07-kultura-biljnih-elija

5/13/2018 07-kultura-biljnih-elija - slidepdf.com

http://slidepdf.com/reader/full/07-kultura-biljnih-elija 1/33

KULTURA BILJNIH ELIJA I

TKIVA IN VITRO



In vitro kultura?

In vitro kultura biljnih elija, tkiva i organa je

posebna grana biotehnologije biljaka koja

predstavlja skup tehnika za aseptino

(sterilno) gajenje i vegetativnorazmnoavanje biljaka, biljnih organa, tkiva i

elija, u hranljivom medijumu definisanog

sastava i pod kontrolisanim uslovima

sredine.



Biljne eli je i tkiva imajusposobnost da rastu i da se

razvi jaju kada se izoluju izorganizma i gaje nasintetikoj podlozi.

Totipotencija - Sposobnost

biljn

ihel

i ja da se in vitrodedif erenciraju, dele i da

regener iu pojedine organe,embr ione ili celu biljku

Plastinost ± sposobnostbiljke da menja svoj programrasta, razvia i metabolizma,u zavisnosti od uslova isignala iz spoljanje sredine.



Postoje razliiti tipovi biljnih kultura in vitro.

Prema tipu eksplantata ± za pokretanje kulture

in vitro se mogu kor istiti gotovo svi delovi biljke

tj. razliiti eksplantati, poev od embr iona,

preko delova kli janaca - korena, kotiledona,epikotila i hipokotila (kod dikotila), odnosno

mezokotila i koleoptila (kod monokotila) i svih

delova odrasle biljke, ukljuujui listove, lisne

peteljke i delove cveta.



Prema nameni, kulture se klasifikuju kao

kulture haploida, kulture korenova, kulture

za mikropropagaci ju, in vitro propagaci ja,somatska embr iogeneza, somaklonalno

var iranje,...

Prema toma kakav je rast: organizovan,neorganizovan i meovit rast



Vegetativno razmnoavanje biljaka u kultur i

in vitro



Gde se vr i vegetativno

razm

noav

anje biljaka

in vitro

kontaminacija

Laminarna komora



Mikropropagaci ja u uem i irem smislu

Sl. Mikropropagacija u uem i irem smislu 1 sakupljanje bonih I vr nih pupoljaka; 2 ± uvoenje pupoljaka

u kulturu; 3 rast izdanaka; 4 ± multiplikaci ja izdanaka; 6 ± oiljavanje izdanaka; 7 ± adaptaci ja u staklar i. Desno

su osnovni koraci razmnoavanja in vitro putem regeneraci je izdanka iz kalusa: 1 izolovanje delova listova i

stabla kao pr imarnih eksplantata; 2 ± uvoenje eksplantata u kulturu; 3 ± indukci ja kalusa na eksplantatima; 4

± kultura nedif erenciranih kalusa; 5 indukci ja izdanaka u kalusu; 6 ± oiljavanje izdanaka; 7 ± adaptaci ja ustaklar i.



Organogeneza iz kalusa



Izdanak u kultur i Umnoavanje izdanaka

Direktna organogeneza



Prednosti vegetativnog razmnoavanja u

uslovima in vitro

1. In vitro razmnoavanje mnogo je bre od in vivo razmnoavanja 2. Mogue je umnoiti i one biljke koje ni je mogue umnoiti u in vivo

uslovima

3. Mikroklonirane biljke esto rastu bolje i bre od biljaka koje rastu u

in vivo uslovima (osloboene su od patogena i inf ekci ja bakter i jama i

gljiv

am

a) 4. U in vitro kultur i se razmnoavaju samo zdrave biljke

5. Vegetativno razmnoavanje u in vitro uslovima moe poeti sa vrlo

malo biljnog mater i jala kao poetnog eksplantata

6. Zahvaljujui kontrolisanim uslovima mogue je predvideti vremenski

proizv

odnju odreen

ihkultura

7. Veliki znaaj ovaj vid razmnoavanja naao je u ex situ zatiti

ugroenih i retkih biljnih vrsta (npr . Nepeta rtanjensis)



Nedostaci vegetativnog razmnoavanja

u uslovima in vitro

1. U nekim kulturama koje se razmnoavaju na ovaj nain genetika stabilnost je niska

2. Kod dr venastih vrsta teko je uspostaviti f or miranje

korenovog sistema in vitro

3. Prenos biljaka iz uslova in vitro u uslove in vivonekada je jako teak i mukotrpan posao

4. Regenerativna sposobnost se moe izgubiti nakon

nekoliko subkultura kalusnog tkiva

5. U nekim sluajevima ster ilizaci ja eksplantata koji se uvode u kulturu in vitro je izuzetno teka



Komercijalizacija mikropropagacije 1970s & 1980-tih Murashige 1974

Broad commercial application



ta je organogeneza? Organogeneza u

najosnovni jem obliku

znaenja predstavlja proces

obrazovanja jedinki.

U in vitro uslovima

kontrolisanje organogeneze

se vr i dodavanje odreenih

komponenti, a najbitni je

meu komponentama jesuFITOHORMONI.



Skoog i Miller hipoteza

Prekretnica, 1957. balans citokinina i

auksina regulie organogenezu kalusa -

Skoog i Miller

Ova hipoteza govor i o odnosu

koncentraci ja auksina i citokinina u

hranljivom medi jumu i kako zapravo date

koncentraci je utiu na mor f ogenezu uuslovima in vitro



Dokazi Milerove hipoteze

Ako se kalusno tkivo prenese na hranljivu podlogu koja sadri veukoncentraci ju auksina nego citokinina, pojavie se korenovi. Ako jekoncentraci ja citokinina vea od koncentraci je auksina, pojavie se pupoljci.

