCAAACGTAGAGCT
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ATGCTAAACAACAAGCTACACAAACTGTCAATGGGTTAAATAGCTTAAATGACGGTCAAAAGCGTGAATTAAATCTATTA
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AAGAAACAGTGTTCAAAACGTTGATCAAGTAAAACAAAGTAGCAATTATG TCAATGAAGATCAACCTGAACAGCACAATT
ATGATAATGCTGTCAATGAAGCTCAAGCTACAATCAACAACAATGCTCAACCTGTTCTAGACAAATTAGCTATAGAACGT
TTAACTCAAACTGTTAACACTACAAAAGATGCATTACATGGTGCTCAAAAA.CTGACACAAGACCAACAAGCTG CTGAAAC
TGGAATACGTGGTTTAACGAGTCTCAATGAACCTCAGAAAAATGCTGAAGTAGCTAAAGTAACTGCAG CAACAACACGTG
ATGAAGTGAGAAATATTCGTCAAGAAG CAACAACATTAGATAC TGCAATGC TTGGTTTACGTAAAAGCAT TAAAGATAAA
AACGATACTAAAAATAGTAGTAAATATATTAATGAGGATCATGACCAACAACAAGCTTATGACAATGCTGTAAATAATG C
TCAACAAGTTATCGATGAAACTCAAGCAACGTTAAGCTCAGATACAATCAATCAATTGGCAAATGC CGTAACTCAAGCTA
AAT C TAAT CTT CATGGAGATACTAAACTACAACACGATAAAGATAGTGCTAAACAAA C GATTGCTCAATTACAGAATTTG
AATT CAGCTCAAAAACATATGGAAGATT C TTTAATTGATAATGAAT CTACACGTACGCAAGT C CAACACGATTTAACAGA
AG CT CAAGC TTTAGATGG TTTAATGGG TG C C TTAAAAGAAAGTATTAAAGATTATACTAATATTGTTTCAAACGGTAATT
ACATCAATGCGGAACCATCTAAGAAACAAG CATATGATGCAGCTGTACAAAATGCTCAAAATATAATAAATGGAACGAAT
CAAC CAACAATTAATAAAGGTAATGT CACTACAGCAACACAAACCGTGAAAAATAC TAAAGATGC CTTAGACGGTGAT CA
TAGATTAGAGGAAGCTAAAAATAATGC CAAT CAAACAAT CAGAAAT C TAT CTAATTTGAACAATGC C CAAAAAGATGCAG
AGAAAAAT C TAGTTAATAGCGCAT CAACATTAGAACAAGTTCAACAAAACTTACAAAC CGCT CA.ACAATTAGATAATGCT
ATGGGTGAG TTAC GACAAAGTAT TGCTAAAAAAGATCAAGTGAAAGCAGATAGTAAATAT CTAAATGAAGAT C CTCAAAT
TAAGCAAAACTATGATGATGCAGTTCAACGTGTTGAAACTATTATTAACGAAACTCAAAACCCTGAATTACTTAAAGCAA
ACATTGAC CAAGCAACT CAAT C C GT TCAAAATG CAGAACAAG C T TTACATGGTGCTGAAAAATTAAATCAAGACAAACAA
ACGTCTTCGACAGAACTAGATGGATTAACAGATTTAACAGATGCACAACG TGAAAAAC TCAGAGAACAAATTAACAC TT C
TAATAGTAGAGATGATATTAAGCAAAAAATTGAGCAAGCAAAAGCACTAAATGACGCAATGAAAAAACTTAAAGAACAAG
TTGCGCAAAAAGATGGTGTTCATGCTAACAGTGATTATACAAATGAAGA CALAAAAAGA A AATAATG CA
CTTAAACAAGCGGAAGACATTATTAATAACAG CTCAAATCCTAACTTAAATGCACAAGACATTACTAATGCTTTAAATAA
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GAAAAACTTAAAGAGGC CGAAGCGCTTGATGAAGCTATGAAACAACTTGAAGAT CAAG TGAAT CAAGATGATCAAATTT C
AAATAGCAGC C CATT CATAAATGAAGACT CAGACAAACAAAAAACTTATAATGATAAAAT C CAAG C TGCAAAAGAAATAA
TTAATCAAACATCTAAT C CAAC C TTAGATAAACAAAAAATTGCTGATACACTT CAAAATATTAAAGATG CAGTGAATAAT
TTACATGGTGAT CAAAAATTAGCTCAAT C TAAACAAGATGCTAATAATCAATTAAAT CAT TTAGATGACTTAACCGAAGA
ACAAAAAAAC CATTTTAAACCGTTAATTAATAATGCTGATAC TCGAGATGAGG TAAATAAACAAC TAGAGATTGCTAAAC
AATTAAATGGTGATATGAGTACACTTCATAAAGTCATAAATGATAAAGATCAAATTCAACATTTAAGCAATTACATTAAT
GCTGATAATGATAAAAAACAAAATTATGATAATGCTATTAAAGAAGCTGAGGATTTAA.TTCATAATCATCCAGATACATT
AGATCATAAAGCATTACAAGATTTATTAAACAAGATAGAC CAAGCGCATAACGAATTAAATGGAGAATC CAGATTTAAAC
AGGC TTTAGACAATGCTTTAAACGACATAGATAGC TTAAACAG T CTCAATGTT C CACAACGC CAAACTGTTAAGGATAAC
ATCAAC CATGTGACAACT C TAGAAAG TTTAGCTCAAGAATTGCAGAAAGCAAAAGAGCTTAATGATGCTATGAA.AGCAAT
GAGAGATAGCATTATGAATCAAGAGCAAATT CG TAAA.AATAGCAATTATACTAATGAAGAC TTAGCTCAACAAAATGC CT
ATAATCATGCAGTAGATAAAATAAATAACATTATTGGTGAAGACAATGCGACGATGGATCCTCAAATAATCAAACAAGCA
ACTCA_AGATATAAATACAGCTATAAATGGATTAAATGGAGATCAAAAACTTCAAGATGCAAAGACAGATGCTAAACAACA
AATTACTAACTTTACTGG TTTAACTGAACCACAAAAACAAGCATTGGAAAACATCATTAACCAACAAACAAGCAGAGCAA
ATGTTGCTAAACAG TTAAGT CATGCTAAATT CTTAAATGGAAAAATGGAAGAATTAAAAGTTGCAGTAG C CAAAGCGT CA
TTAGTAAGACAAAATAGTAACTATATTAATGAAGATGT C T CTGAAAAAGAAGCATATGAACAAGC TAT CGCAAAAGGT CA
GGAAATAATTAATTCAGAAAATAATCCAACAATAAGTAGTACTGATATCAATCG TAC CATT CAAGAAAT TAATGATGCTG
AACAAAATCTTCATGGTGATAATAAATTAAGACAAGCACAGGAAATTGCAAAGAATGAAATACAAAATCTAGACGGATTA
AATTCAG CT CAAATAACAAAATTAAT C CAAGATATAGGCAGAACAACAACTAAAC C TG CAGTAACTCAGAA.ACTAGAAGA
AG CAAAAG CAATAAACCAAGCTATGCAACAACTTAAACAAAGTATAGCCGATAAGGATGCTACTCTAAATTCTAGTAACT
ATCTCAATGAAGATTCTGAGAAAAAGTTAGCGTACGATAATG CTGTAAGCCAAGCTGAACAACTCATAAATCAACTTAAC
GAC C CAACTATGGATATAAG TAATATTCAAGCTATTACT CAAAA.GGTCATT CAAG CAAAA.GATTCATTG CACGGTGCGAA
TAAACTTGC.ACAAAATCAAGCAGATTCAAATTTAATAATAAATCAATCAACAAATTTAAATGATAAACAAAAGCAAGCAT
TAAATGACTTAATTAATCATGCTCAAACTAAACAGCAAGTGGCAGAAATAATTG CACAAGCTAATAAGTTAAATAACGAA
ATGGGCACACTAAAA.ACACT C GTAGAAGAACAGT CAAACGTT CATCAACAAAGTAAATATATTAATGAAGAT C CGCAAG T
TCAAAATATTTATAATGACTCCATTCAAAAAGGTCGAGAAATATTAAACGGCACTACAGATGATGTTTTAAACAACAATA
AAATAGCAGATG C CATT CAAAACATTCATTTAACTAAAAACGATTTACATGG TGAT CAAAAATTACAAAAAGCACAACAA
GATGCA.ACCAATGAATTAAACTATTTAACAAATCTAAACAATTCTCAAAGACAAAG CGAG CATGATGAGATTAACTCTGC
T C CTTCAAGAAC TGAAG TTT CTAATGATTTAAAT CATGC TAAAGCACTTAATGAAGCTATGCG T CAACTTGAGAATGAAG
29/68
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CTTCAAAAAGC TAAAGACATTATCAACGGCGTTCCAAGTAGCACTTTAGATAAAGCTACAATTGAAGATGCTTTATTAGA
ATTGCAAAATGCTAGAGAAAGTTTACATGGTGAGCAAAAACT TCAAGAGG CTAAAAATCAAGCTGTTGCTGAAATTGATA
ATTTACAAGCATTAAATCCTGGACAGGT TCTTGCTGAAAAAACATTAGT TAACCAAG CATCAACCAAACCAGAAGTTCAA
GAAGCCTTACAAAAAGCAAAAGAACTTAATGAAGCTATGAAAGCACTGAAAACTGAAATAAATAAAAAAGAACAAATCAA
GGCTGATAGTAGATATGTAAATGCTGACAGTGGTCTTCAAGCAAATTACAATTCTGCGTTAAATTATGGTTCTCAAATTA
TTGCAACTACCCAACCACCAGAGCTTAATAAAGATGTAATAAATAGAGCAACTCAAACGATTAAAACTGC TGAAAATAAT
TTAAATGGGCAATCTAAATTAGCAGAGGCTAAGTCAGACGGAAATCAAAGCATCGAACATTTGCAAGGATTAACACAATC
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AATTAGATAACTCTATGAATCAACTACAACAAATTGTTAACAATGACAATACAGTAAAACAAAATAGTGATTTCATTAAT
GAAGATTCCAGCCAACAGGATGCTTATAATCATGCAATTCAAGCAGCAAAAGATTTGATAACTGCTCATCCAACTATCAT
GGATAAAAATCAAATAGATCAAGCTATTGAAAATATCAAACAAGCACTTAATGATTTACACGGTAGTAATAAACTATCAG
AAGATAAAAAAGAAGCTTCAGAACAACTACAAAACCTTAATAGCTTGACGAACGGGCAAAAAGATACGATTTTAAATCAT
ATTTTCAGTGCACCAACAAGAAGCCAAGTAGGAGAAAAAATTGCAAGTGCTAAACAATTAAATAATACAATGAAAGCACT
TAGAGATTCTATTGCTGATAATAATGAAATTTTACAAAGTAGTAAGTACTTCAATGAAGATTCTGAACAACAAAATGCTT
ATAATCAAGCCGTAAATAAAGCTAAAAATATAATTAATGATCAACCAACACCAGTAATGGCAAATGATGAGATTCAAAGT
GTCCTAAATGAAGTTAAACAAAC TAAAGATAATTTACATGGTGATC.AAAAACTTGCTAACGACAAGACAGATGCTCAAGC
AACATTAAATGCGTTAAATTAC TTAAATCAAGCGCAAAGAGGTAATC TTGAAACTAAAGTT CAAAAC TCTAATTC TAGAC
CAGAAGTACAAAAAGTAGTTCAATTAGCAAATCAACTTAATGATGC GATGAAAAAATTAGATGATGCTTTAAC TGGTAAT
GACGCAATAAAACAAACGAGTAATTATATTAATGAAGATACT TC TCAACAAGTTAACTTTGATGAGTATACAGATAGAGG
TAAAAACATAGTTGCTGAACAAACAAATCCAAATATGTCTC CAACTAATATTAACACTATTGCTGATAAAATTACTGAAG
CTAAAAACGATTTACATGGCGTACAAAAACTAAAACAAGCTCAACAACAGTCCATCAATACTATTAATCAAATGACTGGT
CTAAACCAAGCTCAAAAAGAACAATTAAATCAAGAAATTCAACAAACTCAAAC C CGTTCTGAAGTACATCAAGTAATTAA
TAAAGCACAAGCTT TAAATGATTCAATGAATACTTTACGTCAAAGTATTACTGATGAACATGAAGTTAAACAAACAAGTA
ACTACATCAATGAAACTGTTGGTAATCAAACTGCATATAACAATGCCGTTGATCGTGTAAAACAAATAATCAATCAAACA
TCTAATCCAACTATGAATCCTTTAGAGGTGGAACGTGCAACATCAAATGTAAAAATTTCTAAAGATGCACTTCATGGTGA
ACGTGAATTGAATGACAATAAAAATTCAAAAACTTTTGCAGTCAATCACTTAGATAACCTCAATCAAGCTCAAAAAGAAG
CATTAACTCATGAAATTGAACAAGCAACTATAGTTTCACAAGTAAATAATATCTATAACAAAGCGAAAGCTTTAAATAAT
GATATGAAAAAACTTAAAGATATCGTTGCTCAACAAGATAATGTGAGACAATCAAACAAT.T.ATATAAACGAGGATAGTAC
ACCTCAAAATATGTACAACGATACAATTAATCATGCACAATCAATCATTGATCAAGTAG CAAACCCTACGATGTCTCATG
ACGAAATAGAGAATGCAATCAATAACATAAAGCATGCCATCAATGCACTCGATGGAGAACATAAATTACAACAAGCAAAA
GAAAATGCAAACTTATTGATTAATAGTT TAAACGATTTAAATG CACCACAAAGAGATGCCATAAATAGAT TGGTTAATGA
AGCTCAAACAAGAGAAAAAGTAGCTGAACAACTTCAAAGTG CTCAAGCTTTAAATGACGCTATGAAGCATTTAAGAAACA
GCATTCAAAATCAATCATCCGTAAGACAAGAGAGCAAATATATTAATGCAAGTGATGCTAAAAAAGAGCAATATAATCAC
GCAGTTAGAGAAGTCGAAAATATTATCAATGAACAACATCCAACATTGGATAAAGAAATAATTAAGCAACTAACGGATGG
TGTAAATCAAGCGAATAATGACTTAAATGGCGTTGAATTATTAGATGCTGATAAGCAAAACGCACATCAATCGATACCTA
CATTGATGCACTTAAATCAAGCACAACAAAACGCATTAAATGAAAAAATTAATAACGCAGTTACCAGAACTGAAGTTGCG
GCTATTATTGGCCAAGCAAAACTACTCGATCATGCTATGGAGAATTTAGAAGAAAGTATCAAAGATAAAGAGCAAGTCAA
ACAGTCAAGTAACTATATTAATGAAGATTCTGATGTTCAAGAAACATACGATAACGCCGTTGATCATGTGACAGAAATAC
TTAATCAAACAGTAAATCCAACTTTATCTATTGAAGATATAGAGCATGCTATCAACGAAGTTAATCAAGCGAAAAAACAA
CTCAGAGGTAAACAAAAACTTTATCAAACTATCGATTTAGCTGATAAAGAATTAAGTAAATTGGATGATTTAACATCACA
ACAAAGCAGTTCAATATCTAATCAAATATATACTGCTAAAACGAGAACAGAAGTTGCCCAAGCAATTGAAAAAGCAAAAT
CATTAAATCATGCAATGAAAGCACTTAACAAAGTATATAAAAATGCAGATAAAGTGTTAGATAGTAGTCGATTCATTAAC
GAAGATCAACCTGAAAAAAAGGCGTATCAACAAGCTATAAATCATGTTGATT CAATCATTCATAGACAAACAAATCCTGA
AATGGATCCAACAGTAATCAATAGCATAACTCATGAACTCGAAACAGCTCAAAATAACTTACATGGTGATCAGAAACTTG
CTCATGCACAACAAGATGCCGCTAATGTAATTAATGGTC TAATTCATCTTAATGTTGCTCAACGTGAGGTAATGATAAAT
ACGAATACAAATGCTACAACACGCGAAAAAGTTGCAAAGAACTTAGATAATGCTCAAGCTCTTGATAAAGCTATGGAAAC
ACTACAACAAGTAGTTGCTCATAAAAATAATATATTGAACGATAGTAAATATTTAAATGAAGATTCAAAATATCAACAAC
AATACGATCGAGTTATTGCTGATGCCGAACAACTACTTAATCAGACAACAAATCCAACATTAGAACCTTATAAAGTCGAT
AT TGTTAAGGATAATGTCCTAGCTAACGAAAAAATACTATTTGGCG CAGAAAAA.CTATCATATGACAAATCAAATG CAAA
TGATGAAATTAAACATATGAATTATCTTAATAATGCACAAAAGCAATCTATAAAAGATATGATTTCTCACGCAGCATTAA
GAACTGAAGTTAAACAACTTCTGCAACAAG CTAAAATCCTTGATGAAG CCATGAAATCACTTGAAGATAAAACTCAAGTA
GTGATTACAGATACTACTTTGCCTAATTACACTGAAGCTTCAGAGGATAAA.AAGGAAAAAGTAGACCAAACTGTATCACA
TGCTCAAGCGATTATTGATAAAATAAATGGCTCAAATGTAAGTTTAGATCAAGTACGACAAGCACTAGAACAATTAACTC
AAGCATCAGAAAACCTCGATGGTGATCAGCGAGTTGAAGAAGCTAAAGTTCATGCTAATCAAACAATTGATCAATTAACA
CATCTTAATTCATTACAACAACAAAC TGCGAAAGAAAGTGTTAAAAACGCAACAAAACTAGAAGAAATCGCTACTGTTAG
TAACAATGCTCAGGCATTAAACAAAGTAATGGGTAAATTAGAACAATTCATTAATCATGCTGATTCTGTTGAAAATAGTG
ATAATTATAGACAAGCCGACGACGACAAAATCATCGCT TATGATGAAGCACT TGAACATGGACAAGATATACAAAAAACT
AACGCAACCCAAAATGAAACAAAACAAGCGTTACAACAATTAATATATGCAGAAACATCGTTAAATGGTTTCGAAAGATT
AAATCATGCTAGACCACGAGCTTTAGAATATATCAAATCACTAGAAAAAATAAACAATGCTCAAAAGTCTGCTTTAGAGG
ATAAAGTAACGCAATCGCATGATTTATTAGAATTAGAACATATTGTCAACGAGGGCACAAAC CTCAATGACATTATGGGT
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GAATTAGCTAACGCAATCGTTAATAACTATGCTCCAACCAAAGCAAGTATAAATTATATTAACGCCGATAACCTACGCAA
AGATAACTTTACTCAAGCTATCAACAATGCACGTGATGCACTCAACAAAACTCAAGGTCAGAACTTAGATTTCAATGCAATTGATACATTTAAAGATGATATATTCAAAACTAAAGATGCACTTAACGGTATTGAACGTTTAACAGCTGCAAAATCAAAA
GCAGAAAAACTAATTGATAGTTTAAAATTTATTAATAAAGCTCAATTCACACATGCAAATGATGAAATTATGAATACTAA
TTCTATTGCACAATTGTCTAGAATCGTGAATCAAGCATTTGATTTAAATGATGCAATGAAATCTTTAAGAGATGAACTTA
ATAATCAAGCTTTTCCTGTCCAAGCAAGCTCAAATTATATAAATTCAGATGAAGATTTAAAACAACAATTTGACCATGCT
TTAAGTAATGCTCGAAAAGTTCTTGCAAAAGAAAATGGTAAAAATTTAGATGAAAAACAAATTCAGGGACTCAAACAAGT
GATTGAGGATACTAAAGATGCTTTAAATGGTATCCAACGTTTATCAAAAGCTAAAGCTAAAGCAATTCAATACGTACAATCTTTATCTTATATCAATGATGCACAGCGTCATATTGCTGAAAATAATATTCACAACTCTGATGATTTATCATCTTTAGCA
AATACATTATCTAAAGCTAGTGATTTAGATAATGCAATGAAAGACTTACGAGATACTATAGAAAGTAATTCAACTTCTGT
TCCAAATAGTGTGAATTATATTAATGCTGATAAGAATTTACAAATTGAATTTGATGAGGCGCTACAACAAGCAAGTGCAACAAGTTCTAAAACTTCAGAAAATCCAGCAACGATTGAAGAAGTATTAGGTCTTAGTCAAGCCATTTACGATACAAAAAAT
GCATTAAATGGTGAACAACGACTTGCAACTGAGAAGAGCAAAGATCTAAAATTAATAAAAGGATTAAAAGATTTAAATAA
AG CACAACTTGAAGATGTCACAAACAAGGTAAATTCAGCAAATACTTTAACAGAGTTATCTCAGCTCACTCAATCAACGT
TAGAATTAAACGATAAAATGAAATTATTGAGAGATAAGCTTAAAACTTTAGTAAATCCTGTTAAAG CAAGTTTAAATTAT
AGAAACGCTGATTATAATTTAAAACGTCAATTTAACAAAGCTTTAAAAGAAGCTAAAGGCGTATTAAATAAAAATAGCGGTACAAATGTCAATATCAATGACATTCAACATCTTTTAACACAAATAGATAATGCTAAAGACCAATTAAATGGTGAACGAC
GTCTAAAAGAACATCAACAAAAATCTGAAGTATTTATTATTAAAGAATTAGATATACTTAATAATGCTCAAAAAGCTGCA
ATAATTAATCAGATTAGAGCGTCTAAAGACATTAAAATAATTAATCAAATCGTTGATAATGCAATAGAATTAAATGATG C
TATGCAAGGTTTAAAAGAACATGTAGCTCAATTAACAGCAACTACAAAAGACAACATTGAATATTTAAATGCTGATGAAG
ACCATAAATTACAATATGATTACGCTATCAACTTAGCGAATAATGTTCTTGACAAAGAAAACGGTACAAATAAAGACGCT
AATATCATAATTGGAATGATTCAAAACATGGATGATGCTAGAGCACTTCTAAATGGAATTGAAAGACTTAAAGATGCTCA
AACAAAAGCACATAA.TGACATTAAAGATACGCTCAAACGTCAACTTGATGAAATTGAACACGCTAATGCAACATCAAATT
C TAAAGCTCAAGCTAAACAAATGGTAAATGAGGAAGCTAGAAAAGCGCTTTCTAATATTAATGACGCAACATCAAATGAT
TTAGTTAATCAAGCAAAAGATGAAGGGCAATCTGCAATTGAACACATACATGCAGATGAATTACCTAAAGCAAAACTAGATGCTAATCAAATGATTGACCAAAAAGTTGAAGATATAAATCACTTAATTAGTCAAAATCCAAACTTATCAAATGAAGAAA
AAAATAAACTAATATCTCAAATTAATAAGTTAGTAAATGGAATTAAGAATGAAATTCAACAAGCTATAAACAAACAACAA
ATAGAAAATG CTACAACAAAACTAGATGAAGTCATTGAAACTACTAAAAAATTAATTATCG C CAAAG CAGAAG CTAAACAAATGATAAAAGAGTTATCACAAAAGAAACGAGATGCAATAAAT`AACAACAC•TGATT-T-AACALLi.i CAAAAGGCACATG
CTTTAGCAGATATTGATAAAACAGAAAAAGATGCACTTCAACATATCGAAAATTCTAATTCAATTGATGATATCAATAAC
AATAAAGAGCATGCATTTAATACTTTAGCTCATATCATTATTTGGGATACTGATCAGCAACCATTAGTTTTTGAACTACC
TGAATTGAGCCTTCAAAATGCTCTAGTAACAAGTGAGGTGGTTGTTCACAGAGATGAAACTATTTCATTAGAATCTATAA
TTGGAGCTATGACTTTAACTGATGAACTTAAAGTCAATATTGTTTCATTACCGAACACTGATAAAGTAGCTGATCACCTA
ACCGCTAAAGTTAAGGTTATTTTAGCTGATGG CTCATATGTCACTGTAAATGTTC CAGTCAAAGTTGTAGAAAAAGAATT
ACAAATAGCTAAAAAGGATGCTATAAAAACAATTGATGTTCTGGTAAAACAAAAAATCAAAGATATAGATTCTAATAACG
