1024201792.química biológica

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Captulo III

Consideraciones tericas y prcticas

de Qumica Biolgica

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Manual terico prctico de Qumica Orgnica y Biolgica

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PROTENAS

Funciones de las protenas. Niveles de organizacin en las protenas. Propiedades de

las protenas. Extraccin de protenas. Cuantificacin de protenas.

Los aminocidos son compuestos nitrogenados que tienen un papel

primordial en la formacin de los seres vivos, puesto que constituyen los

bloques fundamentales con los que se forman las protenas, en las cuales los

aminocidos se unen mediante enlaces peptdicos. Las protenas tienen un

peso molecular elevado y son especficas de la especie y del rgano.

Funciones de las protenas

La gran mayora de los procesos biolgicos depende de la presencia y/oactividad de alguna protena. stas pueden presentar diferentes actividades

biolgicas tales como: enzimtica, hormonal, de transporte (hemoglobina),

inmunolgica o de defensa (anticuerpos), de receptor celular (a los cuales se

fijan molculas capaces de desencadenar una respuesta determinada),

contrctil (actina y miosina, responsables de la contraccin muscular), de

reserva (ovoalbmina del huevo, casena de la leche y gliadina del trigo),

estructural (el colgeno, que integra fibras altamente resistentes en tejidos de

sostn), entre otras. Por todo esto, su estudio representa un enorme inters

para mltiples disciplinas biolgicas como gentica, biologa molecular,

biologa celular, bioqumica, fisiologa, medicina humana, veterinaria,

agronoma, zootecnia, botnica y zoologa, entre muchas otras.

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1. Niveles de organizacin en las protenas

Estructura primaria: Incluye a todos los enlaces covalentes entre los

aminocidos y se define por la secuencia de los aminocidos unidos por

enlaces peptdicos y la localizacin de los puentes disulfuro.

Estructura secundaria: ordenamiento espacial de la cadena de

aminocidos de la estructura primaria sin considerar las conformaciones de

sus cadenas laterales.Plegamiento bsico de la cadena debido a enlaces dehidrgeno entre grupos -CO- y -NH- del enlace peptdico: hlices, lminas y

giros

Estructura terciaria: Describe el plegamiento tridimensional de un

polipptido, incluidas sus cadenas laterales. Las estructuras estabilizantes

entre las cadenas laterales de los aminocidos, son: enlaces hidrgeno,

interaccin hidrofbica, electrosttica, puentes disulfuros, y enlaces ester

(entre aminocidos alejados).

Estructura cuaternaria: Asociacin de distintas subunidades, siendo

cada una un polipptido. Es el arreglo tridimensional de las subunidades que

forman las protenas. Esta estructura se estabiliza por puentes hidrgeno,

interaccin hidrofbica, electrosttica y puentes disulfuros.

Estructura Estructura Estructura Estructuraprimaria secundaria terciaria cuaternaria

Residuos de hlice Cadena polipeptdica Subunidades ensambladasaminocidos

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2. Propiedades de las protenas

2.1.Carga neta: Las protenas presentan propiedades cido-base. Los

grupos funcionales de las protenas se pueden ionizar dependiendo del

pH de la solucin donde se encuentren.

2.2.Solubilidad: A pH bajo o por encima del punto isoelctrico, la

protena tiene una carga neta positiva o negativa. Esto hace que sea

soluble. En el punto isoelctrico las protenas reaccionan unas con

otras formando agregados que tienden a precipitar. Segn la fuerza

inica cambia la solubilidad

2.3.Desnaturalizacin o prdida de la estructura o conformacin

nativa: Es un cambio parcial o total de la estructura nativa de la

protena (secundaria, terciaria ycuaternaria).Ocurre con la ruptura de puentes de azufre y de las interacciones no

covalentes. Los factores que producen la desnaturalizacin de las

protenas pueden ser fsicos (temperatura) o qumicos (pHs extremos,

detergentes, compuestos que forman puentes de hidrgeno o que

participan en interacciones hidrofbicas)

3. Aislamiento, purificacin y caracterizacin de protenas

La mayor parte de las investigaciones bioqumicas requieren de la

purificacin, al menos parcial, de las sustancias objeto de estudio. Los

primeros pasos para encarar el estudio de una protena involucran su

aislamiento o extraccina partir de una fuente determinada (animal, vegetal,

fngica, bacteriana, etc.) y su purificacin, al menos parcial. Esto requiere

generalmente un gran esfuerzo ya que una clula contiene miles de sustancias

diferentes y la molcula que buscamos puede ser extremadamente inestable o

encontrarse a concentraciones muy bajas. Sin embargo, se dispone de

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diferentes mtodos adecuados para cada caso particular y para cada etapa de

este proceso, tales como, lisis celular, destruccin mecnica o tcnicas de

congelacin-descongelacin, a fin de romper las clulas y extraer las

protenas.

3.1. Mtodos de ruptura celular y extraccin de protenas

La extraccin de protenas es considerada a menudo slo como un paso

preliminar para una subsiguiente purificacin, pero de hecho constituye un

paso crucial para su estudio, ya que el procedimiento de extraccin determina

la naturaleza y la estabilidad de las protenas extradas, lo que a su vez

determina la calidad y la validez de los resultados.

En general, el primer paso consiste en la obtencin de un homogenato,

que implica la destruccin de la clula y el pasaje de las protenas a solucin o

suspensin. Esto puede llevarse a cabo de diferentes maneras, entre las que se

puede citar:

A) Homogenizacin mecnica: Puede utilizarse un homogeneizador de

vidrio, mortero, licuadora, a veces, con la ayuda de abrasivos como almina,

arena o bolitas de vidrio y con un solvente adecuado, isotnico (sacarosa 0,25

M, NaCl 0,9%, KCl 0,15 M) o ligeramente hipertnico, en una solucin

tampn (buffer) adecuado para controlar el pH.

B) Homogeneizacin snica: El choque de ondas snicas o ultrasnicas

provoca cambios de presin de miles de atmsferas, que rompen la pared

celular. Se usa generalmente para bacterias y levaduras y, a veces, para

determinados tejidos animales (bazo, rin, eritrocitos).

C) Desintegracin trmicas: El congelamiento y descongelamiento rpido y

repetido suele usarse para desintegrar bacterias y eritrocitos. Por congelacin

se forman cristales de hielo intracelulares, destruyendo la estructura. Al

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descongelarse, las clulas se destruyen osmticamente debido a la presencia

de agua pura y se libera su contenido.

D) Homogeneizacin por deshidratacin: Se basa en la precipitacin de

protenas por solventes orgnicos (etanol, acetona, etc.). En la preparacin

del "polvo acetnico" se utiliza acetona en fro.

3.2 Mtodos de extraccin de protenas (tejidos vegetales)

Para la extraccin de protenas a partir de un homogenato de tejidos

vegetales se pueden citar tres procedimientos generales:

A) Extraccin con soluciones tampn: El uso de tampones de baja fuerza

inica nos permite recuperar las protenas citoplsmicas solubles y las de los

espacios intercelulares, mientras que con alta fuerza inica tambin extraemos

las protenas ligadas a la pared celular.

B) Extraccin con detergentes: La extraccin con dodecil sulfato de sodio

(SDS) permite la extraccin de protenas solubles y de las ligadas a la

membrana celular en condiciones desnaturalizantes.

C) Precipitacin directa: Consiste en precipitar directamente la protena total

del tejido, triturando ste en presencia de cido tricloroactico (ATC) fro al

10%. Esta ltima tcnica se utiliza para comparar patrones proteicos entre

varias muestras analizadas por 2DPAGE (electroforesis bidimensional en

geles de poliacrilamida). Sin embargo, la presencia de ATC desnaturaliza

irreversiblemente las protenas, por lo que no puede ser utilizado cuando se

efectan estudios de actividad enzimtica o de otro tipo.

Para evitar la desnaturalizacin es necesario operar a bajas temperaturas

y a veces es conveniente la adicin de inhibidores de enzimas proteolticas

(proteasas) al buffer de extraccin. Algunos agentes estabilizadores como el

dimetilsulfxido (DMSO) al 10%, o glicerol al 25% protegen las protenas

contra la accin proteoltica. La adicin de agentes reductores como el

ditiotreitol (DTT) 5 mM, L-cisteina 8 mM, o mercaptoetanol 3mM,

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protege las protenas de la oxidacin, pero se debe tener cuidado porque estos

agentes, en algunos casos pueden activar a las proteasas.

3.3Mtodos de purificacin y caracterizacin

Por otro lado, para separar o purificar una protenaa partir de una

mezcla de protenas se aplican habitualmente mtodos cromatogrficosque

aprovechan diferentes propiedades de la molcula proteica, como su masa

molecular (en la cromatografa de filtracin por gel), su carga (en la

cromatografa de intercambio inico) o su afinidad por determinados grupos

qumicos (cromatografa de afinidad). El anlisis de la protena o protenas

aisladas, como la determinacin de su peso molecular o la existencia de

subunidades (estructura cuaternaria), pI (punto isoelctrico), se lleva a cabo

generalmente mediante tcnicas electroforticas en condiciones nativas o

desnaturalizantes e isoelectroenfoque. El anlisis de la estructura de una

protena se hace mediante RMN, dicrosmo cicular, espectrofluorimetra,

secuenciacin, etc. Si la protena es una enzima, se realiza el anlisis de su

actividad biolgica y estudio de su comportamiento cintico.

