Cultivo de leptospirasTipo I

Dra. Elthy Galarza

Medios de cultivos• Medio Líquido

– aislamiento– preparación de antígeno

• Medio Semi-sólido (0.1 - 0.5% agar)– aislamiento – conservación

• Medio sólido (0.8 - 1.3 % agar)– aislamiento de muestras o cultivos contaminados

Requerimientos nutricionales para el crecimiento

Esenciales:

– vit B1

– vit B12

– ácido grasos de cadena larga (C15)

– fosfatos

– Ca 2+ Mg 2+ Fe 2+

• peptonas• asparagina• extracto de carne• tween• piruvato de sodio• glicerol

proteínas

remplace peptonas

componente esencial

energía y carbón

facilita la multiplicación

carbono, incrementa el crecimiento

Requerimientos nutricionales para el crecimiento. Cont....

• Sales: – estabiliza la membrana– incrementa el crecimiento

• Na+ K+

– potasio permite tiempos de generación mas cortos que el sodio

Requerimientos nutricionales para el crecimiento. Cont....

• Ca 2+, Mg 2+

– Estabilizadores de membrana– Células virulentas responde a altas concentraciones

de Mg

• Fe 2+

– Previene la acumulación de peróxidos orgánicos– Sustituye Hb

• Amonio– Fuente de nitrógeno

Requerimientos nutricionales para el crecimiento. Cont....

• Suero de conejo– Inicia el crecimiento y la velocidad– componentes esencial

• 5 Fluoro-uracilo– Derivado de la pirimidina, letal para varios

microorganismos, pero no para las leptospiras

Requerimientos nutricionales para el crecimiento. Cont....

Medios de cultivos

• Medio tradicional: 8-10% suero de conejo– Stuart, Korthof, Fletcher, Vervoort, Schüffner

• Medio Tween 80/BSA de Ellinghausen y McCullough, modificado por Johnson and Harris: EMJH

• Medio bajo o libre de proteina– Shenberg, Bey and Johnson

• Medio enriquecido: – Suero (fetal bovino o conejo), Hydrolysado

Lactoalbumina, Superoxide dismutase, Pyruvato

• Medio selectivo:– 5-fluorouracil (0.01-0.04%), Neomycin, nalidixic acid,

actidione, sulfadiazol, rifampicin, amphotericin B

Crecimiento de leptospiras

• Mediolíquido, semi sólido, sólido

• Tiempo de duplicación6-8 horas, algunas veces 14-18 horas

• Temperatura óptima28-30°C

Cultivos • Usualmente desde y para medio líquido usando

pipetas : Ej 0.5 mL de cultivo es tomado con una pipeta estéril y transferido asépticamente para un tubo con 5 mL de medio.

• Visualmente no hay diferencia entre cepas, por tanto hay que tomar mucho cuidado no mezclar, rotulando bien los subcultivos.

• Todas las cepas deben ser monitoreadas periódicamente por serología y autenticidad genética.

Aislamiento y cultivo de muestras clínicas de humanos

- Fase de Leptospiremia• 1era semana. Sangre

- Fase de Leptospiruria y Fase Inmune.

• 2da hasta 4ta semana. Líquido cefalorraquídeo y Orina

Cultivo de Sangre y LCR

• Inocular 2-3 gotas de sangre (EDTA, heparina) o LCR dentro de ±5 ml de medio (suero también es posible)

• Incubar por 4-6 meses a 30 °C

• Medios (preferiblemente 5)– EMJH– EMJH+5-FU– Fletcher– EMJH+1%suero conejo+1%suero fetal bovino– EMJH+1%suero conejo+1%suero fetal bovino+5-FU

Cultivo de orina

• Cultivar orina, con un tiempo no mayor de 2 horas después de obtenida

• Inocular 1:10, 1:100 y 1:1000 en 5 mL de medio

• Incubar por 4-6 meses a 30 °C

• Medio: usar 6 tubos– 3x EMJH+5-FU– 3x EMJH+1%suero conejo+1%suero fetal bovino+5-FU

Cultivo de tejido

• Cultivar tan pronto sea posible, o mantener a 5 °C

• Triturar un pedacito de tejido (0.5 x 0.5 mm) con 1 mL de medio o PBS pH 7.2 estéril

• Inocular 1:10, 1:100 y 1:1000 en 5 mL de medio

• Incubar por 4-6 meses a 30 °C

• Medio: usar 6 tubos– 3x EMJH+5-FU– 3x EMJH+1%suero conejo+1%suero fetal bovino+5-FU

Factores que afectan la viabilidad de las leptospiras

• Cristalería no adecuadamente limpia• Medios inapropiados• Sustancias inhibidoras• Tratamiento con antibióticos• Contaminación• Temperaturas de incubación (28-30 °C)• pH del medio (7.2 - 7.4)

Purificación de cultivos contaminados

• Filtración (0.45 - 0.2 µm)

• 5-fluoro-uracilo, Ej. 200 µg/ml

• Plaquear en medio sólido

• Migrar a través de un filtro de 0.2 µm sobre medio sólido

• Diluciones en medio líquido selectivos

• Pase por animales (hámster, curieles)

INMUNIZACIÓN• Conejo adulto, 2.5 - 5 kg

• Extracción de sangre y obtención de suero

• Realizar a los sueros Prueba de MAT , para confirmar ausencia de Ac antileptospirales

• Al menos 2 conejos por cada cepa, y el suero será unido.

• Cultivo de cepas y aislamiento de una colonia, a partir de medio sólido.

Esquema de inmunización• Preparar un cultivo de 5-7 días con 2 x 108 leptospiras/mL

• Inocular 1, 2, 4, 6 y 6 mL del cultivo vivo en la vena marginal de la oreja, una vez por semanas

• Analizar muestra de sangre 2 semanas despues de la ultima inyección.

• Si el título es 1:10 000 – 1:50 000 el conejo es desangrado por punción cardiaca o desangrado.

• Si el título es <1:10 000 entonces de nuevo inyectar 6 mL de cultivo vivo, y analizar la sangre pasadas 2 semanas.

• Si el título se mantiene bajo, entonces inmunizar otro conejo.