AATTAACGTCTACTCAACGTGAAGATGCAAAAGCTGAAATTGAAAGATTGAAAAAGCAAGCCATCGATAAAGTGAATCAT
TCAAAATCGATTAAAGATATTGAAACAGTAAAACGAACTGATTTTGAAGAAATAGATCAGTTTGATCCTAAACGCTTTAC
G CTAAATAAAGCTAAAAAGGATATCATTACTGATGTTAATACTCAAATCCAAAATGGTTTCAAAGAAATTGAAACAATAA
AAGGTTTAACTTCTAATGAAAAAACTCAGTTTGATAAACAATTAACTGCACTACAAAAAGAATTTTTAGAAAAAGTCGAG
CATG CTCATAATTTAGTAGAATTAAATCAATTACAACAAGAGTTTAATAATAGATATAAACATATTTTAAAC CAAG CACA
TTTACTAGGTGAAAAACATATAGCAGAACATAAATTAGGATATGTTGTAGTAAACAAAACTCAGCAAATACTAAATAATC
AATCTGCTTCTTACTTTATAAAACAATGGGCACTTGATAGAATTAAACAAATTCAACTAGAAACGATGAATTCAATTCGT
GGTGCGCATACCGTACAAGATGTACACAAAGCATTATTACAAGGTATAGAGCAAATCTTGAAAGTAAATGTAAGTATTAT
AAATCAATCTTTCAACGATTCCTTGCATAACTTTAATTATCTTCATTCAAAATTTGATGCTAGATTAAGAGAAAAGGATG
TTGCAAACCATATCGTACAAACTGAAACATTCAAAGAAGTTCTAAAAGGAACGGGTGTTGAACCAGGTA.AAATCAACAAAGAAACACAGCAACCAAAACTTCATAAGAATGATAATGATAGCCTATTCAAACATTTAGTTGATAATTTCGGCAAAACTGT
AGGTGTTATTACATTAACTGGTTTACTTTCTAGTTTCTGGTTAGTTTTGGCTAAAAGACGTAAAAAAGAAGAAGAAGAAA
AACAATCGATAAAAAATCATCACAAAGATATTCGTCTTTCAGATACTGATAAAATAGATCCAATIGTAATAACTAAG CGT
AAAATAGATAAAGAAGAACAAATTCAAAACGATGACAAACATTCAATTCCAGTTGCTAAACATAAGAAATCTAAAGAAAA
GCAATTGAGTGAAGAGGATATTCA'TTCAATCCCCGTCGTTAAGCGTAAACAAAACAGTGATAACAAAGATACAAAACAGA
AGAAAGTTACTTCTAAAAAGAAGAAAACGCCTCAGTCAACTAAAAAAGTTGTAAAAACCAAAAAGCGTTCTAAAAAG
SEQ ID NO:49 seqüência de polinucleotídeoATGAGAGATAAGAAAGGACCGGTAAATAAAAGAGTAGATTTTCTATCAAATAAATTGAATAAATATTCAATAAGAAAATT
TACAGTTGGAACAGCATCTATTTTAATTGGCTCACTAATGTATTTGGGAACTCAACAAGAAGCAGAAGCAGCTGAAAACA
ATATTGAGAATCCAACTACATTAAAAGATAATGTCCAATCAAAAGAAGTGAAGATTGAAGAAGTAACAAACAAAGACACT
GCACCACAAGGTGTAGAAGCTAAATCTGAAGTAACTTCAAACAAAGACACAATCGAACATGAAGCATCAGTAAAAGCTGA
AGATATATCAAAAAAGGAGGATACACCAAAAGAAGTAG CTAATGTTG CTGAAGTTCAGC CGAAATCGTCAGTCACTCATA
ACGCAGAGGCACCTAAGGTTAGAAAAGCTCGTTCTGTTGATGAAGGCTCTTTTGATATTACAAGAGATTCTAAA.AATGTA
GTTGAATCTACCCCAATTACAATTCAAGGTAAAGAACATTTTGAAGGTTACGGAAGTGTTGATATACAAAAAAACCCAAC
AGATTTAGGGGTATCAGAGGTAACCAGGTTTAATGTTGGTAATGAAAGTAATGGTTTGATAGGAGCTTTACAATTAAAAA
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ATAAAATAGATTTTAGTAAGGATTTCAATTTTAAAGTTAGAGTGGCAAATAACCATCAATCAAATACCACAGGTGCTGAT
GGTTGGGGGTTCTTATTTAGTAAAGGAAATGCAGAAGAATATTTAACTAATGGTGGAATCCTTGGGGATAAAGGTCTGGT
AAATTCAGGCGGATTTAAAATTGATACTGGATACATTTATACAAGTTCCATGGACAAAACTGAAAAGCAAGCTGGACAAG
GTTATAGAGGATACGGAGCTTTTGTGAAAAATGACAGTTCTGGTAATTCACAAATGGTTGGAGAAAATATTGATAAATCA
AAAACTAATTTTTTAAACTATGCGGACAATTCAACTAATACATCAGATGGAAAGTTTCATGGGCAACGTTTAAATGATGT
CATCTTAACTTATGTTGCTTCAACTGGTAAAATGAGAGCAGAATATGCTGGTAAAACTTGGGAGACTTCAATAACAGATT
TAGGTTTATCTAAAAATCAGGCATATAATTTCTTAATTACATCTAGTCAAAGATGGGGCCTTAATCAAGGGATAAATGCA
AATGGCTGGATGAGAACTGACTTGAAAGGTTCAGAGTTTACTTTTACACCAGAAGCGCCAAAAACAATAACAGAATTAGA
AAAAAAAGTTGAAGAGATTCCATTCAAGAAAGAACGTAAATTTAATCCGGATTTAGCACCAGGGACAGAAAAAGTAACAA
GAGAAGGACAAAAAGGTGAGAAGACAATAACAACACCAACACTAAAAAA.TCCATTAACTGGAGAAATTATTAGTAAAGGT
GAATCGAAAGAAGAGATCACAAAAGATCCGATTAATGAATTAACAGAATACGGACCAGAAACGATAGCACCAGGTCATCG
AGACGAATTTGATCCGAAGTTACCAACAGGAGAGA.AAGAAGAAGTTCCAGGTAAACCAGGAATTAAGAATCCAGAAACAG
GAGACGTAGTTAGACCACCGGTCGATAGTGTAACA.AAATATGGACCTGTAAAAGGAGACTCGAT'TGTAGAAAA.AGAAGAA
ATTCCATTCGAGAAAGAACGTAAATTTAATCCTGATTTAGCACCAGGAACAGAAAAAGTAACAAGAGAAGGACAAAAAGG
TGAGAAGACAATAACGACACCAACACTAAAAAATCCATTAACTGGAGAAATTATTAGTAAAGGTGAATCGAAAGAAGAGA
TCACAAAAGATCCGATTAATGAATTAACAGAATACGGACCTGAAACAATAGCGCCAGGTCATCGAGACGAATTTGATCCG
AAGTTACCAACAGGAGAGAAAGAAGAAGTTCCAGGTAAACCAGGAATTAAGAATCCAGAAACAGGAGACGTAGTTAGACC
GCCGGTCGATAGCGTAACAAAATATGGACCTGTAAAAGGAGACTCGATTGTAGAAAAAGAAGAAATTCCATTCAAGAAAG
AACGTAAATTTAATCCTGATTTAGCACCAGGGACAGAAAAAGTAACAAGAGAAGGACAAAAAGGTGAGAAGACAATAACG
ACGCCAACACTAAAAAATCCATTAACTGGAGAAATTATTAGTAAAGGTGAATCGAAAGAAGAAATCACAAAAGATCCGAT
TAATGAATTAACAGAATACGGACCAGAAACGATAACACCAGGTCATCGAGACGAATTTGATCCGAAGTTACCAACAGGAG
AGAAAGAGGAAGTTCCAGGTAAACCAGGAATTAAGAATCCAGAAACAGGAGATGTAGTTAGACCACCGGTCGATAGCGTA
ACAA.AATATGGACCTGTAAAAGGAGACTCGATTGTAGAAAAAGAAGAAATTCCATTCGAGAAAGAACGTAAATTTAATCC
TGATTTAGCACCAGGGACAGAAAAAGTAACAAGAGAAGGACAAAAAGGTGAGAAGACAATAACGACGCCAACACTAAAAA
ATCCATTAACTGGAGAAATTATTAGTAAAGGTGAATCGAAAGAAGAAATCACAAAAGATCCAGTTAATGAATTAACAGAATTCGGTGGCGAGAAAATACCGCAAGGTCATAAAGATATCTTTGATCCAAACTTACCAACAGATCAAACGGAAAAAGTACC
AGGTAAACCAGGAATCAAGAATCCAGACACAGGAAAAGTGATCGAAGAGCCAGTGGATGATGTGATTAAACACGGACCAA
AAACGGGTACACCAGAAACAAAAACAGTAGAGATACCGTTTGAAACAAAACGTGAGTTTAATCCAAAATTACAACCTGGT
GAAGAGCGAGTGAAACAAGAAGGACAACCAGGAAGTAAGACAATCACAACACCAATCACAGTGAACCCATTAACAGGTGA
AAAAGTTGGCGAGGGTCAACCAACAGAAGAGATCACAAAACAACCAGTAGATAAGATTGTAGAGTTCGGTGGAGAGAAAC
CAAAAGATCCAAAAGGACCTGAAAACCCAGAGAAGCCGAGCAGACCAACTCATCCAAGTGGCCCAGTAAATCCTAACAAT
CCAGGATTATCGAAAGACAGAGCAAAACCAAATGGCCCAGTTCATTCAATGGATAAAAATGATAAAGTTAAAAAATCTAA
AATTGCTAAAGAATCAGTAGCTAATCAAGAGAAAAAACGAGCAGAATTACCAAAAACAGGTTTAGAAAGCACGCAAAAAG
GTTTGATCTTTAGTAGTATAATTGGAATTGCTGGATTAATGTTATTGGCTCGTAGAAGAAAGAATTAA
SEQ ID NO:50 seqüência de polinucleotídeoATGGGCAAACGTAGACAAGGTCCTATTAATAAAAAAGTGGATTTTTTACCTAACAAATTAAACAAGTATTCTATAAGAAA
ATTCACTGTTGGTACGGCCTCAATATTACTTGGTTCGACACTTATTTTTGGAAGTAGTAGCCATGAAGCGAAAGCTGCAG
AAGAAAAACAAGTTGATCCAATTACACAAGCTAATCAAAATGATAGTAGTGAAAGATCACTTGAAAACACAAATCAACCT
ACTGTAAACAATGAAGCACCACAGATGTCTTCTACATTGCAAGCAGAAGAAGGAAGCAATGCAGAAGCACCGAATGTTCC
AACTATCAAAGCTAATTCAGATAATGATACACAAACACAATTTTCAGAAGCCCCTACAAGAAATGACCTAGCTAGAAAAG
AAGATATCCCTGCTGTTTCTAAAAACGAGGAATTACAATCATCACAACCAAACACTGACAGTAAAATAGAACCTACAACT
TCAGAACCTGTGAATTTAAATTATAGTTCTCCGTTTATGTCCTTATTAAGCATGCCTGCTGATAGTTCATCCAATAACACTAAAAATACAATAGATATACCGCCAACTACGGTTAAAGGTAGAGATAATTACGATTTTTACGGTAGAGTAGATATCCAAAGTAATCCTACAGATTTAAATGCGACAAATTTAACGAGATATAATTATGGACAGCCACCTGGTACAACAACAGCTGGTGCAGTTCAATTTAAAAATCAAGTTAGTTTTGATAAAGATTTCGACTTTAACATTAGAGTAGCAAACAATCGTCAAAGTAATACAACTGGTGCAGATGGTTGGGGCTTTATGTTCAGCAAGAAAGATGGGGATGATTTCCTAAAAAACGGTGGTATCTTACGTG
AAAAAGGTACACCTAGTGCAGCTGGTTTCAGAATTGATACAGGATATTATAATAACGATCCATTAGATAAAATACAGAAA
CAAGCTGGTCAAGGCTATAGAGGGTATGGGACAT'TTGTTAAAAATGACTCCCAAGGTAATACTTCTAAAGTAGGATCAGG
TACTCCATCAACAGATTTTCTTAACTACGCAGATAATACTACTAATGATTTAGATGGTAAATTCCATGGTCAAAAATTAA
ATAATGTTAATTTGAAATATAATGCTTCAAATCAAACTTTTACAGCTACTTATGCTGGTAAAACTTGGACGGCTACGTTA
TCTGAATTAGGATTGAGTCCAACTGATAGTTACAATTTTTTAGTTACATCAAGTCAATATGGAAATGGTAATAGTGGTAC
ATACGCAGATGGCGTTATGAGAGCTGATTTAGATGGTGCAACATTGACATATACTCCTAAAGCAGTCGATGGAGACCCAA
TTACATCAACTAAGGAAATACCATTTAATAAAAAACGCGAATTTGATCCAAACTTAGCGCCAGGTACAGAAAAAGTCGTT
CAAAAAGGTGAACCAGGAATTGAAACAACAACAACACCAACTTATGTCAATCCTAATACTGGAGAAAAAGTAGGTGAAGG
CACACCTACAACAAAGATCACTAAACAACCAGTGGATGAAATCGTTCATTATGGTGGCGAAGAAATCAAGCCAGGACATA
AAGATGAATTTGATCCAAATGCACCGAAAGGTAGTCAAACAACGCAACCAGGTAAGCCAGGAGTTAAAAATCCTGATACAGGCGAAGTAGTCACACCACCAGTGGATGATGTGACAAAATATGGTCCAGTTGATGGAGATCCGATTACGTCAACGGAAGAAATTCCATTCGACAAGAAACGTGAATTCAATCCTGATTTAAAACCAGGTGAAGAGCGTGTTAAACAAAAAGGTGAACCAGGAACAAAAACAATTACAACACCAACAACTAAGAACCCATTAACAGGGGAAAAAGTTGGCGAAGGTGAACCAACAGAAAAA
ATAACAAAACAACCAGTAGATGAAATCACAGAATATGGTGGCGAAGAAATCAAGCCAGGCCATAAGGATGAATTTGATCC
32/68
GAACGCACCGAAAGGTAGCCAAGAGGACGTTCCAGGTAAACCAGGAGTTAAAAATCCTGATACAGGCGAAGTAGTCACAC
CACCAGTGGATGATGTGACAAAATATGGTCCAGTTGATGGAGATCCGATTACGTCAACGGAAGAAATTCCGTTTGATAAA
AAACGCGAATTTGATCCAAACTTAGCGCCAGGTACAGAGAAAGTCGTTCAAAAAGGTGAACCAGGAACAAAAACAATTAC
AACACCAACAACTAAGAACCCATTAACAGGAGAAAAAGTTGGCGAAGGTGAACCAACAGAAAAAATAACAAAACAACCAG
TGGATGAAATCGTTCATTATGGTGGCGAAGAAATCAAGCCAGGCCATAAGGATGAATTTGATCCGAACGCACCGAAAGGT
AGCCAAGAGGACGTTCCAGGTAAGCCAGGAGTTAAAAATCCTGATACAGGCGAAGTAGTCACACCACCAGTGGATGATGT
GACAAAATATGGTCCAGTTGATGGAGATCCGATTACGTCAACGGAAGAAATTCCATTCGACAAGAAACGTGAATTCAATC
CTGATTTAAAACCAGGTGAAGAGCGTGTTAAACAAAAAGGTGAACCAGGAACAAAAACAATTACAACACCAACAACTAAG
AACCCATTAACAGGGGAAAAAGTTGGCGAAGGTGAACCAACAGAAAAAGTAACAAAACAACCAGTGGATGAAATCGTTCA
TTATGGTGGCGAAGAAATCAAGCCAGGCCATAAGGATGAATTTGATCCAAATGCACCGAAAGGTAGCCAAGAAGACGTTC
CAGGTAAACCAGGAGTTAAAAACCCTGATACAGGCGAAGTAGTTACTCCACCAGTGGATGATGTGACAAAATATGGTCCA
GTTGATGGAGATCCGATTACGTCAACGGAAGAAATTCCGTTTGATAAAAAACGCGAATTTGATCCAAACTTAGCGCCAGG
TACAGAGAAAGTCGTTCAAAAAGGTGAACCAGGAACAAAAACAATTACAACACCAACAACTAAGAACCCATTAACAGGAG
AAAAAGTTGGCGAAGGTGAACCAACAGAAAAAATAACAAAACAACCAGTGGATGAGATCGTTCATTATGGTGGCGAAGAA
ATCAAGCCAGGCCATAAGGATGAATTTGATCCGAACGCACCGAAAGGTAGTCAAACAACGCAACCAGGTAAGCCAGGAGT
TAAAAATCCTGATACAGGCGAAGTAGTCACACCACCAGTGGATGATGTGACAAAATATGGTCCAGTTGATGGAGATCCGA
TTACGTCAACGGAAGAAATTCCGTTTGATAAAAAACGCGAATTTGATCCAAACTTAGCGCCAGGTACAGAGAAAGTCGTT
CAAAAAGGTGAACCAGGAACAAAAACAATTACAACGCCAACAACTAAGAACCCATTAACAGGAGAAAAAGTTGGCGAAGG
TGAACCAACAGAAAAAATAACAAAACAACCAGTGGATGAGATTGTTCATTATGGTGGTGAACAAATACCACAAGGTCATA
AAGATGAATTTGATCCAAATGCACCTGTAGATAGTAAAACTGAAGTTCCAGGTAAACCAGGAGTTAAAAATCCTGATACA
GGTGAAGTTGTTACCCCACCAGTGGATGATGTGACAAAATATGGTCCGAAAGTTGGTAATCCAATCACATCAACGGAAGA
GATTCCATTTGATAAGAAACGTGTATTTAATCCTGATTTAAAACCAGGTGAAGAGCGCGTTAAACAAAAAGGTGAACCAG
GAACAAAAACAATTACAACACCAATATTAGTTAATCCTATTACAGGAGAAAAAGTTGGCGAAGGTAAATCAACAGAAAAA
GTCACTAAACAACCTGTTGACGAAATTGTTGAGTATGGTCCAACAAAAGCAGAACCAGGTAAACCAGCGGAACCAGGTAA
ACCAGCGGAACCAGGTAAACCAGCGGAACCAGGTAAACCAGCGGAACCAGGTACGCCAGCAGAACCAGGTAAACCAGCGG
AACCAGGTAAACCAGCGGAACCAGGTAAACCAGCGGAACCAGGTAAACCAGCGGAACCAGGTAAACCAGCGGAACCAGGT
ACGCCAGCAGAACCAGGTAAACCAGCGGAACCAGGTAAACCAGCGGAACCAGGTAAACCAGCGGAACCAGGTACGCCAGC
AGAACCAGGTAAACCAGCGGAACCAGGTACGCCAGCAGAACCAGGTAAACCAGCGGAACCAGGTACGCCAACACAATCAG
GTGCACCAGAACAACCAAATAGATCAATGCATTCAACAGATAATAAAAATCAATTACCTGATACAGGTGAAAATCGTCAA
GCTAATGAGGGAACTTTAGTCGGATCTCTATTAGCAATTGTCGGATCATTGTTCATATTTGGTCGTCGTAAAAAAGGTAA
TGAAAAATAA
SEQ ID NO:51 seqüência de polinucleotídeoATGAAGAAACTATATACATCTTATGGCACTTATGGATTTTTACATCAAATAAAAATCAATAACCCGACCCATCAACTATT
CCAATTTTCAGCATCAGATACTTCAGTTATTTTTGAAGAAACTGATGGTGAGACTGTTTTAAAATCACCTTCAATATATG
-AAGTTATTAAAGAAATTGGTGAATTCAGTGAACATCATTTCTATTGTGCAATCTTCATTCCTTCAACAGAAGATCATGCA
TATCAACTTGAAAAGAAACTGATTAGTGTAGACGATAATTTCAGAAACTTTGGTGGCTTTAAAAGCTATCGTTTGTTAAG
ACCTGCTAAAGGTACAACATATAAAATTTATTTCGGATTTGCTGATCGACATGCATACGAAGACTTTAAGCAATCTGATG
CCTTTAATGACCATTTTTCAAAAGACGCATTAAGTCATTACTTTGGTTCAAGCGGACAACATTCAAGTTATTTTGAAAGA
TATCTATACCCAATAAAAGAATAG
SEQ ID NO:52 seqüência de polinucleotídeoATGTATTTATATACATCTTATGGGACTTACCAATTTTTAAATCAAATTAAACTTAATCATCAAGAACGTAGTTTATTTCA
ATTTTCCACTAATGATTCCTCAATAATCTTAGAAGAGTCTGAGGGAAAATCAATCTTAAAACATCCTAGTGCATATCAAGTGATTGATAGCACAGGTGAATTTAACGAACATCATTTTTATAGTGCTATTTTTGTCCCTACATCTGAAGATCATCGTCAA
CAGCTAGAGAAAAAATTATTACTCGTAGACGTACCTTTAAGAAATTTTGGTGGTTTTAAAAGCTATCGTTTATTAAAACC
CACTGAGGGGTCTACCTACAAAATTTACTTTGGTTTTGCAAATCGAACAGCATATGAAGATTTCAAAGCTTCTGATATAT
TTAATGAAAACTTTTCAAAAGATGCATTGAGCCAATACTTTGGTGCTAGTGGTCAACATTCTAGCTACTTTGAAAGATAT
TTATATCCAATAGAAGATCATTAA
SEQ ID NO:53 seqüência de polinucleotídeoATGATTAACAGGGATAATAAAAAGGCAATAACAAAAAAGGGTATGATTTCAAATCGCTTAAACAAATTTTCGATTAGAAA
GTATACTGTAGGAACTGCATCGATTTTAGTAGGTACGACATTGATTTTTGGTCTAGGGAACCAAGAAGCTAAAGCTGCTG
AAAACACTAGTACAGAAAATGCGAAACAAGATGATGCAACGACTAGTGATAATAAAGAAGTAGTGTCGGAAACTGAAAAT
AATTCGACAACAGAAAATGATTCAACAAATCCAATTAAGAAAGAAACAAATACTGATTCACAACCAGAAGCTAAAGAAGA
ATCAACTACATCAAGTACTCAACAACAGCAAAATAACGTTACAGCTACAACTGAAACTAAGCCTCAAAACATTGAAAAAG
AAAATGTTAAACCTTCAACTGATAAAACTGCGACAGAAGATACATCTGTTATTTTAGAAGAGAAGAAAGCACCAAATTAT
ACAAATAACGATGTAACTACAAAACCATCTACAAGTGAAATTCAAACAAAACCAACTACACCTCAAGAATCTACAAATAT
TGAAAATTCACAACCGCAACCAACGCCTTCAAAAGTAGACAATCAAGTTACAGATGCAACTAATCCAAAAGAACCAGTAA
ATGTGTCAAAAGAAGAACTTAAAAATAATCCTGAGAAATTAAAAGAATTAGTTAGAAATGATAACAATACAGATCGTTCA
33/68
ACTAAACCAGTTGCTACAGCTCCAACAAGTGTTGCACCAAAACGATTAAATGCGAAAATGCGTTTTGCAGTTGCACAACC
AGCAGCAGTTGCTTCAAATAATGTAAATGACTTAATTACAGTTACGAAACAGACGATCAAAGTTGGCGATGGTAAAGATA
ATGTGGCAGCAGCGCATGACGGTAAAGATATTGAATATGATACAGAGTTTACAATTGACAATAAAGTCAAAAAAGGCGAT
ACAATGACGATTAATTATGATAAGAATGTAATTCCTTCGGATTTAACAGATAAAAATGATCCTATCGATATTACTGATCC
ATCAGGAGAGGTCATTGCCAAAGGAACATTTGATAAAGCGACTAAGCAAATCACATATACATTTACAGATTATGTAGATA
AATATGAAGATATAAAAGCACGTTTAACTTTATACTCATATATTGATAAGCAAGCAGTACCTAATGAAACTAGTTTGAAT
TTAACGTTTGCAACAGCAGGTAAAGAAACTAGCCAAAACGTTTCTGTTGATTATCAAGACCCAATGGTTCATGGTGATTC
AAACATTCAATCTATCTTTACAAAGTTAGATGAAAACAAACAAACTATTGAACAACAAATTTATGTTAATCCTTTGAAAA
AAACAGCAACTAACACTAAAGTTGATATAGCTGGTAGTCAAGTAGATGATTATGGAAATATTAAACTAGGAAATGGTAGT
ACCATTATTGACCAAAATACAGAAATAAAAGTTTATAAAGTTAACCCTAATCAACAATTGCCTCAAAGTAATAGAATCTA
TGATTTTAGTCAATACGAAGATGTAACAAGTCAATTTGATAATAAAAAATCATTTAGTAATAATGTAGCAACATTGGATT
TTGGTGATATTAATTCAGCCTATATTATCAAAGTTGTTAGTAAATATACACCTACATCAGATGGCGAACTAGATATTGCT
CAAGGTACTAGTATGAGAACAACTGATAAATATGGTTATTATAATTATGCAGGATATTCAAACTTCATCGTAACTTCTAA
TGACACTGGCGGTGGCGACGGTACTGTTAAACCTGAAGAAAAGTTATACAAAATTGGTGACTATGTATGGGAAGACGTTG
ATAAAGACGGTGTCCAAGGTACAGATTCGAAAGAAAAGCCAATGGCAAACGTTTTAGTTACATTAACTTACCCGGACGGT