Tcnicas utilizadas en el estudio de protenas

Purificacin Cuantificacin Anlisis deestructura

Anlisis deactividad

Fraccionamientosubcelular porcentrifugacindiferencial

Espectrofotometra Espectrofluorimetra Actividadenzimtica

Precipitacinsalina

Espectrofluorimetra Dicroismo circular Anlisis deradioligandos

Dilisis ELISA RMN ComplejosAntgenoAnticuerpo

Cromatografa defiltracin por gel,intercambioinico,afinidad

MALDI-MS

Electroforesis en

geles

Secuenciacin de

aminocidosisoelectroenfoque Difraccin de RX

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3.4

Cuantificacin de protenasPor ltimo, muchas veces es indispensable un mtodo que permita

medir la actividad biolgica de la protena que intentamos aislar y purificar

(por ejemplo, una actividad enzimtica) y en todo momento se requiere de un

mtodo adecuado para poder cuantificar el contenido proteico del sistema en

estudio. Los criterios importantes para la eleccin de un mtodo adecuado

para poder cuantificar el contenido proteico del sistema en estudio son:a) Especificidad

b) Bajo umbral de deteccin

c) Facilidad para ponerla en prctica

d) Rapidez

e) Costo accesible

f) Facilidad para integrarla a un protocolo de purificacinEntre los mtodos ms usados citaremos tres:

Absorbancia a 280 nm

Aunque ninguno de los 20 aminocidos hallados en las protenas

absorbe luz en la regin visible del espectro electromagntico, tres de ellos

(tirosina, triptofano y fenilalanina) absorben significativamente en la regindel UV cercano a los 280 nm. Dado que las protenas poseen restos de

aminocidos aromticos, las medidas de absorcin a 280 nm constituyen un

mtodo rpido para la determinacin del contenido de protena de una

solucin. Este mtodo es usado para determinar la localizacin de protenas en

una o ms fracciones procedentes de un proceso de separacin

cromatogrfica.

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Protenas (mg/ml) = 1.55 A280 0.76A260

Mtodo de Bradford- Fijacin no Covalente de Colorante

El colorante puede existir en diferentes formas inicas en una solucin

cida. La forma aninica (azul) del Coomassie Blue G250 (max=590 nm), se

fija a las protenas por interacciones electrostticas con los grupos catinicos.

El colorante interacciona en forma preferencial con los grupos funcionales de

arginina y lisina. El mismo colorante tiene una forma catinica roja (max=470

nm) y otra verde (

mx=650 nm). El complejo es estable por una hora.

Mtodo de Lowry

Es un mtodo espectrofotomtrico de valoracin cuantitativa de

protenas. Se basa en la reaccin de las protenas con el reactivo de Folin-

Ciocalteau, que consiste en una solucin de tungstato sdico y molibdato

sdico en cido fosfrico y cido clorhdrico. A una adecuada dilucin deprotenas se aade el Reactivo de Folin que forma un complejo coloreado con

ellas, siendo la intensidad de color resultante proporcional a la concentracin

de protenas, segn la ley de Lambert-Beer (A= .L.C).

Fundamento: La reaccin entre las protenas y los reactivos empleados

por este mtodo consta de dos etapas:

1) Los iones Cu

2+

, en medio alcalino, se unen a las protenas en lostomos de nitrgeno de los enlaces peptdicos, formando complejos. Estos

complejos Cu2+-protena, de un color azul plido, provocan el desdoblamiento de

la estructura tridimensional de la protena, exponiendo hacia la superficie a los

residuos fenoles de tirosina, que van a participar en la segunda etapa de la

reaccin. El Cu2+se mantiene en solucin alcalina en forma de su complejo con

tartrato.

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2) Tambin en medio bsico, el cobre acta como catalizador de la

reduccin del reactivo de Folin-Ciocalteau por parte de los grupos fenlicos de

los residuos de tirosina, presentes en la mayora de las protenas. El principal

constituyente del reactivo de Folin-Ciocalteau es el cido fosfomolibdotngstico,

de color amarillo, que al ser reducido por los residuos fenlicos da lugar a un

complejo de color azul intenso que se lee en espectrofotmetro a una longitud de

onda () de 750 nanmetros (nm). La intensidad del color depende de la

cantidad de estos aminocidos aromticos presentes en las protenas y ser

proporcional a la concentracin de protenas en la solucin.

Reaccin entre la protena y los reactivos de Cu2+ y de FolinCada mtodo presenta sus ventajas y desventajas las cuales se resumen

en la tabla. La eleccin de uno u otro mtodo depender del objetivo final que

se pretende llegar en el estudio de protenas.

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Ventajas DesventajasGrupos

Aromticos(280 nm)

-Gran espectro de sensibilidad-Mtodo no destructivo

-Interfieren cidosnucleicos y otroscompuestos aromticos.

Unin Peptdica(205 nm)

-Protenas con y sin gruposaromticos-Mtodo no destructivo

-Deteccin de otroscompuestos qumicos.-Interfieren la mayorade los tampn.

Mtodo deLowry

(745-750 nm)

-10 veces ms sensible que UV(5 a 100 g)-Aconsejable para mezclascomplejas (tisulares)

-Interferencia de variassustancias.-Inestabilidad de losreactivos-Desviacin de lalinealidad a altasconcentraciones

Mtodo deBradford(595 nm)

-5 veces ms sensible que el deLowry-Pequeas interferencias secompensan con el control

-La sensibilidaddepende del contenidode lisinas y argininas.-El complejo dejarestos azules en lascubetas.

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Experimentacin

Protenas

Objetivos

Extraer, concentrar y purificar protenas de origen animal y vegetal.

Estudiar la propiedad amortiguadora del pH de las protenas.

Determinar el punto isoelctrico de una protena.

Estudiar el efecto de solventes orgnicos sobre las protenas.

Ensayar e interpretar los procesos de desnaturalizacin reversible eirreversible de las protenas.

Emplear un mtodo colorimtrico para el anlisis cuantitativo de las

protenas presentes en una muestra desconocida.

A. Extraccin de protenas solubles de hojas de trtago (Ricinus

communis).Tcnica: pesar aproximadamente 100 g de hojas de trtago. Lavar el

material vegetal con agua corriente y enjuagar con agua destilada. Cortar en

trozos pequeos con tijeras y homogeneizar en una procesadora con 100 ml de

buffer fosfato de sodio 50 mM pH 7,5 conteniendo 2-mercaptoetanol 1 mM

(buffer de extraccin) y rotular como Extracto Crudo (M0). Filtrar el

extracto crudo por doble gasa y centrifugar el lquido filtrado a una velocidadde 2000 rpm durante 15 minutos. Recuperar el sobrenadante y medir su

volumen. Rotular como Extracto Centrifugado (M1).

B. Tcnica de concentracin de extracto de protenas solubles

El extracto centrifugado se concentra mediante precipitacin con

sulfato de amonio slido hasta un 100 % de saturacin (para 100 ml desolucin al 100 % se debe agregar 70,6 g de (NH4)2SO4). Se debe medir el

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volumen del extracto que se va a concentrar y calcular la cantidad de sal

necesaria para alcanzar una saturacin del 100 %. Pesar el sulfato de amonio y

agregarlo lentamente y con agitacin para lograr una buena precipitacin de

las protenas. Posteriormente centrifugar a una velocidad de 2000 rpm durante

15 minutos. Descartar el lquido sobrenadante y resuspender el precipitado en

un pequeo volumen de buffer acetato de sodio 10 mM pH 5,5 con 2-

mercaptoetanol 1 mM (tampn de dilisis).

A fin de eliminar el (NH4)2SO4, que puede alterar irreversiblemente a

algunas protenas, se debe someter el extracto concentrado a un proceso de

dilisis. Para ello, se carga el extracto en una membrana de dilisis y se dializa

contra 500 ml del tampn de dilisis durante dos horas, renovando el lquido

de dilisis a los 60 minutos. Durante este proceso las molculas salinas de

menor tamao atraviesan los poros de la membrana por difusin simple y las

protenas, de mayor tamao, son retenidas. Rotular como Extracto

concentrado (M2).

Advertencia: el 2-mercaptoetanol es un producto combustible y

sumamente txico por ingestin, inhalacin o contacto con la piel. Irrita

ojos, piel y vas respiratorias.

C. Propiedad amortiguadora de las protenas: titulacin con cido.

Reactivos:

- Acido clorhdrico 0,01 N

- Solucin indicadora de Rojo de Metilo. Vira de rojo (pH 4,2) a amarillo (pH

6,3).

- Suero sanguneo.

- Suero desproteinizado : A una muestra de suero sanguneo se la somete a

calentamiento (100C durante 1 a 2 minutos). Posteriormente se filtra o

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centrifuga 5 min a 2000 rpm. Se descarta el precipitado. El sobrenadante

constituye el suero desproteinizado

Procedimiento:

Titular una fraccin alcuota del suero y una del suero

desproteinizado, ambos diluidos 1/5 con agua destilada. La titulacin se

realiza en presencia de 10 gotas del indicador rojo de metilo que al mezclar

con el suero se torna de color amarillo,.agregando HCl 0,01 N hasta cambio

de color a rosado plido. Se mide el volumen de HCl gastados.

D. Solubilidad de la casena a diferentes pH

Reactivos:

- Acido actico 1 N.

- Solucin de casena en acetato de sodio 0,1 N.

Procedimiento:

- Rotular nueve tubos de 1 a 9. En el tubo uno colocar 3,2 ml de cido

actico 1 N y 6,8 ml de agua destilada, mezclar.

- Agregar 5 ml de agua destilada a los 8 tubos restantes.

- Tomar 5 ml de la solucin del tubo 1 y verter en el tubo 2. Mezclar y

repetir la operacin hasta el ltimo tubo. Descartar los 5 ml finales.

- Medir el pH a cada solucin (rango de pH esperado 3,5-5,9).

- Agregar 1 ml de casena a cada tubo de la escala de pH y mezclar

inmediatamente por agitacin.

- Observar la solubilidad de la casena a distintos pH a tiempo cero (T0) y a

los 30 minutos (T30) de contacto.

E. Precipitacin y desnaturalizacin de protenas.

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Reactivos:

- Etanol de 95

- Acetona

- Hidrxido de sodio conc.

- HCl conc.

- Solucin de ovoalbmina: separar la clara de huevo, medir su volumen y

batir durante unos minutos, mezclar con cinco volmenes de agua destilada y

filtrar la mezcla a travs de doble gasa.

Procedimiento:

Precipitacin de ovoalbmina con solventes orgnicos: agregar

volmenes iguales de alcohol y acetona a la solucin de ovoalbmina.

Coagulacin de ovoalbmina: en una serie de tubos numerados del 1 al 4,

colocar en cada uno 2 ml de solucin de ovoalbmina y proceder a:

Tubo 1: calentar.

