18.5.2014.

1

Kvalitativna UV/VIS analiza

• UV-VIS spektri, opdenito, prikazuju samo nekoliko širokih apsorpcijskih traka.

• U poređenju sa tehnikama kao što su infracrvena spektrometrija, koja stvara mnogo uskih traka, UV-VIS spektrometrija pruža ograničenu količinu kvalitativnih informacija.

• Vedina apsorpcija organskih spojeva proizilazi iz prisutnosti nezasidenih veza.

Uticaj priroda molekule na položaj trake

18.5.2014.

2

Uticaj osobina otapala na apsorpcijski spektar

Uticaj pH vrijednosti na apsorpcijski spektar

(a) boja bromtimol plavog u kiseloj, (b) neutralnoj i (c) baznoj sredini

18.5.2014.

3

KVANTITATIVNA ANALIZA

• Slabljenje elektromagnetnog zračenja koje prolazi kroz uzorak je kvantitativno opisano kroz dva zasebna, ali povezana pojma: transmitansu i apsorbansu.

• Transmitansa T, se definira kao omjer intenziteta elektromagnetnog zračenja koje izlazi iz uzorka (I), nekada se označava kao snaga propuštenog zračenja (P) i intenziteta elektromagnetnog zračenja iz izvora (I0) odnosno snage upadnog zračenja ( P0 ):

00 P

P

I

IT

Slabljenje intenziteta zračenja usljed apsorpcije od strane obojene otopine

Množenjem sa 100 dobiva se postotak transmitanse (% T), koja varira između 100 % (nema apsorpcije), i 0 % (potpuna apsorpcija).

100%0

I

IT

18.5.2014.

4

• Sve metode detekcije, da li je to ljudsko oko ili moderna fotoelektrična sonda, mjere transmitansu elektromagnetnog zračenja. Oslabljeno zračenje nakon što je prošlo kroz uzorak daje transmitansu manju od 1.

• Pored apsorpcije od strane analita, uključuje se i nekoliko dodatnih pojava koje doprinose ukupnom slabljenju zračenja, to su apsorpcija i refleksija od strane kivete, apsorpcija komponente matriksa (sve komponente uzorka, osim analita), i raspršenje zračenja

Slabljenje intenziteta zračenja usljed refleksija od strane zidova kivete, apsorpcija komponente matriksa i raspršenje zračenja o molekule u otopini.

Za kompenzaciju apsorpcije od strane matriksa i gubitka energije zračenja usljed refleksija od strane zidova kivete, kao i raspršenje o molekule prije svega otapala koristi se slijepa proba

18.5.2014.

5

Promjene intenziteta elektromagnetnog zračenja nakon prolaska kroz slijepu probu i kroz otopinu uzorka sa analitom

• Intenzitet zračenja koji prođe kroz slijepu probu uzima se kao početni intenzitet, I0. Alternativna metoda za izražavanje slabljenja elektromagnetnog zračenja je apsorbansa, A, koja je definisana kao:

odnosno

TA log

18.5.2014.

6

Uporedni apsorpcioni spektar dobijen mjerenjem transmitanse (puna linija) i mjerenjem apsorbanse (isprekidana linija)

Lambert-Beerov zakon

• Kada snop monohromatskog elektromagnetnog zračenja prolazi kroz neodređeno tanki sloj uzorka, debljine dx, dolazi do smanjenja intenziteta zračenja I za dI.

• Djelimično smanjenje intenziteta zračenja je proporcionalno debljini uzorka dx i koncentraciji analita, c.

IcdxdI

ε – je konstanta proporcionalnosti

18.5.2014.

7

Faktori iz kojih se izvodi Lambert-Beerov zakon

Dijeljenjem lijeve i desne strane jednačine sa I dobija se

Integriranje lijeve strane jednačine od I0 do I i desne strane od x = 0 do x = b, gdje je b ukupna debljina uzorka dobit de se:

cdxI

dI

bx

x

I

I

dxcI

dI

00

18.5.2014.