ACTACAAAATCAGTAAGAACAGATGCTAACGGTCATTATGAATT CGGTGGTTTGAAAGACGGAGAAACTTATACAGTTAA
ATTCGAAACGCCAGCTGGATATCTTCCAACAAAAGTAAATGGAACAACTGATGGTGAAAAAGACTCAAATGGTAGTTCTA
TAACTGTTAAAATTAATGGTAAAGATGATATGTCTTTAGACACTGGTTTTTATAAAGAACCTAAATATAATCTTGGTGAC
TATGTATGGGAAGATACAAATAAAGATGGTATCCAAGATGCTAATGAACCTGGTATCAAAGATGTTAAGGTTACATTAAA
AGATAGTACTGGAAAAGTTATTGGTACAACTACTACTGATGCCTCGGGTAAATATAAATTTACAGATTTAGATAATGGTA
ACTATACAGTAGAATTTGAAACACCAGCAGGTTACACGCCAACGGTTAAAAATACTACAGCTGAAGATAAAGATTCTAAT
GGTTTAACAACAACAGGTGTCATTAAAGATGCAGATAATATGACATTAGACAGTGGTTTCTATAAAACACCAAAATACAG
TTTAGGTGATTATGTTTGGTACGACAGTAATAAAGACGGTAAACAAGATTCAACTGAAAAAGGTATCAAAGATGTTAAAG
TTACTTTAT TAAATGAAAAAGGCGAAGTAAT TGGAACAACTAAAACAGATGAAAATGGTAAATATCGTTTCGATAATTTA
GATAGCGGTAAATACAAAGTTATTTTTGAAAAG CCTGCTGGCTTAACACAAACAGTTACAAATACAACTGAAGATGATAA
AGATGCCGATGGTGGCGAAGTTGACGTAACAATTACGGATCATGATGATTTCATACTTGATAACGGATACTTCGAAGAAG
ATACATCAGACAGTGATTCAGACTCAGACAGTGATTCAGACTCAGACAGCGACTCAGATTCAGACAGTGATTCAGACTCA
GATAGCGATTCAGATTCAGACAGCGACTCAGACTCAGATAG CGACTCAGACT CAGACAGCGACTCAGACTCAGATAGCGA
CTCAGATTCGGACAGCGATTCAGACTCAGATAGCGACTCAGATTCAGACAGCGATTCAGACTCAGATAGCGACTCAGATT
CAGACAGTGACTCAGACTCAGATAGCGACTCAGACTCAGACAGTGACTCAGACTCAGACAGCGATTCAGATTCAGATAGC
GACTCAGATTCGGACAGTGATTCAGACTCAGATAGCGACT CAGATTCAGACAGCGACTCAGACTCAGATAGCGACTCAGA
CTCAGACAGTGATTCAGACTCAGATAGCGATTCGGACTCGGATGCAGGAAAACATACACCTGTTAAACCAATGAGTACTA
CTAAAGACCATCACAATAAAGCAAAAGCATTACCAGAAACAGGTAGTGAAAATAACGGCTCAAATAACGCAACGTTATTT
GGTGGATTATTTGCAGCATTAGGTTCATTATTGTTATTCGGTCGTCGCAAAAAACAAAACAAATAA
SEQ ID NO:54 seqüência de polinucleotídeoATGATTAATAAAAAAAATAATTTACTAACTAAAAAGAAACCTATAGCAAATAAATCCAATAAATATGCAATTAGAAAATT
CACAGTAGGTACAGCGTCTATTGTAATAGGTGCAACATTATTGTTTGGTTTAGGTCATAATGAGGCCAAAGCCGAGGAGA
ATTCAGTACAAGACGTTAAAGATTCGAATACGGATGATGAATTATCAGACAGCAATGATCAGTCTAGTGATGAAGAAAAG
AATGATGTGAT CAATAATAATCAGTCAATAAACACCGACGATAATAACCAAATAATTAAAAAAGAAGAAACGAATAACTA
CGATGGCATAGAAAAACGCTCAGAAGATAGAACAGAGTCAACAACAAATGTAGATGAAAACGAAGCAACATTTTTACAAA
AGACCCCTCAAGATAATACTCATCTrACAGAAGAAGAGGTAAAAGAATCCTCATCAGTCGAATCCTCAAATTCATCAATT
GATACTGCCCAACAACCATCTCACACAACAATAAATAGAGAAGAATCTGTTCAAACAAGTGATAATGTAGAAGATTCACA
CGTATCAGATTTTGCTAACTCTAAAATAAAAGAGAGTAACACTGAATCTGGTAAAGAAGAGAATACTATAGAGCAACCTA
ATAAAGTAAAAGAAGAT TCAACAACAAGTCAGC CGTCTGGCTATACAAATATAGATGAAAAAATTTCAAATCAAGATGAG
TTATTAAATTTACCAATAAATGAATATGAAAATAAGGCTAGACCATTATCTACAACATCTGCCCAACCATCGATTAAACG
TGTAACCGTAAATCAATTAGCGGCGGAACAAGGTTCGAATGTTAATCATTTAATTAAAGTTACTGATCAAAGTATTACTG
AAGGATATGATGATAGTGAAGGTGTTATTAAAGCACATGATGCTGAAAACTTAATCTATGATGTAACTTTTGAAGTAGAT
GATAAGGTGAAATCTGGTGATACGATGACAGTGGATATAGATAAGAATACAGTTCCATCAGATTTAACCGATAGCTTTAC
AATACCAAAAATAAAAGATAATTCTGGAGAAATCATCGCTACAGGTACTTATGATAACAAAAATAAACAAATCACCTATA
CTTTTACAGATTATGTAGATAAGTATGAAAATATTAAAGCACACCTTAAATTAACGTCATACATTGATAAATCAAAGGTT
CCAAATAATAATACCAAGT TAGATGTAGAATATAAAACGGCCCT TTCATCAGTAAATAAAACAATTACGGTTGAATATCA
AAGACCTAACGAAAATCGGACTGCTAACCTTCAAAGTATGTTTACAAACATAGATACGAAAAATCATACAGTTGAGCAAA
CGATTTATATTAACCCTCTTCGTTATTCAGCCAAGGAAACAAATGTAAATATTTCAGGGAATGGTGATGAAGGTTCAACA
ATTATAGACGATAGCACAATAATTAAAGTTTATAAGGTTGGAGATAATCAAAATTTACCAGATAGTAACAGAATTTATGA
TTACAGTGAATATGAAGATGTCACAAATGATGATTATGCCCAATTAGGAAATAATAATGATGTGAATATTAATTTTGGTA
ATATAGATTCACCATATATTATTAAAGTTATTAGTAAATATGACCCTAATAAGGATGATTACACGACTATACAGCAAACT
GTGACAATGCAGACGACTATAAATGAGTATACTGGTGAGTTTAGAACAGCATCCTATGATAATACAATTGCTTTCTCTAC
AAGTTCAGGTCAAGGACAAGGTGACTTGCCTCCTGAAAAAACTTATAAAATCGGAGATTACGTATGGGAAGATGTAGATA
AAGATGGTATTCAAAATACAAATGATAATGAAAAACCGCTTAGTAATGTATTGGTAACTTTGACGTATCCTGATGGAACT
TCAAAATCAGTCAGAACAGATGAAGATGGGAAATATCAATTTGATGGATTGAAAAACGGATTGACTTATAAAATTACATT
34/68
CGAAACACCTGAAGGATATACGCCGACGCTTAAACATTCAGGAACAAATCCTGCACTAGACTCAGAAGGTAATTCTGTAT
GGGTAACTATTAATGGACAAGACGATATGACGATTGATAGTGGATTTTATCAAACACCTAAATACAGCTTAGGGAACTAT
GTATGGTATGACACTAATAAAGATGGTATTCAAGGTGATGATGAAAAAGGAATCTCTGGAGTTAAAGTGACGTTAAAAGA
TGAAAACGGAAATATCATTAGTACAACTACAACCGATGAAAATGGAAAGTATCAATTTGATAATTTAAATAGTGGTAATT
ATATTGTTCATTTTGATAAACCTTCAGGTATGACTCAAACAACAACAGATTCTGGTGATGATGACGAACAGGATGCTGAT
GGGGAAGAAGTTCATGTAACAATTACTGATCATGATGACTTTAGTATAGATAACGGATACTATGATGACGAATCGGATTC
CGATAGTGACTCAGACAGCGACTCAGATTCCGATAGTGATTCAGACTCCGATAGCGACTCGGATTCAGACAGCGACTCAG
ATTCAGACAGCGACTCGGATTCTGATAGCGACTCGGATTCAGACAGCGACTCAGACTCAGACAGTGATTCAGATTCAGAC
AGCGACTCAGATTCCGATAGTGATTCAGACTCAGACAGCGACTCAGATTCTGATAGTGATTCAGACTCAGACAGTGATTC
AGATTC.AGACAGCGACTCAGATTCCGATAGTGATTCAGACTCAGACAGCGACTCAGATTCCGATAGTGATTCAGACTCAG
ACAGCGACTCAGATTCTGATAGTGATTCAGACTCAGACAGTGATTCAGATTCCGATAGTGATTCAGACTCCGATAGCGAC
TCAGACTCGGATAGTGACTCAGATTCTGATAGTGATTCAGACTCAGACAGTGATTCGGATTCCGATAGTGATTCAGACTC
AGACAGCGACTCAGATTCTGATAGTGATTCAGACTCAGACAACGACTCAGATTTAGGCAATAGCTCAGATAAGAGTACAA
AAGATAAATTACCTGATACAGGAGCTAATGAAGATTATGGCTCTAAAGGCACGTTACTTGGAACTCTGTTTGCAGGTTTA
GGAGCGTTATTATTAGGGAAACGTCGCAAAAATAGAAAAAATAAAAATTAA
SEQ ID NO:55 seqüência de polinucleotídeoATGTCTAATAATTTTAAAGATGACTTTGAAAAAAATCGTCAATCGATAGACACAAATTCACATCAAGACCATACGGAAGA
TGTTGAAAAAGACCAATCAGAATTAGAACATCAGGATACAATAGAGAATACGGAGCAACAGTTTCCGCCAAGAAATGCCC
AAAGAAGAAAAAGACGCCGTGATTTAGCAACGAATCATAATAAACAAGTTCACAATGAATCACAAACATCTGAAGACAAT
GTTCAAAATGAGGCTGGCACAATAGATGATCGTCAAGTCGAATCATCACACAGTACTGAAAGTCAAGAACCTAGCCATCA
AGACAGTACACCTCAACATGAAGAGGAATATTATAATAAGAATGCTTTTGCAATGGATAAATCACATCCAGAACCAATCG
AAGACAATGATAAACACGAGACTATTAAAGATGCAGAAAATAACACTGAGCATTCAACAGTTTCTGATAAGAGTATAGCT
GAACAATCTCAGCAACCTAAACCATATTTTGCAACAGGTGCTAACCAAGCAAATACATCAAAAGATAAACATGATGATGT
AACTGTTAAGCAAGACAAAGATGAATCTAAAGATCATCATAGTGGTAAAAAAGGCGCAGCAATTGGTGCTGGAACAGCGG
GTGTTGCAGGTGCAGCTGGTGCAATGGGTGTTTCTAAAGCTAAGAAACATTCAAATGACGCTCAAAACAAAAGTAATTCT
GACAAGTCGAATAACTCGACTGAGGATAAAGCGTCTCAAGATAAGTCTAAAGATCATCATAATGGCAAAAAAGGTGCAGC
GATCGGTGCTGGAACAGCAGGTTTGGCTGGAGGCGCAGCAAGTAAAAGTGCTTCTGCCGCTTCAAAACCACATGCCTCTA
ATAATGCAAGCCAAAACCATGATGAACATGACAATCATGACAGAGATAAAGAACGTAAAAAAGGTGGCATGGCCAAAGTA
TTGTTACCATTAATTGCAGCTGTACTAATTATCGGTGCATTAGCGATATTTGGAGGCATGGCATTAAACAATCATAATAA
TGGTACAAAAGAAAATAAAATCGCGAATACAAATAAAAATAATGCTGATGAAAGTAAAGACAAAGACACATCTAAAGACG
CTTCTAAAGATAAATCAAAATCTACAGACAGTGATAAATCAAAAGAGGATCAAGACAAAGCGACTAAAGATGAATCTGAT
AATGATCAAAACAACGCTAATCAAGCGAACAATCAAGCACAAAATAATCAAAATCAACAACAAGCTAATCAAAATCAACA
ACAGCAACAACAACGTCAAGGTGGTGGCCAAAGACATACAGTGAATGGTCAAGAAAACTTATACCGTATCGCAATTCAAT
ACTACGGTTCAGGTTCACCGGAAAATGTTGAAAAAATTAGACGTGCCAATGGTTTAAGTGGTAACAATATTAGAAACGGT
CAACAAATCGTTATTCCATAA
SEQ ID NO:56 seqüência de polinucleotídeoGTGATTGAATTAATTAAAATGGAAGGGATGATAGTTGTGTCTAATAATAATTTTAAAGATGATTTCGAAAAGAATCGTCA
ATCTATTAATCCAGACGAACAGCAAACAGAATTAAAAGAAGATGATAAAACAAATGAAAATAAAAAAGAAGCTGACTCTC
AAAACAGTTTATCTAATAACTCAAATCAACAATTTCCTCCGAGAAATGCCCAACGACGAAAAAGACGTAGAGAGACAGCA
ACTAATCAAAGCAAACAACAAGACGACAAACATCAAAAAAATAGTGACGCTAAAACTACAGAAGGTTCATTAGATGACCG
TTATGACGAAGCACAGTTACAGCAACAACATGATAAATCGCAACAACAAAATAAAACTGAAAAACAATCACAAGATAATA
GAATGAAAGATGGAAAAGATGCAGCTATTGTAAATGGAACATCTGAGTCACCAGAACATAAATCAAAATCAACACAAAAT
AGACCCGGCCCTAAAGCTCAACAACAAAAGCGTAAATCAGAAAGTACGCAATCAAAACCGTCAACAAACAAAGATAAAAA
AGCAGCTACAGGTGCTGGAATAGCTGGTGCAGCTGGTGTTGCTGGTGCAGCAGAAACATCCAAACGTCATCATAATAAAA
AAGATAAACAAGATTCTAAACACTCAAACCATGAGAATGACGAAAAATCTGTTAAAAATGATGACCAAAAGCAATCTAAA
AAAGGCAAAAAAGCAGCAGTCGGTGCTGGCGCAGCTGCAGGAGTTGGTGCGGCTGGTGTTGCGCATCATAATAATCAAAA
TAAACATCATAATGAGGAAAAAAATTCTAATCAAAACAATCAGTACAATGACCAATCAGAAGGTAAGAAAAAAGGTGGTT
TCATGAAAATCTTGTTACCACTTATAGCAGCCATTCTTATTCTAGGTGCAATAGCAATATTCGGTGGTATGGCTCTAAAT
AATCACAACGATAGTAAAAGTGATGACCAAAAAATAGCGAATCAAAGTAAGAAAGACTCAGATAAAAAAGATGGTGCGCA
ATCCGAAGATAACAAAGACAAAAAATCTGATAGTAACAAAGACAAAAAATCTGATTCTGATAAGAACGCAGATGATGACT
CTGATAATAGTTCCTCAAATCCTAACGCTACTTCAACTAATAATAACGATAATGTAGCCAATAATAACTCAAATTATACA
AACCAAAATCAACAAGATAATGCAAACCAAAATAGCAATAATCAACAGGCAACTCAAGGTCAACAATCACATACAGTATA
CGGTCAAGAAAACTTATATCGTATCGCCATACAATATTATGGAGAAGGAACTCAAGCTAACGTAGATAAAATTAAACGTG
CGAATGGATTAAGCAGTAATAATATTCATAATGGTCAAACATTAGTTATTCCTCAATAA
SEQ ID NO:57 seqüência de polinucleotídeoATGAAAAATAAATTGATAGCAAAATCTTTATTAACAATAGCGGCAATTGGTATTACTACAACTACAATTGCGTCAACAGC
AGATGCGAGCGAAGGATACGGTCCAAGAGAAAAGAAACCAGTGAGTATTAATCACAATATCGTAGAGTACAATGATGGTA
35/68
CTTTTAAATATCAATCTAGACCAAAATTTAACTCAACACCTAAATATATTAAATTCAAACATGACTATAATATTTTAGAA
TTTAACGATGGTACATTCGAATATGGTGCACGTCCACAATTTAATAAACCAGCAGCGAAAACTGATGCAACTATTAAAAA
AGAACAAAAATTGATTCAAGCTCAAAATCTTGTGAGAGAATTTGAAAAAACACATACTGTCAGTGCACACAGAAAAGCAC
AAAAGGCAGTCAACTTAGTTTCGTTTGAATACAAAGTGAAGAAAATGGTCTTACAAGAGCGAATTGATAATGTATTAAAA
CAAGGATTAGTGAGATAA
SEQ ID NO:58 seqüência de polinucleotídeoATGAAAACACGTATAGTCAGCTCAGTAACAACAACACTATTGCTAGGTTCCATATTAATGAATCCTGTCGCTAATGCCGC
AGATTCTGATATTAATATTAAAACC GGTACTACAGATATTGGAAGCAATACTACAGTAAAAACAGGTGATT TAGTCACTT
ATGATAAAGAAAATGGCATGCACAAAAAAGTATTTTATAGTTTTATCGATGATAAAAATCACAATAAAAAACTGCTAGTT
ATTAGAACGAAAGGTACCATTGCTGGTCAATATAGAGTT TATAGCGAAGAAGGTGCTAACAAAAGTGGTTTAGCCTGGCC
TTCAGCCTTTAAGGTACAGTTGCAACTACCTGATAATGAAGTAGCTCAAATATCTGATTACTATCCAAGAAATTCGATTG
ATACAAAAGAGTATATGAGTACTTTAACTTATGGATTCAACGGTAATGTTACTGGTGATGATACAGGAAAAATTGGCGGC
CTTATTGGTGCAAATGTTTCGATTGGTCATACACTGAAATATGTTCAACCTGATTTCAAAACAATTT'TAGAGAGCCCAAC
TGATAAAAAAGTAGGCTGGAAAGTGATATTTAACAATATGGTGAATCAAAAT'TGGGGACCATATGATAGAGATTCTTGGA
ACCCGGTATATGGCAATCAACTTTTCATGAAAACTAGAAATGGTTCTATGAAAGCAGCAGAGAACTTCCTTGATCCTAAC
AAAGCAAGTTCTCTATTATCTTCAGGGTTTTCACCAGACTTCGCTACAGTTATTACTATGGATAGAAAAGCATCCAAACA
ACAAACAAATATAGATGTAATATACGAACGAGTTCGTGATGACTACCAATTGCATTGGACTTCAACAAATTGGAAAGGTA
CCAATACTAAAGATAAATGGACAGATCGTTCTTCAGAAAGATATAAAATCGATTGGGAAAAAGAAGAAATGACAAATTAA
SEQ ID NO:59 seqüência de polinucleotídeoATACACATGAAAAATAAATATATCTCGAAGTTGCTAGTTGGGGCAGCAACAATTACTTTAGCTACAATGATTTCAAATGG
GGAAGCAAAAGCGAGTGAAAACACGCAACAAACTTCAACTAAGCACCAAACAACTCAAAACAAC TACGTAACAGATCAAC
AAAAAGCTTTTTATCAAGTATTACATCTAAAAGGTATCACAGAAGAACAACGTAAC CAATACATCAAAACATTACGCGAA
CACCCAGAACGTGCACAAGAAGTATTCTCTGAATCAC TTAAAGACAGCAAGAACCCAGACCGACGTGTTGCACAACAAAA
CGCTTTTTACAATGTTCTTAAAAATGATAACTTAACTGAACAAGAAAAAAATAATTACATTGCACAAATTAAAGAAAACC
C TGATAGAAGCCAACAAGTTTGGGTAGAATCAGTACAATC TTCTAAAGCTAAAGAACGTCAAAATATTGAAAATGCGGAT
AAAGCAATTAAAGAT TTCCAAGATAACAAAGCAC CACACGATAAATCAGCAGCATATGAAGCTAACTCAAAATTACCTAA
AGATTTACGCGATAAAAATAACCGC TTTGTAGAAAAAGTTTCAATTGAAAAAGCAATCGTTCGTCATGATGAGCGTGTGA
AATCAGCAAATGATGCAATCTCAAAATTAAATGAAAAAGATTCAATTGAAAACAGACGTTTAGCACAACGTGAAGTTAAC
AAAGCACCTATGGATGTAAAAGAGCATTTACAGAAACAATTAGACGCATTAGTAGCTCAAAAAGATGCTGAAAAGAAAGT
GGCGCCAAAAGTTGAGGCTCCTCAAATTCAATCACCACAAATTGAAAAACCTAAAGCAGAATCACCAAAAGTTGAAGTCC
CTCAATCTAAATTATTAGGTTACTACCAATCATTAAAAGATTCATT'TAACTATGGTTACAAGTATTTAACAGATACTTAT
AAAAGCTATAAAGAAAAATATGATACAGCAAAGTACTACTATAATACGTACTATAAATACAAAGGTGCGATTGATCAAAC
AGTATTAACAGTACTAGGTAGTGGTTCTAAATCTTACATCCAACCATTGAAAGTTGATGATAAAAACGGCTACTTAGCTA
AATCATATGCACAAGTAAGAAACTATGTAACTGAGTCAATCAATACTGGTAAAGTATTATATACTTTCTACCAAAACCCA
ACATTAGTAAAAACAGCTATTAAAGCTCAAGAAACTGCATCATCAATCAAAAATACATTAAGTAATTTATTATCATTCTG
GAAATAA
SEQ ID NO:60 seqüência de polinucleotídeoATGACAAAACATTATTTAAACAGTAAGTATCAATCAGAACAACGTTCATCAGCTATGAAAAAGATTACAATGGGTACAG C
ATCTATCATTTTAGGTTCCCTTGTATACATAGGCGCAGACAGCCAACAAGTCAATGCGGCAACAGAAGCTACGAACGCAA
CTAATAATCAAAGCACACAAGTTTCTCAAGCAACATCACAACCAATTAATTTCCAAGTGCAAAAAGATGGCTCTTCAGAG
AAGTCACACATGGATGACTATATGCAACACC C TGGTAAAGTAATTAAACAAAATAATAAATATTATTTCCAAACCGTGTT
AAACAATGCATCATTCTGGAAAGAATACAAATTTTACAATGCAAACAATCAAGAATTAGCAACAACTGTTGTTAACGATA
ATAAAAAAGCGGATACTAGAACAATCAATGTTGCAGTTGAACCTGGATATAAGAGCTTAACTACTAAAGTACATATTGTC
GTGCCACAAATTAATTACAATCATAGATATACTACGCATTTGGAATTTGAAAAAGCAATTCCTACATTAGCTGACGCAGC
AAAACCAAACAATGTTAAACCGGTTCAACCAAAACCAGCTCAACCTAAAACACCTACTGAGCAAACTAAACCAGTTCAAC
C TAAAGTTGAAAAAGTTAAACCTACTGTAACTACAACAAGCAAAGTTGAAGACAATCACTCTACTAAAGTTGTAAGTACT
GACACAACAAAAGATCAAACTAAAACACAAACTGCTCATACAGTTAAAACAGCACAAACTGCTCAAGAACAAAATAAAGT
TCAAACACCTGTTAAAGATGTTGCAACAGCGAAATCTGAAAGCAACAATCAAGCTGTAAGTGATAATAAATCACAACAAA
CTAACAAAGTTACAAAACATAACGAAACGCCTAAACAAGCATCTAAAGCTAAAGAATTACCAAAAACTGGTTTAACTTCA
GTTGATAACTTTATTAGCACAGTTGCCTTCGCAACACTTGCCCTTTTAGGTTCATTATCTTTATTACTTTTCAAAAGAAA
AGAATCTAAATAA
SEQ ID NO:61 seqüência de polinucleotídeoATGAACAAACAGCAAAAAGAATTTAAATCATTTTATTCAATTAGAAAGTCATCACTAGGCGTTGCATCTGTAGCGATTAG
TACACTTTTATTATTAATGTCAAATGGCGAAGCACAAGCAGCAG CTGAAGAAACAGGTGGTACAAATACAGAAGCACAAC
CAAAAACTGAAGCAGTTGCAAGTCCAACAACAACATCTGAAAAAGCTCCAGAAACTAAACCAGTAGCTAATGCTGTCTCA
36/68
GTATCTAATAAAGAAGTTGAGG C CCCTACTTCTGAAACAAAAGAAG CTAAAGAAGTTAAAGAAGTTAAAGC CC CTAAGGA
AACAAAAGCAGTTAAACCAGCAGCAAAAGCCACTAACAATACATATCC TATTTTGAATCAGGAACTTAGAGAAGCGATTA