Tubo 2: agregar unas gotas de cido clorhdrico concentrado (HCl).

Tubo 3: agregar solucin concentrada de hidrxido de sodio (NaOH).

Tubo 4: usar como control.

Explicar el fenmeno observado.

F. Determinacin cuantitativa de protenas.

Mtodo de Lowry.

Reactivos:

1- NaOH 0,5 N

2- Reactivo 1: Se prepara en el momento de usar. Cada 10 ml de Na2CO32%

se agrega 0,1 ml de CuSO4.5 H2O 1% y 0,1 ml de Tartrato de Na y K 2,7 %.

3 Reactivo de Folin-Ciocalteau. Se emplea una dilucin .

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El mtodo como en todo mtodo cuantitativo colorimtrico requiere de

la realizacin de una curva de calibracin, tambin llamada curva estndar,

para lo cual se emplea una solucin patrn de albmina srica bovina (BSA)

de 0,15 mg/ml.

Tcnica: Rotular 8 tubos y agregar la solucin estndar o las muestras y

los reactivos, segn el siguiente protocolo:

Tubo

BSA:

0,15 mg/ml

(ml)

H2O

(ml)

NaOH

(ml)

R1*

(ml)

Folin**

(ml)

DO

750 nm

1(Blanco) ------- 0,20 0,4 2 0,2

2(7,5 g) 0,05 0,15

3(15 g) 0,10 0,10

4(22,5 g) 0,15 0,05

5(30 g) 0,20 -------

M0

M1

M2

* Mezclar y esperar 10 minutos antes de agregar el Reactivo de Folin

** Mezclar y leer exactamente a los 30 minutos la DO a 750 nm.

Curva de Calibracin: graficar en papel milimetrado los valores de

DO en funcin de los de g de BSA.

Valoracin de las muestras desconocidas: Para determinar la cantidad

de protenas presentes en las muestras problemas se debe interpolar sus valores a

partir de las DO determinadas. En base al contenido de protenas determinadas

por este mtodo y conociendo los volmenes y diluciones empleados para la

determinacin, se puede calcular la concentracin de protenas de las muestras

problema en mg/ml.

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ENZIMAS

Definicin de enzimas. Nomenclatura y clasificacin. Actividad enzimtica.

Velocidad de reaccin. Cintica enzimtica.

Las reacciones qumicas de los sistemas biolgicos raramente ocurren

en ausencia de un catalizador. Estos catalizadores se denominan enzimas y

son casi en su totalidad de naturaleza proteica, con la excepcin de un

pequeo grupo de molculas de RNA cataltico (ribozimas). Las funciones

vitales de cualquier clula seran imposibles de mantener si las reacciones que

ocurren en ellas fueran extremadamente lentas. Adems de incrementar la

velocidad de las reacciones, las enzimas exhiben una elevada especificidad y

en algunos casos pueden ser reguladas por diferentes metabolitos que

aumentan o disminuyen su actividad.

Las enzimas, como todos los catalizadores, son efectivas en pequeas

cantidades, no sufren modificaciones qumicas irreversibles durante la

catlisis ni afectan el equilibrio de las reacciones que catalizan. Aunque los

estadios inicial y final de una reaccin son los mismos con y sin un

catalizador, su presencia hace que se llegue al equilibrio mucho ms

rpidamente, es decir, slo modifican la velocidad de la reaccin.

Por otro lado, debido a su naturaleza proteica, las enzimas comparten

caractersticas con las protenas no enzimticas y difieren de los catalizadores

inorgnicos en que:

Son termolbiles y su actividad depende en la mayora de los casos del pH

del medio.

El reconocimiento de la enzima por su sustrato es altamente especfico.

Tienen gran eficiencia, es decir, transforman un gran nmero de molculas

de sustrato por unidad de tiempo.

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Estn sujetas a una gran variedad de controles celulares, genticos y

alostricos.

Nomenclatura y clasificacin de las enzimas

Muchas enzimas han sido designadas aadiendo el sufijo -asa al

nombre del sustrato, es decir, la molcula sobre la cual ejerce su actividad

cataltica. Por ejemplo, la ureasa cataliza la hidrlisis de la urea y la arginasa

cataliza la hidrlisis de la arginina. Otras enzimas han recibido su nombre en

funcin del tipo de reaccin que catalizan; as la Gliceraldehdo-3-fosfato-

deshidrogenasa cataliza la deshidrogenacin (oxidacin) del Gliceraldehdo-

3-fosfato a 3-fosfoglicerato. Incluso tienen nombres especficos que no dan

informacin alguna del sustrato que transforman o de la reaccin que

catalizan, como por ejemplo la tripsina (enzima proteoltica).

No obstante, existe una clasificacin sistemtica de las enzimas que

las divide en seis grandes grupos, cada uno de los cuales se subdivide a su

vez en clases:

1: Oxido-reductasas (reacciones de oxido-reduccin)

2: Transferasas (transfieren grupos funcionales)

3: Hidrolasas (reacciones de hidrlisis),

4: Liasas (reacciones de adicin a los dobles enlaces)

5: Isomerasas (reacciones de isomerizacin)

6: Ligasas (formacin de enlaces con consumo de ATP).

Actividad enzimtica

El estudio o investigacin de una actividad enzimtica involucra dos

aspectos: uno cualitativo y otro cuantitativo.

Anlisis cualitativo:

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Consiste en poner de manifiesto la presencia de la enzima en estudio,

mediante la observacin de la transformacin del sustrato de la enzima en un

producto dado, mediante reacciones que involucren un cambio de color,

aparicin de gas, cambio de pH, variacin de viscosidad o de otro parmetro

fsico, etc.

Anlisis cuantitativo:

Consiste en determinar la cantidad de enzima presente en un sistema;

para ello se recurre a la medida de la velocidad de la reaccin catalizada por la

enzima que se ensaya. Esto es posible debido que, en condiciones adecuadas,

la velocidad de una reaccin enzimtica es directamente proporcional a la

cantidad de enzima presente.

Velocidad de reaccin:

Se entiende por velocidad de una reaccin qumica a la variacin de la

concentracin de reactivos o de productos en funcin del tiempo. As, la

velocidad de una reaccin enzimtica puede medirse como la velocidad de

utilizacin del sustrato o bien como la velocidad de formacin de uno de los

productos. De esta manera, se puede expresar la cantidad de enzima en

trminos de unidades enzimticas, entendindose por Unidad de Enzimaa la

cantidad de enzima que cataliza la transformacin de un micromol de

sustrato por minuto bajo condiciones definidas de temperatura y pH .

Cuando la actividad de una enzima se relaciona con el contenido

proteico de la preparacin enzimtica, se la denomina Actividad Especficay

se expresa como el nmero de unidades de enzima por miligramo de protena

(UE/mg). La actividad especfica de una enzima indica el grado de pureza de

la preparacin enzimtica y es mxima cuando la enzima se encuentra pura.

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200

Otra unidad empleada para expresar la actividad de una enzima,

especialmente en los campos de medicina y bioqumica, es el Katal(kat). Un

katal es la cantidad de enzima que cataliza la transformacin de 1 mol de

sustrato por segundo. Esta unidad introducida recientemente por la Unin

Internacional de Bioqumica: 1 kat equivale a 60 x 106 UE. Debido a que se

trata de una unidad muy grande, frecuentemente se utilizan submltiplos

como microkatal (kat) y nanokatal (nkat). Tambin suele emplearse la

Actividad Molecular (nmero de recambio): es el nmero de molculas de

sustrato transformadas por minuto por una molcula de enzima. Se calcula

dividiendo la velocidad mxima de la enzima por el peso molecular; es una

caracterstica de las enzimas individuales y no refleja la pureza de la

preparacin.

Cintica enzimtica

La cintica enzimtica estudia la velocidad de las reacciones catalizadas

por enzimas. Los estudios cinticos proporcionan informacin directa acerca

del mecanismo de la reaccin cataltica y de la especificidad de la enzima. La

velocidad de una reaccin enzimtica puede determinarse midiendo la

aparicin de los productos o bien la desaparicin de los reactivos como

funcin del tiempo. Al medir la aparicin de producto (o la desaparicin del

sustrato) en funcin del tiempo se obtiene la llamada curva de avance o de

progreso de la reaccin (Figura 1), o simplemente, la cintica de la reaccin.

A medida que la reaccin transcurre, la velocidad de aparicin del

producto (pendiente de la curva en cada punto) va disminuyendo porque se va

consumiendo el sustrato de la reaccin.

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21/72


201

Para que los valores determinados reflejen la cantidad de enzima

presente en la preparacin siempre se procede a medir lavelocidad inicial de

la reaccin (v0) que es igual a la pendiente de la curva de avance a tiempo

cero. As, la medida de v0se realiza antes de que se consuma el 10% del total

del sustrato, entonces puede considerarse la concentracin molar del sustrato

([S]) como esencialmente constante a lo largo del ensayo. En estas

condiciones no es necesario considerar la reaccin inversa ya que la cantidad

de producto formada es tan pequea que la reaccin inversa apenas ocurre.

En la prctica se debe determinar el rango de tiempo en el que la

variacin de la concentracin del producto formado (o de sustrato consumido)

es directamente proporcional al tiempo de la reaccin. Por ejemplo, en la

E+ S P+E

Curva de progreso de la reaccin

0 100 200 300 400 500 6000

2

4

6

8

10

[S]O= 1 KMvo

[P]Mm

TIEMPO (min)

Concentra

cindeProducto

Tiempo (minutos)

Valores medidos -- Velocidad inicial (v0)

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202

Figura 1 se observa una respuesta lineal hasta los 50 minutos de incubacin;

en consecuencia, para medir la actividad de esa enzima basta con incubar

como mximo durante tiempos inferiores a 50 minutos (por ejemplo 30 40

minutos) y de esta manera estamos seguros de medir actividades

correspondientes a la velocidad inicial de la enzima.

Factores que afectan la velocidad de una reaccin catalizada por enzimas

La velocidad de las reacciones enzimticas es afectada por una serie de

factores tales como pH, temperatura, concentracin de enzima, concentracin

de sustrato y presencia de molculas efectoras (activadores o inhibidores de la

enzima).

