Referat general Aciunea radicalilor liberi la nivelul cardiac

J.M.B.

ef lucr.dr. Nicoleta Taus, dr. Laurian Taus, Mirela Donea, dr. Monica Potrovia, as.univ.dr. Daniela Marinescu, ef lucr.dr. Ligia Neica Universitatea Transilvania din Braov, Facultatea de Medicin Spitalul Clinic Judeean de Urgen Braov Direcia Sanitar Veterinar i pentru Sigurana Alimentelor Braov Abstract:A significant number of in vitro and animal studies have demonstrated ROS activation in the cardiovascular system in response to various stressors and in the failing heart. Hypoxia / reoxygenation increases level of oxidative species and attenuation of those species protects cardiomyocytes from induced damage. Keywords: ROS activation, stress, heart

Introducere Inima este cel mai susceptibil organ la mbolnvire prematur i stres oxidativ indus de radicalii liberi. Alterrile induse de radicalii liberi pot fi rezultatul leziunilor acute de ischemie reperfuzie, deteriorrilor endoteliale date de hiperhomocisteinemii ca i a alterrilor oxidative secundare peroxidrii lipidelor. Metalele grele din organism, n special cele tranziionale Fe i Cu, sunt capabile s iniieze reacii adverse la radicali liberi. Bardenheuer a demonstrat c nainte de angioplastia coronarian transluminal percutan, n condiii de perfuzare normal, concentraiile de adenozin i hipoxantin erau 176 34 nM respectiv 723 73 nM. La 30 secunde dup dezumflarea balonului, concentraiile adenozinei erau crescute direct proporional cu durata ocluziei: 326 47 nM la 30 secunde, 531 80 nM la 60 secunde i 793 150 nM la 90 secunde. n timpul reperfuziei au fost obinute rezultate similare i n cazul hipoxantinei i acidului uric [4]. Miocardul de obolan izolat supus la 15 minute de ischemie, urmate de 30 de minute de reperfuzie a prezentat acumulri concomitente de Ca2+ liber (tehnica indo-1- fluorescenei) i degradarea fosfolipidelor membranare, indicat de creterea coninutului intracelular de acid arahidonic (IVANICS et al.). Aceast observaie este sugestiv pentru o relaie a fluorescenei legat de Ca2+ i acumularea de acid arahidonic, probabil datorit unei stimulri a fosfolipazei A2 (PLA2) mediat de Ca2+ [8]. Performana muchilor papilari izolai n perioada de hipoxie a fost mbuntit de pre26

zena manitolului hiperton [19]. Acest lucru se datoreaz creterii cantitii fluxului colateral ntr-o zon miocardic ischiemizat, demonstrat pe un model experimental utiliznd o inim intact [16]. n miocardul de iepure reperfuzat, MnSOD a avut un efect crescut de protecie pn la o doz reperfuzat de 5 g/ml, peste aceast valoare pierzndu-i capacitatea protectoare, iar la doze foarte mari (peste 50 g/ml) a exacerbat leziunea. n timp ce inimile izolate de iepure reperfuzate cu soluii tampon standard pentru 45 de minute au prezentat o eliberare marcat de GSSG (glutation oxidat) cu un peak la 5 minute de la reluarea fluxului, GSSH eliberat din inimile tratate cu SOD timp de 15 minute i apoi cu perfuzie standard alte 30 de minute, a fost neglijabil [17]. Tratamentul celulelor miocardice la oarece cu SOD (Cu,Zn-SOD 100u/ml) a suprimat semnificativ alterrile celulare induse de hipoxie. Din moment ce SOD a suprimat i fragmentarea ADN indus de hipoxie, mbuntirea supravieuirii celulare de ctre SOD se crede a fi mediat prin efectul su antiapoptotic. Aciunea radicalilor liberi la nivelul miocardului hipoxic Ide i colaboratorii au realizat un model experimental de infarct miocardic i remodelare ventricular creat prin ligaturarea timp de 4 sptmni a arterei coronare anterioare descendente. Ide a identificat n acest model experimental prezena radicalilor OH care provin de la anionul superoxid, ct i formarea de peroxizi lipidici n mitocondrie, n numr crescut n