AAAACC C TGCAATAAAAGATAAAGATCATAGCGCACCAAACTCTCGTCCAATTGATTTTGAAATGAAAAAAGAAAATGGT
GAGCAACAATTTTATCATTATGCCAGC TC TGTTAAACCTGC TAGAGTTATTTTCAC TGATTCAAAACCAGAAATTGAATT
AGGATTACAATCAGGTCAATTTTGGAGAAAATTTGAAGTTTATGAAGGTGACAAAAAGTTGCCAATTAAATTAGTATCAT
ACGATACTGTTAAAGATTACGC TTACATTCGC TTC TC TGTTTCAAATGGAACAAAAGCCGTTAAAATTGTAAGTTCAACT
CACTTCAATAACAAAGAAGAAAAATACGATTACACATTAATGGAATTCGCACAACCAATTTATAACAGTGCAGATAAATT
CAAAACTGAAGAAGATTATAAAGC TGAAAAATTATTAGCGCCATATAAAAAAGCGAAAACAC TAGAAAGACAAGTTTATG
AATTAAATAAAATTCAAGATAAAC TTCCTGAAAAATTAAAGGCTGAGTACAAGAAGAAATTAGAGGATACAAAGAAAGC T
TTAGATGAGCAAGTGAAATCAGCTATTAC TGAATTCCAAAATGTACAACCAACAAATGAAAAAATGAC TGATTTACAAGA
TACAAAATATGTTGTTTATGAAAGTGTTGAGAATAACGAATCTATGATGGATACTTTTGTTAAACACCC TATTAAAACAG
GTATGCTTAACGGCAAAAAATATATGGTCATGGAAAC TAC TAATGACGATTACTGGAAAGATTTCATGGTTGAAGGTCAA
CGTGTTAGAACTATAAGCAAAGATGC TAAAAATAATAC TAGAACAATTATTTTC C CATATGTTGAAGGTAAAAC TCTATA
TGATGCTATCGTTAAAGTTCACGTAAAAACGATTGATTATGATGGACAATACCATGTCAGAATCGTTGATAAAGAAGCAT
TTACAAAAGCCAATACCGATAAATCTAACAAAAAAGAACAACAAGATAACTCAGCTAAGAAGGAAGCTACTCCAGCTACG
C CTAGCAAAC CAACACCATCAC C TGTTGAAAAAGAATCACAAAAACAAGACAGC CAAAAAGATGACAATAAACAATTAC C
AAGTGTTGAAAAAGAAAATGACGCATC TAGTGAGTCAGGTAAAGACAAAACGC CTGC TACAAAACCAACTAAAGGTGAAG
TAGAATCAAGTAGTACAAC TC CAACTAAGGTAGTATC TACGACTCAAAATGTTGCAAAACCAACAACTGC TTCATCAAAA
ACAACAAAAGATGTTGTTCAAACTTCAGCAGGTTCTAGCGAAGCAAAAGATAGTGCTCCATTACAAAAAGCAAACATTAA
AAACACAAATGATGGACACACTCAAAGCCAAAACAATAAAAATACACAAGAAAATAAAGCAAAATCATTACCACAAACTG
GTGAAGAATCAAATAAAGATATGACATTAC CATTAATGG CATTACTAGCTTTAAGTAGCATCGTTGCATTCGTATTAC CT
AGAAAACGTAAAAACTAA
SEQ ID NO:62 seqüência de polinucleotídeoATGAATAATAAAAAGACAGCAACAAATAGAAAAGGCATGATACCAAATCGATTAAACAAATTTTCGATAAGAAAGTATTC
TGTAGGTAC TGCTTCAATTTTAGTAGGGACAACATTGATTTTTGGGTTAAGTGGTCATGAAGC TAAAGCGGCAGAACATA
CGAATGGAGAATTAAATCAATCAAAAAATGAAACGACAGC C C CAAGTGAGAATAAAACAACTGAAAAAGTTGATAGTCGT
CAACTAAAAGACAATACGCAAACTGCAAC TGCAGATCAGCCTAAAGTGACAATGAGTGATAGTGCAACAGTTAAAGAAAC
TAGTAGTAACATGCAATCACCACAAAACGCTACAGCTAGTCAATCTACTACACAAACTAGCAATGTAACAACAAATGATA
AATCATCAACTACATATAGTAATGAAACTGATAAAAGTAATTTAACACAAGCAAAAAACGTTTCAACTACAC C TAAAACA
ACGACTATTAAACAAAGAGCTTTAAATCGCATGGCAGTGAATACTGTTGCAGC TC CACAACAAGGAACAAATGTTAATGA
TAAAGTACATTTTACGAACATTGATATTGCGATTGATAAAGGACATGTTAATAAAACAACAGGAAATACTGAATTTTGGG
CAACTTCAAGTGATGTTTTAAAATTAAAAGCGAATTACACAATCGATGATTCTGTTAAAGAGGGCGATACATTTAC TTTT
AAATATGGTCAATATTTCCGTCCAGGTTC TGTAAGATTACCTTCACAAACTCAAAATTTATATAATGCCCAAGGTAATAT
TATTGCAAAAGGTATTTACGATAGTAAAACAAATACAACAACGTATACTTTTACGAATTATGTAGATCAATACACAAATG
TTAGCGGTAGC TTTGAACAAGTCGCATTTGCGAAACGTGAAAATGCAACAAC TGATAAAACTGCTTATAAAATGGAAGTA
ACTTTAGGTAATGATACATATAGTAAAGATGTCATTGTCGATTATGGTAATCAAAAAGGTCAACAACTTATTTCGAGTAC
AAATTATATTAATAATGAAGATTTGTCACGTAATATGACTGTTTATGTAAATCAACCTAAAAAGACCTATACAAAAGAAA
CATTTGTAACAAATTTAACTGGTTATAAATTTAATCCAGATGCTAAAAACTTCAAAATTTACGAAGTGACAGATCAAAAT
CAATTTGTGGATAGTTTCAC C CCAGATACTTCAAAACTTAAAGATGTTACTGGTCAAT T CGATGTTATTTATAGTAATGA
TAATAAGACGGCGACAGTAGATTTATTGAATGGTCAATCTAGTAGTGATAAACAGTACATCATT CAACAAGTTGCTTATC
CAGATAATAGTTCAACAGATAATGGGAAAATTGATTATACTTTAGAAACACAAAATGGAAAAAGTAGTTGGTCAAACAGT
TATTCAAATGTGAATGGCTCATCAACTGCAAATGGCGAC CAAAAGAAATATAATCTAGGTGAC TATGTATGGGAAGATAC
AAATAAAGATGGTAAACAAGATGCCAATGAAAAAGGGATTAAAGGTGTTTATGTCATTCTTAAAGATAGTAACGGTAAAG
AATTAGATCGTACGACAACAGATGAAAATGGTAAATATCAGTTCACTGGTTTAAGCAATGGAACTTATAGTGTAGAGTTT
TCAACACCAGCCGGTTATACACCGACAACTGCAAATGCAGGTACAGATGATGCTGTAGATTCTGATGGAC TAACTACAAC
AGGTGTCATTAAAGACGCTGACAACATGACATTAGATAGTGGATTCTACAAAACACCAAAATATAGTTTAGGTGATTATG
TTTGGTACGACAGTAATAAAGATGGTAAACAAGATTCGACTGAAAAAGGAATTAAAGGTGTTAAAGTTACTTTGCAAAAC
GAAAAAGGCGAAGTAATTGGTACAACTGAAACAGATGAAAATGGTAAATACCGC TTTGATAATTTAGATAGTGGTAAATA
CAAAGTTATCTTTGAAAAGCCTGCTGGTTTAACTCAAACAGGTACAAATACAAC TGAAGATGATAAAGATGCCGATGGTG
GCGAAGTTGATGTAACAATTACGGATCATGATGATTTCACACTTGATAATGGCTACTACGAAGAAGAAACATCAGATAGT
GACTCAGATTCGGACAGCGATTCAGACTCAGATAGCGACTCAGATTCAGATAGTGACTCAGACTCAGATAGCGACTCAGA
CTCAGATAGCGACTCAGACAGCGACTCAGACTCAGATAGTGATTCAGATTCGGACAGCGACTCAGATTCAGACAGCGAAT
CAGATTCGGATAGCGACTCAGACTCAGATAGCGACTCAGACAGCGACTCAGATTCAGACAGTGACTCAGACTCAGACAGC
GACTCAGATTCAGACAGCGATTCAGATTCGGATAGCGACTCAGAT TCAGATAGCGATTCGGACTCAGACAACGACTCAGA
TTC TGACAGCGATTCAGACTCAGATAGCGACTCAGATTCAGACAGCGACTCAGATTCAGACAGCGATTCAGATTCAGATA
GCGATTCAGATTCAGACAGCGACTCAGATTCAGATAGCGACTCAGACTCAGACAGCGATTCAGACTCAGATAGCGACTCA
GACAGCGATTCAGATTCGGATAGCGATTCAGATTCAGATGCAGGTAAACATACTCCGACTAAACCAATGAGTACGGTTAA
AGATCAGCATAAAACAGCTAAAGCATTACCAGAAACAGGTAGTGAAAATAATAATTCAAATAATGGCACATTATTCGGTG
GATTATTCGCGGCATTAGGATCATTATTGTTATTCGGTCGTCGTAAAAAACAAAATAAATAA
37/68
SEQ ID NO:63 seqüência de polinucleotídeoATGAATATGAAGAAAAAAGAAAAACACGCAATTCGGAAAAAATCGATTGGCGTGGCTTCAGTGCTTGTAGGTACGTTAAT
CGGTTTTGGACTACTCAGCAGTAAAGAAGCAGATGCAAGTGAAAATAGTGTTACGCAATCTGATAGCGCAAGTAACGAAA
GCAAAAGTAATGATTCAAGTAGCGTTAGTGCTGCACCTAAAACAGACGACACAAACGTGAGTGATACTAAAACATCGTCA
AACACTAATAATGGCGAAACGAGTGTGGCGCAAAATCCAGCACAACAGGAAACGACACAATCATCATCAACAAATGCAAC
TACGGAAGAAACGCCGGTAACTGGTGAAGCTACTACTACGACAACGAATCAAGCTAATACACCGGCAACAACTCAATCAA
GCAATACAAATGCGGAGGAATTAGTGAATCAAACAAGTAATGAAACGACTTCTAATGATACTAATACAGTATCATCTGTA
AATTCACCTCAAAATTCTACAAATGCGGAAAATGTTTCAACAACGCAAGATACTTCAACTGAAGCAACACCTTCAAACAA
TGAATCAGCTCCACAGAATACAGATGCAAGTAATAAAGATGTAGTTAGTCAAGCGGTTAATCCAAGTACGCCTAGAATGA
GAGCATTTAGTTTAGCGGCAGTAGCTGCAGATGCACCGGCAGCTGGCACAGATATTACGAATCAGTTGACAGATGTGAAA
GTTACTATTGACTCTGGTACGACTGTGTATCCGCACCAAGCAGGTTATGTCAAACTGAATTATGGTTTTTCAGTGCCTAA
TTCTGCTGTTAAAGGTGACACATTCAAAATAACTGTACCTAAAGAATTAAACTTAAATGGTGTAACTTCAACTGCTAAAG
TGCCACCAATTATGGCTGGAGATCAAGTATTGGCAAATGGTGTAATCGATAGTGATGGTAATGTTATTTATACATTTACA
GACTATGTTGATAATAAAGAAAATGTAACAGCTAATATTACTATGCCAGCTTATATTGACCCTGAAAATGTTACAAAGAC
AGGTAATGTGACATTGACAACTGGCATAGGAACCAATACTGCTAGTAAGACAGTATTAATCGACTATGAGAAATATGGAC
AATTCCATAATTTATCAATTAAAGGTACGATTGATCAAATCGATAAAACAAATAATACGTATCGCCAAACAATTTATGTC
AATCCAAGCGGAGATAACGTTGTGTTACCTGCCTTAACAGGTAATTTAATTCCTAATACAAAGAGTAATGCGTTAATAGA
TGCAAAAAACACTGATA'TTAAAGTTTATAGAGTCGATAATGCTAATGATTTATCTGAAAGTTATTATGTGAATCCTAGCG
ATTTTGAAGATGTAACTAATCAAGTTAGAATTTCATTTCCAAATGCTAATCAATACAAAGTAGAATTTCCTACGGACGAT
GACCAAATTACAACACCGTATATTGTAGTTGTTAATGGCCATATTGATCCTGCTAGTACAGGTGATTTAGCACTACGTTC
GACATTTTATGGTTATGATTCTAATTTTATATGGAGATCTATGTCATGGGACAACGAAGTAGCATTTAATAACGGATCAG
GTTCTGGTGACGGTATCGATAAACCAGTTGTTCCTGAACAACCTGATGAGCCTGGTGAAATTGAACCAATTCCAGAGGAT
TCAGATTCTGACCCAGGTTCAGATTCTGGCAGCGATTCTAATTCAGATAGCGGTTCAGATTCTGGCAGTGATTCTACATC
AGATAGTGGTTCAGATTCAGCGAGTGATTCAGATTCAGCAAGTGATTCAGACTCAGCGAGTGATTCAGATTCAGCAAGTG
ATTCAGATTCAGCAAGTGATTCAGATTCAGCAAGTGATTCAGACTCAGCAAGTGATTCAGATTCAGCAAGTGATTCAGAT
TCAGCAAGCGATTCAGATTCAGCGAGCGATTCAGATTCAGCGAGCGATTCAGATTCAGCGAGTGATTCCGACTCAGCGAG
CGA'TTCAGACTCAGATAGTGACTCAGATTCCGATAGCGATTCCGACTCAGATAGCGACTCAGATTCAGACAGCGATTCTG
ACTCAGACAGCGATTCTGACTCAGACAGTGACTCAGATTCCGATAGCGATTCTGACTCAGACAGTGACTCAGATTCCGAT
AGCGATTCAGATTCAGACAGTGATTCAGACTCAGATAGCGATTCAGATTCCGACAGTGACTCAGACTCAGACAGCGATTC
AGATTCCGATAGCGATTCAGATTCCGACAGTGACTCAGATTCCGATAGTGACTCGGATTCAGCGAGTGATTCAGATTCAG
ATAGCGATTCAGAATCAGATAGTGACTCAGACTCAGACAGTGATTCAGATTCAGATAGTGACTCAGACTCAGACAGCGAT
TCAGAATCAGATAGTGACTCCGATTCAGACAGCGATTCAGAATCAGATAGTGACTCCGATTCAGATAGCGATTCGGATTC
AGCGAGTGATTCAGACTCAGGTAGTGACTCCGATTCATCAAGTGATTCAGATTCCGATTCAACGAGTGACACAGGATCAG
ACAACGACTCAGACAGTGATTCAAATAGCGATTCCGAGTCAGGTTCTAACAATAATGTAGTTCCGCCTAATTCACCTAAA
AATGGTACTAATGCTTCTAATAAAAATGAGGCTAAAGATAGTAAAGAACCATTACCAGATACAGGTTCTGAAGATGAAGC
GAATACGTCACTAATTTGGGGATTATTAGCATCATTAGGTTCATTACTACTTTTCAGAAGAAAAAAAGAAAATAAAGATA
AGAAATAA
SEQ ID NO:64 seqüência de polinucleotídeoGTGAAAAACAATCTTAGGTACGGCATTAGAAAACATAAATTGGGAGCAGCATCAGTATTCTTAGGAACAATGATCGTTGT
TGGGATGGGACAAGATAAAGAAGCTGCAGCATCAGAACAAAAGACAACTACAGTAGAAGAAAATGGGAATTCAGCTACTG
ATAATAAAACAAGTGAAACACAAACAACTGCTACTAACGTTAATCATATAGAAGAAACTCAATCATATAACGCAACAGTA
ACAGAACAACCGTCAAACGCAACACAAGTAACAACTGAAGAAGCACCAAAAGCAGTACAAGCACCACAAACTGCACAACC
AGCAAATGTAGAAACAGTTAAAGAAGAAGAGAAACCTCAAGTTAAGGAAACGACACAACCTCAAGACAATAGCGGAAATC
AAAGACAAGTAGATTTAACACCTAAAAAGGTTACACAAAATCAAGGGACAGAAACACAAGTTGAAGTGGCACAGCCAAGA
ACGGCATCAGAAAGTAAGCCACGTGTGACAAGATCAGCAGATGTAGCGGAAGCTAAGGAAGCTAGTGACGTTTCAGAAGT
TAAAGGCACAGATGTTACAAGTAAAGTTACAGTAGAAAGTGGTTCTATTGAGGCACCTCAAGGAAATAAAGTAGAGCCAC
ATGCTGGTCAACGTGTCGTATTGAAATACAAATTGAAATTCGCAGATGGATTAAAAAGAGGAGATTATTTTGATTTTACA
TTATCAAATAATGTAAATACTTATGGGGTTTCAACAGCTAGAAAGGTACCAGAGATTAAAAATGGCTCAGTTGTAATGGC
TACAGGTGAGATCTTAGGGAATGGTAACATAAGATATACATTTACTAACGAAATTGAACACAAGGTAGAGGTAACAGCTA
ATTTAGAAATCAACTTATTTATTGACCCTAAAACTGTACAAAGCAATGGAGAACAAAAGATTACTTCTAAATTAAATGGT
GAAGAAACAGAAAAAACAATACCAGTTGTTTATAATCCAGGTGTTAGCAATAGTTATACAAATGTAAATGGATCAATTGA
AACATTTAATAAAGAATCTAATAAATTTACACATATAGCTTATATTAAGCCAATGAATGGAAACCAGTCAAACACTGTAT
CAGTAACAGGGACGTTGACTGAAGGTAGTAATTTAGCTGGTGGACAACCTACTGTTAAAGTATATGAATATCTAGGGAAA
AAAGATGAATTGCCACAAAGTGTTTATGCAAATACATCAGATACTAACAAATTCAAAGATGTAACAAAGGAAATGAATGG
AAAATTGAGTGTGCAAGACAATGGTAGTTACTCATTGAATTTAGATAAGTTGGATAAAACGTATGTCATTCATTATACAG
GTGAATATTTGCAAGGGTCAGATCAGGTTAATTTTAGAACTGAATTATATGGGTATCCAGAACGAGCATATAAATCTTAC
TATGTTTATGGGGGATATCGTTTAACTTGGGATAATGGTTTAGTTTTATATAGCAATAAAGCTGACGGCAATGGTAAAAA
TGGACAAATTATTCAAGATAATGATTTTGAATATAAAGAAGATACTGCAAAAGGAACTATGAGCGGGCAGTACGATGCCA
AGCAAATTATTGAAACAGAAGAAAATCAAGACAATACACCGCTTGACATTGATTACCACACAGCTATAGATGGTGAGGGT
38/68
GGTTATGTTGATGGGTATATTGAAACAATAGAAGAAACGGATTCATCAGCTATTGATATCGATTACCATACTGCTGTGGATAGTGAAGTGGGTCACGTTGGAGGATACACTGAGTCCTCTGAGGAATCAAATCCAATTGACTTTGAAGAATCGACACATG
AAAATTCAAAACATCACGCTGATGTTGTTGAATATGAAGAGGATACAAATCCAGGTGGTGGCCAAGTAACAACTGAGTCT
AACTTAGTTGAATTTGACGAAGAGTCTACAAAAGGTATTGTAACTGGCGCAGTGAGCGACCATACAACAATTGAAGATAC
GAAAGAATATACGACTGAAAGTAATCTGATTGAACTAGTAGATGAACTACCTGAAGAACATGGTCAAGCACAAGGACCAATCGAGGAAATTACTGAAAACAATCATCATATTTCTCATTCTGGTTTAGGAACTGAAAATGGTCACGGTAATTATGGCGTG
ATTGAAGAAATCGAAGAAAATAGCCACGTTGATATTAAGAGTGAATTAGGTTACGAAGGTGGCCAAAATAGCGGTAACCA
GTCATTCGAGGAAGACACAGAAGAAGACAAACCTAAATATGAACAAGGTGGCAATATCGTAGATATCGATTTCGACAGTGTACCTCAAATTCATGGTCAAAATAAAGGTGACCAGTCATTCGAAGAAGATACAGAGAAAGACAAGCCTAAATATGAACAT
GGCGGTAATATCATTGATATCGACTTCGACAGTGTGCCACAAATTCATGGATTCAATAAGCATAATGAAATTATTGAAGA
AGATACAAACAAAGATAAACCTAATTATCAATTCGGTGGACACAATAGTGTTGACTTTGAAGAAGATACACTTCCAAAAG
TAAGCGGCCAAAATGAAGGTCAACAAACGATTGAAGAAGATACAACGCCGCCAACGCCACCGACACCAGAAGTACCGAGT
GAGCCGGAAACACCAATGCCACCGACACCAGAAGTACCGAGTGAGCCGGAAACACCAACGCCACCAACACCAGAGGTACC
AAGTGAGCCGGAAACACCAACACCACCGACTCCGGAAGTACCAAGTGAGCCGGAAACACCAACACCACCGACACCAGAAGTGCCGAGTGAGCCAGAAACACCAACACCGCCAACACCAGAGGTACCAGCTGAACCTGGTAAACCAGTACCACCCGCAAAA
GAAGAACCTAAAAAGCCTTCTAAACCAGTGGAACAAGGTAAAGTAGTAACACCTGTTATTGAAATCAATGAAAAGGTTAA
AGCAGTGGCACCAACTAAAAAAGCACAATCTAAGAAATCTGAACTACC TGAAACAGGTGGAGAAGAATCAACAAACAAAG
GTATGTTGTTCGGCGGATTATTCAGCATTCTAGGTTTAGCATTATTACGCAGAAATAAAAAGAATAACAAAGCATAA
SEQ ID NO:65 seqüência de polinucleotídeoTTGAAAAAAAGAATTGATTATTTGTCGAATAAGCAGAATAAGTATTCGATTAGACGTTTTACAGTAGGTACCACATCAGT
AATAGTAGGGGCAACTATACTATTTGGGATAGGCAATCATCAAGCACAAGCTTCAGAACAATCGAACGATACAACGCAAT
CTTCGAAAAATAATGCAAGTGCAGATTCCGAAAAAAACAATATGATAGAAACACCTCAATTAAATACAACGGCTAATGATACATCTGATATTAGTGCAAACACAAACAGTGCGAATGTAGATAGCACAACAAAACCAATGTCTACACAAACGAGCAATAC
CACTACAACAGAGCCAGCTTCAACAAATGAAACACCTCAACCGACGGCAATTAAAAATCAAGCAACTGCTGCAAAAATGC
AAGATCAAACTGTTCCTCAAGAAGCAAATTCTCAAGTAGATAATAAAACAACGAATGATGCTAATAGCATAGCAACAAAC
AGTGAGCTTAAAAATTCTCAAACATTAGATTTACCACAATCATCACCACAAACGATTTCCAATGCGCAAGGAACTAGTAA
ACCAAGTGTTAGAACGAGAGCTGTACGTAGTTTAGCTGTTGCTGAACCGGTAGTAAATGCTGCTGATGCTAAAGGTACAA
ATGTAAATGATAAAGTTACGGCAAGTAATTTCAAGTTAGAAAAGACTACATTTGACCCTAATCAAAGTGGTAACACATTT
ATGGCGGCAAATTTTACAGTGACAGATAAAGTGAAATCAGGGGATTATTTTACAGCGAAGTTACCAGATAGTTTAACTGG
TAATGGAGACGTGGATTATTCTAATTCAAATAATACGATGCCAATTGCAGACATTAAAAGTACGAATGGCGATGTTGTAG
CTAAAGCAACATATGATATCTTGACTAAGACGTATACATTTGTCTTTACAGATTATGTAAATAATAAAGAAAATATTAAC
GGACAATTTTCATTACCTTTATTTACAGACCGAGCAAAGGCACCTAAATCAGGAACATATGATGCGAATATTAATATTGC
GGATGAAATGTTTAATAATAAAATTACTTATAACTATAGTTCGCCAATTGCAGGAATTGATAAACCAAATGGCGCGAACA
TTTCTTCTCAAATTATTGGTGTAGATACAGCTTCAGGTCAAAACACATACAAGCAAACAGTATTTGTTAACCCTAAGCAA
CGAGTTTTAGGTAATACGTGGGTGTATATTAAAGGCTACCAAGATAAAATCGAAGAAAGTAGCGGTAAAGTAAGTGCTAC
AGATACAAAACTGAGAATTTTTGAAGTGAATGATACATCTAAATTATCAGATAGCTACTATGCAGATCCAAATGACTCTA
ACCTTAAAGAAGTAACAGACCAATTTAAAAATAGAATCTATTATGAGCATCCAAATGTAGCTAGTATTAAATTTGGTGAT
ATTACTAAAACATATGTAGTATTAGTAGAAGGGCATTACGACAATACAGGTAAGAACTTAAAAACTCAGGTTATTCAAGA
AAATGTTGATCCTGTAACAAATAGAGACTACAGTATTTTCGGTTGGAATAATGAGAATGTTGTACGTTATGGTGGTGGAA