La determinacin de la actividad enzimtica se realiza generalmente en

las condiciones ptimas de pH y temperatura, en presencia de cofactores y en

concentraciones saturantes de sustrato. En estas condiciones, la velocidad de

reaccin observada es la velocidad mxima (Vmax). Sin embargo, dichas

condiciones deben ser cambiadas cuando se quiere estudiar el efecto de

alguna de estas variables (pH, temperatura, concentracin de sustrato, etc.) o

de otros factores (inhibidores o activadores) sobre la velocidad de la reaccin.

Efecto de la concentracin de sustrato sobre la velocidad de la reaccin.

La concentracin del sustrato es uno de los principales factores que

determinan la velocidad de una reaccin enzimtica. La relacin entre la

concentracin de sustrato y la velocidad de la reaccin enzimtica puede

expresarse de manera cuantitativa a travs de la ecuacin de Michaelis-

Menten.

V= Vmax. [S] / Km+[S]

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203

Km representa:

1. Constante de equilbrio de disociacin del complejo ES

2. Medida inversa de la afinidad de la enzima por el sustrato

3. Concentracin de sustrato para la que la velocidad se hace igual a la mitad

de La mxima (V 0.5)

4. Se define para un dado complejo enzima-sustrato

5. Se mide en unidades de concentracin

Considerando la recproca de la ecuacin de Michaelis Menten obtenemos la

ecuacin de Lineaweaver Burk

Km

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204

Experimentacin

ENZIMASObjetivos

Determinar la actividad de una enzima hidroltica (invertasa cida soluble

deRicinus communis) mediante mtodos espectrofotomtricos.

Determinar la velocidad inicial de la enzima (efecto del tiempo de

incubacin). Determinacin del pH ptimo de enzima mediante el ensayo del efecto del

pH sobre la actividad de enzima.

Determinar la KMy la Vmaxde la enzime mediante el estudiao del efecto de

la concentracin de sustrato.

Anlisis cuantitativo de la actividad enzimticaInvertasas:

Son hidrolasas involucradas en el metabolismo de los hidratos de

carbono de especies vegetales. Tambin se las denomina -D

fructofuranosidasa pues hidrolizan el enlace glicosdico entre la fructosa y la

glucosa del disacrido sacarosa. La sacarosa es un azcar no reductor pues no

tiene grupos carbonilos libres. La hidrlisis enzimtica del disacrido originaglucosa y fructosa, ambos azcares reductores. Por lo tanto, la actividad de

esta enzima se puede medir mediante la aparicin del poder reductor de

la glucosa y fructosa originadas, segn la siguiente reaccin:

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205

INVERTASA

SACAROSA GLUCOSA + FRUCTOSA

No Reductor Reductores

Las invertasas atacan al disacrido desde el residuo de fructosa y

aunque su principal sustrato es la sacarosa (Glu-Fru), algunas tambin

hidrolizan otros oligosacridos -D fructsidos como la rafinosa (Gal-Glu-

Fru) y la estaquiosa (Gal-Gal-Glu-Fru), aunque en menor proporcin.

A. Determinacin de azcares reductores por el Mtodo de Somogyi-

Nelson

Fundamento:

Los azcares con un grupo aldehdo o cetona libre son capaces de

reducir los iones Cu++del Reactivo alcalino de Somogyi, en iones Cu+, que al

reaccionar con el cido arseno-molbdico del Reactivo de Nelson producen

compuestos coloreados que se leen fotocolorimtricamente a 520 nm.

INVERTASA

ESTAQUIOSA GAL-GAL-GLU + FRUCTOSA


INVERTASA

RAFINOSA GAL-GLU + FRUCTOSA


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206

Reactivos:

a) Reactivo cprico de Somogyi. Se prepara en el momento de usar

mezclando 1 volumen de la solucin A con 9 volmenes de la solucin B:

Solucin A: CuSO4.5 H2O al 10 %.

Solucin B: Disolver 28 g. de Na2HPO4anhidro en 700 ml de agua destilada.

Agregar 40 g de Tartrato de Sodio y Potasio. 4 H2O. Cuando la disolucin es

completa agregar 100 ml de NaOH 1N y 120 g de Na2SO4anhidro. Llevar a

900 ml con agua destilada y dejar en reposo durante 48 horas, filtrar y guardar

en frasco color caramelo.

b) Reactivo de Nelson. Disolver 25 g de molibdato de amonio. 4 H2O en 450

ml de agua destilada, aadir 21 ml de H2SO4 concentrado. Luego de mezclar

con cuidado (reaccin exotrmica) y agregar 3 g de arseniato disdico. 7 H2O.

Dejar en reposo durante 48 horas a temperatura ambiente, filtrar y guardar en

frasco color caramelo.

c) Glucosa 1 mM, como solucin estndar.

Procedimiento: cargar tubos con cantidades crecientes de la solucin de

glucosa, entre 0,05 y 0,30 moles, para realizar la curva estndar y diluciones

de las muestras problema centrifugadas para su valoracin. Completar con

agua destilada hasta 0,5 ml, agregar 0,5 ml del Reactivo de Somogyi y

calentar en BM hirviente durante 15 minutos. Enfriar, agregar 0,5 ml del

Reactivo de Nelson y 1 ml de agua destilada. Mezclar y leer a 520 nm.

Procesar simultneamente un Blanco de Reactivos. Graficar la DO leda en

funcin de moles de glucosa y determinar la concentracin de azcares

reductores de las muestras problema.

Sensibilidad del Mtodo: 0,05-0,3 moles de azcares reductores.

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207

Curva estndar de azcares reductores (Somogyi-Nelson)

Solucin estndar: glucosa 1mM (1 mol/ml).

Tubo Glucosa

(ml)

H2O

(ml)

Reactivo

Somogyi

(ml)

Reactivo

Nelson

(ml)

H2O

(ml)

0 0 0,50 0,50 100 0,50 1 Leer

1 0,10 0,40 C DO

2 0,15 0,35 15 520

3 0,20 0,30 min. nm

4 0,25 0,25

5 0,30 0,20

B. Determinacin del efecto del tiempo de incubacin sobre la

actividad de la enzima

Tubo Buff. 0,2M pH 5,5

Sac. 0,3 M(ml)

H2O d.(ml)

Enzima(ml)

Tiempo(minutos)

T0 0,2 ml 0,1 ------- 0,2 0T5 0,2 ml 0,1 ml ------- 0,2 5T10 0,2 ml 0,1 ml ------- 0,2 10T20 0,2 ml 0,1 ml ------- 0,2 20

Cont.Sac T

0

0,2 ml 0,1 ml 0,2 ------- 0

Cont.Sac.T5

0,2 ml 0,1 ml 0,2 ------- 5

Cont.Sac T10

0,2 ml 0,1 ml 0,2 ------- 10

Cont.Sac T20

0,2 ml 0,1 ml 0,2 ------- 20

Cont. Ez. 0,2 ml ------- 0,1 0,2 20

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208

1- Cargar los tubos de acuerdo al esquema, iniciar la reaccin

con el agregado de la enzima, incubar en bao termostatizado a 37 C el

tiempo indicado en cada caso y finalizar la reaccin mediante elagregado de 0,5 ml del Reactivo de Somogyi.

2- En cada tubo determinar los azcares reductores que se

formaron durante la reaccin enzimtica segn el mtodo de Somogyi-

Nelson (medir la DO 520 nm).

3- Estimar la DO que corresponde a los nuevos azcares

reductores formados (DO = DO mezcla DO Cenz. DO Csust.).

4- Transformar los datos de DO en micromoles de azcares

reductores usando una curva estndar del mtodo empleado.

5- Transformar los micromoles de azcares reductores en

micromoles de sacarosa hidrolizado (dividiendo en 2).

6- Calcular y expresar la velocidad inicial para cada tiempo

como micromoles de sacarosa hidrolizados por minuto (dividiendo en

los minutos que se incub cada mezccla).

7- Confeccionar en papel milimetrado un grfico de v en

funcin de tiempo.

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209

C. Determinacin del efecto de la concentracin de sustrato sobrela actividad de la enzima

Tubo Sac0,025

M

Sac0,05M

Sac0,10M

Sac0,20M

Sac0,30M

Buff.pH 5,5 H2Od. Enzima

0

(C.Ez)

------- ------- ------- ------- ------- 0,2 ml 0,1 ml 0,2 ml

5 mM 0,1 ml ------- ------- ------- ------- 0,2 ml ------- 0,2 ml

C. 5mM

0,1 ml ------- ------- ------- ------- 0,2 ml 0,2 ml -------

10mM

------- 0,1 ml ------- ------- ------- 0,2 ml ------- 0,2 ml

C. 10mM

------- 0,1 ml ------- ------- ------- 0,2 ml 0,2 ml -------

20

mM

------- ------- 0,1 ml ------- ------- 0,2 ml ------- 0,2 ml

C. 20mM

------- ------- 0,1 ml ------- ------- 0,2 ml 0,2 ml -------

40mM

------- ------- ------- 0,1 ml ------- 0,2 ml ------- 0,2 ml

C 40mM

------- ------- ------- 0,1 ml ------- 0,2 ml 0,2 ml -------

60

mM

------- ------- ------- ------- 0,1 ml 0,2 ml ------- 0,2 ml

C. 60mM

------- ------- ------- ------- 0,1 ml 0,2 ml 0,2 ml -------


con el agregado de la enzima, incubar en bao termostatizado a 37 C

durante 15 minutos y finalizar la reaccin mediante el agregado de 0,5

ml del Reactivo de Somogyi.

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Nelson (medir la DO 520 nm).3- Estimar la DO que corresponde a los nuevos azcares






6- Calcular y expresar la velocidad inicial para cada

concentracin de sustrato como micromoles de sacarosa hidrolizados

por minuto (dividiendo en 15 minutos).


funcin de concentracin de sustrato.

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211

D. Determinacin del efecto del pH sobre la actividad enzimtica

Tubo Buff.pH 2,5

Buff.pH 3,5

Buff.pH 4,5

Buff.pH 5,5

Buff.pH 6,5

Sac.0,3 M

H2Od.