Referat generalventriculul stng post ischemie. Daneshrad demonstreaza c n condiii de hipoxie artificial (expunerea n condiii de 10% oxigen pentru 3 sptmni) se produce o cretere a activitii hexokinazei n ventriculul drept i stng i n septul inimii de obolan, precum i o scdere a activitii hidroxiacilCoA-dehidrogenazei n miocardul ambilor ventriculi [6]. Exist din ce n ce mai multe dovezi c multiple proteinkinaze, mitogen activate, sunt sensibilizate n timpul ischemiei i/sau reperfuziei i pot contribui la modificrile structurale i funcionale dup ischiemia miocardic [1]. Expunerea celulelor miocardice de obolan la ischemie, au avut ca rezultat o activare rapid i tranzitorie a kinazelor reglate de semnale extracelulare, p38 i c-Jun NH2protein-kinaza. n reoxigenare s-a observat activarea tuturor celor 3 protein-kinaze mitogen activate; peak-urile activitilor au crescut cu 5,5, 5,2 i respectiv 6,2. Inspecia vizual a acestor celule cardiace expuse la cicluri ischemie/reoxigenare a identificat c 18,6% dintre celule manifestau modificri caracteristice apoptozei, care au fost confirmate prin fragmentarea AND-ului. Miocitele tratate cu PD 98059, un inhibitor de proteinkinaz mitogen activat/ kinaz reglat de semnale extracelulare (MEK 1/MEK 2), au manifestat o supresie a activrii kinazelor reglate de semnale extracelulare, indus de ischemie/reoxigenare, n timp ce activitile p38 i ale proteinkinazei c-Jun NH2terminale au fost crescute cu 70,3% i respectiv 55% n plus numrul de celule apoptotice a crescut cu 33,4%. Prin pretratamentul celulelor cu SB 203580, un inhibitor al p38 i al proteinkinazei c-Jun NH2-terminale, numrul de celule apoptotice indus de ischemie/reoxigenare plus PD 98059 a fost redus cu 42,8% respectiv 63,3%. Culturi de cardiomiocite de la obolani de 3 zile, expuse la 40 mmHg presiune de O2, n primele 24 de ore au artat uoare balonizri ale cristelor mitocondriale. La 48 de ore toate mitocondriile erau balonizate cu cristele mitocondriale distorsionate, iar membrana extern mitocondrial era frecvent ntrerupt. Matricea mitocondrial era clar i coninea zone electrono-dense difuze. Sau observat i fragmentri ale mitocondriilor. 27

J.M.B.Au fost de asemenea observate modificri majore, cum ar fi marginaia cromatinei nucleare, dezintegrarea nuclear i clarificarea sarcoplasmei cu pierderea frecvent a membranei celulare. Miofilamentele au fost deteriorate, i unele miofibrile erau ntrerupte i dispuse haotic. Dup 20 de minute de expunere n atmosfer cu 5% O2, reoxigenarea timp de 5 ore a cauzat o cretere n volum a reticulului sarcoplasmic, tubulilor T i mitocondriilor, n special la obolanii mai tineri; o cretere a densitii distruciilor lipidice, vacuolare i mitocondriale. Reperfuzia postischemic scoate n eviden relevana porilor de tranziie permeabili n metabolismul NAD+. Coninutul intramitocondrial de NAD+, care este intens afectat pe perioada ischiemiei, devine aproape depleionat odat cu reluarea fluxului coronar (dup o perioad lung de ischemie). Inhibarea depleiei NAD+ mitocondrial sugereaz c dup reperfuzie creterea Ca2+ intracelular, mpreun cu creterea generrii de radicali liberi, produc deschiderea porilor de permeabilitate tranzitorie, cauznd eliberarea NAD+ intramitocondrial, cu hidroliza secundar a acestuia. Inhibarea porilor nu doar previne scderea NAD+ mitocondrial, dar i protejeaz semnificativ viabilitatea celulei, fapt dovedit prin mai multe modele experimentale. Rigiditatea miocardic n insuficiena contractil reversibil, ce apare frecvent n cardiomiopatia ischemic este asociat cu degradarea selectiv a troponinei I, rezultnd o molecul trunchiat care prezint o reducere considerabil a sensibilitii fa de Ca2+. S-a postulat faptul c suprancrcarea intracelular cu Ca2+ datorit ischemiei severe ar putea activa o proteaz Ca2+-dependent, care n schimb cliveaz troponina I. Klairguti i colaboratorii au demonstrat c endotelina 1 (ET 1) miocardic este crescut dup 20 de minute de ischemie, i au sugerat c ET 1 ar putea juca un rol de inductor al apoptozei [9]. Sybers precizeaz c apare o cretere accentuat i dependent de timp a semnalelor ESR corespunztoare complexului NO-Fe (II) N-metil-D-glucamil ditiocarbonat ce a fost observat n zona ischemic la 8 ore i la 24 de ore dup ischiemie miocardic indus de ocluzia arterei coronare stngi [16]. In vitro, cardiomiocitele fetuilor de oarece reaprovizionate cu