GTGCTGATGGTGATTCAGCAGTAAATCCGAAAGACCCAACTCCAGGGCCGCCGGTTGACCCAGAACCAAGTCCAGACCCA
GAACCAGAACCAACGCCAGATCCAGAACCAAGTCCAGACCCAGAACCGGAACCAAGCCCAGACCCGGATCCGGATTCGGA
TTCAGACAGTGACTCAGGCTCAGACAGCGACTCAGGTTCAGATAGCGACTCAGAATCAGATAGCGATTCGGATTCAGACA
GTGATTCAGATTCAGACAGCGACTCAGAATCAGATAGCGATTCAGAATCAGATAGCGACTCAGATTCAGATAGCGATTCA
GATTCAGATAGCGATTCAGAATCAGATAGCGATTCGGATTCAGACAGTGATTCAGATTCAGACAGCGACTCAGAATCAGA
TAGCGACTCAGAATCAGATAGTGAGTCAGATTCAGACAGTGACTCGGACTCAGACAGTGATTCAGACTCAGATAGCGATT
CAGACTCAGATAGCGATTCAGACTCAGACAGCGATTCAGATTCAGACAGCGACTCAGAATCAGACAGCGACTCAGACTCA
GATAGCGACTCAGACTCAGACAGCGACTCAGATTCAGATAGCGATTCAGACTCAGACAGCGACTCAGACTCAGACAGCGA
CTCAGACTCAGATAGCGATTCAGACTCAGACAGCGACTCAGATTCAGATAGCGATTCGGACTCAGACAGCGATTCAGATT
CAGACAGCGACTCAGACTCGGATAGCGATTCAGATTCAGACAGCGACTCAGACTCGGATAGCGACTCGGATTCAGATAGT
GACTCCGATTCAAGAGTTACACCACCAAATAATGAACAGAAAGCACCATCAAATCCTAAAGGTGAAGTAAACCATTCTAA
TAAGGTATCAAAACAACACAAAACTGATGCTTTACCAGAAACAGGAGATAAGAGCGAAAACACAAATGCAACTTTATTTG
GTGCAATGATGGCATTATTAGGATCATTACTATTGTTTAGAAAACGCAAGCAAGATCATAAAGAAAAAGCGTAA
SEQ ID NO:66 seqüência de polinucleotídeoATGAAAAAGCAAATAATTTCGCTAGGCGCATTAGCAGTTGCATCTAGCTTATTTACATGGGATAACAAAGCAGATGCGAT
AGTAACAAAGGATTATAGTAAAGAATCAAGAGTGAATGAGAAAAGTAAAAAGGGAGCTACTGTTTCAGATTATTACTATT
GGAAAATAATTGATAGTTTAGAGGCACAATTTACTGGAGCAATAGACTTATTGGAAGATTATAAATATGGAGATCCTATC
TATAAAGAAGCGAAAGATAGATTGATGACAAGAGTATTAGGAGAAGACCAGTATTTATTAAAGAAAAAGATTGATGAATA
TGAGCTTTATAAAAAGTGGTATAAAAGTTCAAATAAGAACACTAATATGCTTACTTTCCATAAATATAATCTTTACAATT
39/68
TAACAATGAATGAATATAACGATATTTTTAACTCTTTGAAAGATGCAGTTTATCAATTTAATAAAGAAGTTAAAGAAATA
GAGCATAAAAATGTTGACTTGAAGCAGTTTGATAAAGATGGAGAAGACAAGGCAACTAAAGAAGTTTATGACCTTGTTTC
TGAAATTGATACATTAGTTGTAACTTATTATGCTGATAAGGATTATGGGGAGCATGCGAAAGAGTTACGAGCAAAACTGG
ACTTAATCCTTGGAGATACAGACAATCCACATAAAATTACAAATGAGCGTATAAAAAAAGAAATGATCGATGACTTAAAT
TCAATTATAGATGATTTCTTTATGGAGACTAAACAAAATAGACCGAATTCTATAACAAAATATGATCCAACAAAACACAA
TTTTAAAGAGAAGAGTGAAAATAAACCTAATTTTGATAAATTAGTTGAAGAAACAAAAAAAGCAGTTAAAGAAGCAGACG
AATCTTGGAAAAATAAAACTGTCAAAAAATACGAGGAAACTGTAACAAAATCTCCTGTTGTAAAAGAAGAGAAGAAAGTT
GAAGAACCTCAATTAC CTAAAGTTGGAAACCAGCAAGAGGTTAAAACTACGGCTGGTAAAGCTGAAGAAACAACACAAC C
AGTGGCACAGCCATTAGTAAAAATTCCACAAGAAACAATCTATGGTGAAACTGTAAAAGGTCCAGAATATCCAACGATGG
AAAATAAAACGTTACAAGGTGAAATCGTTCAAGGTCCCGATTTTCTAACAATGGAACAAAACAGACCATCTTTAAGCGAT
AATTATACTCAACCGACGACACCGAACCCTATTTTAGAAGGTCTTGAAGGTAGCTCATCTAAACTTGAAATAAAACCACA
AGGTACTGAATCAACGTTGAAAGGTATTCAAGGAGAAT CAAGTGATATTGAAGTTAAACCTCAAGCAACTGAAACAACAG
AAGCTTCTCAATATGGTCCGAGACCGCAATTTAACAAAACACCTAAGTATGTGAAATATAGAGATGCTGGTACAGGTATC
CGTGAATACAACGATGGAACATTTGGATATGAAGCGAGACCAAGATTCAACAAGCCAAGTGAAACAAATGCATACAACGT
AACGACAAATCAAGATGGCACAGTATCATACGGAGCTCGCCCAACACAAAACAAGCCAAGTGAAACAAACGCATATAACG
TAACAACACATGCAAATGGTCAAGTATCATACGGTGCTCGCCCAACACAAAAAAAGCCAAGCAAAACAAATGCATACAAC
GTAACAACACATGCAAATGGTCAAGTATCATATGGCGCTCGCCCGACACAAAAAAAGCCAAGCAAAACAAATGCATATAA
CGTAACAACACATGCAAATGGTCAAGTATCATACGGAGCTCGCCCGACATACAAGAAGCCAAGCGAAACAAATGCATACA
ACGTAACAACACATGCAAATGGTCAAGTATCATATGGCGCTCGCCCGACACAAAAAAAGCCAAGCGAAACAAACGCATAT
AACGTAACAACACATGCAGATGGTACTGCGACATATGGGCCTAGAGTAACAAAATAA
SEQ ID NO:77 seqüência de polinucleotídeoGTGAAAAGCAATCTTAGATACGGCATAAGAAAACACAAATTGGGAGCGGCCTCAGTATTCTTAGGAACAATGATCGTTGT
TGGAATGGGACAAGAAAAAGAAGCTGCAGCAT CGGAACAAAACAATACTACAGTAGAGGAAAGTGGGAGTTCAGCTACTG
AAAGTAAAGCAAGCGAAACACAAACAACTACAAATAACGTTAATACAATAGATGAAACACAATCATACAGCGCGACATCA
ACTGAGCAACCATCAAAATCAACTCAAGTAACAACAGAAGAAGCACCAACAACTGTGCAAGCACCAAAAGTAGAAACCGA
AATGAAATCACAAGAAGATTTACCATCAGAAAAAGTTGCTGATAAGGAAACTACAGGAACTCAAGTTGACATAGCTCAAC
CAAGTAACGTCTCAGAAATTAAACCAAGAATGAAAAGATCAGCTGACGTTACAGCAGTTTCAGAGAAAGAAGTAGCGGAA
GAAGCTAAAGCGACAGGTACAGATGTAACAAATAAAGTGGAAGTTACTGAAAGCTCTTTAGAAGGACATAATAAAGATTC
GAATATTGTTAATCCGCATAATGCTCAAAGAGTAACTTTAAAATACAAATGGAAATTTGGAGAAGGAATTAAGGCAGGAG
ATTATTTTGATTTCACATTAAGTGATAATGTTGAAACACATGGTATATCAACACTGCGTAAAGTTCCGGAGATAAAAAGT
TCAACAGAAGATAAAGTTATGGCAAATGGTCAAGTTATAAATGAACGTACAATTCGCTATACATTTACTGATTATATAAA
TAACAAAAAAGATTTAACTGCTGAATTAAACTTAAACCTATT CATTGACCCAACAACAGTGACAAAGCAAGGGAGTCAAA
AAGTTGAAGTAACACTAGGTCAAAATAAAGTCTCAAAAGAATTTGATATCAAATATTTAGACGGCGTTAAAGATAGAATG
GGTGTTACTGTTAATGGTCGTATTGATACTTTGAATAAAGAAGAGGGTAAATTTAGCCATTTTGCATATGTGAAGCCTAA
CAACCAGTCGTTAACTTCTGTCACAGTAACTGGTCAAGTAACATCTGGATATAAACAAAGTGCTAATAATCCAACAGTCA
AAGTATATAAACACATTGGTTCAGATGAATTAGCTGAAAGTGTTTATGCAAAGCTTGATGATACCAGTAAATTTGAAGAT
GTGACTGAAAAAGTAAATCTATCTTACACAAGTAATGGTGGGTACACATTGAACCTTGGCGATTTAGATAATTCGAAAGA
CTATGTAATTAAATATGAAGGTGAATATGATCAAAATGCTAAGGATCTAAATTTCCGAACACATCTTTCAGGATATCATA
AATACTACCCATACTATCCTTATTACCCGTATTATCCAGTTCAATTAACTTGGAACAACGGTGTTGCATTTTACTCTAAT
AATGCTAAAGGCGATGGTAAAGATAAACCAAATGAT CC TATCATTGAGAAGAGTGAACCAATTGATTTAGACATTAAATC
AGAGCCACCAGTGGAGAAGCATGAATTGACTGGTACAATCGAAGAAAGTAACGATTCTAAGCCAATTGATTTTGAATATC
ATACAGCTGTTGAAGGTGCAGAAGGTCATGCAGAAGGTATTATTGAAACTGAAGAAGATTCTATTCATGTGGATTTTGAA
GAATCTACACATGAAAATTCAAAACATCACGCTGATGTTGTTGAATATGAAGAGGATACAAACCCAGGTGGTGGCCAAGT
AACAACTGAGTCTAACTTAGTTGAATTTGACGAAGAGTCTACAAAAGGTATTGTAACTGGCGCAGTGAGCGACCATACAA
CAGTTGAAGATACGAAAGAATATACAACTGAAAGTAAT CTGATTGAATTAGTGGATGAATTACCTGAAGAACATGGTCAA
GCACAAGGGCCAATCGAGGAAATTACTGAAAACAAT CATCATATTTCTCATTCTGGTTTAGGAACTGAAAATGGTCACGG
TAATTATGGCGTGATTGATGAAATCGAAGAAAATAGCCACGTTGATATTAAGAGTGAATTAGGTTATGAAGGTGGCCAAA
ATAGCGGTAATCAGTCATTCGAGGAAGACACAGAAGAAGATAAACCTAAATATGAACAAGGTGGTAATATCGTAGATATC
GATTTCGACAGTGTACCTCAAATTCATGGTCAAAATAATGGTAACCAGTCATTCGAGGAAGACACAGAAGAAGACAAGCC
TAAGTATGAACAAGGTGGTAACATCATTGATATCGACTTCGACAGTGTGCCACAAATTCATGGATTCAATAAGCATAATG
AAATTATTGAAGAAGATACAAACAAAGATAAAC CTAATTATCAATTTGGTGGACACAACAGTGTTGATTTTGAAGAAGAT
ACACTTCCAAAAGTAAGTGGTCAAAATGAAGGTCAACAAACGATTGAAGAAGATACAACGCCGCCAACACCGCCAACACC
AGAGGTACCAAGTGAGCCGGAAACACCAACACCACCAACACCAGAAGTACCGAGTGAGCCAGGCGAACCAACGCCACCAA
AACCGGAAGTACCAAGTGAGCCGGAAACACCAGTACCACCAACAC CAGAGGTACCATCTGAACCTGGTAAACCAGTAC CA
CCTGCTAAAGAAGAACCrAAAAAACCTTCTAAACCAGTGGAACAAGGTAAGGTAGTAACACCTGTTATTGAAATCAATGA
AAAGGTTAAAGCAGTGGCACCAACTAAACAAAAACAATCTAAGAAATCTGAACTACCTGAAACAGGTGGAGAAGAATCAA
CAAACAAAGGTATGTTGTTCGGCGGATTATTCAGCATTCTAGGTTTAGTATTATTACGCAGAAATAAAAAGAATAACAAA
GCATAA
40/68
SEQ ID NO:78 seqüência de polinucleotídeoATGAAATTTAAGTCATTGATTACAACAACATTAGCATTAGGCGTTATAGCATCAACAGGAGCAAACTTTAATACTAACGA
AGCATCTGCCGCAGCTAAGCCATTAGATAAATCATCAAGTACATTACACCATGGACATTCTAACATCCAGATTCCATATA
CAATTACTGTGAACGGTACAAGCCAAAACATTTTATCAAGCTTAACATTTAATAAGAATCAAAATATTAGTTATAAAGAT
ATAGAGAATAAAGTTAAATCAGTTTTATACTTTAATAGAGGTATTAGTGATATCGATTTAAGACTTTCAAAGCAAGCGGA
ATATACGGTTCATTTTAAAAATGGAACAAAAAGAGTTATCGATTTGAAATCAGGTATCTACACAGCTGACTTAATCAATA
CAAGTGACATTAAAGCTATCAGTGTTAACGTAGATACTAAAAAGCAACCTAAAGATAAAGCTAAAGCAAATGTTCAAGTG
CCATATACAATCACAGTGAACGGCACAAGCCAAAACATTTTATCAAACCTAACATTTAATAAAAATCAAAATATTAGTTA
CAAAGATTTAGAGGGTAAAGTTAAATCAGTTTTAGAATCAAATAGAGGTATTACTGATGTTGATTTAAGACTTTCGAAGC
AAGCGAAATATACAGTTAATTTTAAAAATGGAACGAAGAAAGTTATCGATTTGAAATCAGGTATTTACACAGCGAATTTA
ATCAATTCAAGTGATATTAAAAGTATCAATATTAACGTAGATACAAAAAAACATATCGAAAATAAAGCTAAAAGAAACTA
TCAAGTTCCATATTCAATTAATCTAAATGGTACATCTACAAACATTTTATCGAATCTTTCATTTTCAAATAAACCTTGGA
CAAATTACAAAAATTTAACTAGTCAAATAAAATCAGTACTGAAGCATGATAGAGGTATTAGTGAACAAGATTTAAAATAT
GCTAAGAAAGCTTATTATACTGTTTATTTTAAAAATGGTGGTAAAAGAATCTTACAGTTAAATTCAAAAAATTACACAGC
AAACTTAGTTCATGCGAAAGATGTTAAGAGAATTGAAATTACTGTTAAAACAGGAACTAAAGCGAAAGCAGACAGATATG
TACCATACACAATTGCAGTAAATGGCACATCAACACCAATTTTATCAAAACTAAAAATTTCGAATAAACAATTAATTAGT
TACAAATATTTAAACGACAAAGTGAAATCTGTATTAAAAAGTGAAAGAGGTATCAGTGATCTTGACTTAAAATTTGCGAA
ACAAGCAAAATATACAGTATATTTCAAAAATGGAAAGAAACAAGTAGTGAATTTAAAATCAGACATCTTTACACCTAATT
TATTTAGTGCCAAAGATAT'TAAAAAGATTGATATTGATGTAAAACAATACACTAAATCAAAAAAAAAAATAAATAAATCT
AATAATGTGAAATTCCCAGTAACAATAAATAAATTTGAAAACATAGTTTCAAATGAATTTGTGTTCTATAATGCAAGCAA
AATTACAATTAATGATTTAAGTATAAAACTTAAATCAGCAATGGCAAATGATCAAGGGATAACTAAACATGACATAGGAC
TTGCTGAACGCGCAGTGTATAAAGTGTATTTTAAAAATGGTTCGTCAAAATATGTAGACTTAAAAACTGAGTATAAAGAT
GAAAGAGTATTTAAAGCAACTGACATTAAAAAGGTAGATATTGAACTTAAATTCTAA
SEQ ID NO:79 seqüência de polinucleotídeoATGAACAAACATCACCCAAAATTAAGGTCTTTCTATTCTATTAGAAAATCAACTCTAGGC
GTTGCATCGGTCATTGTCAGTACACTATTTTTAATTACTTCTCAACATCAAGCACAAGCA
GCAGAAAATACAAATACTTCAGATAAAATCTCGGAAAATCAAAATAATAATGCAACTACA
ACTCAGCCACCTAAGGATACAAATCAAACACAACCTGCTACGCAACCAGCAAACACTGCG
AAAAACTATCCTGCAGCGGATGAATCACTTAAAGATGCAATTAAAGATCCTGCATTAGAA
AATAAAGAACATGATATAGGTCCAAGAGAACAAGTCAATTTCCAGTTATTAGATAAAAAC
AATGAAACGCAGTACTATCACTTTTTCAGCATCAAAGATCCAGCAGATGTGTATTACACT
AAAAAGAAAGCAGAAGTTGAATTAGACATCAATACTGCTTCAACATGGAAGAAGTTTGAA
GTCTATGAAAACAATCAAAAATTGCCAGTGAGAC TTGTATCATATAGTCCTGTACCAGAA
GACCATGCCTATATTCGATTCCCAGTTTCAGATGGCACACAAGAATTGAAAATTGTTTCT
TCGACTCAAATTGATGATGGAGAAGAAACAAATTATGATTATACTAAATTAGTATTTGCT
AAACCTATTTATAACGATCCTTCACTTGTAAAATCAGATACAAATGATGCAGTAGTAACG
AATGATCAATCAAGTTCAGTCGCAAGTAATCAAACAAACACGAATACATCTAATCAAAAT
ATATCAACGATCAACAATGCTAATAATCAACCGCAGGCAACGACCAATATGAGTCAACCT
GCACAACCAAAATCGTCAACGAATGCAGATCAAGCGTCAAGCCAACCAGCTCATGAAACA
AATTCTAATGGTAATACTAACGATAAAACGAATGAGTCAAGTAATCAGTCGGATGTTAAT
CAACAGTATCCACCAGCAGATGAATCACTACAAGATGCAATTAAAAACCCGGCTATCATC
GATAAAGAACATACAGCTGATAATTGGCGACCAATTGATTTTCAAATGAAAAATGATAAA
GGTGAAAGACAGTTCTATCATTATGCTAGTACTGTTGAACCAGCAACTGTCATTTTTACAAAAACAGGACCAATAATTGAATTAGGTTTAAAGACAGCTTCAACATGGAAGAAATTTGAA
GTTTATGAAGGTGACAAAAAGTTACCAGTCGAATTAGTATCATATGATTCTGATAAAGAT
TATGCCTATATTCGTTTCCCAGTATCTAATGGTACGAGAGAAGTTAAAATTGTGTCATCT
ATTGAATATGGTGAGAACATCCATGAAGAC TATGATTATACGCTAATGGTCTTTGCACAG
CCTATTACTAATAACCCAGACGACTATGTGGATGAAGAAACATACAATTTACAAAAATTA
TTAGCTCCGTATCACAAAGCTAAAACGTTAGAAAGACAAGTTTATGAATTAGAAAAATTA
CAAGAGAAATTGCCAGAAAAATATAAGGCGGAATATAAAAAGAAATTAGATCAAACTAGA
GTAGAGTTAGCTGATCAAGTTAAATCAGCAGTGACGGAATTTGAAAATGTTACACCTACA
AATGATCAATTAACAGATTTACAAGAAGCGCATTTTGTTGTTTTTGAAAGTGAAGAAAAT
AGTGAGTCAGTTATGGACGGCTTTGTTGAACATCCATTCTATACAGCAACTTTAAATGGT
CAAAAATATGTAGTGATGAAAACAAAGGATGACAGTTACTGGAAAGATTTAATTGTAGAA
GGTAAACGTGTCACTACTGTTTCTAAAGATCCTAAAAATAATTCTAGAACGCTGATTTTC
CCATATATACCTGACAAAGCAGTTTACAATGCGATTGTTAAAGTCGTTGTGGCAAACATT
GGTTATGAAGGTCAATATCATGTCAGAATTATAAATCAGGATATCAATACAAAAGATGATGATACATCACAAAATAACACGAGTGAACCGCTAAATGTACAAACAGGACAAGAAGGTAAG
GTTGCTGATACAGATGTAGCTGAAAATAGCAGCACTGCAACAAATCCTAAAGATGCGTCT
41/68
GATAAAGCAGATGTGATAGAACCAGAGTCTGACGTGGTTAAAGATGCTGATAATAATATT
GATAAAGATGTGCAACATGATGTTGATCATTTATCCGATATGTCGGATAATAATCACTTC
GATAAATATGATTTAAAAGAAATGGATACTCAAATTGCCAAAGATACTGATAGAAATGTG
GATAAAGATGCCGATAATAGCGTTGGTATGTCATCTAATGTCGATACTGATAAAGACTCT
AATAAAAATAAAGACAAAGTCATACAGCTGAATCATATTGCCGATAAAAATAATCATACT
GGAAAAGCAGCAAAGCTTGACGTAGTGAAACAAAATTATAATAATACAGACAAAGTTACT
GACAAAAAAACAACTGAACATCTGCCGAGTGATATTCATAAAACTGTAGATAAAACAGTG
AAAACAAAAGAAAAAGCCGGCACACCATCGAAAGAAAACAAACTTAGTCAATCTAAAATG
CTACCAAAAACTGGAGAAACAACTTCAAGCCAATCATGGTGGGGCTTATATGCGTTATTA
GGTATGTTAGCTTTATTCATTCCTAAATTCAGAAAAGAATCTAAATAA
SEQ ID NO:80 seqüência de polinucleotídeoGCTGAGACGACACAAGATCAAACTACTAATAAAAACGTTTTAGATAGTAATAAAGTTAAA
GCAACTACTGAACAAGCAAAAGCTGAGGTAAAAAATCCAACGCAAAACATTTCTGGCACT
CAAGTATATCAAGACCCTGCTATTGTCCAACCAAAAACAGCAAATAACAAAACAGGCAAT
GCTCAAGTAAGTCAAAAAGTTGATACTGCACAAGTAAATGGTGACACTCGTGCTAATCAA
TCAGCGACTACAAATAATACGCAGCCTGTTGCAAAGTCAACAAGCACTACAGCACCTAAA
ACTAACACTAATGTTACAAATGCTGGTTATAGTTTAGTTGATGATGAAGATGATAATTCA
GAAAATCAAATTAATCCAGAATTAATTAAATCAGCTGCTAAACCTGCAGCTCTTGAAACG
CAATATAAAACCGCAGCACCTAAAGCTGCAACTACATCAGCACCTAAAGCTAAAACTGAA
GCGACACCTAAAGTAACTACTTTTAGCGCTTCAGCACAACCAAGATCAGTTGCTGCAACA
CCAAAAACGAGTTTGCCAAAATATAAACCACAAGTAAACTCTTCAATTAACGATTACATT
TGTAAAAATAACTTAAAAGCACCTAAAATTGAAGAAGATTATACATCTTACTTCCCTAAA
TACGCATACCGTAACGGCGTAGGTCGTCCTGAAGGTATCGTAGTTCATGATACAGCTAAT
GATCGTTCGACGATAAATGGTGAAATTAGTTATATGAAAAATAACTATCAAAACGCATTC
GTACATGCATTTGTTGATGGGGATCGTATAATCGAAACAGCACCAACGGATTACTTATCT
TGGGGTGTCGGTGCAGTCGGTAACCCTAGATTCATCAATGTTGAAATCGTACACACACAC
GACTATGCTTCATTTGCACGTTCAATGAATAACTATGCTGACTATGCAGCTACACAATTA
CAATATTATGGTTTAAAACCAGACAGTGCTGAGTATGATGGAAATGGTACAGTATGGACT
CACTACGCTGTAAGTAAATATTTAGGTGGTACTGACCATGCCGATCCACATGGATATTTA
AGAAGTCATAATTATAGTTATGATCAATTATATGACTTAATTAATGAAAAATATTTAATA
AAAATGGGTAAAGTGGCGCCATGGGGTACGCAATCTACAACTACCCCTACTACACCATCA
AAACCAACAACACCGTCGAAACCATCAACTGGTAAATTAACAGTTGCTGCAAACAATGGT
GTCGCACAAATCAAACCAACAAATAGTGGTTTATATACTACTGTATACGACAAAACTGGT
AAAGCAACTAATGAAGTTCAAAAAACATTTGCTGTATCTAAAACAGCTACATTAGGTAAT
CAAAAATTCTATCTTGTTCAAGATTACAATTCTGGTAATAAATTTGGTTGGGTTAAAGAA
GGCGATGTGGTTTACAACACAGC TAAATCACCTGTAAATGTAAATCAATCATATTCAATC
AAACCTGGTACGAAACTTTATACAGTACCTTGGGGTACATCTAAACAAGTTGCTGGTAGT
GTGTCTGGCTCTGGAAACCAAACATTTAAGGCTTCAAAGCAACAACAAATTGATAAATCA