8

• logaritmiranjem jednačine i pretvaranjem ln u log dobijamo sljededu jednačinu:

bcI

I

I

I

00

log303.2ln

daljnjim rješavanjem ove jednačine dobivamo.

abcbcI

I

303,2log 0

kako je ATI

I

I

I logloglog

0

0

slijedi da je abcA

bc

Aa

gdje je a apsorptivnost analita (apsorpcijski koeficijent) u jedinicama cm-1 konc-1 (najčešće masena koncentracija). Dat je izrazom:

a definira se kao apsorbansa pri prolazu svjetlosti kroz sloj jedinične debljine i jedinične koncentracije otopine

18.5.2014.

9

• Kada se koncentracija izražava kao količinska koncentracija, apsorptivnost se zamjenjuje sa molarnom apsorptivnosti, ε

(u jedinicama cm-1 mol-1 dm3).

• Prethodne dvije jednačine koje utvrđuju linearne odnose između absorbanse i koncentracije, poznate su kao Lambert-Beerov zakon, ili više kao Beerov zakon.

• Apsorbansa je direktno proporcionalna koncentraciji određene supstance pri prolasku monohromatske svjetlosti tačno definirane talasne dužine i pri stalnoj debljini sloja otopine i određenoj temperaturi.

• Apsorptivnost odnosno molarna apsorptivnost je karakteristična za datu tvar pod precizno definiranim uvjetima, kao što je talasna dužina, otapalo i temperatura.

• U praksi, mjerenje molarne apsorptivnosti ovisi djelomično o karakteristikama korištenog instrumenta.

18.5.2014.

10

• Kalibraciona ili radna kriva se priprema za tvar kako bi se mogla analizirati uz pomodu jedne ili više standardnih otopina poznate koncentracije analita.

• Za elektronske prijelaze, razlika u energiji između osnovnih i pobuđenih stanja je relativno velika.

• Stoga, pri sobnoj temperaturi, vrlo je vjerojatno da su sve molekule u elektronski osnovnom stanju.

• Apsorpcija i povratak u osnovno stanje su brzi procesi, a ravnoteža se postiže vrlo brzo.

• Tako, apsorpcija UV-VIS svjetla je kvantitativno vrlo precizna. Jednostavni linearni odnos između apsorbanse i koncentracije i relativna jednostavnost mjerenja UV-VIS svjetla su učinili UV-VIS spektrometriju osnovnom tehnikom za veliki broj kvantitativnih analitičkih metoda.

• Kalibracione krive bazirane na Beerovom zakonu koriste se rutinski u kvantitativnoj analizi.

18.5.2014.

11

• Za razliku od transmitanse, prema Beerovom zakonu apsorbansa je direktno proporcionalna koncentraciji, dakle slijedi jednačinu pravca

y = a·x odnosno A = a·b·c

• Dakle apsorbansa linearno raste sa povedanjem koncentracije

Mjerenje apsorbanse

• Tvar može apsorbirati samo zračenje određene frekvencije dok de ostalo zračenje prodi nesmanjenim intenzitetom.

• Prikaže li se slikom ovisnost apsorbanse (molarnog koeficijenta apsorbanse ili njihovih logaritama) o talasnoj dužini (frekvenciji ili talasnom broju) zračenja, dobije se takozvani spektralni apsorpcijski dijagram ili skradeno spektar.

• Svakom elektronskom prelazu odgovara pojava jedne apsorpcijske trake u spektru

18.5.2014.

12

• Ukoliko molekula sadrži više hromofora, tada se i spektar sastoji iz više traka i naziva se apsorpcijski spektar ili kriva spektralne raspodjele.

• Kako apsorpcijski spektar ovisi o sastavu i strukturi molekula, to se njegovim tumačenjem može izvršiti kvalitativna analiza, odnosno identifikacija analizirane supstance.

• Apsorpcijsku traku karakteriše položaj trake, odnosno talasna dužina na kojoj otopina maksimalno apsorbuje (λmax), poluširina trake (Δλ) i molarni apsorpcijski koeficijent (emax) koji se izračunava iz Lamber-Berovog zakona:

Obično se sva mjerenja izvode na talasnoj dužini gdje imamo maksimalnu apsorbansu (max). Na maksimalnoj apsorbansi imamo i maksimalni odziv. Na taj način su smanjene greške prilikom mjerenja

18.5.2014.

13

Metode određivanja koncentracije elemenata

• Rutinskoj primjeni neke metode, po pravilu mora prethoditi ispitivanje osnovnih analitičkih mogudnosti.