Ez.

2,5 0,2 ml ------- ------- ------- ------- 0,1 ml ------- 0,2 mlC Sac2,5

0,2 ml ------- ------- ------- ------- 0,1ml 0,2 ml -------

3,5 ------- 0,2 ml ------- ------- ------- 0,1 ml ------- 0,2 mlC. Sac3,5

------- 0,2 ml ------- ------- ------- 0,1 ml 0,2 ml -------

4,5 ------- ------- 0,2 ml ------- ------- 0,1 ml ------- 0,2 mlC.Sac.4,5

------- ------- 0,2 ml ------- ------- 0,1 ml 0,2 ml -------

5,5 ------- ------- ------- 0,2 ml ------- 0,1 ml ------- 0,2 mlC Sac.5,5

------- ------- ------- 0,2 ml ------- 0,1 ml 0,2 ml -------

6,5. ------- ------- ------- ------- 0,2 ml 0,1 ml ------- 0,2 mlC Sac.6,5

------- ------- ------- ------- 0,2 ml 0,1 ml 0,2 ml -------

C. Ez. ------- ------- ------- ------- ------- ------- 0,4 ml 0,2 ml


con el agregado de la enzima, incubar en bao termostatizado a 37 C

durante 15 minutos y finalizar la reaccin mediante el agregado de 0,5

ml del Reactivo de Somogyi.



Nelson (medir la DO 520 nm).

3- Estimar la DO que corresponde a los nuevos azcares




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212



6- Calcular y expresar la velocidad inicial para cada pH comomicromoles de sacarosa hidrolizados por minuto (dividiendo en 15

minutos).


funcin de pH.

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213

CIDOS NUCLEICOSDefinicin de cidos nucleicos. Composicin. Bases nitrogenadas. Estructura de los

nuclesidos, nucletidos y polinucleticos. ADN conformacin. ARN. Tipos. Funcin

INTRODUCCION

Los cidos nucleicos son las biomolculas portadoras de la

informacin gentica. Tienen una estructura polimrica, lineal, cuyos

monmeros son los nucletidos. Son molculas formadas por centenares demillones de nucletidos en una sola estructura covalente. El nucletido est

formado por un fosfato esterificado a una pentosa, la que a su vez est unida

por un enlace -glicosdico a una base nitrogenada.

De la misma manera que las protenas son polmeros lineales

aperidicos de aminocidos, los cidos nucleicos lo son de nucletidos. La

aperiodicidad de la secuencia de nucletidos implica la existencia deinformacin. Los cidos nucleicos constituyen el depsito de informacin de

todas las secuencias de aminocidos de todas las protenas de la clula. Existe

una correlacin entre ambas secuencias, lo que se expresa diciendo que cidos

nucleicos y protenas son colineares; la descripcin de esta correlacin es lo

que llamamos Cdigo Gentico, establecido de forma que a una secuencia de

tres nucletidos en un cido nucleico corresponde un aminocido en unaprotena. Adems hay cidos nucleicos implicados en la transmisin y

procesado de la informacin gentica, otros con funciones catalticas

(ribozimas), y hay secuencias regulatorias que controlan la expresin de

diferentes genes (hormonas, factores de crecimiento, seales qumicas en

general).

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214

La hidrlisis enzimtica completa de un cido nucleico da lugar a una

mezcla de nucletidos. La hidrlisis completa de un nucletido da lugar a una

mezcla equimolar de:

Una Base nitrogenada heterocclica, que puede ser de dos tipos:

Purinao Pirimidina

Una Pentosa, que puede ser Ribosao 2-Desoxirribosa

Ortofosfato

Bases nitrogenadas

Las bases nitrogenadas de los cidos nucleicos son bases heterocclicas

que pertenecen a una de dos familias:

Unas estn basadas en el Anillo pirimidnico, las Pirimidinas que

constituyen un sistema plano de seis tomos, cuatro carbonos y dos

nitrgenos. Los tomos del anillo pirimidnico tienen la siguiente numeracin:

N1: C2: N3: C4: C5: C6:

Las distintas bases pirimidnicas se obtienen por sustitucin de este

anillo con grupos oxo (=O), grupos amino (-NH2) o grupos metilo (-CH3).

2,4 di oxo 5 metil pirimidina 2,4 di oxo pirimidina 2 oxo 4 amino pirimidina

N

N

6

54

3

21

CITOSINAURACILOTIMINA

N

N

O

NH2

N

N

O

O

N

N

O

O

HHCH3

H H H

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215

Timina se encuentra slo en la molcula de ADN; Uracilo slo se

encuentra en el ARN y Citosina es comn a ambos cidos nucleicos.

La otra familia de bases nitrogenadas est basada en el Anillo purnico,

son las Purinas, las que constituyen un sistema plano de nueve tomos, cinco

carbonos y cuatro nitrgenos. El anillo purnico puede considerarse como la

fusin de un anillo pirimidnico con uno imidazlico. Ambas bases pricas

(Adenina y Guanina) se encuentran tanto en ADN como en ARN. Los tomos

del anillo purnico se numeran de la forma siguiente: N1: C2: N3: C4: C5: C6:

N7: C8: N9

NN

NN

H

1

23 4

56 7

89

PURINA

GUANINAADENINA

NN

NN

O

NN

NN

NH2H

H HNH2

Nuclesidos

La unin de una base nitrogenada a una pentosa da lugar a los

compuestos llamados nuclesidos. Obsrvese el sufijo sido, caracterstico de

todos los glicsidos. La pentosa puede ser D-Ribosa (D-ribofuranosa), en

cuyo caso hablamos de Ribonuclesidos, o bien 2-D-Desoxirribosa (D-

desoxirribofuranosa), constituyendo los Desoxirribonuclesidos. Todos losnuclesidos son del tipo anomrico beta. Esto nos introduce a la distincin

6 amino purina 2 amino 6 oxo purina

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216

bsica entre ADN (constitudo por desoxirribonucletidos) y ARN (por

ribonucletidos), que est dada por las distintas pentosas y bases nitrogenadas.

Nucletidos

Cuando un ortofosfato se esterifica a alguno de los -OH de la pentosa

de un nuclesido, la estructura resultante se llama nucletido. En los

ribonuclesidos, el ortofosfato puede esterificarse en tres posiciones distintas:

2', 3' y 5'. En los desoxirribonuclesidos, la esterificacin con grupos fosfato

se da en 3, 5 de la pentosa.

La pentosa se une a la base nitrogenada por un enlace N-glicosdico que

se establece entre el tomo de C1 del azcar y el tomo de N9 de las bases

pricas o el N1 de las bases pirimidnicas. El grupo fosfato se halla unido por

un enlace ster al tomo C5 de la pentosa.

O

H

-

-

H

O CHPO

O

O

OH

H

2

1'

2'3'

4'

5'

H

H

NN

NN

NH 2

Adems de los nucletidos formados por un ortofosfato aparecen entrelas biomolculas nucletidos formados con un polifosfato. Ej. ADP, ATP.

O

H

-

H

O CHPO

O

O

OH

H

2

1'

2'3'

4'

5'

H

OH

PO

O

O

-

- N

N

NN

NH2

Nucletido de ADNDesoxiadenosina 5monofosfato (AMP)

Adenosina 5difosfato (ADP)

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217

Aparte de su carcter como monmeros de cidos nucleicos, la

estructura de nucletido est generalizada entre las biomolculas, y

particularmente como coenzimas, por ej. NADP, FAD, CoA.

Polinucletidos

Dos nucletidos pueden unirse a travs de un enlace fosfodister. Un

nucletido est fosforilado en 3' y este fosfato, a su vez, esterifica al 5'-OH del

siguiente nucletido

El enlace as establecido se llama enlace

fosfodister, y es caracterstico de los cidos

nucleicos. A su vez, el grupo 3' -OH del segundo

nucletido puede esterificarse a otro fosfato que

por su parte se esterifica al 5'-OH del siguiente

nucletido y este ltimo se une de la misma

manera a otro nucletido y as sucesivamente.

Convencionalmente los polinucletidos se numeran desde el residuo 5'

terminal, que es aquel que tiene un 5'-OH libre (extremo 5') el cual muy

frecuentemente aparece esterificado a un fosfato o polifosfato mientras que en

el extremo opuesto de la molcula hay un grupo 3' -OH libre que recibe el

nombre de extremo 3'.

Las enzimas que hidrolizan polinucletidos, genricamente llamadas

nucleasas, son, por lo tanto, fosfodiesterasas (su accin consiste en la

hidrlisis de un fosfodister).

Acido Desoxirribonucleico, ADN

La conformacin Bdel ADN fue propuesta por Watsony Cricken su

trabajo original de 1953. Son dos cadenas de polinucletidos enrollados uno

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218

en torno a otro, constituyendo una doble hlice dextrgira de tipo

plectonmico (lo cual quiere decir que para separar uno de otro es preciso

desenrollar previamente la hlice). Puede observarse que las bases estn en

planos aproximadamente perpendiculares al eje mayor de la doble hlice y

dirigidas hacia dentro de la estructura mientras que las desoxirribosa-fosfato

se dirigen hacia el exterior.

Los dos polinucletidos as estructurados tienen polaridad opuesta.

En uno de sus extremos hay un grupo 5'-OH libre, el extremo 5'mientras que

en el otro extremo hay un grupo 3'-OH libre, el extremo 3'

El otro polinucletido presenta una

polaridad opuesta. Su extremo 5' est del mismo

lado que el 3' del otro polinucletido; mientras

que el extremo 3' est del lado del 5' del otro

polinucletido, son por lo tanto, antiparalelos.

Los dos polinucletidos interaccionan

entre s mediante enlaces de hidrgeno

establecidos entre las bases nitrogenadas de uno

y de otro. Esta interaccin slo puede tener lugar

entre adenina y timina (el par A-T) entre las

que se establecen dosenlaces de hidrgeno. O bien, entre guanina y citosina

(el par G-C) entre las que se establecen tresenlaces de hidrgeno.