ATTTATTTATATGGCTCTGTGAATGGTAAATCTGGTTGGGTAAGTAAAGCATATTTAGTT
GATACTGCTAAACCTACGCCTACACCAACACCTAAGCCATCAACACCTACAACAAATAAT
AAATTAACAGTTTCATCATTAAACGGTGTTGCTCAAATTAATGCTAAAAACAATGGCTTA
TTCACTACAGTTTATGACAAAACTGGTAAGCCAACGAAAGAAGTTCAAAAAACATTTGCT
GTAACAAAAGAAGCAAGTTTAGGTGGAAACAAATTCTACTTAGTTAAAGATTACAATAGT
CCAACTTTAATTGGTTGGGTTAAACAAGGTGACGTTATTTATAACAATGCAAAATCACCT
GTAAATGTAATGCAAACATATACAGTAAAACCAGGCACTAAATTATATTCAGTACCTTGG
GGCACTTATAAACAAGAAGCTGGTGCAGTTTCTGGTACAGGTAACCAAACTTTTAAAGCG
ACTAAGCAACAACAAATTGATAAATCTATCTATTTATTTGGAACTGTAAATGGTAAATCT
GGTTGGGTAAGTAAAGCATATT'TAGCTGTACCTGCTGCACCTAAAAAAGCAGTAGCACAA
CCAAAAACAGCTGTAAAA
SEQ ID NO: 81 seqüência de polinucleotídeoGCTTATACTGTTACTAAACCACAAACGACTCAAACAGTTAGCAAGATTGCTCAAGTTAAA
CCAAACAACACTGGTATTCGTGCTTCTGTTTATGAAAAAACAGCGAAAAACGGTGCGAAA
TATGCAGACCGTACGTTCTATGTAACAAAAGAGCGTGCTCATGGTAATGAAACGTATGTA
TTATTAAACAATACAAGCCATAACATCCCATTAGGTTGGTTCAATGTAAAAGACTTAAAT
GTTCAAAACTTAGGCAAAGAAGTTAAAACGACTCAAAAATATAC TGTTAATAAATCAAAT
AACGGCTTATCAATGGTTCCTTGGGGTACTAAAAACCAAGTCATTTTAACAGGCAATAAC
42/68
ATTGCTCAAGGTACATTTAATGCAACGAAACAAGTATCTGTAGGCAAAGATGTTTATTTA
TACGGTACTATTAATAACCGCACTGGTTGGGTAAATGCAAAAGATTTAACTGCACCAACT
GCTGTGAAACCAAC TACATCAGCTGCCAAAGATTATAACTACACTTATGTAATTAAAAAT
GGTAATGGTTATTACTATGTAACAC CAAATTCTGATACAGCTAAATACTCATTAAAAGCA
TTTAATGAACAACCATTCGCAGTTGTTAAAGAACAAGTCATTAATGGACAAAC TTGGTAC
TATGGTAAATTATCTAACGGTAAATTAGCATGGATTAAATCAACTGATTTAGCTAAAGAA
TTAATTAAGTATAATCAAACAGGTATGACATTAAACCAAGTTGCTCAAATACAAGCTGGT
TTACAATATAAACCACAAGTACAACGTGTACCAGGTAAGTGGACAGATGCTAAATTTAAT
GATGTTAAGCATGCAATGGATACGAAGCGTTTAGCTCAAGATCCAG CATTAAAATATCAA
TTCTTACGCTTAGACCAACCACAAAATATTTCTATTGATAAAATTAATCAATTCTTAAAA
GGTAAAGGTGTATTAGAAAAC CAAGGTGCTGCATTTAACAAAGCTGCTCAAATGTATGGC
ATTAATGAAGTTTATCTTATCTCACATGCCCTATTAGAAACAGGTAACGGTACTTC TCAA
TTAGCGAAAGGTGCAGATGTAGTGAACAACAAAGTTGTAACTAACTCAAACACGAAATAC
CATAACGTATTTGGTATTGCTGCATATGATAACGATCCTTTACGTGAAGGTATTAAATAT
GCTAAACAAG CTGGTTGGGACACAGTATCAAAAGCAATCGTTGGTGGTGCTAAATTCATC
GGCAACTCATATGTAAAAGCTGGTCAAAATACACTTTACAAAATGAGATGGAATCCTGCA
CATCCAGGAACACACCAATATGCTACAGATGTAGATTGGGCTAACATCAATGCTAAAATC
ATCAAAGGCTACTATGATAAAATTGGCGAAGTCGGCAAATACTTCGACATCCCACAATAT
AAA
SEQ ID NO: 82 seqüência de polinucleotídeoGATCGTGTATTAGCCTCACATC CAGATGTTGCGACAATACGTCAAAACGTGACAGCAGCG
AATGCCGCTAAATCAGCACTTGATCAAGCACGTAATGGCTTAACAGTCGATAAAGCGCCT
TTAGAAAATGCGAAAAATCAACTACAACATAGTATTGACACGCAAACAAGTACAACTGGT
ATGACACAAGACTCTATAAATGCATACAATGCGAAGTTAACAGCTGCACGTAATAAGATT
CAACAAATCAATCAAGTATTAGCAGGTTCACCGACTGTAGAACAAATTAATACAAATACG
TCTACAGCAAATCAAGCTAAATCTGATTTAGATCATGCACGTCAAGCTTTAACACCAGAT
AAAGCGCCGCTTCAAACTGCGAAAACGCAATTAGAACAAAGCATTAATCAACCAACGGAT
ACAACAGGTATGACGACCGCTTCGTTAAATGCGTACAACCAAAAATTACAAG CAGCGCGT
CAAAAGTTAACTGAAATTAATCAAGTGTTGAATGGCAACC CAACTGTCCAAAATATCAAT
GATAAAGTGACAGAGGCAAACCAAGCTAAGGATCAATTAAATACAGCACGTCAAGGTTTA
ACATTAGATAGACAGCCAGCGTTAACAACATTACATGGTGCATCTAACTTAAACCAAGCA
CAACAAAATAATTTCACGCAACAAATTAATGCTGCTCAAAATCATGCTGCGCTTGAAACA
ATTAAGTCTAACATTACGGCT TTAAATACTGCGATGACGAAATTAAAAGACAGTGTTGCG
GATAATAATACAATTAAATCAGATCAAAATTACACTGACGCAACACCAGCTAATAAACAA
GCGTATGATAATGCAGTTAATGCGGCTAAAGGTGTCATTGGAGAAACGACTAATCCAACG
ATGGATGTTAA CACAGTGAACCAAAAAGCAGCATCTGTTAAATCGACGAAAGATGCTTTA
GATGGTCAACAAAACTTACAACGTGCGAAAACAGAAGCAACAAATGCGATTACGCATGCA
AGTGATTTAAACCAAGCACAAAAGAATGCATTAACACAACAAGTGAATAGTGCACAAAAC
GTGCAAGCAGTAAATGATATTAAACAAACGACTCAAAGCTTAAATACTGCTATGACAGGT
TTAAAACGTGGCGTTGCTAATCATAACCAAGTCGTACAAAGTGATAATTATGTCAACGCA
GATACTAATAAGAAAAATGATTACAACAATGCATACAACCATGCGAATGACATTATTAAT
GGTAATGCACAACATCCAGTTATAACACCAAGTGATGTTAACAATGCTTTATCAAATGTC
ACAAGTAAAGAACATGCATTGAATGGTGAAGCTAAGTTAAATGCTGCGAAACAAGAAGCG
AATACTGCATTAGGTCATTTAAACAATTTAAATAATGCACAACGTCAAAACTTACAATCG
CAAATTAATGGTGCGCATCAAATTGATGCAGTTAATACAATTAAGCAAAATGCAACAAAC
TTGAATAGTGCAATGGGTAACTTAAGACAAGCTGTTGCAGATAAAGATCAAGTGAAACGT
ACAGAAGATTATGCGGATGCAGATACAGCTAAACAAAATGCATATAACAGTGCAGTTTCA
AGTGCCGAAACAATCATTAATCAAACAACAAATCCAACGATGTCTGTTGATGATGTTAAT
CGTGCAACTTCAGCTGTTACTTCTAATAAAAATG CATTAAATGGTTATGAAAAATTAGCA
CAATCTAAAACAGATGCTGCAAGAGCAATTGATGCATTACCACATTTAAATAATGCACAA
AAAGCAGATGTTAAATCTAAAATTAATGCTGCATCAAATATTGCTGGCGTAAATACTGTT
AAACAACAAGGTACAGATTTAAATACAGCGATGGGTAACTTGCAAGGTGCAATCAATGAT
GAACAAACGACGCTTAATAGTCAAAACTATCAAGATGCGACACCTAGTAAGAAAACAGCA
TACACAAATGCGGTACAAGCTGCGAAAGATATTTTAAATAAATCAAATGGTCAAAATAAA
ACGAAAGATCAAGTTACTGAAGCGATGAATCAAGTGAATTCTGCTAAAAATAACTTAGAT
43/68
GGTACGCGTTTATTAGAT
SEQ ID NO: 83 seqüência de polinucleotídeoGCTTCTACACAACATACAGTACAATCTGGTGAATCATTATGGAGTATTGCTCAAAAATAC
AACACTTCAGTAGAGAGTATTAAACAAAATAAC CAATTAGATAACAACTTGGTATTCC CT
GGTCAAGTTATCTCAGTAGGTGGAAGTGATGCACAAAATACGTCAAACACTTC TCCACAA
GC TGGTTCAGCATCATCTCATACTGTACAAGCTGGTGAATCATTAAATATCATTGCTAGC
AGATATGGTGTTTCAGTTGATCAATTAATGGCAGCCAATAACTTACGTGGTTATTTAATT
ATGCCTAACCAAACATTACAAATTCCTAATGGTGGATCAGGTGGTACAACACCAACAGCT
ACAACAGGTAGCAATGGCAATGCATCATCTTTTAATCAC CAAAATTTATACACTGCTGGT
CAATGTACATGGTACGTATTTGACCGTCGTGCTCAAGC TGGTAGTCCAATTAGCACATAT
TGGTCAGACGCTAAGTATTGGGCTGGTAACGCAGCTAATGATGGTTACCAAGTAAACAAC
ACACCATCAGTTGGTTCAATTATGCAAAGCACACCTGGTCCATATGGTCATGTTGC TTAT
GTTGAACGTGTCAATGGTGATGGTAGTATCTTGAT TTCTGAAATGAATTACACATATGGT
CCATACAATATGAACTACCGTACAATTCCAGCTTCAGAAGTTTCTAGCTATGCATTCATC
CATTAA
SEQ ID NO:84 seqüência de polinucleotídeoATGAATAATAAAAAGACAGCAACAAATAGAAAAGGCATGATAC CAAATCGATTAAACAAA
TTTTCGATAAGAAAGTATTC TGTAGGTACTGCTTCAATTTTAGTAGGGACAACATTGATT
TTTGGGTTAAGTGGTCATGAAGCTAAAGCGGCAGAACATACGAATGGAGAATTAAATCAA
TCAAAAAATGAAACGACAGCC CCAAGTGAGAATAAAACAACTAAAAAAGTTGATAGTCGT
CAACTAAAAGACAATACGCAAACTGCAACTGCAGATCAGCCTAAAGTGACAATGAGTGAT
AGTGCAACAGTTAAAGAAACTAGTAGTAACATGCAATCACCACAAAACGCTACAGCTAAT
CAATCTACTACAAAAACTAGCAATGTAACAACAAATGATAAATCATCAACTACATATAGT
AATGAAACTGATAAAAGTAATTTAACACAAGCAAAAGATGTTTCAACTACACCTAAAACA
ACGACTATTAAACCAAGAACTTTAAATCGCATGGCAGTGAATAC TGTTGCAGCTC CACAA
CAAGGAACAAATGTTAATGATAAAGTACATTTTTCAAATATTGACATTGCGATTGATAAA
GGACATGTTAATCAGACTACTGGTAAAAC TGAATTTTGGGCAACTTCAAGTGATGTTTTA
AAATTAAAAGCAAATTACACAATCGATGATTCTGTTAAAGAGGGCGATACATTTACTTTT
AAATATGGTCAATATTTC CGTCCAGGATCAGTAAGATTAC C TTCACAAACTCAAAATTTA
TATAATGCCCAAGGTAATATTATTGCAAAAGGTATTTATGATAGTACAACAAACACAACA
ACATATACTTTTACGAAC TATGTAGATCAATATACAAATGTTAGAGGTAGCTTTGAACAA
GTTGCATTTGCGAAACGTAAAAATGCAACAAC TGATAAAACAGCTTATAAAATGGAAGTA
ACTTTAGGTAATGATACATATAGCGAAGAAATCATTGTCGATTATGGTAATAAAAAAGCA
CAACCGCTTATTTCAAGTACAAACTATATTAACAATGAAGATTTATCGCGTAATATGACT
GCATATGTAAATCAAC C TAAAAATACATATACTAAACAAACGTTTGTTAC TAATTTAACT
GGATATAAATTTAATC CAAATGCAAAAAACTTCAAAATTTACGAAGTGACAGATCAAAAT
CAATTTGTGGATAGTTTCAC CCCTGATACTTCAAAACTTAAAGATGTTACTGATCAATTC
GATGTTATTTATAGTAATGATAATAAAACAGC TACAGTCGATTTAATGAAAGGCCAAACA
AGCAGCAATAAACAATACATCATTCAACAAGTTGC TTATCCAGATAATAGTTCAACAGAT
AATGGAAAAATTGATTATACTTTAGACACTGACAAAACTAAATATAGTTGGTCAAATAGT
TATTCAAATGTGAATGGCTCATCAACTGCTAATGGCGACCAAAAGAAATATAATCTAGGT
GACTATGTATGGGAAGATACAAATAAAGATGGTAAACAAGATGC CAATGAAAAAGGGATT
AAAGGTGTTTATGTCATTCTTAAAGATAGTAACGGTAAAGAATTAGATCGTACGACAACA
GATGAAAATGGTAAATATCAGTTCACTGGTTTAAGCAATGGAACTTATAGTGTAGAGTTT
TCAACACCAGC CGGTTATACAC CGACAACTGCAAATGTAGGTACAGATGATGCTGTAGAT
TCTGATGGACTAACTACAACAGGTGTCATTAAAGACGCTGACAACATGACATTAGATAGT
GGATTCTACAAAACACCAAAATATAGTTTAGGTGATTATGTTTGGTACGACAGTAATAAA
GATGGTAAACAAGATTCGACTGAAAAAGGAATTAAAGGTGTTAAAGTTAC TTTGCAAAAC
GAAAAAGGCGAAGTAATTGGTACAACTGAAACAGATGAAAATGGTAAATACCGCTTTGAT
AATTTAGATAGTGGTAAATACAAAGTTATC TTTGAAAAACCTGCTGGCTTAACTCAAACA
GGTACAAATACAACTGAAGATGATAAAGATGCCGATGGTGGCGAAGTTGATGTAACAATT
ACGGATCATGATGATTTCACACTTGATAATGGCTACTACGAAGAAGAAACATCAGATAGC
GACTCAGATTCTGACAGCGATTCAGACTCAGATAGCGACTCAGATTCAGATAGCGAC TCA
GATTCAGACAGCGATTCAGACAGCGACTCAGACTCAGATAG CGATTCAGATTCAGACAGC
GACTCAGAC TCAGACAGCGATTCAGAC TCGGATAG C GAC TCAGACTCAGATAGCGAC TCA
GATTCGGATAGCGACTCAGACTCAGATAGCGATTCAGATTCAGATAGCGATTCGGACTCA
GACAGTGATTCAGATTCAGACTCAGATAGCGACTCAGATT C TGACAGCGATTCAGAC TCA
44/68
GACAGCGACTCAGACTCAGACAGTGATTCAGATTCAGACAGCGACTCAGATTCAGATAGC
GACTCAGACTCAGATAGCGACTCAGATTCAGATAGCGATTCGGACTCAGACAACGACTCA
GATTCAGATAGCGAT TCAGATTCAGATAGCGACTCAGATTCGGACAGCGATTCAGACTCA
GATAGCGATTCAGACTCAGACAGCGATTCAGATTCAGATAGCGACT CAGACTCAGATAGC
GACTCAGACTCGGATAGCGATTCAGATTCAGACAGCGACTCAGATTCAGATAGCGATTCG
GACTCAGACAACGACTCAGATTCAGATAGCGATTCAGATTCAGATGCAGGTAAACATACT
CCGGCTAAACCAATGAGTACGGTTAAAGATCAGCATAAAACAGCTAAAG CATTAC CAGAA
ACAGGTAGTGAAAATAATAATTCAAATAATGGCACATTATTCGGTGGATTATTCGCGGCATTAGGATCATTATTGTTATTCGGTCGTCGTAAAAAACAAAATAAATAA
SEQ ID NO: 85 seqüência de polinucleotídeoATGAATTTGTTAAAGAAAAATAAATATAGTATTAGGAAGTATAAAGTAGGCATATTCTC T
ACTTTAATCGGAACAGTTTTATTACTTTCAAACCCAAATGGTGCACAAGCCTTAACTACG
GATAATAATGTACAAAGCGATACTAATCAAGCAACACCTGTAAATTCACAAGATAAAGAT
GTTGCTAATAATAGAGGTTTAGCAAATAGTGCGCAGAATACACCTAATCAATCTGCAACA
AC CAATCAAGCAACGAATCAAGCATTGGTTAATCATAATAATGGTAGTATAGTAAATCAA
GCTACGCCAACATCAGTGCAATCAAGTACGCCTTC.AGCACAAAACAATAATCATACAGAT
GGCAATACAACAGCAACTGAGACAGTGTCAAACGCTAATAATAATGATGTAGTGTCGAAT
AATACCGCATTAAATGTACCAACTAAAACAAATGAAAATGGTTCAGGAGGACATCTAACT
T TAAAGGAAATTCAAGAAGATGTTCGTCATTCTTCAAATAAAC CAGAGCTAGTTGCAATT
GCTGAACCAGCATCTAATAGACCGAAAAAGAGAAGTAGACGTGCGGCACCGGCAGATC CT
AATGCAACTCCAGCAGATCCAGCGGCTGCAGCGGTAGGAAACGGTGGTGCACCAGTTGCA
ATTACAGCGCCATATACGCCAACAACTGATCCTAATGCCAATAATGCAGGACAAAATGCA
CCTAACGAAGTGCTGTCATTTGATGACAA.TGGTATTAGACCAAGTACCAACCGTTCTGTG
CCAACAGTAAACGTTGTTAATAACTTGCCGGGCTTCACACTAATCAATGGTGGCAAAGTA
GGGGTGTTTAGTCATGCAATGGTAAGAACGAGCATGTTTGATTCAGGAGATAATAAGAAC
TATCAAGCACAAGGAAATGTAATTGCATTAGGTCGTATACATGGAACTGATACGAATGAC
CATGGCGATTTTAATGGTATCGAGAAAGCATTAACAGTAAATCCGAATTCTGAATTAATC
TTTGAATTTAATACAATGACTACTAAAAACGGTCAAGG CGCAACAAATGTTATTAT CAAA
AATGCTGATACTAATGATACGATTGCTGAAAAGACTGTTGAAGGCGGTCCAACTTTGCGT
TTATTTAAAGTAC CTGATAATGTGAGAAATCTCAAAAT TCAATTTGTAC CTAAAAATGAC
GCAATAACAGATGCGCGTGGCATTTATCAACTAAAAGATGGTTACAAATACTATAGCTTT
GTTGACTCTATCGGACTTCATTCTGGGTCACATGTTTTTGT TGAAAGACGAACAATGGAT
C CAACAGCAACAAATAATAAAGAGTTTACTGTAACAACATCATTAAAGAATAATGGTAAT
TCTGGTGCTTCTCTAGATACAAATGACTTTGTATATCAAGTTCAATTACCTGAAGGTGTT
GAATATGTGAACAATTCATTGACTAAAGATTTTCCAAGTAACAATTCAGGCGTTGATGTT
AATGATATGAATGTTACATATGATGCAGCAAATCGTGTGATAACAATTAAAAGTAC TGGA
GGAGGTACAGCAAACTCTCCGGCACGACTTATGC CTGATAAAATACTCGATTTAAGATAT
AAATTACGTGTAAATAATGTGCCGACACCAAGAACAGTAACATTTAACGAGACATTAACG
TATAAAACATATACACAAGATTTCATTAATTCAGCTGCAGAAAGTCATACTGTAAGTACA
AATCCATATACTATCGATATCATCATGAATAAAGATGCATTACAAGCCGAAGTTGACAGA
CGTATTCAACAAGCTGATTATACATTTGCGTCATTAGATATCTTTAATGGTCTGAAACGA
CGCGCACAAACGATTTTAGATGAAAATCGTAACAATGTAC CATTAAATAAAAGAGTTTCT
CAAGCATATATTGATTCATTAACTAATCAAATGCAACATACGTTAATTCGAAGTGTTGAT
GCTGAAAATGCAGTTAATAAAAAAGTTGAC CAAATGGAAGATTTAGTTAATCAAAATGAT
GAATTGACAGATGAAGAAAAACAAGCAGCAATACAAGTTATCGAGGAACATAAAAATGAA
ATAATTGGTAATATTGGTGAC C AAACGACTGATGATGGCGTTACTAGAATCAAAGATCAA
GGTATACAGACCTTAAGTGGGGATACTGCAACACCGGTTGTTAAACCAAATGCTAAAAAA
GCAATACGTGATAAAGCAACGAAACAAAGGGAAATTATCAATGCAACAC CAGATGCTACT
GAAGACGAGATTCAAGATGCACTAAATCAATTAGCTACGGATGAAACAGATGCTATTGAT
AATGTTACGAATGCTACTACAAATGCTGACGTTGAAACAGCTAAAAATAATGGCATCAAT
ACTATTGGAGCAGTTGTTCCTCAAGTAACTCATAAAAAAGCTGCAAGAGATGCAATTAAC
CAAGCAACAGCAACGAAAAGACAACAAATAAATAGTAATAGAGAAGCAACTCAGGAAGAG
AAAAATGCAGCATTGAACGAATTAACTCAAGCAACCAACCATGCTTTAGAACAAATCAAT
CAAGCAACAACAAATGCTAATGTTGATAACGCCAAAGGAGATGGTCTAAATGCCATTAAT
CCAATTGCTCCTGTAACTGTTGTTAAGCAAGCTGCAAGGGATGCCGTATCACATGATG CA
CAACAACATATCGCAGAGATCAATGCTAATC CTGATGCGACTCAAGAAGAAAGACAAG CA
GCAATTGACAAAGTGAATGC TGCTGTAACTGCAGCAAACACAAACATTTTAAACGC TAAT
45/68
ACCAATGCTGATGTTGAACAAGTAAAGACAAATGCGATTCAAGGAATACAAGCAATTACA
CCAGCTACAAAAGTAAAAACAGATGCAAAAAATGCCATCGATAAAAGTGCGGAAACGCAA
CATAATACGATATTTAATAATAATGATGCGACGCTCGAAGAACAACAAGCAGCACAACAA
TTACTTGATCAAGCTGTAGCCACAGCGAAGCAAAATATTAATGCAGCAGATACGAATCAA
GAAGTTGCACAAGCAAAAGATCAGGGCACACAAAATATAGTAGTGATTCAACCGGCAACA
CAAGTTAAAACGGATACTCGCAATGTTGTAAATGATAAAGCGCGAGAGGCGATAACAAAT
ATCAATGCTACAACTGGCGCGACTCGAGAAGAGAAACAAGAAGCGATAAATCGTGTCAAT
ACACTTAAAAATAGAGCATTAACTGATATTGGTGTGACGTCTACTACTGCGATGGTCAAT
AGTATTAGAGACGATGCAGTCAATCAAATCGGCGCAGTTCAACCGCATGTAACGAAGAAA
CAAACTGCTACAGGTGTATTAAATGATTTAGCAACTGCTAAAAAGCAAGAAATTAATCAA
AACACAAATGCAACAACTGAAGAAAAGCAAGTGGCTTTAAATCAAGTGGATCAAGAGTTA
GCAACGGCAATTAATAATATAAATCAAGCTGATACAAATGCGGAAGTAGATCAAGCGCAA
CAATTAGGTACAAAAGCAATTAATGCGATTCAGCCAAATATTGTTAAAAAACCTGCAGCA
TTAGCACAAATCAATCAGCATTATAATGCTAAATTAGCTGAAATCAATGCTACACCAGAT
GCAACGAATGATGAGAAAAATGCTGCGATCAATACTTTAAATCAAGACAGACAACAAGCT
ATTGAAAGTATTAAACAAGCTAACACAAATGCAGAAGTAGACCAAGCTGCGACAGTAGCA
GAGAATAATATCGATGCTGTTCAAGTTGATGTAGTAAAAAAACAAGCAGCGCGAGATAAA
ATCACTGCTGAAGTGGCGAAGCGTATTGAAGCGGTTAAACAAACACCTAATGCAACTGAC
GAAGAAAAGCAGGCTGCTGTTAATCAAATCAATCAACTTAAAGATCAAGCAATTAATCAA
