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Introducción a la espectroscopía vibracional
1. .Conceptos básicos Estados vibracionales y energía Modos normales de vibración frecuencia de vibraciones
2. .Técnicas Espectroscopía infrarroja Regiones del IR
Grupos funcionales "Huellas digitales"
Número de ondas e intensidad Reglas de selección FTIR y sus ventajas
Espectroscopía Raman Dispersión inelástica de
fotones (Stokes y anti-Stokes) Reglas de selección Ventajas sobre el IR Resonanacia Raman
3. .Aplicaciones a proteínas Análisis de estructura
secundaria Cálculos Asignaciones Uso de isótopos Grupos laterales
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2
Bibliografía
Campbell, I.D. and Dwek, R.A.; Biological Spectroscopy; Benjamin Cummings (1984)
Cantor, C.R. and Schimmel, P.R.; Biophysical Chemistry; Vol 2, (1984).
Krimm, S and Jagdeesh Bandekar, Vibrational Spectroscopy and Conformation of Peptides, Polypeptides and Proteins; Adv. Prot Chem. 38; (1986), p. 180
Susi, H and Byler, D.M.; Resolution Enhanced Fourier Transform Infrared Spectroscopy of Enzymes; Methods in Enzymology; 130, p 290
Williams, R.W.; Protein Secondary Structure Analysis Using Raman Amide I and Amide III Spectra; Methods in Enzymology; 130, p 311
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Introducción a la espectroscopía vibracional
Espectro electromagnético
Frecuencia (Hz)Longitud de onda Tipo de radiación Tipos de transición
1020 - 1024 10-12 - 10-16 m Rayos gamma Nuclear
1017 - 1020 1 nm - 1 pm Rayos X Electrones internos
1015 - 1017 400 - 1 nm Ultravioleta Electrones externos
4.3x1014 - 7.5x1014 700 - 400 nm Visible Electrones externos
1012-1014 2.5 µm - 700 nm Infrarrojo Vibraciones
108 - 1012 1 mm - 2.5 µm Microondas Rotaciones
100 - 108 108 - 1 m Radiofrecuencia Inversión de spin
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4
2
34
1
0
E
Distancia internuclear
Estados vibracionales y energía
k
2
1Frecuencia de la vibración
k = constante de fuerza del enlace F = -kx
µ = masa reducida, para un sistema diatómico 21
21
mm
mm
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5
cm-1 IR RAMAN
estiramiento (sim)
1340 - +
estiramiento (asim)
2349 + -
deformación 667 + -
deformación 667 + -
Modos normales de vibración (3N - 5)
O OC
O OC
O OC
O OC
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Técnicas: INFRARROJO Reglas de selección:
No todas las vibraciones serán “activas” en IR
Sólo aquellas en las que cambie el momento dipolar permanente durante la vibración
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INFRARROJO
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NH CH3
O
N-H C-H
C=O
INFRARROJO
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FTIREspectrometría IR con
Transformada de Fourier1. Mejor relación señal/ruido ya
que la luz no debe pasar por un monocromador.
2. Se miden todas las frecuencias a la vez lo que da mucha mayor rapidez
3. Puede tener una resolución de menos de 0.01 cm-1
4. Los espectros pasan necesariamente por una computadora lo que facilita el análisis y manejo espectral
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10
C N
C
HC
O
C N
C
HC
O
C N
C
HC
O
C N
C
HC
O
C N
C
HC
O
C N
C
HC
OC N
C
HC
O
C N
C
HC
O
C N
C
HC
O
C N
C
HC
O
C N
C
HC
O
C N
C
HC
O
estiramiento NH (3236 F) amida I (1653 F) amida II (1567 F) amida III (1299 M)
amida IV (627 D) amida V (725 F)
estiramiento NC (1096 D)
estiramiento CN y CC (881 D)
deformación CCN (436 D)
deformación CNC(289 D)
amida VI (600 M) amida VII (206 M)
Modos normales de vibración del grupo amida (valores para metilacetamida)
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antiparalela
hélice
transición
ovillo estadístico
Susi, H., Timasheff, S and Stevens, L. J Biol
Chem (1967) 242, 5460-5466
Estructura secundaria
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13Goormaghtigh, E; Ruysschaert, J. M. and Raussens, V Biophysical Journal Volume 90 April 2006 2946–2957
Estructura
Estructura
Estructura secundaria
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Porcentajes de hélice y cadena extendida obtenidas por rayos X y
FTIR
Proteína % Hélice % Cadena extendida
FTIR RX FTIR RX
Carboxipeptidasa 40 39 33 30
α-Quimotripsina 12 10 50 49