La estructura del DNA se mantiene gracias a los enlaces de hidrgeno

establecidos entre las bases, por una parte, y a una interaccin de naturaleza

hidrofbica que se da entre pares de bases contiguos, la interaccin de

apilamiento(stacking).

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219

Conformacin A

La conformacin A del ADNaparece en cristales de baja hidratacin y

menor grado de polimerizacin que el ADN-B. Se trata de una estructura ms

ancha y corta que el ADN-B.

Conformacin Z

La conformacin Z del ADN aparece fundamentalmente en zonas

ricas en el par G-C.

Existen algunas diferencias entre la conformacin Z y las otras dos. En primer

lugar las hlices son levgiras, es una doble hlice ms estrecha y alargada

que el ADN-B.

Tambin puede hallarse ADN en las mitocondrias o en los cloroplastos

(clulas eucariotas) o los plsmidos (clulas procariotas), virus y

transposones.

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220

El ADN mitocondrial y cloroplastdico

Las mitocondrias poseen su propio ADN, no asociado con histonas, que

se replica dentro del mismo orgnulo y forma nuevas mitocondrias (o

cloroplastos, en el caso de las clulas vegetales) por divisin simple;

asimismo, se transcribe y se traduce -aunque a escasas protenas. En

aproximadamente de todas las especies de plantas, el gameto masculino no

aporta los cloroplastos al cigoto. De modo semejante, en animales (incluidos

los humanos) el espermatozoide no contribuye con citoplasma al huevo

fecundado y, en consecuencia, las mitocondrias son de origen materno.

El ADN adicional de las bacterias: los plsmidos

Aunque las bacterias contienen en su cromosoma todos los genes

necesarios para su crecimiento y reproduccin, se ha encontrado, virtualmente

en todos los tipos de bacterias, molculas de ADN adicionales conocidas

como plsmidos. Los plsmidos son, al igual que el cromosoma bacteriano,

circulares y auto replicantes y van asociados a alguna cualidad o factor que

otorgan a la clula husped. En algunos casos la replicacin es independiente

y, entonces, la bacteria puede contener mltiples copias.

Los ms conocidos son el plsmido o factor F (sexual) y elR(resistente

a las drogas). La transferencia de plsmidos, y con ellos las caractersticas que

proveen a la bacteria, se lleva a cabo por conjugacin o por transformacin

(pasando simplemente, de una clula a otra a travs de las membranas).

Propiedades:

Absorcin de luz UV a 260 nm. En el ADN doble hlice se da el

fenmeno de hipocromismo: el ADN desnaturalizado por el calor

absorbe un 20-30 % ms que el ADN nativo

Reaccin positiva de los polidesoxirribonucletidos a la difenilamina y al

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221

reactivo de Schiff

Reaccin con orcinol

Reaccin con agentes intercalantes (acridinas)

Resistencia a hidrlisis por lcalis.

Metilacin de purinas: por tratamiento con dimetil sulfato (DMS) y

calentamiento a pH neutro se produce la metilacin de las purinas. El

tratamiento a pH bajo produce la ruptura del enlace glicosdico con

formacin de un sitio apurnico. El tratamiento posterior con cido

diluido rompe la cadena por el sitio apurnico.

El tratamiento de ADN con hidrazina rompe el enlace glicosdico de las

pirimidinas, quedando un sitio apirimidnico; el tratamiento posterior con

piperidina rompe la cadena por el sitio apirimidnico

.

ON

NH3C

OH

O

O

O

O

-O

H2C

OP

-O

O

-O

H2C

O

P

-O

O

-O

H2C

O

P

-O

N

N

NH H

O

N

N N

NN

H

H

OHH3C

ON

NH3C

OH

O

O

O

O

-O

H2C

OP

-O

O

-O

H2C

O

P

-O

O

-O

H2C

O

P

-O

N

N

NH H

O

OH

pH bajo

Sitio apurnico

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42/72


222

Ruptura enzimtica de polinucletidos: a) Endonucleasas: atacan

enlaces fosfodister situados en el interior de una cadena polinucleotdica,

y suelen ser especficas de cada cido nucleico Ribonucleasas,

Desoxirribonucleasas b) Exonucleasas: atacan enlaces fosfodister

situados en los extremos (3 o 5) de una cadena polinucleotdica, y suelen

O

-O

H2C

O

P

-O

ON

NH3C

OH

O

O

O

ON

N

N

N

NH

H

O

-O

H2C

O

P

-O

O

-O

H2C

O

P

-O

O

O

-O

H2C

O

P

-O

N

N

NH H

O

N

N N

NN

H

H

OH

O

-O

H2C

O

P

-O

ON

NH3C

OH

O

O

O

ON

N

N

N

NH

H

O

-O

H2C

O

P

-O

O

-O

H2C

O

P

-O

O

O

-O

H2C

O

P

-O

N

N

NH H

O

N

N N

NN

H

H

OHH3C

DMS

O

-O

H2C

O

P

-O

ON

NH3C

O

H

O

O

O

ON

N

N

N

NH

H

O

-O

H2C

O

P

-O

O

-O

H2C

O

P

-O

O

O

-O

H2C

O

P

-O

N

N

N

H H

O

OH

Sitio apurnico

O

O

-OO-

P

-O

O

-O

H2C

OP

-O

N

N

NH H

O

O

-O

H2C

O

P

-O

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NH3C

O

H

O

ON

N

N

N

NH

H

-O

H2C

O

P

-O

O

O-

cido diludo

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43/72


223

atacar indistintamente ambos tipos de cidos nucleicos.Ruptura tipo

a: Da lugar a una mezcla de 5-nucletidos y Ruptura tipo b: Da lugar a

una mezcla de 3-nucletidos

O

-O

H2C

O

P

-O

ON

NH3C

O

H

O

ON

N

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NHH

ON

N

N

N

O

NH

H

ON

N

N

N

NH

H

O

-O

H2C

O

P

-

O

O

-O

H2C

O

P

-O

O

O

-O

H2C

OP

-O

H

ON

N

N

N

O

NH

H

H

OH

CH2OP

O-O

O-

ON

N

N

N

NH

H

OH

OP

O-O

O-CH2

OP

O-O

O-CH2

ON

NH3C

O

H

O

OH

OP

O-O

O-CH2 O

N

N

O

NHH

OH

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44/72


224

Los fragmentos de restriccin del DNA pueden separarse mediante

tcnicas electroforticas. Una vez separados, se tratan con bromuro de etidio

(un agente intercalante) y se observan bajo luz UV.

cido Ribonucleico, ARN

Sin importar el tipo de ARN del que se trate, el producto de la transcripcin es

siempre una cadena simple de ARN. Las monohebras tienden a adoptar una

conformacin helicoidal con giro a la derecha, dirigida por las interacciones

del apilamiento de bases.

Reactividad Qumica:El RNA, al tener el grupo 2-OH, es mucho ms

reactivo qumicamente que el DNA. En concreto, puede ser

completamente hidrolizado por lcali a una mezcla de 2- y 3-nucletidos.

Estructura tridimensional: Las formas en doble hlice del RNA adoptan

la configuracin A (en lugar de la B, propia del DNA), as como los

hbridos DNA-RNA.

Tamao molecular: Aun con ser grande, es de bastante menor tamao

que el DNA.

Funciones: El cido ribonucleico (RNA, ARN) cumple una serie de

importantsimas funciones en la clula,

1- RNA mensajero (mRNA), que porta la informacin necesaria para el

establecimiento de una secuencia correcta de aminocidos por parte de la

maquinaria de sntesis proteica

2- A su vez, el mRNA deriva del transcrito primario o RNA nuclear

heterogneo (HnRNA), que es el primer producto de la transcripcin y

sufre una serie de modificaciones antes de convertirse en mRNA.

3- RNAs nucleares pequeos (snRNA) o RNAs nucleolares pequeos

(snoRNA), que participan en la conversin de HnRNA en mRNA.

4- RNA de transferencia (tRNA), al cual se unen los distintos aminocidos,

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225

que quedan as activados y aptos para integrarse en la biosntesis de

protenas.

5- RNA ribosmico (rRNA) que integra, junto con protenas, la partcula

conocida como ribosoma.

6- RNAs genmicos: en algunos virus, el RNA es el material gentico. En

ciertos casos, este RNA se retrotranscribe a DNA mediante el proceso de

transcripcin inversay se integra en el genoma del husped; es el caso de

los retrovirus.

7- RNAs como enzimas: Algunos RNA son capaces de catalizar reacciones

qumicas del mismo modo que las enzimas, son lasribozimas. Participan

en el procesado del RNA transcrito primario (mRNA) y en la formacin de

enlace peptdico en la sntesis de protenas.

O

H

-

-

H

O CHPO

O

O

OH

H

2

1'

2'3'

4'

5'

H

N

N

O

O

OH

Nucletido de ARNUridina 5monofosfato

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226

Experimentacin

cidos nucleicos: ARN y ADN

Objetivos

Obtener el cido ribonucleico precipitado de la levadura de cerveza.

Obtener el cido desoxirribonucleico precipitado del timo de ternera

Comprobar la solubilidad de los cidos nucleicos en diferentes solventes.

Realizar la hidrlisis de los cidos nucleicos obtenidos.

Verificar el resultado de la hidrlisis a travs de reacciones caractersticas

de cada uno de sus componentes.

A. Obtencin de cido ribonucleico

Disgregar 50 g de levadura (Saccharomyces cerevisiae) y disolver en

150 ml de NaOH al 0,3%. Calentar a Bao Mara (B.M), 100C. durante 30

minutos removiendo de vez en cuando. Enfriar y agregar cido actico glacial

hasta reaccin ligeramente cida, enfriar y filtrar para eliminar las protenas.

Verter la solucin agitando vigorosamente en 20 ml de alcohol etlico al 95%

el que contiene 2 ml de HCl 36%. Dejar reposar y lavar el precipitado 2 veces

con etanol, por decantacin y luego con ter, decantar el exceso de lquido,

transferir a un papel de filtro y secar el residuo por aspiracin sobre Bchner

con bomba de vaco. Usar el precipitado as obtenido para estudiar las

propiedades del cido nucleico como sigue:

1. Solubilidad: Evaluar la solubilidad en agua fra y caliente y en alcohol

2. Solubilidad en lcalis:Agregar HCl 10% hasta que la solucin se torne

cida y luego NaOH 2 N. Observar.