Dejstvo citokinina i auksinana organogenezu moe se

pokazati sledeimpr imerom. Ako se izolujedeo tkiva stabla duvana igaji na hranljivoj podlozikoja sadri potrebnenutr itivne sastojke, a od

hor mona se dodaju auksin(indol-siretna kiselina) icitokinin (kinetin) u istimkoncentraci jama, doi edo deobe eli ja i njihovog

uv

eav

anja. N

a ov

akv

om

medi jumu stvara se kaluskoji se sastoji od masenedif erenciranih eli ja.



Kod Gl oxinie

BA 0.3 0.3 0.3 0.3 0.3

(mg/L)

NAA 0 0.1 0.3 1.0 3.0



Kultura kalusa Kultura tkiva odnosno kultura kalusa je tehnika kojom

se tkivo moe odravati u nedif erenciranom stanjuneogranieno dugo.

Kultura kalusa se moe dobiti iz bilo kog vegetativnog

tkiva dedif erenci jaci jom, tako da kalusna tkiva najee

nisu f otosintetika.

Kalusi se esto gaje u mraku jer svetlost moe podstai

dif erenci jaci ju.

Kalusi se, generalno, mogu podeliti na dva tipa:

kompaktne i rastresite.



SOM ATSKA EMBRIOGENEZA

Somatska embriogeneza je proces u kome

haploidne ili diploidne somatske eli je prolaze

kroz karakter istine embr ionalne stadi jume bez

f uzi je gameta i mogu stvarati kompletne biljke Pr vi somatski embr ioni dobi jeni su u kultur i eli ja

argarepe



1. Direktna (neposredna) embriogeneza - embr ioni se stvaraju

neposredno iz pojedinanih eli ja, to moe smanjiti stepen

var i jabilnosti u kultur i. Na razvoj ovih embr iona utie sastav

hranlj

ive podloge

i izbor eksplantata

.

Direktna somatska embr iogeneza



2. Indirektna (posredna) embriogeneza - ovom

metodom se pr vo stvara kalusno tkivo u k ome se

kasni je zameu embr ioni

Indirektna

somatska

embr iogeneza



³Pr irodna´ somatska embr iogeneza, kao alternativna strategi ja reprodukci je biljaka



Kultura protoplasta



ta je protoplast

Protoplasti su gole biljne eli je, bez eli jskogzida, tako da su zatiene jedino plazmalemom.

Protoplasti mogu iznova da regener iu eli jski

zid, da rastu i da se dele

Kultura protoplasta, Äogoljenih³ eli ja bez

eli jskog zida, se moe dobiti bilo iz eli jske

suspenzi je, bilo direktno iz mezofila lista. eli jski

zid se obino uklanja enzimskim tretmanom,

dejstvom celulaza i pektinaza u rastvoru visokog

osmolar iteta.



Uklanjanje eli jskog zida omoguava i fuziju

protoplasta i dobi janje intra- ili interspeci jskih

somatskih hibrida.

Protoplasti su idealan mater i jal za transf or maci ju

pomou razliitih tehnika, kao to su elektroporaci ja,

mikroinjektiranje ili hemi jska transf or maci ja

Prebacivanjem protoplasta na vrst medi jum se dobi jaju

kalusi, iz kojih se mogu regener isati cele biljke biloorganogenezom, bilo somatskom embr iogenezom.



Principi gajenja biljaka u kulturi in vitro

Gajenje in vitro kultura podrazumeva kontrolu svih

relevantnih inilaca (f aktora), poev od izbora

eksplantata i uspostavljanja aseptinih (ster ilnih) uslova,

preko manipulacie razvia u kultur i putem definisanja

sastava medi juma, pr venstveno balansa hor mona, do

kontrole spoljanjih f aktora sredine kao to su svetlost,

vlanost i temperatura.

Kultura in vitro se uvek uspostavlja u aseptinim

uslovima, kako ne bi dolo do razvoja gljiva i bakter i ja,

koje spreavaju rastenje i razvie biljaka.



Rad sa in vitro kulturom podrazumeva i neke od vidiva ster ilizaci je kao to su:

1.S

terilizacijaS

terilizacija autoklaviranjemautoklaviranjem (na ovaj nain sesteriliu medijumi za gajenje biljaka, kao i posude u kojima sebiljke gaje npr. teglice, erlenmajeri, boce, tegle, epruvete,petri kutije,...)

2. SterilizacijaSterilizacija iskuvavanjemiskuvavanjem ( na ovaj nain najee se

steriliu instrumenti za rad koji su neophodni primanipulativnim tehnikama u laminaru)

3. SterilizacijaSterilizacija biljnogbiljnog materijalamaterijala ( koja je jo oznaena ikao dezinfestacija). Za ovu sterilizaciju se najee koristirazblaenaNaClO (varikina ili domestos).

4. SterilizacijaSterilizacija filtriranjemfiltriranjem, gde se pomou specijalnihfilter papira vri sterilizacija nestabilnih jedinjenja kao to jenpr. ABA, GA3, antibiotici ili neki vitamini. Ove komponente senaknadno dodaju u prohlaeni medijum.



Autoklav



Medijumi za gajenje biljaka mogu biti vrsti,

poluvrsti ili teni.

Za veinu kultura optimalan pH podloge je 5.8 ± 0.2.

Teni medi jum za razliku od vrstog ne sadri agar .

Vrlo bitna komponenta svakog medi juma jesu i makro i

mikro soli, kao i vitamini.

Medi jum koji je razliven u erlenmajere



Prostor za gajenje biljaka

Posebne prostor i je sa optimalnim uslovima za gajenje biljaka

07-kultura-biljnih-elija

Documents