• U prvom redu treba odrediti radni interval koncentracija, odnosno najnižu i najvišu koncentraciju koja se može kvantitativno odrediti.

• Ove koncentracije ovise o tipu instrumenta, ukupnom sastavu otopine i drugim parametrima eksperimenta.

• Najniža koncentracija koja se može kvantitativno određivati obično je, ovisno o tačnosti koja se zahtijeva, 5 do 10 puta veda od granice detekcije.

Metoda kalibracione (baždarne) krive

• Proces kalibracije, u ograničenom smislu analitičke kalibracije, vodi ka pripremi kalibracijske krivulje koja je, u stvari, grafičko predstavljanje varijacija eksperimentalnih mjerenja (mjerenja kvantitativne promjenjive analitičkog sistema kao funkcije koncentracije analita u otopini).

• Kvantitativne spektrometrijske metode uglavnom se temelje na baždarnim krivim koje su po pravilu linearne.

18.5.2014.

14

• Metoda se sastoji u tome da se instrument nuluje sa otapalom ili slijepom probom, a potom se za seriju standarda poznate koncentracije odredi vrijednost mjernog parametra (apsorbanse, emisije,..)

• U praksi, prvi korak je konstrukcija kalibracione krive A = f(c) za 3 do 5 otopina poznatih koncentracija komponenata koje se određuju i koje su podvrgnute istom tretmanu kao i uzorak.

• Ova kriva, koja je najčešde prava linija za razblažene otopine, omogudava određivanje koncentracije cx nepoznatog uzorka.

18.5.2014.

15

Višekomponentna analiza

Načelo aditivnosti

• Prema Beerovom zakonu, apsorbansa je proporcionalna broju molekula koje apsorbiraju zračenje na datoj talasnoj dužini.

• Ovo načelo je istinito, ako je prisutna više od jedne apsorpcijske vrste.

• Sve višekomponentne kvantitativne metode temelje se na načelu da apsorbansa na bilo kojoj talasnoj dužini smjese jednaka je zbiru apsorbanse svake komponente u smjesi pri toj talasnoj dužini.

• Beerov zakon se može proširiti na uzorke koji sadrže nekoliko apsorpcijskih komponenti, pod uvjetom da ne postoji interakcija između komponenti. Individualne absorbanse, Ai, su aditivne. Za dvokomponentnu smjesu X i Y, ukupna absorbansa, AUKUPNO, je

AUKUPNO = AX + AY = εXbCX + εYbCY

• Generalno je absorbansa za spoj n komponente, Am, data kao

i

n

i

i

n

i

iUKUPNO bCAA

11

18.5.2014.

16

Osnovne komponente spektrometrijskih instrumenata

Instrumenti koji se koriste u spektrometriji sastoje se od nekoliko zajedničkih komponenti:

• izvora elektromagnetnog zračenja,

• selektora talasnih dužina,

• prostora za uzorak,

• detektora signala i

• signal procesora.

Izvori zračenja

• Pod izvorom elektromagnetnog zračenja se podrazumijeva svako tijelo koje ima sposobnost da, u ovisnosti o uslovima pod kojima se nalazi, emitira zračenje iz kompletnog elektromagnetnog spektra ili iz određenog njegovog dijela.

• Kada govorimo o izvorima elektromagnetnog zračenja, prije svega mislimo na tijela koja emitiraju zračenje iz optičkog dijela spektra (ultraljubičasto, vidljivo i infracrveno zračenje).

• Idealan izvor bi trebao davati zračenje stalnog intenziteta za sve talasne dužine uz dugotrajnu stabilnost i nizak šum.

18.5.2014.

17

• Prema tipu spektra koje emitiraju izvori zračenja se dijele na:

- izvore koji emitiraju kontinuirani spektar;

- izvore koji emitiraju diskontinuirani (linijski) spektar.