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227

3. Hidrlisis:A una cantidad pequea de precipitado agregar 10 ml de H2SO4

10%y calentar a ebullicin durante 10 min.

4.Ensayo con pentosas:Colocar 2 ml de hidrolizado en un tubo de ensayo,

agregar unas gotas de reactivo de Bial y calentar en B.M. a ebullicin durante

3 minutos. La aparicin de un color verde revela la presencia de pentosas. El

reactivo de Bial contiene orcinol en cido clorhdrico y forma complejos slo

con las pentosas.

Reactivo de Bial: 300 ml de HCl concentrado en 250 ml de agua destilada.

Aadir 1,5 g de orcinol y 8 gotas de cloruro frrico al 1%

5. Ensayo de fosfatos:Agregar un ligero exceso de amonaco, acidificar con

cido ntrico y agregar molibdato de amonio 10% a la solucin en ebullicin.Un precipitado color amarillo revela la formacin de fosfomolibdato de

amonio.

H3PO4+ 3 NH3+ 24 HNO3+ 12 (NH4)2MoO4 12 MoO3PO4 (NH4)3+ 24 NH4NO3+ 12 H2O

6. Ensayo de bases: Colocar 2 ml del lquido hidrolizado en un tubo de

ensayo y aadir unas gotas de solucin de Ag NO3 0,1 M, un precipitado

blanco indica la presencia de bases. Las mezclas de bases nitrogenadas

precipitan por el agregado de soluciones de plata.

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228

B. Aislamiento del cido desoxirribonucleico

El mtodo consta de cinco pasos:

1. Aislamiento del complejo desoxirribonucleoproteico (ADN-protena).

El propsito de esta primera etapa es aislar, en fracciones diferentes, los

complejos nucleoproteicos que se encuentran presentes en el timo de ternera:

la ribonucleoprotena (RNP) y la desoxirribonucleoprotena (dRNP).

Esta separacin se consigue homogeneizando el tejido en una solucin

salina de baja fuerza inica (ClNa: 0,05 a 0,25 moles/litro), que favorece la

estabilidad de ambos complejos y disuelve a la mayor parte de las molculas

que se encuentran presentes en el timo (incluso la RNP) pero no disuelve a

las dRNP. En el mtodo elegido se utiliza una solucin isotnica (ClNa 0,15

M = 0,9 %).

Los mtodos de baja fuerza inica son adecuados para el aislamiento de

las dRNP; sin embargo presentan una gran desventaja: favorecen la liberacin

de las nucleasas; estas enzimas producen la degradacin enzimtica parcial de

los cidos nucleicos y requieren, para su actividad la presencia de ciertos

cationes bivalentes (Mg++, Mn++. Fe++y Co++). Para evitar este inconveniente,

la homogeneizacin se realiza en presencia de agentes quelantes como el

EDTA, o de ciertos aniones como el fluoruro o el citrato, que extraen del

medio los cationes bivalentes que son necesarios para la actividad de estas

enzimas. En el mtodo que elegimos se utiliza el citrato para complejar los ca-

tiones bivalentes (citrato de sodio 0,015 M).

Si se quiere mantener la integridad de la molcula de ADN es necesario

verificar que las soluciones que se emplean en su aislamiento se encuentren a

pH 7. Los cidos, a pH inferior a 2 producen la ruptura del enlace N-

glucosdico de las purinas dando origen a un sitio apurnico.

A pH alcalino se produce la desnaturalizacin del ADN o sea la ruptura

de los puentes hidrgeno que mantienen unidas las dos cadenas

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229

polinucleotdicas. Tambin se recomienda agregar algunas gotas de alcohol

octlico normal, porque evita la formacin de espuma y produce hemlisis con

lo cual se facilita la eliminacin de la hemoglobina del tejido.

Otro factor muy importante es la temperatura; a bajas temperaturas (0 a

5C) se inhibe la ADNasa y otras enzimas que se producen en el metabolismo

de la glndula y que actan sobre el ADN produciendo la degradacin de su

molcula. Por ese motivo en esta primera etapa todos los pasos deben

realizarse en fro (0 a 5C), aunque se trabaje en presencia de inhibidores.

Los dos tipos de nucleoprotenas (RNP y dRNP) que se encuentran

presentes en el homogenato, diferenciables por su distinta solubilidad, pueden

separarse por centrifugacin en fro; se obtiene un precipitado formado por el

material insoluble en la solucin salina (dRNP) y un sobrenadante que

contiene el material soluble en esa solucin (RNP).

Mtodologa: Pesar 15 g de timo en una cpsula de Petri y cortar con un

cuchillo o navaja en lminas delgadas; colocar el tejido en un vaso de

licuadora y agregar 45 ml de citrato de sodio 0,015 M y 45 ml de cloruro de

sodio 0,15 M (SSC-1X). Mantener el pH de la suspensin en 7 mediante el

agregado de tampn TRIS-HCl 20 mM pH= 7. Homogeneizar hasta obtener

una suspensin de color rosado con resto de tejido de aspecto fibroso.

Centrifugar el homogenato durante 5 minutos a 5.000 r.p.m. a 5C. Se obtiene

un precipitado adherente blanquecino (dRNP) y un sobrenadante de color

rosado (RNP). Desechar el sobrenadante y trabajar con el precipitado.

2. Disociacin del complejo en sus dos componentes: DNA y protenas.

La homogenizacin del tejido con solucin SSC-1X y la centrifugacin

posterior, realizadas en la primera etapa, han permitido aislar el DNA del timo

de ternera combinado con protenas en forma de un complejo dRNP.

El propsito de esta segunda etapa es disociar el complejo aislado,

liberando el DNA (como desoxirribonucleato de sodio) de las protenas que lo

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230

acompaan. Esta disociacin se consigue mediante el empleo de Lauril sulfato

de sodio o dodecil sulfato de sodio (SDS), reactivo que en presencia de

cloruro de sodio, disocia el complejo dRNP y precipita las protenas liberadas

sin producir la despolimerizacin del nucleato.

Metodologa: Colocar en un erlenmeyer de 200 ml el precipitado obtenido y

agregar 30,75 ml de citrato de sodio 0,015 M y dispersar con varilla de vidrio

a temperatura ambiente. Agregar 0,77 ml de solucin de SDS al 5% en etanol

al 45%.Agregar los siguientes reactivos en el orden indicado mezclando

despus de cada adicin: 9,72 ml de SDS al 45% en etanol al 45%, 52,50 ml

de ClNa 2 M y 3,78 ml de citrato de sodio 0,015 M.

3. Eliminacin de las protenas.

Las protenas que quedan en el sobrenadante luego del tratamiento con

SDS se eliminan con una mezcla de cloroformo y alcohol isoamlico, que las

desnaturaliza y coagula. La preparacin cruda de ADN se agita vigorosamente

con cloroformo-alcohol isoamlico. La emulsin resultante se centrifuga en

fro para acelerar la separacin de las fases. Se separan dos fases bien

definidas separadas por una interfase slida; ellas son:

I-Fase Orgnica: (cloroformo - alcohol isoamlico) se separan en el fondo del

tubo y contiene los compuestos lipdicos.

II-Fase acuosa: en la parte superior del tubo y contiene la sal de sodio del

ADN y nucleoprotena.

III-Interfase slida: es de color blanco y se interpone entre las dos anteriores;

est constituida por el gel que se forma entre el clorhidrato de protena y la

mezcla de cloroformo - alcohol isoamlico.

Mtodoga: En una ampolla de decantacin colocar la suspensin obtenida y

agregar el mismo volumen de cloroformo-alcohol isoamlico (24:1, v/v),

agitar vigorosamente durante 30 segundos. Distribuir la emulsin resultante

en tubos de centrfuga y centrifugar en fro (5C) durante 10 minutos a 5000

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r.p.m. Retirar los tubos suavemente de la centrfuga para mantener la

separacin de las fases. Con una pipeta capilar retirar la capa acuosa superior

que contiene la sal de sodio del ADN tratando de no perturbar la fase proteica.

4. Precipitacin del desoxirribonucleato de sodio.

El etanol al 95 % precipita al ADN bajo la forma de un material fibroso

que puede ovillarse alrededor de una varilla de vidrio. Esta propiedad permite

separar el ADN de otras macromolculas que coagulan de una manera no

fibrosa, como por ejemplo el ARN y las protenas.

Metodologa: A la capa acuosa desproteinizada agregar dos volmenes de

etanol al 95% (5C). Verter lentamente sobre las paredes del recipiente

tratando de formar una capa alcohlica sobre la fase acuosa viscosa. Con una

varilla de vidrio gruesa agitar la solucin de ADN con un movimiento de

rotacin suave y continuo hasta que las dos fases se mezclen y todas las fibras

del material gelatinoso rico en ADN se hallan enroscado sobre la varilla

Presionar las fibras de ADN sobre las paredes del recipiente para eliminar el

exceso de solvente. Posteriormente colocar la varilla sobre un papel de filtro.

Lavar el precipitado introduciendo la varilla que contiene el ADN en un tubo

que contenga etanol al 95% y luego en otro que contenga ter etlico. . Todo

el procedimiento se efecta a baja temperatura (5C). Retirar el ADN de la

varilla y colocar en un vidrio de reloj. Dejar secar 10 minutos para eliminar

por completo el solvente.

5. Disolucin e hidrlisis del desoxirribonucleato de sodio. La sal de sodio

del ADN es soluble en agua destilada y en soluciones de baja fuerza inica.

Metodologa: A una cantidad pequea de precipitado agregar 10 ml de cido

sulfrico 10 % y calentar a ebullicin durante 10 min (hidrlisis). Ensayar los

productos de hidrlisis: pentosas, fosfatos y bases utilizando la metodologa

descripta previamente.