Referat generalO2 i glucoz dup o or de deprivare au prezentat degenerri mitocondriale, miofibrilare i granule de glicogen nconjurate de o membran simpl sau dubl care era incomplet. Vacuolele au fost n mod obinuit localizate n regiunea perinuclear, iar membrana nuclear a prezentat n mod frecvent o concavitate adiacent vacuolelor, ca i cum ar fi fost format prin presiunea vacuolelor asupra ei [16]. Aciunea radicalilor liberi la nivelul endoteliului capilar Stresul oxidativ altereaz multe funcii ale endoteliului inclusiv modularea tonusului vasomotor. Inactivarea oxidului nitric prin radicalul superoxid i alte specii reactive de oxigen, pare a se produce n condiii de HTA, hipercolesterolemie, diabet zaharat, fumat. Toi aceti factori de risc predispun la ateroscleroz. Moncada indic c unul dintre evenimentele precoce ce apar dup reperfuzia unui pat vascular ischiemiat este o disfuncie semnificativ a endoteliului caracterizat prin pierderea factorului relaxant endotelial, cunoscut astzi ca oxid nitric (NO) [14]. Acesta poate contribui semnificativ la leziunile de reperfuzie, deoarece se tie c NO produce vasodilataie, inhib agregarea plachetar, atenueaz aderena i activarea PMN, distruge radicalii superoxid [7, 15]. Donorul de NO -C87-3754 a prevenit vasoconstricia coronarian determinat de PMN-urile activate i a atenuat majoritatea disfunciilor endoteliale la nivelul inimii de pisic ischemiat i reperfuzat [11]. Babbs demonstreaz ca generarea radicalului superoxid se produce n apropierea suprafeei luminale a celulelor endoteliale, arteriolelor, venulelor i capilalelor n primele 2 minute de reoxigenare, dup 60 de minute de ischemie n inimile izolate de la obolan [2]. Experimental, arterele coronare, cu endoteliu intact izolate de la porc au generat radical superoxid cu o vitez de 90 0,8 Pm/min/mg de substan uscat. Aceast vitez a fost diminuat cu aproximativ 24% cnd endoteliul a fost ndeprtat. Colorarea seciunilor arteriale cu nitroblue tetrazoliu a avut ca rezultat formarea unui precipitat de formazan n principal la nivelul intimei. n inimile de obolan perfuzat conform tehnicii Langendorff, radicalul superoxid a 28