Emisijski spektar tipičnog kontinuiranog izvora zračenja (a) i tipičnog diskontinuiranog izvora zračenja (b)

Izvor zračenja Talasno područje Vrsta spektroskopije

ko

nti

nu

iran

i iz

vo

ri

H2 i D2 lampa 160–380 nm UV molekulska apsorpcija

volfram lampa 320–2400 nm VIS molekulska apsorpcija

Xe lučna lampa 200–1000 nm molekulska fluorescencija

Nernstov štapić 0.4–20 mm IC molekulska apsorpcija

Globar 1–40 mm IC molekulska apsorpcija

nikromska žica 0.75–20 mm IC molekulska apsorpcija

dis

ko

nti

nu

iran

i iz

vo

ri

lampa sa šupljom

katodom

UV/VIS atomska apsorpsija

atomska fluorescencija

Bezelektrodna

lampa uz pražnjenje

UV/VIS atomska apsorpsija

atomska fluorescencija

lampa sa Hg

parama

UV/VIS molekulska fluorescencija

laser UV/VIS/IC Atomska i molekulska

apsorpcija,

raspršenje i fluorescencija

Najčešći linijski i kontinuirani izvori elektromagnetskih zračenja

u spektrometriji

18.5.2014.

18

volframova lampa

deuterijumova lampa

ksenonova lampa

Nernstov štapid

18.5.2014.

19

Monohromatori

• Filteri imaju ograničenja, jer su dostupni samo za određene nominalne talasne dužine, zatim nije moguda neprekidna selekcija talasnih dužina, odnosno, filter se mora promijeniti između dva mjerenja na dvije različite talasne dužine.

• Alternativni pristup odabiru talasne dužine koji omogudava pregled neprekidne promjene talasnih dužina je monohromator.

• Monohromatori su veoma slične građe za UV, VIS i IC zračenje i sastavljeni su od sljededih osnovnih dijelova:

- pukotine (ulazna i izlazna)

- sočiva, ogledala (proizvode paralelan snop)

- prozori (ulazno-izlazni koji štite unutrašnje dijelove od prašine i hemikalija)

- disperzna sredstva (prizme ili rešetke)

- žarišna ravan.

18.5.2014.

20

Odabir talasne dužine pomodu monohromatora

• Zračenje koje iz izvora ulazi u monohromator kroz ulaznu pukotinu sakuplja se pomodu konkavnog ogledala sa koga odlazi paralelni snop zračenja do disperznog sistema (prizme ili difrakcione rešetke).

• Disperzno zračenje se potom usmjerava na drugo ogledalo koje fokusira zračenje na žarišnu ravan koja sadrži izlaznu pukotinu i kroz koju izlazi monohromatsko zračenje

Tipični monohromator sa prizmom (a) i

disperzija bijele svjetlosti na prizmi (b)

18.5.2014.

21

Monohromator sa rešetkom

Spremnici za uzorke

Spremnici za uzorke u molekulskoj spektrometriji su

ćelije ili kivete raznih oblika, najčešće pravougaone

kivete sa otvorom na vrhu, čije su dvije suprotne strane

prozirne a druge dvije mat

18.5.2014.

22

• Različite su veličine - od 1mm pa do 100 mm, međutim najviše se upotrebljavaju kivete širine 10 mm.

• Takođe, kivete se izrađuju od različitog materijala: plastike, stakla, kvarca.

• Od kojeg materijala de se koristiti neka kiveta prvenstveno ovisi o spektralnoj oblasti u kojoj se vrši mjerenje.

• U idealnom slučaju delija u kojoj se nalazi uzorak to jest kiveta za mjerenje trebala bi da bude napravljena od materijala koji je transparentan na svim talasnim dužinama odnosno da taj materijal ne apsorbira nikakvo zračenje.

Detektori zračenja

• Detektor je naprava koja pokazuje postojanje neke fizičke pojave (kazaljka vage, visina žive u termometru itd.).

• Osnovi načini na koji se može vrši detekcija (registrovanje) zračenja spektrometrijskim instrumentima su, vizuelno, fotografski, radiohemijski (korišdenjem toplotnog efekta zračenja), fotoelektrično i pomodu poluvodiča.

• Niti jedan od nabrojanih načina detekcije nema opštu primjenjivost niti značajnu prednost. Koji način detekcije de biti primijenjen ovisi o osjetljivosti u ispitivanoj oblasti spektra elektromagnetnog zračenja.

18.5.2014.

23

• Moderni detektori koriste osjetljive sonde za pretvaranje signala postojedeg fotona u lako mjerljiv električni signal.