ATTAATCAAAACCAAACAAATGATCAGGTAGACACAACTACAAATCAAGCGGTAAATGCT
ATAGATAATGTTGAAGCTGAAG.TAGTAATTAAAACAAAGGCAATTGCAGATATTGAAAAA
GCTGTTAAAGAAAAGCAACAGCAAATTGATAATAGTCTTGATTCAACAGATAATGAGAAA
GAAGTTGCTTCACAAGCATTAGCTAAAGAAAAAGAAAAAGCACTTGCAGCTATTGACCAA
GCTCAAACGAATAGTCAGGTGAATCAAGCAGCAACAAATGGTGTATCAGCGATTAAAATT
ATTCAACCTGAAACAAAAGTTAAACCAGCTGCACGTGAAAAAATCAATCAAAAAGCGAAT
GAATTACGTGCTAAGATTAATCAGGATAAAGAAGCAACAGCAGAAGAAAGACAAGTAGCA
CTAGATAAAATCAATGAATTTGTAAATCAAGCCATGACAGATATTACGAATAATAGAACA
AATCAACAAGTTGATGATACAACAAGTCAAGCGCTTGATAGCATTGCTTTAGTGACGCCT
GACCATATTGTTAGAGCAGCTGCTAGAGATGCAGTTAAGCAACAATATGAAGCTAAAAAG
CGCGAAATTGAGCAAGCGGAACATGCGACTGATGAAGAAAAACAAGTTGCTTTAAATCAA
TTAGCGAATAATGAAAAACGTGCATTACAAAACATCGATCAAGCAATAGCGAATAATGAT
GTGAAACGTGTTGAAACAAATGGCATTGCTACACTAAAAGGTGTACAACCTCATATTGTA
ATTAAGCCTGAAGCACAACAAGCAATAAAAGCAAGTGCAGAAAATCAAGTAGAATCAATA
AAAGATACACCACATGCAACAGTTGATGAATTAGATGAAGCGAATCAATTAATTAGCGAC
ACACTCAAACAAGCGCAACAAGAAATAGAAAATACAAATCAAGATGCTGCTGTTACTGAT
GTTAGAAATCAAACAATCAAGGCAATAGAGCAAATAAAACCTAAAGTAAGACGTAAACGA
GCTGCGCTTGATAGCATTGAAGAAAATAATAAAAATCAACTCGATGCAATCCGAAATACG
TTGGATACTACTCAAGATGAAAGAGATGTTGCTATTGATACTTTAAATAAAATTGTAAAT
ACAATTAAAAATGACATTGCACAAAACAAAACGAATGCAGAAGTGGATCGAACTGAGACT
GATGGCAACGACAACATCAAAGTGATTTTACCTAAAGTTCAAGTTAAACCAGCAGCGCGT
CAATCTGTTGGTGTAAAAGCCGAAGCTCAAAATGCACTAATCGATCAAAGCGATTTATCA
ACTGAAGAAGAAAGACTAGCTGCTAAACATTTAGTAGAACAAGCACTTAATCAGGCTATT
GATCAGATCAATCATGCAGATAAGACTGCCCAAGTTAATCAAGATAGTATAAATGCTCAA
AATATTATTTC.AAAAATTAAACCAGCGACAACAGTTAAAGCAACAGCATTACAACAAATT
CAAAATATCGCTACAAATAAAATTAATTTAATTAAAGCAAATAACGAAGCGACAGATGAA
GAACAAAATATTGCAATAGCACAAGTTGAAAAAGAGTTAATTAAAGCTAAACAACAAATT
GCTAGTGCAGTGACTAATGCAGATGTGGCATATTTATTGCATGATGAGAAAAACGAAATT
CGTGAAATCGAACCTGTTATTAACAGAAAGGCGTCTGCTCGAGAACAATTGACAACATTA
TTCAACGATAAAAAACAAGCAATTGAAGCGAATATTCAAGCAACGGTAGAAGAAAGAAAT
AGTATATTAGCACAGTTACAAAATATTTATGACACTGCTATTGGACAAATTGATCAAGAT
CGTAGCAATGCACAAGTTGATAAAACAGCATCATTAAATCTACAAACAATACATGATTTA
GATGTACATCCTATTAAAAAGCCAGATGCTGAAAAAACGATTAATGATGATCTTGCACGC
GTCACTGCT£TAGTGCAAAATTATCGAAAAGTAAGTAATCGTAATAAGGCTGATGCATTA
AAAGCTATAACTGCTTTAAAATTACAAATGGATGAAGAATTAAAAACAGCACGCACTAAT
GCTGATGTTGATGCAGTTTTAAAACGATTTAATGTTGCATTAAGCGATATAGAAGCAGTA
ATTACTGAAAAAGAAAATAGCTTACTGCGAATTGATAACATTGCTCAACAAACATATGCG
AAATTCAAAGCGATCGCAACACCAGAACAATTAGCTAAAGTAAAAGTATTAATTGATCAA
TATGTTGCAGATGGCAATAGAATGATTGATGAAGATGCGACATTAAATGACATCAAACAA
CACACGCAATTCATTGTTGATGAAATTTTAGCAATTAAATTACCAGCTGAAGCGACGAAA
GTATCACCAAAAGAAATTCAGCCAGCTCCAAAAGTTTGTACGCCTATTAAAAAAGAAGAG
ACACATGAATCGCGCAAAGTTGAAAAAGAACTTCCAAATACAGGTTCTGAAGGAATGGAT
46/68
TTACCATTGAAAGAATTTGCACTGATTACAGGTGCGGCTTTGTTAGCTAGAAGACGTACT
AAAAACGAAAAAGAATCATAA
SEQ ID NO: 86 seqüência de polinucleotídeoGAGGAGAATTCAGTAC.AAGACGTTAAAGATTCGAATACGGATGATGAATTATCAGACAGC
AATGATCAGTCTAGTGATGAAGAAAAGAATGATGTGATCAATAATAATCAGTCAATAAAC
ACCGACGATAATAACCAAATAATTAAAAAAGAAGAAACGAATAACTACGATGGCATAGAA
AAACGCTCAGAAGATAGAACAGAGTCAACAACAAATGTAGATGAAAACGAAGCAACATTT
TTACAAAAGACCCCTCAAGATAATACTCATCTTACAGAAGAAGAGGTAAAAGAATCCTCA
TCAGTCGAATCCTCAAATTCATCAATTGATACTGCCCAACAACCATCTCACACAACAATA
AATAGAGAAGAATCTGTTCAAACAAGTGATAATGTAGAAGATTCACACGTATCAGATTTT
GCTAACTCTAAAATAAAAGAGAGTAACACTGAATCTGGTAAAGAAGAGAATACTATAGAG
CAACCTAATAAAGTAAAAGAAGATTCAACAACAAGTCAGCCGTCTGGCTATACAAATATA
GATGAAAAAATTTCAAATCAAGATGAGTTATTAAATTTACCAATAAATGAATATGAAAAT
AAGGCTAGACCATTATCTACAACATCTGCCCAACCATCGATTAAACGTGTAACCGTAAAT
CAATTAGCGGCGGAACAAGGTTCGAATGTTAATCATTTAATTAAAGTTACTGATCAAAGT
ATTACTGAAGGATATGATGATAGTGAAGGTGTTATTAAAGCACATGATGCTGAAAACTTA
ATCTATGATGTAACTTTTGAAGTAGATGATAAGGTGAAATCTGGTGATACGATGACAGTG
GATATAGATAAGAATACAGTTCCATCAGATTTAACCGATAGCTTTACAATACCAAAAATA
AAAGATAATTCTGGAGAAATCATCGCTACAGGTACTTATGATAACAAAAATAAACAAATC
ACCTATACTTTTACAGATTATGTAGATAAGTATGAAAATATTAAAGCACACCTTAAATTA
ACGTCATACATTGATAAATCAAAGGTTCCAAATAATAATACCAAGTTAGATGTAGAATAT
AAAACGGCCCTTTCATCAGTAAATAAAACAATTACGGTTGAATATCAAAGACCTAACGAA
AATCGGACTGCTAACCTTCAAAGTATGTTTACAAACATAGATACGAAAAATCATACAGTT
GAGCAAACGATTTATATTAACCCTCTTCGTTATTCAGCCAAGGAAACAAATGTAAATATT
TCAGGGAATGGTGATGAAGGTTCAACAATTATAGACGATAGCACAATAATTAAAGTTTAT
AAGGTTGGAGATAATCAAAATTTACCAGATAGTAACAGAATTTATGATTACAGTGAATAT
GAAGATGTCACAAATGATGATTATGCCCAATTAGGAAATAATAATGATGTGAATATTAAT
TTTGGTAATATAGATTCACCATATATTATTAAAGTTATTAGTAAATATGACCCTAATAAG
GATGATTACACGACTATACAGCAAACTGTGACAATGCAGACGACTATAAATGAGTATACT
GGTGAGTTTAGAACAGCATCCTATGATAATACAATTGCTTTCTCTACAAGTTCAGGTCAA
GGACAAGGTGACT TGCCTCCTGAAAAAACTTATAAAATCGGAGATTACGTATGGGAAGAT
GTAGATAAAGATGGTATTCAAAATACAAATGATAATGAAAAACCGCTTAGTAATGTATTG
GTAACTTTGACGTATCCTGATGGAACTTCAAAATCAGTCAGAACAGATGAAGATGGGAAA
TATCAATTTGATGGATTGAAAAACGGATTGACTTATAAAATTACATTCGAAACACCTGAA
GGATATACGCCGACGCTTAAACATTCAGGAACAAATCCTGCACTAGACTCAGAAGGTAAT
TCTGTATGGGTAACTATTAATGGACAAGACGATATGACGATTGATAGTGGATTTTATCAA
ACACCTAAATACAGCTTAGGGAACTATGTATGGTATGACACTAATAAAGATGGTATTCAA
GGTGATGATGAAAAAGGAATCTCTGGAGTTAAAGTGACGTTAAAAGATGAAAACGGAAAT
ATCATTAGTACAACTACAACCGATGAAAATGGAAAGTATCAATTTGATAATTTAAATAGT
GGTAATTATATTGTTCATTTTGATAAACCTTCAGGTATGACTCAAACAACAACAGATTCT
GGTGATGATGACGAACAGGATGCTGATGGGGAAGAAGTTCATGTAACAATTACTGATCAT
GATGACTTTAGTATAGATAACGGATACTATGATGACGAA
SEQ ID NO: 88 seqüência de polinucleotídeo
ATGATTAACAGGGATAATAAAAAGGCAATAACAAAAAAGGGTATGATTTCAAATCGCTTAAACAAATTTTCGATTAGAAA
GTATACTGTAGGAACTGCATCGATTITAG TAGGTACGACATTGATTTTTGGTCTAGGGAACCAAGAAGCTAAAGCTGCTG
AAAACACTAGTACAGAAAATGCGAAACAAGATGATGCAACGACTAGTGATAATAAAGAAGTAGTGTCGGAAACTGAAAAT
AATTCGACAACAGAAAATGATTCAACAAATCCAATTAAGAAAGAAACAAATACTGATTCACAACCAGAAGCTAAAGAAGA
ATCAACTACATCAAGTACTCAACAACAGCAAAATAACGTIACAGCTACAACTGAAACTAAGCCTCAAAACATTGAAAAAG
AAAATGTTAAACCTTCAACTGATAAAACTGCGACAGAAGATACATCTGTTATTTTAGAAGAGAAGAAAGCACCAAATTAT
ACAAATAACGATGTAACTACAAAACCATCTACAAGTGAAATTCAAACAAAACCAACTACACCTCAAGAATCTACAAATAT
TGAAAATTCACAACCGCAACCAACGCCTTCAAAAG TAGACAATCAAGTTACAGATGCAACTAATCCAAAAGAACCAGTAA
ATGTGTCAAAAGAAGAACTTAAAAATAATCCTGAGAAATTAAAAGAATTAGTTAGAAATGATAACAATACAGATCGTTCA
ACTAAACCAGTTGCTACAGCTC CAACAAGTGTTGCACCAAAACGATTAAATGCCIA A ATGCGTTTTGCAGTTGCACAACC
AGCAGCAGTTGCTTCAAATAATGTAAATGACTTAATTACAGTTACGAAACAGACGATCAAAGTTGGCGATGGTAAAGATA
ATGTGGCAGCAGCGCATGACGGTAAAGATATTGAATATGATACAGAGTTTACAATTGACAATAAAGTCAAAAAAGGCGAT
ACAATGACGATTAATTATGATAAGAATGTAATTCCTTCGGATTTAACAGATAAAAATGATCCTATCGATATTACTGATCC
ATCAGGAGAGGTCATTGCCAAAGGAACATTTGATAAAGCGACTAAGCAAATCACATATACATTTACAGATTATGTAGATA
AATATGAAGATATAAAAGCACGTTTAAL rrrATACTCATATATTGATAAGCAAGCAGTACCTAATGAAACTAGTTTGAAT
TTAACurn. GCAACAGCAGGTAAAGAAACTAGCCAAAACGTTTCTGTTGATTATCAAGACCCAATGGTTCATGGTGATTC
AAACATTCAATCTATCTTTACAAAGTTAGATGAAAACAAACAAACTATTGAACAACAAATTTATGTTAATCCTTTGAAAA
AAACAGCAACTAACACTAAAGTTGATATAGCTGGTAGTCAAGTAGATGATTATGGAAATATTAAACTAGGAAATGGTAGT
47/68
ACCATTATTGACCAAAATACAGAAATAAAAGTTTATAAAGTTAACCCTAATCAACAATTGCCTCAAAGTAATAGAATCTA
TGATTTTAGTCAATACGAAGATGTAACAAGTCAATTTGATAATAAAAAATCATTTAGTAATAATGTAGCAACATTGGATT
TTGGTGATATTAATTCAGCCTATATTATCAAAGTTGTTAGTAAATATACACCTACATCAGATGGCGAACTAGATATTGCT
CAAGGTACTAGTATGAGAACAACTGATAAATATGGTTATTATAATTATGCAGGATATTCAAACTTCATCGTAACTIVTAA
TGACACTGGCGGTGGCGACGGTACTGTTAAACCTGAAGAAAAGTTATACAAAATTGGTGACTATGTATGGGAAGACGTTG
ATAAAGACGGTGTCCAAGGTACAGATTCGAAAGAAAAGCCAATGGCAAACGTTTTAGTTACATTAACTTACCCGGACGGT
ACTACAAAATCAGTAAGAACAGATGCTAACGGTC.ATTATGAATTCGGTGGITTGAAAGACGGAGAAACTTATACAGTTAA
ATTCGAAACGCCAGCTGGATATCTTCCAACAAAAGTAAATGGAACAACTGATGGTGAAAAAGACTCAAATGGTAGTTCTA
TAACTGTTAAAATTAATGGTAAAGATGATATGTCTTTAGACACTGG=TATAAAGAACCTAAATATAATCTTGGTGAC
TATGTATGGGAAGATACAAATAAAGATGGTATCCAAGATG CTAATGAACCTGGTATCAAAGATGTTAAGGTTACATTAAA
AGATAGTACTGGAAAAGTTATTGGTACAACTACTACTGATGCCTCGGGTAAATATAAATITACAGATTTAGATAATGGTA
ACTATACAGTAGAATTTGAAACACCAGCAGGTTACACGCCAACGGTTAAAAATACTACAGCTGAAGATAAAGATTCTAAT
GGTTTAACAACAACAGGTGTCATTAAAGATGCAGATAATATGACATTAGACAGTGGITTCTATAAAACAC CAAAATACAG
TITAGGTGATTATGMGGTACGACAGTAATAAAGACGGTAAACAAGATTCAACTGAAAAAGGTATCAAAGATGTTAAAG
TTACTTTATTAAATGAAAAAGGCGAAGTAATTGGAACAACTAAAACAGATGAAAATGGTAAATATCGTTTCGATAATTTA
GATAGCGGTAAATACAAAGTTATTTTTGAAAAGCCTGC TGGCTTAACACAAACAGTTACAAATACAACTGAAGATGATAA
AGATGCCGATGGTGGCGAAGTTGACGTAACAATTACGGAT CATGATGATTTCATACTTGATAACGGATACTTCGAAGAAG
ATACATCAGACAGTGATTCAGACTCAGACAGTGATTCAGACTCAGACAGCGACTCAGATTCAGACAGTGATTCAGACTCAGATAGCGATTCAGATTCAGACAGCGACTCAGACTCAGATAGCGACTCAGACTCAGACAGCGACTCAGACTCAGATAGCGA
CTCAGATTCGGACAGCGATTCAGACTCAGATAG CGACTCAGATTCAGACAGCGATTCAGACTCAGATAGCGACTCAGATT
CAGACAGTGACTCAGACTCAGATAGCGACTCAGACTCAGACAGTGACTCAGACTCAGACAGCGATTCAGATTCAGATAGC
GACTCAGATTCGGACAGTGATTCAGACTCAGATAGCGACTCAGATTCAGACAGCGACTCAGACTCAGATAGCGACTCAGACTCAGACAGTGATTCAGACTCAGATAGCGATTCGGACTCGGATGCAGGAAAACATACACCTGTTAAACCAATGAGTACTA
CTAAAGACCATCACAATAAAGCAAAAGCATTACCAGAAACAGGTAGTGAAAATAACGGCTCAAATAACGCAACGTTAMT
GGTGGATTATTTGCAGCATTAGGTTCATTATTGTTATTCGGTCGTCGCAAAAAACAAAACAAATAA
SEQ ID NO: 90 seqüência de polinucleotídeo
ATGCTAAACAGAGAAAATAAAACGGCAATAACAAGGAAAGGCATGGTATCCAATCGATTAAATAAATTTTCGATTAGAAA
GTACACAGTGGGAACAGCATCAATTTTAGTAGGTACAACATTAATTTTTGGTCTGGGGAACCAAGAAGCAAAGGCTGCAGAAAGTACTAATAAAGAATTGAACGAAGCGACAACTTCAGCAAGTGATAATCAATCGAGTGATAAAGTTGATATGCAGCAA
CTAAATCAAGAAGACAATACTAAAAATGATAATCAAAAAGAAATGGTATCATCTCAAGGTAATGAAACGACTTCAAATGG
GAATAAATTAATAGAAAAAGAAAGTGTACAATCTACCACTGGAAATAAAGTTGAAGTTTCAACTGCCAAATCAGATGAGC
AAGCTTCACCAAAATCTACGAATGAAGATTTAAACACTAAACAAACTATAAGTAATCAAGAAGCGTTACAACCTGATTTGCAAGAGAATAAATCAGTGGTAAATGTTCAACCAACTAATGAGGAAAACAAAAAGGTAGATGCCAAAACTGAATCAACTAC
ATTAAATGTTAAAAGTGATGCTATCAAGAGTAATGATGAAACTCTTGTTGATAACAATAGTAATTCAAATAATGAAAATA
ATGCAGATATCAITTTGCCAAAAAGTACAGCACCTAAACGTTTGAATACAAGAATGCGTATAGCAGCAGTACAGCCATCA
TCAACAGAGGCTAAAAATGTTAATGATTTAATCACATCAAATACAACATTAACTGTCGTTGATGCAGATAAAAACAATAA
AATCGTACCAGCCCAAGATTATTTATCATTAAAATCACAAATTACAGTTGATGACAAAGTTAAATCAGGTGATTATTTCA
CAATTAAATACTCAGATACAGTACAAGTATATGGATTGAATCCGGAAGATATTAAAAATA'rTGGTGATATTAAAGATCCA
AATAATGGTGAAACAATTGCGACTGCAAAACATGATACTGCAAATAATTTAATTACATATACATTTACAGATTATGTTGA
TCGATTTAATTCTGTACAAATGGGAATTAATTATTCAATTTATATGGATGCTGATACAATTCCTGTTAGTAAAAACGATG
TTGAGrTTAATGTTACGATAGGTAATACTACAACAAAAACAACTGCTAACATTCAATATCCAGATTATGTTGTAAATGAGAAAAATTCAATTGGATCAGCGTTCACTGAAACAGTITCACATGTTGGAAATAAAGAAAATCCAGGGTACTATAAACAAAC
GATTTATGTAAATCCATCGGAAAATTCITTAACAAATGCCAAACTAAAAGTTCAAGCTTACCACTCAAGTTATCCTAATAATATCGGGCAAATAAATAAAGATGTAACAGATATAAAAATATATCAAGTTCCTAAAGGTTATACATTAAATAAAGGATAC
GATGTGAATACTAAAGAGCTTACAGATGTAACAAATCAATACTTG CAGAAAATTACATATGGCGACAACAATAGCGCTGT
TATTGATTTTGGAAATGCAGATTCTGCTTATGTTGTAATGGTTAATACAAAATTCCAATATACAAATAGCGAAAGCCCAA
CACTTGTTCAAATGGCTACTITATCTTCAACAGGTAATAAATCCGTTTCTACTGGCAATGCTTTAGGATITACTAATAAC
CAAAGTGGCGGAGCTGGTCAAGAAGTATATAAAATTGGTAACTACGTATGGGAAGATACTAATAAAAACGGTGTTCAAGAATTAGGAGAAAAAGGCGTTGGCAATGTAACTGTAACTGTATTTGATAATAATACAAATACAAAAGTAGGAGAAGCAGTTA
CTAAAGAAGATGGGTCATACTTGATTCCAAACTTACCTAATGGAGATTACCGTGTAGAATTTTCAAACTTACCAAAAGGT
TATGAAGTAACCCCTTCAAAACAAGGTAATAACGAAGAATTAGATTCAAACGGCTTATCTTCAGTTATTACAGTTAATGG
CAAAGATAACTTATCTGCAGACTTAGGTATTTACAAACCTAAATACAACTTAGGTGACTATGTCTGGGAAGATACAAATAAAAATGGTATCCAAGACCAAGATGAAAAAGGTATATCTGGCGTAACGGTAACATTAAAAGATGAAAACGGTAACGTGTTAAAAACAGTTACAACAGACGCTGATGGCAAATATAAATTTACTGATTTAGATAATGGTAATTATAAAGTTGAATTTACTAC
ACCAGAAGGCTATACACCGACTACAGTAACATCTGGTAGCGACATTGAAAAAGACTCTAATGGTTTAACAACAACAGGTGTTATTAATGGTGCTGATAACATGACATTAGATAGTGGATTCTACAAAACACCAAAATATAATITAGGTAATTATGTATGG
GAAGATACAAATAAAGATGGTAAGCAGGATTCAACTGAAAAAGGTATTTCAGGCGTAACAGTTACATTGAAAAATGAAAACGGTGAAG rrri ACAAACAACTAAAACAGATAAAGATGGTAAA TATCAATTTACTGGATTAGAAAATGGAACTTATAAAGTTGAATTCGAAACACCATCAGGTTACACACCAACACAAGTAGGTTCAGGAACTGATGAAGGTATAGATTCAAATGGTACATCAACAACAGGTGTCATTAAAGATAAAGATAACGATACTATTGACTCTGGTTTCTACAAACCGACTTACAACTTAGGTGA
CTATGTATGGGAAGATACAAATAAAAACGGTGITCAAGATAAAGATGAAAAGGGCATITCAGGTGTAACAGTTACGTTAAAAGATGAAAACGACAAAGTTTTAAAAACAGTTACAACAGATGAAAATGGTAAATATCAATTCACTGATTTAAACAATGGAACTTATAAAGTTGAATTCGAGACACCATCAGGTTATACACCAACITCAGTAACTTCTGPAn ATGATACTGAAAAAGNITCTAATGGTTTAACAACAACAGGTGTCATTAAAGATGCAGATAACATGACATTAGACAGTGGTTTCTATAAAACACCAAAATATAGTTTAGGTGATTATGTTTGGTACGACAGTAATAAAGACGGCAAACAAGATTCAACTGAAAAAGGTATCAAAGATGTTAAAGTTACTTTATTAAATGAAAAAGGCGAAGTAATTGGAACAACTAAAACAGATGAAAATGGTAAATACTGCTITGATAATTTAGATAGCGGTAAATACAAAGTTATTTTTGAAAAGCCTGCTGGCTTAACACAAACAGTTACAAATACAACTGAAGATGATAAAGATGCAGATGGTGGCGAAGTTGACGTAACAATTACGGATCATGATGATTTCACACTTGATAACGGATACTTCGAAGAAGATACATCAGACAGCGATTCAGACTCAGATAGTGACTCAGACAGCGACTCAGACTCAGACAGCGACTCAGACTCAGACAGTGATTCAGATTCAGACAGCGACTCAGATTCAGATAGCGACTCAGATTCGGACAGCGATTCAGACTCAGATAGCGACT
CAGATTCAGATAGCGATTCAGACTCAGACAGCGACTCAGATTCAGATAGCGATTCGGACTCAGACAGCGATTCAGACTCA
GATAGCGACTCAGACTCAGACAGCGACTCAGATTCAGATAGCGATTCGGACTCAGATAGCGACTCAGATTCAGACAGCGA