J.M.B.crescut eliberarea prostanoizilor vasoconstrictori (TxA2, PGF2) i i-a sczut pe cei vasodilatatori (PGI2 PGE2). Cu toate c indometacinul (administrat n doza de 10 M) un inhibitor al ciclooxigenazei a atenuat creterea presiunii de perfuzie a coronarelor n timpul perfuzrii O2.creterea nu a fost complet blocat. OKY-046 Na (administrat n doza de 10 M) un inhibitor al sintezei tromboxanului nu a avut nici un efect asupra creterii presiunii de perfuzie a coronarelor determinate de O2.- pe cnd ONO3708 (10 M) un antagonist al receptorilor TxA2 (PGH2) a diminuat acest efect. Chen arat c leziunile miocardice perfuzate (prin metod Langendorff) ale oarecilor cu modificri genetice, care au prezentat o supraexprimare a Cu/Zn SOD n celulele coronarelor, au fost atenuate dup 45 de minute de reperfuzie ce au urmat dup 35 de minute de ischemie global comparativ cu leziunile depistate la inimile nemodificate genetic [5]. De asemenea a existat i o eliberare scazut a LDH n inimile oarecilor cu modificri genetice. Mehta i Li au incubat celulele endoteliale din arterele coronare umane cu urmtoarele substane: epinefrin (10-9-10-5M); analogul hidrosolubil al vitaminei E trolox (10-5M); vitamina E liposolubil (5X10-5M) i atenolol (10-5M) [13]. La o or respectiv la 24 de ore de incubare cu epinefrin, generarea radicalilor superoxid a crescut cu 102% respectiv 81%. Au fost crescute i activitile Mn SOD i Cu/Zn SOD. Tratamentul celulelor n prealabil cu trolox i vitamina E a sczut generarea de radical superoxid, iar tratarea celulelor cu atenolol a blocat up-reglarea SOD. Ballinger evideniaz leziunile ADN n endoteliocitele din vena ombilical uman expus la superoxid, hidrogen peroxid, oxid nitric i tocoferol, peroxinitrit. Att n endoteliocite ct i n miocitele din aorta uman leziunile s-au nregistrat mai frecvent la nivelul ADN-lui mitocondrial comparativ cu ADN-ul nuclear [3]. Sinteza proteinelor mitocondriale a fost inhibat dependent de doza de peroxinitrit, rezultatul fiind o scdere a nivelelor intracelu-

Referat generallare de ATP i a funciei redox mitocondriale. n culturi de endoteliu de ven safen uman incubate 2 ore n condiii de hipoxie, aderena neutrofilelor a crescut de 5-6 ori comparativ cu rezultatele obinute n condiii de normoxie. Maxwell i Ward au observat c o combinaie ntre SOD i catalaza a micorat att sngerrile la nivelul membranei luminale ct i balonizarea celulelor endoteliale n inimile de obolani supuse la ischemie/reperfuzie. Trolox, un analog hidrosolubil al tocoferolului, a redus sngerarea asemntor SOD [12,18]. Pretatamentul cu N-(2-mercaptopropionil)-glicina, un ndeprttor de ROS a inhibat complet inducia proteinei 1 -chemotactice monocitare n infarctele reperfuzate la cine. In vitro tratarea culturilor de endoteliu obinute din vena jugular de cine cu H2O2 a determinat o cretere, dependent de doze, a nivelelor ARNm a proteinei 1-monocitare chemotactice. Acest proces ce a fost inhibat de N-acetil-L-cisteina (un precursor al glutationului) dar nu a fost inhibat de pyrolidindithiocarbonat. n anumite circumstane NO s-a dovedit a avea un efect protector a celulelor endoteliale fa de speciile reactive de oxigen produse la acest nivel n condiii de ischemie/reperfuzie. Okayama i colaboratorii au examinat adeziunea PMN de celulele endoteliale, ca marker al stresului oxidativ endotelial. n acest scop au folosit celule endoteliale din vena ombilical umana i NO i H2O2 utilizate n alte teste similare. Creterea adeziunii determinate de NO i H2O2 a fost atenuat semnificativ de 0,1 mM desferioxamina ct i de 1 mM metionina. NOS endotelial (NOS III, NOSendetolial) este exprimat n sistemul cardiovascular i este foarte fin reglat de Ca 2+ 100-500 nmol/L, i de calmomodulin. Activarea eNOS att n condiii de ischiemie ct i mediate de receptor a crescut reactivitatea NADPH- diaphorazei n miocardul de obolan. Procesul a fost cuantificat prin msurarea anticorpilor formai mpotriva aminoacizilor din domeniul central al eNOS de origine bovin sau din captul N-terminal al eNOS uman. Creterea activrii eNOS a fost asociat cu o cretere a coninutului GMPc. n miocardul 29