• Idealni signal treba biti linearna funkcija elektromagnetnog zračenja.

• Fotografska detekcija

• Radiometrijska (toplinska) detekcija

• Fotoelektrična (fotoelektronska) detekcija

Fotoćelije

• Plinska ili vakuumska fotodelija (elektronska fotocijev) je zatvorena kvarcna cijev (ili staklena cijev sa kvarcnim prozorom) ispunjena nekim inertnim plinom pod malim pritiskom ili je u cijevi vakuum.

18.5.2014.

24

Fotomultiplikatori

• Fotomultiplikatori su vakuumski fotoelementi kod kojih dolazi do primarne fotostruje na račun sekundarne emisije.

Procesori signala

• Procesori signala su elektroničke naprave koje pojačavaju električni signal iz detektora.

• Električni signal koji je generiran od strane pretvarača šalje se na procesor signala koji ima pogodan oblik za analitičara kao što su skale, digitalna očitanja, monitori računara.

• Primjeri procesora signala uključuju analogne ili digitalne mjerače, snimače, računare opremljene sa digitalnim opremom.

18.5.2014.

25

• Signal procesor se može, takođe, koristi za kalibraciju detektora da bi se pojačao signal iz detektora, te za uklanjanje šuma filtriranjem ili matematičkim pretvaranjem signala.

• Procesorom se može vršiti diferenciranje, integriranje, logaritmiranje i druge matematičke operacije sa signalom.

Instrumenti (spektrometri) koji se koriste u UV/VIS oblasti spektra

Svaki spektrometar se sastoji iz tri osnovna dijela:

• izvora zračenja,

• disperznog sistema koji čine optički dio, i

• sistema za detekciju

Te komponente su obično povezane u jedinstvenu cjelinu i čine spektrometar za hemijsku analizu.

18.5.2014.

26

UV/VIS spektrometri

• UV/VIS spektrometri se svrstavaju u tri tipa (dizajna) instrumenta:

• fiksni spektrometar s jednim snopom svjetlosti i jednim prostorom za uzorke,

• skenirani spektrometar s dvostrukim snopom svjetlosti i dva prostora za uzorke za automatsko mjerenje apsorbanse i

• neskenirani spektrometar s nizom detektora za simultano mjerenje višestrukih talasnih dužina.

Šema spektrometra sa jednom zrakom

Šema double-beam spektrometara sa prostorno odvojenim zrakama

18.5.2014.

27

• Metode fluorescencije, gdje se zahtijeva selektor talasnih dužina prije i poslije uzorka a detektor se nalazi pod uglom od 900 u odnosu na uzorak

Šema instrumenta za mjerenje fluorescencije

• Kod spektrometara sa dvije vremenski odvojene zrake na optičkom putu zrake postavljen je čoper (sjekač), a njegova uloga je da dijeli zraku na dva dijela, jednu, koji prolazi kroz slijepu probu i drugu koji prolazi kroz uzorak.

• Obje zrake na kraju prolaze kroz detektor .

• Čoper se okrede pri tolikoj brzini da se mjerenja slijepe probe i uzorka naizmjenično ponavljaju više puta u sekundi. Na taj način dolazi do ispravke promjena u intenzitetu lampe (drift).

18.5.2014.

28

Šema double-beam spektrometara sa vremenski odvojenim zrakama

• U posljednje vrijeme zabilježen je napredak u izradi lampi i elektronike, što je dovelo do povedanja stabilnosti jednosnopnih spektrofotometara i samim tim preporoda ove konfiguracije, tako da oni sada pružaju vedu osjetljivost i jednostavniji su za upotrebu.

• Jedini nedostatak je drift, koji je za dva reda lošiji nego kod dvosnope konfiguracije.

18.5.2014.

29

IZGLED SPEKTARA

UV SPEKTROGRAM

VIS SPEKTROGRAM

18.5.2014.

30

IR (IC) - SPEKTROGRAM

SPEKTROGRAM - FLUORESCENCIJA

18.5.2014.

31

NMR - SPEKTROGRAM

GASNI HROMATOGRAM - SPEKTAR

18.5.2014.

32

MS - SPEKTROGRAM

HPLC - SPEKTROGRAM