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232

CROMATOGRAFA Y ELECTROFORESIS

Generalidades, clasificacin de mtodos cromatogrficos, aplicaciones,

electroforesis

El trmino cromatografa, del griego khromatos (color) y graphos

(escrito), fue usado por primera vez en 1906 por el botnico ruso Miguel

Tswett para describir la separacin de pigmentos vegetales. Tswett defini la

cromatografa como un mtodo en el cual los componentes de una mezcla de

solutos (analtos) son separados en una columna adsorbente (fase estacionaria)

dentro de un sistema fluyente (fase mvil). La separacin, basada en la

velocidad de desplazamiento diferencial de los solutos, se establece al ser

arrastrados los mismos por la fase mvil (liquida o gaseosa) a travs de un

lecho cromatogrfico que contiene la fase estacionaria(slida o lquida).

La separacin entre dos sustancias empieza cuando una es retenida ms

fuertemente por la fase estacionaria que la otra, que tiende a desplazarse ms

rpidamente en la fase mvil. Las retenciones mencionadas pueden tener su

origen en fenmenos de adsorcin, que es la retencin de una especie

qumica por parte de los puntos activos de la superficie de un slido quedando

delimitado el fenmeno a la superficie que separa las fases, o bien de

absorcin,que es la retencin de una especie qumica por parte de una masa,

debido a la tendencia que sta tiene a formar una mezcla con la primera

(absorcin pura) o a reaccionar qumicamente con la misma (absorcin con

reaccin qumica) considerando ambas como un fenmeno msico y no

superficial.

Las tcnicas cromatogrficas aprovechan alguna o algunas propiedades

fsicas o fsico-qumicas de los analitos, como solubilidad, adsorcin,

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233

volatilidad, tamao, carga, reactividad qumica o bioqumica, etc. La mezcla

de sustancias a separar se coloca en una situacin experimental dinmica

donde exhiben dos de estas propiedades, o bien una de ellas pero por

duplicado tal como la solubilidad en dos lquidos diferentes, como ocurre en

cromatografa lquido-lquido. Por otro lado, se considera improbable que dos

especies presenten cuantitativamente el mismo par de propiedades fsicas o

fsico-qumicas frente a un sistema cromatogrfico dado. Por tanto, en estas

diferencias, que pueden ser muy pequeas, se basa la separacin

cromatogrfica. As, las propiedades de los componentes de una mezcla

determinan su movilidad entre s y con respecto a la fase mvil. Se eligen

las condiciones experimentales y las fases cromatogrficas para que los

componentes de la mezcla se muevan a distinta velocidad. La base de la

separacin cromatogrfica ser, por tanto, la diferencia en la velocidad de

migracin de los mismos.

Clasificacin de los mtodos cromatogrficos: Para clasificar globalmente a

los mtodos cromatogrficos es necesario tener en cuenta dos criterios:

Tipo de fenmeno fsico-qumico que prevalezca o fundamento del

proceso cromatogrfico, lo que conduce a los tipos de cromatografa.

Forma de realizar el proceso cromatogrfico, es decir, lo que constituye

las distintas tcnicas cromatogrficas

Tipos de cromatografa

-Fase estacionaria slida:

Cromatografa de adsorcin: El slido adsorbe al componente que

inicialmente estaba en fase mvil, lquida o gaseosa (Fuerzas de Van der

Waals).

Cromatografa de intercambio inico: el slido es un intercambiador de

iones (fuerzas electrostticas).

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Cromatografa de exclusin (o de geles): el slido es un gel formado por

polmeros no inicos porosos que retienen a las molculas de soluto segn su

tamao.

Cromatografa de afinidad: es un tipo especial de cromatografa de

adsorcion, utilizada especialmente en bioqumica, en la que un slido tiene

enlazado un llamado ligando de afinidad que puede ser por ejemplo, un

indicador enzimtico o un anticuerpo.

-Fase estacionaria lquida: en ese caso el lquido se encuentra soportado en

un slido inerte, se trata de la Cromatografa de particin. El soluto se

reparte entre la fase mvil (lquido o gas) y la fase estacionaria.

Segn la naturaleza de la fase mvil, la tcnica cromatogrfica

correspondiente recibe el nombre de dicha fase mvil:

-Fase mvil lquidao cromatografa liquida, cabe distinguir:

Cromatografa lquido-lquido (CLL), en la que ambas fases son lquidas y,

por tanto, se trata de una cromatografa de particin.

Cromatografa liquido-slido (CLS), en la que la fase estacionaria es slida

(adsorcin, intercambio inico, exclusin, afinidad).

-Fase mvil gaseosao cromatografa de gases, puede ser:

Cromatografa gas-liquido (CGL), que es una cromatografa de particin.

Cromatografa gas-slido (CGS), que es una cromatografa de adsorcin.

Tcnicas cromatogrficas

Segn la forma de llevar a cabo la separacin cromatogrfica, cabe

distinguir dos tipos de tcnicas cromatogrficas: en columna y plana.

Cromatografa en columna: se utiliza un tubo cilndrico, en cuyo interior se

coloca la fase estacionaria y a travs de ella se hace pasar la fase mvil. El

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235

flujo de la fase mvil (lquido o gas) a travs de la fase estacionaria se

consigue por: presin, capilaridad, gravedad.

Cromatografa plana: en este caso la fase estacionaria est colocada en una

superficie plana. Se divide en dos tipos generales:

Cromatografa en papel: en la que el papel acta como soporte de la fase

estacionaria (cromatografa de particin).

Cromatografa en capa fina: en la que un slido acta como fase estacionaria

(cromatografa de particin), que se extiende en una capa delgada sobre una

placa, generalmente de vidrio o aluminio.

Adems, en estos casos el flujo de la fase mvil puede conseguirse de dos

formas:

Por capilaridad (cromatografa horizontal y ascendente).

Por capilaridad y gravedad (cromatografa descendente).

La cromatografa plana es considerada la ms simple de todas las

tcnicas cromatogrficas. La diferencia principal con la cromatografa en

columna es de tipo tcnico, es decir, difieren en la forma de soportar la fase

estacionaria. Sin embargo el fundamento de ambas tcnicas es el mismo.

En la cromatografa plana, la muestra a separar se sita sobre el plano

que contiene la fase estacionaria (papel o placa fina) en forma de mancha, o a

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236

veces de banda, a corta distancia de uno de los extremos de dicho plano. Una

vez seca la mancha o banda, el extremo del plano prximo a la misma se pone

en contacto con la fase mvil, manteniendo todo el sistema cromatogrfico en

una cmara cerrada. La separacin se produce por migracin diferencial de los

componentes de la muestra en la direccin en que se mueve la fase mvil.

Generalmente, a diferencia de la cromatografa en columna, en cromatografa

plana las sustancias analizadas no abandonan el lecho cromatogrfico, de

forma que el proceso se detiene cuando la fase mvil ha alcanzado una

determinada zona del plano.

En la cromatografa en papel, la celulosa acta como soporte de la fase

estacionaria que suele ser agua. No obstante, tambin existen en el comercio

papeles impregnados (gel de slice o almina, silicona, intercambiadores

inicos, etc.) o tratadas qumicamente (grupos intercambiadores incorporados

al esqueleto polimrico de la celulosa), que amplan la aplicabilidad de esta

tcnica.

En cromatografa en capa fina, un slido o soporte de la fase

estacionaria, se extiende en forma de capa sobre el plano de una superficie

rgida, normalmente una capa de vidrio o polietileno o una placa de aluminio,

de forma que la fase mvil fluye a travs del mismo. Dependiendo de las

caractersticas del slido utilizado, la cromatografa ser de particin,

adsorcin, intercambio inico o exclusin.

Hasta hace relativamente poco tiempo, la cromatografa en capa fina

(CCF) o Thin Layer Cromatography (TLC) era considerada una tcnica

cualitativa simple y rpida, para separar mezclas no demasiado complejas,

pero su aplicabilidad cuantitativa resultaba una pobre alternativa frente a otras

tcnicas cromatogrficas. Sin embargo, actualmente, debido a los cambios

introducidos en esta tcnica (calidad de los soportes, equipos para aplicar

muestras y sistemas de deteccin), es considerada una tcnica til para separar

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57/72


237

y determinar cualitativa y cuantitativamente mezclas complejas a nivel de

trazas. Estos cambios han llevado a modificar el nombre de la tcnica,

denominndose Cromatografia en Capa Fina de Alta Resolucin (CCFAR) o

High Performance Thin Layer Cromatography(HPTLC). Lo mismo ocurri

cuando se mejor la capacidad de resolucin de la cromatografa lquida en

columna, pasando a denominarla Cromatografa Liquida de Alta Resolucin

(CLAR) oHigh Performance Liquid Cromatography(HPLC).

Diferencias entre cromatografa plana y en columna

Aunque con algunas modificaciones, los principios tericos de la

cromatografa en columna pueden ser aplicados, en general, a la

cromatografa plana. Las diferencias entre estas tcnicas hay que buscarlas en

la distinta configuracin de ambos sistemas cromatogrficos ya que la

cromatografa plana se realiza en un sistema de lecho abierto, mientras que lacromatografa en columna es un sistema de lecho cerrado. Sobre esta base

pueden indicarse las diferencias siguientes:

En la cromatografa plana la separacin se realiza por distancias mientras

que en columna se hace por tiempos o volmenes de elucin.

En cromatografa plana la velocidad de la fase mvil slo puede

controlarse indirectamente ya que est gobernada por fuerzas capilares que

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son las que permiten el paso de dicha fase a travs del lecho

cromatogrfico. Por el contrario, en cromatografa en columna la velocidad

de la fase mvil puede controlarse regulando el gradiente de presin a

travs de la columna (por ej. cromatografa de alta presin).

En la cromatografa plana, el tiempo que dura la separacin est

determinado por el tiempo necesario para que el frente del disolvente

llegue a una zona determinada del lecho cromatogrfico y es independiente

del camino recorrido por los componentes de la muestra. En cromatografa

en columna, cada soluto debe atravesar completamente la longitud de la

columna, por lo que el tiempo que dura la separacin est determinado por

el tiempo que tarda el componente ms lento en llegar al detector.

En la cromatografa en columna la separacin de varias muestras se realiza

de forma secuencial, es decir, cada muestra debe sembrarse, fraccionarse

y detectarse individualmente, mientras

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