Concanavalina A 4 2 60 60
Lisozima 41 45 21 19
Papaína 27 29 32 29
Ribonucleasa A 21 22 50 46
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C N
C
HC
O
1H2O
2H2O
Efecto de la deuteración de la proteína sobre la posición de la banda amida I
J. Biol. Chem. (1998) 273: 771-777
Uso de isótopos
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BIAP (A) apo BIAP (B) Asignación tentativa
1682 C=O amida I (hoja )
1660 C=O amida I (giro)
1651–1652 1652 C=O amida I (hélice )
1633 1633 C=O amida I (hoja )
1586–1577 1586–1571 C=O COO– Asp o Glu
1547 1547 N-H amida II
1516–1517 1516–1517 OH anillo Tyr
1443 1455 N-2H amida II y 2HOH
Asignación tentativa de las diferentes bandas en el espectro FTIR de BIAP y apoBIAP en 2H2O, pH 6.6
Uso de isótopos
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C N
C
HC
O
Efecto del tiempo en la deuteración de tripsina en 2H2O a 25º C, pD = 3.1
Eur. J. Biochem. 48, 339-344 (1974)
1 = 27 min2 = 63 min3 = 180 min4 = 21 h
Uso de isótopos
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FTIR de monóxido de carbono unido a citocromo c aa3 de T. termophilus.
Referencia: Pinakoulaki, E.; Soulimane, T. and Varotsis, C. (2002) J. Biol. Chem. 277:32867.
Isótopos y posición de las bandas
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Unión de ligandos
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Sir Chandrasekhara Venkata Raman, ( சந்தி�ரசேசகர வெங்கடர�மன்)Tiruchirapalli, Tamil Nadu -7/11/1888 Bangalore, Karnataka - 21/11/1970
Premio Nobel de Física 1930
Técnicas: RamanDispersión inelástica de fotones
estados electrónicos virtuales
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muestra
Láser, luz monocromática
Monocromador,
espectrógrafo
Regla de selección:
Para que la vibración sea activa en Raman debe provocar un cambio en la polarizabilidad de la molécula.
Ventajas de Raman con respecto a IR1. Se mide en el visible o el UV donde los detectores son mucho
más sensibles2. El agua produce una dispersión Raman muy débil3. La resonancia Raman permite sondear grupos asociados a
cromóforos con una sensibilidad 102- 104 veces mayor
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N N
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Resonancia Raman
estado electrónico excitado
estado electrónico basal
estado energético virtual
Raman
ResonanciaRaman
La resonancia Raman es más intensa que la dispersión Raman, pero necesita que exista un cromóforo y sólo se intensifican las bandas debidas al cromóforo
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27Das, T. K., S. Mazumdar and S. Mitra (1998). Eur J Biochem 254(3): 662-70
= 406.7 nm
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28
Spiro, T. C. and Strekas, T. G. (1973) JACS 96: 338
[hemo] = 0.34 mM[SO4
2-] = 400 mMSO4
2-
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Unión de óxido nítrico a superóxido reductasa de Pyrococcus furiosus
= 476 nm
Uso de isótopos
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Espectro IR de BSA sólida (azul) y espectro Raman de BSA en solución en amortiguador de fosfato (rojo).
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Infrarrojo y Raman
• El fenómeno de absorción es más intenso por lo que se requieren muestras menores
• El equipamiento es más sencillo y de uso más flexible
• No presenta interferencias con otros fenómenos físicos (p. ej. fluorescencia)
• Se mide en el visible o UV donde los detectores son mucho más sensibles
• El agua produce una dispersión Raman muy débil
• El Raman resonante permite sondear grupos asociados a cromóforos con una sensibilidad varios órdenes de magnitud mayor
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Introducción a la espectroscopía vibracional
1. .Conceptos básicos Estados vibracionales y energía Modos normales de vibración frecuencia de vibraciones
2. .Técnicas Espectroscopía infrarroja Regiones del IR
Grupos funcionales "Huellas digitales"
Número de ondas e intensidad Reglas de selección FTIR y sus ventajas
Espectroscopía Raman Dispersión inelástica de
fotones (Stokes y anti-Stokes) Reglas de selección Ventajas sobre el IR Resonanacia Raman
3. .Aplicaciones a proteínas Análisis de estructura
secundaria Cálculos Asignaciones Uso de isótopos Grupos laterales