48/68
TTCAGACTCAGATAGCGACTCAGATTCAGACAGCGATTCAGA CTCAGATAGMACTCAGACTCAGACAGTGATTCAGATT
CAGACAGCGACTCAGACTCAGATAGCGACTCAGATTCGGACAGCGACTCAGACTCTGATAGCGACTCAGACTCAGACAGT
GATTCAGACAGCGATTCAGACTCGGATGCAGGAAAACATACACCTGTTAAACCAATGAGTACTACTAAAGACCATCACAA
TAAAGCAAAAGCATTACCAGAAACAGGTAGTGAAAATAACGGCTCAAATAACGCAACGTTATTTGGTGGATTATTTG CAG
CATTAGGTTCATTATTGTTATTCGGTCGTCGCAAAAAACAAAACAAATAA
SEQ ID NO: 92 seqüência de polinucleotídeo
ATGGCTAAATATCGAGGGAAACCGTTTCAATTATATGTAAAGTTATCGTGTTCGACAATGATGGCGACAAGTATCA I PT
AAcGAATATCTTGCCGTACGATGCCCAAGCTGCATCTGAAAAGGATACTGAAATTACAAAAGAGATATTATCTAAGCAAG
ATTTATTAGACAAAGTTGACAAGGCAATTCGTCAAATTGAGCAATTAAAACAGTTATCGGCTTCATCTAAAGAACATTAT
AAAGCACAACTAAATGAAGCGAAAACAGCATCGCAAATAGATGAAATCATAAAACGAGCTAATGAGTTGGATAGCAAAGA
CAATAAAAGTTCTCACACTGAAATGAACGGTCAAAGTGATATAGACAGTAAATTAGATCAATTGCTTAAAGATTTAAATG
AGGTTTCTTCAAATGTTGATAGGGGTCAACAAAGTGGCGAGGACGATCTTAATGCAATGAAAAATGATATGTCACAAACG
GCTACAACAAAACATGGAGAAAAAGATGATAAAAATGATGAAGCAATGGTAAATAAGGCGTTAGAAGACCTAGACCATTT
GAATCAGCAAATACACAAATCGAAAGATGCATCGAAAGATACATCGGAAGATCCAGCAGTGTCTACAACAGATAATAATC
ATGAAGTAGCTAAAACGCCAAATAATGATGGTTCTGGACATGTTGTGTTAAATAAATTCCTTTCAAATGAAGAGAATCAA
AGCCATAGTAATCGACTCACTGATAAATTACAAGGAAGCGATAAAATTAATCATGCTATGATTGAAAAATTAGCTAAAAG
TAATGCCTCAACGCAACATTACACATATcATAAACTGAATACGTTACAATCTTTAGATCAACGTATTGCAAATACGCAAC
TTCCTAAAAATCAAAAATCAGACTTAATGAGCGAAGTAAATAAGACGAAAGAGCGTATAAAAAGTCAACGAAATATTATT
TTGGAAGAACTTGCACGTACTGATGATAAAAAGTATGCTACACAAAGCA rrrTAGAAAGTATATTTAATAAAGACGAGGC
AGTTAAAATTCTAAAAGATATACGTGTTGATGGTAAAACAGATCAACAAATTGCAGATCAAATTACTCGTCATATTGATC
AATTATCTCTGACAACGAGTGATGATTTATTAACGTCATTGATTGATCAATCACAAGATAAGTCGCTATTGATTTCTCAA
ATTTTACAAACGAAATTAGGAAAAGCTGAAGCAGATAAATTGGCTAAAGATTGGACGAATAAAGGATTATCAAATCGCCA
AATCGTTGACCAATTGAAGAAACATTTTGCATCAACTGGCGACACGTCTTCAGATGATATATTAAAAGCAATTTTGAATA
ATGCCAAAGATAAAAAACAAGCAATTGAAACGATTTTAGCAACACGTATAGAAAGACAAAAGGCAAAATTACTGGCAGAT
TTAATTACTAAAATAGAAACAGATCAAAATAAAATTTTTAATTTAGTTAAATCGGCATTGAATGGTAAAGCGGATGATTT
ATTGAATTTACAAAAGAGACTCAATCAAACGAAAAAAGATATAGATTATATTTTATCACCAATAGTAAATCGTCCAAGTT
TACTAGATCGATTGAATAAAAATGGGAAAACGACAGATTTAAATAAGTTAGCAAATTTAATGAATCAAGGATCAGATTTA
TTAGACAGTATTCCAGATATACCCACACCAAAGCCAGAAAAGACGTTAACACTTGGTAAAGGTAATGGATTGTTAAGTGGATTATTAAATGCTGATGGTAATGTATCTTTGCCTAAAGcGGGGGAAACGATAAAAGAACATTGGTTGCCGATATCTGTAA
TTGTTGGTGCAATGGGTGTACTAATGATTTGGTTATCACGACGCAATAAGTTGAAAAATAAAGCATAA
SEQ ID NO: 94 seqüência de polinucleotídeo
ATGAAAAAATTAGCAACAGTAGGTTCTTTAATTGTAACAAGCACTTTAGTATTCTCAAGTAT
GCCTTTTCAAAATGCGCATGCCGACACAACTTCAATGAATGTGTCGAATAAACAAAGCCAAA
ATGTACAAAATCATCGTCCTTATGGCGGAGTAGTACCACAAGGAATGACGCAAGCACAATATACTGAATTAGAGAAAGCTTTACCCCAATTAAGCGCTGGCAGTAATATGCAAGACTATAATAT
GAAATTGTATGATGCGACGCAAAATATTGCTGATAAATACAATGTGATAATTACAACTAATGTAGGGGTATTTAAACCACATGCTGTTAGAGATATGAATGGCCATGCGTTACCTTTAACAAAAGATGGCAATTTTTATCAAACGAATGTAGATGCAAATGGTGTTAATCATGGTGGTAGTGAAAT
GGTGCAAAATAAAACAGGTCATATGAGTCAACAAGGCCATATGAATCAGAACACACACATGAACCAACAGCCACACATGCAACAAGGTCATATGCAATCATCAAACCATCAAATGATGAGTCCAAAAGCAAATATGCATTCATCAAATCATCAAATGAACCAAAGTAACAAAAAAGTTTTACCAGCTGCTGGTGAAAGTATGACATCAAGTATTCTTACTGCAAGTATTGCCGCACTACTATTAGTATCTGGGTTATTCTTAGCATTTAGACGACGTTCAACAAATAAATAA
49/68
A
B
FIGURA 3
Purificação de alfa-toxina
I 2 3 4 5 6 7 8 9 10 1 11 12 13 14 15
10 5 2 1µ1
50/68
90
FIGURA 4
Purificação de SdrC
M Iniciação Fri C D E
MW 1µI 2µ1 5111 10µ1
51/68
FIGURA 5
O.D. em dil
uiçã
o de soro de 1/1
.000
4
3.5
3
2.5
2
1.5
1
0.5
Elisa anti-atl-amidase
7
7
Combinação Combinação BlccamundongosamundongosPré Pós III
Combinação Combinação Blccoelho coelhoPré Pós III
O.D. em dil
uiçã
o de soro de 1/1
.000
Elisa anti-alfa-toxina
3.5
2.5
2
1.5
0.5
Combinação Combinação BkcamundongowamundongosPré Pós III
Combinação Combinação Blccoelho coelhoPré Pós III
O.D. em dil
uiçã
o de soro de 1/1
.000
Elisa anti-EbH
3.5
2.5
2
1.5
0.5
OCombinação Combinação Blc Combinação Combinação Bkcamundongos camundongos coelho coelhopré Pós III Pré Pós III
52/68
FIGURA 5
O.D. em dil
uiçã
o de soro de 1/1
.000
4
3.5
3
2.5
2
1.5
1
0.5
Anti-SdrG ELISA
CombinaçãocamundongoscamundongosPré Pós III
Combinação Blc CombinaçãocoelhoPré
CombinaçãocoelhoPós III
Blc
oo
Anti-Atl-glucosaminidase ELISA
o
3.5
o
2O 2.5oo17Oeas 1.5•_
E 0.5
oO Combinação Combinação
camundongos camundongosPré Pós III
Blc CombinaçãoCombinaçãocoelho coelhoPré Pós III
Blc
oo
▪ 4
euO 3
Anti-MRP ELISA
3.5
ot4 2.5N• 2oleu0, 1.5
"O 1
E 0.5eu
O Combinação CombinaçãocamundoncescamundongosPré Pós III
Blc Combinação Combinaçãocoelho coelhoPré Pós III
Blc
53/68
FIGURA 5
O.D.
em diluição de soro de 1/1.000 Anti-Sbi ELISA
4
3.5
3
2.5
2
1.5
1
0.5
0Combinação Combinação B1ccamundongoscamundongosPré Pós III
Combinação Combinaçãocoelho coelhoPré Pós III
Bic
O.D. em dil
uiçã
o de soro de 1/1
.000
Anti-IsdA ELISA
oCombinação Combinação BiccamundongoscamundongosPré Pós III
Combinação Combinação Blccoelho coelhoPré Pós III
Anti-SdrC ELISA
ooR
3.5
2• 2.5co
2otas 1.5tr
E 0.5to• o• Combinação Combinação Bic CombinaçãcCombinação
camundongos camundongos coelho coelhoPré Pós III Pré Pós III
Blc
54/68
FIGURA 5
O.D. em dil
uiçã
o de soro de 1/1
.000
Anti4saA ELISA
3.5
2.5
2
1.5
0.5
Combinação Combinação 13Ic Combinação Combinação BEcamundongos camundongos coelho Pré coelho Pós IIIPré Pós III
O.D.
em dil
uiçã
o de soro de 111
.000
Anti-FnbpA ELISA
4
3.5
3
2.5
2
1.5
1
0.5
CombinaçãoCombinaçãocamundongos camundongos
Pré Pós III
81c Combinação Combinação Blccoelho Pré coelho Pós III
55/68
FIGURA 5
O.D. em dil
uiçã
o de soro de 1/1
.000
4
3.5
3
2.5
1.5
1
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0
CombinaçãocamundongosPré
Anti-atl-AaA ELISA
CombinaçãocamundongosPós III
BlcCombinação Biccoelho Pré coelho Pós III
o
- 3.5e.)
O -o
3
o• 2.5
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E• 0.5
• 0Ó Combinação
camundongosPré
Anti-ClfA ELISA
CombinaçãocamundongosPós III
Blc CombinaçOombinação 13tcoelho Pré coelho Pós III
56/68
A
B
C
FIGURA 6
Soros de camundongo anti-SdrC
2
1.5
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10 20 40 80 160 320 640 1280 2560 5120 10240 20480
2
1.5cio
0.5
Soros de camundongo anti-SdrC
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Diluições
2
1.5
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Soros de camundongo anti-SdrC
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Diluições
57/68
A
B
C
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Soros de camundongo anti-FnbpA
2
1.5
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10 20 40 80 160 320 640 1280 2560 5120 10240 20480
2
1.5
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0.5
Soros de camundongo anti-FnbpA
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Soros de camundongo anti-FnbpA
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Diluições
58/68
FIGURA 6
Soros de camundongo anti-EbH
2
1.5
0.5
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10 20 40 80 160 320 640 1280 2560 5120 10240 20480
2
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0.5
o
Soros de camundongo anti-EbH
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Diluições
Soros de camundongo anti-EbH
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10 20 40 80 160 320 640 1280 2560 5120 10240 20480
Diluições
59/68
FIGURA 6
2
soros de camundongo anti-Sbi
T
1.5
1
0.5
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10 20 40 80 160 320 640 1280
•
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, o
5120
. •
10240
. e
20480
2
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0.5
soros de camundongo anti-Sbi
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Diluições
3
2.5
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0.5
o
soros de camundongo anti-Sbi
10 20 40 80 160 320 640 1280 2560 5120 10240 20480
Diluições
60/68
• FIGURA 6
A
B
soros de camundongo anti-CIfA
2
1.5
0.5
10 20 40 80 160 320 640 1280 2560 5120 10240 20480
1.5
oEccrb
0.5
soros de camundongo anti-CIfA
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1̀51 0
2 4'0 X60
\f° (1?0‘
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fir 8,5) ri9#
Diluições
1.5ci
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0.5
soros de camundongo anti-CIfA
e--
10 20 40 80 160 320 640 1280 2560 5120 10240 20480
Diluições
61/68
A
B
C
FIGURA 7
3.5
soros de coelho anti-IsaA
3
2.5
2
1.5
1
0.5
O
10 20 40 80 160 320 640 1280 2560 5120 10240 20480
soros de coelho anti-IsaA
4
3.5
3
2.5
2
1.5
1
0.5 • •
O
• •
, I---, ç 1
10 40 160 640 2560 10240
soros de coelho anti-IsaA
3.5
3
2.5
2
1.5
1
0.5
O , , i ,-----,----i--- -
10 40 160 640 2560 10240
62/68
FIGURA 7
DO 490
-620
3.5
3
2.5
2
1.5
0.5
o
soros de coelho anti IsdB
10 20 40 80 160 320 640 1280 2560 5120 10240 20480
Diluições
soros de coelho anti IsdB
4
3.5
3
2.5
2
1.5
1 .----
0.5
0 , 1
ci,30 çp •o bc,, #No ,tio bo, 'bo Nçz.O n51,0 O
1, rf? •r q, rotx
soros de coelho anti IsdB
3.5
3
2.5
2
1.5
1
0.5
O 1.
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i o
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63/68
A
B
C
FIGURA 7
DO 490-620
3.5
3
2.5
2
1.5
1
0.5
soros de coelho anti-HarA
10 20 40 80 160 320 640 1280 2560 5120 10240 20480
Diluições
soros de coelho anti-HarA
4
3.5
3
2.5
2
1.5
1
0.5
O ,
p‘sz) cp 1,5) (bo e nsig to ocbsz, ,t)g3o <0\,19, ,z23,5) stcp
soros de coelho anti-HarA
3.5
3
2.5
2
1.5
1
0.5
O ----,----,---,-- 11~-1-6—
N `1, b• q:' è• n) çgo) I r\q" re j'• 0 1̀?‘ ,191`
64/68
A
B
FIGURA 7soros de coelho anti-Sdrg
3.5
3
2.5
2
1.:
1
0.5
O10 20 40 80 160 320 640 1280 2560 5120 10240 20480
soros de coelho anti-Sdrg
4
3.5
3
2.5
2
---- ---"*`1.5
1..____,w
.- 0.5
O 1 . 1 , ,
0 0 Q, ÇoQ, 19 0 ca°tO rtg Cgç 'b'' °SI' çr? <1,5 cf? '\ 0'1' ,tio3
soros de coelho anti-Sdrg
3.5
3
2.5
2
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1
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O
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.‘
,19. fp 00,\O (19 ts, cbo 00 „),-1,0 ç:Ixo <0.1' ei%) 0. fr r19
65/68
A
B
C
FIGURA 7soros de coelho anti-Sbi
3.5
3
2.5
1.5
0.5
10 20 40 80 160 320 640 1280 2560 5120 10240 20480
soros de coelho anti-Sbi
4
3.5
3
2.5
2
1.5
1
0.5
O
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soros de coelho anti-Sbi
3.5
3
2.5
2
1.5
1
0.5
O .
P o O (to t!P tgO if 0 (I)Q' , \ço' 05-19 j &cb 4, P• g, b,4D 0 r19
66/68
A
B
C
FIGURA 7
soros de coelho anti-C1Fa
3.5
3
2.5
2
1.5
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. • •-----11—f-41.---, ,
10 20 40 80 160 320 640 1280 2560 5120 10240 20480
soros de coelho anti-CIFa
4
3.5
3
2.5
2
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1
0.5
O
NO ep 10 %o o() 0519 _b.0 00 00 '19 tx0 .40
10' I0 <0' \ NO ti (19°`-
soros de coelho anti-CIFa
3.5
3
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2
1.5
1
0.5
O ,
0 .19 0 cá) .‘é) „5-19 % 409 (1,,,z° <19 ri3O X00
(') \O rp
67/68
A
C
FIGURA 7
soros de coelho anti-Fnbpa
3.5
3
2.5
2
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0.5
----.... 1,...,.„..........,_.,..,.....,,,a__
10 20 40 80 160 320 640 1280 2560 5120 10240 20480
soros de coelho anti-Fnbpa
4
3.5
3
2.5
2 •
1.5
1.
0.5 4,____.______._______a______‘_
O
•
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,,o ,10 o cbo oo nso _O ,t5) ÇDO (19 ,a,$) _cho,(1, rf,3 <0' o' t' 92°̀-
soros de coelho anti-Fnbpa
3.5
3
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2
1.5
1
0.5
O
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68/68
A
B
C
FIGURA 7
soros de coelho anti-Atl amidase
3.5
3
2.5
2
1.5
1
0.5 . --
--------4---1===== .4--,—.4—,-4—,-1,--O ,
10 20 40 80 160 320 640 1280 2560 5120 10240 20480
`c :01R,ntOo
soros de coelho anti-Atl amidase
43.5
32.52
1.51
0.50
'19 tx° 00 -O oro .0 -O ,\.1,- 0 0too <0 oro, ",
Diluições
DO 490
-620
3.5
3
2.5
2
1.5
soros de coelho anti-Atl amidase
0.5
O ‘ ,?4—T--.--1-19-1
ri9 tP (91 çz+b̀ N9, rf,) (0\
Diluições
,970 ,0£>11.0--‘3'
1
RESUMO
"COMPOSIÇÃO IMUNOGÊNICA, VACINA, MÉTODOS PARA
PREPARAR A VACINA, E PARA PREVENIR OU TRATAR INFECÇÃO
ESTAFILOCÓCICA, USO DA COMPOSIÇÃO IMUNOGÊNICA, E,
5 PROCESSO PARA CONJUGAR OLIGOSSACARlDEO OU
POLISSACARlDEO CAPSULAR"
A presente invenção refere-se às composições imunogênicas
compreendendo oligossacarídeo ou polissacarídeo capsular de Tipos 5 e/ou 8
de S. aureus possuindo entre 30 e 100% de O-acetilação. Vacinas, métodos de
10 tratamento usando [sic] e processos para preparar uma composição
imunogênica compreendendo polissacarídeos capsulares de Tipos 5 e/ou 8
com 30-100% de 0-acetilação também são descritos.