J.M.B.uman supus la ischemie n timpul operaiilor pe cord, reperfuzia precoce a crescut activitatea eNOS. Inhibarea sintezei NO de diveri NOS inhibitori a crescut eliberarea de oxidani leucocitari i a stimulat rularea i adeziunea neutrofilelor de celulele endoteliale. Adeziunea neutrofilelor poate fi blocat prin anticorpi anti CD18 sau anti - ICAM. Inhibitorii NOS pot determina agregarea leucocitelor de plachetele sangvine, proces care este atenuat de 8-Br-GMPC ct i de anticorpi mpotriva selectinei P. Leucocitele aderente au prezentat o cretere a nivelelor de GMPC. Adeziunea pe termen scurt a neutrofilelor de colagenul I poate fi redus de S-nitrozopenicilinamina (NO donor) i 8-Br-GMPC. Dup incubare ndelungat nu s-au observat diferene ntre celulele tratate cu S-nitrozopenicilinamin i cele netratate, sugernd c efectul a fost mediat de NO. Kokura i colaboratorii au expus endoteliocite dispuse n monostrat, recoltate din vena ombilical uman la 60 de minute de anoxie i ulterior la 24 de ore de reoxigenare; dup 6 ore de reoxigenare au fost adugate limfocite T umane. Dup 18 ore de incubare, cultura de limfocite T endoteliocite a fost pus n contact cu o alt cultur coninnd celule endoteliale dispuse n monostrat i neutrofile. Nu s-a observat o cretere a adezivitii neutrofilelor de celulele endoteliale, n schimb adezivitatea a fost crescut la adugarea de limfocite T. Aceast cretere se datoreaz creterii nivelelor de TNF i IL-8 n culturile de limfocite T endoteliocite asociat cu o cretere n expresia E-selectinei endoteliale. Tratarea culturii de limfocite T endoteliocite cu anticorpi anti TNF sau anti IL-8 a redus adezivitatea neutrofilelor [10]. Pentoxifilinul a sczut producia TNF i a inhibat aciunea acestuia asupra neutrofilelor. NO eliberat din endoteliu difuzeaz att n celulele musculare netede ct i n lumenul vascular, iar prin stimularea guanilatciclazei plachetare inhib agregarea plachetar. Este posibil ca efectul s se produc doar n lumenul vascular, NO fiind rapid inactivat prin legare de hemoglobin. NO stimuleaz legarea guanilatciclazei solubile de gruprile prostetice ale hemoglobinei i determin o cretere a activitii ei de

Referat generalpn la 400 de ori. Dintre toi radicalii NO (NO+, NO-, NO) doar NO a determinat o cretere a activitii enzimei. Bradikinina crete semnificativ invaginrile membranare i formarea veziculelor n endoteliul izolat din inima de oarece. Inhibarea secreiei bazale de NO cu NG_ nitro-L arginin nu a produs modificri n procesul de formare al veziculelor. Nitroprusiatul de Na a sczut numrul veziculelor. Endoteliul poate interaciona cu plachetele circulante n cel puin 2 moduri. n primul rnd produii eliberai din plachete (ADP, serotonin) s-au dovedit stimulatori poteni ai factorului relaxant endotelial. Un al 2-lea mecanism implic aciunea direct a factorului relaxant (antiagregant plachetar potent). Prostaciclina (PGI2) sintetizat de celulele endoteliale i eliberat predominant spre lumenul vascular acioneaz prin intermediul adenilatciclazei. La nivelul plachetelor crete cantitatea de AMPC, inhib adeziunea, agregarea acestora i determin eliberarea de substane proagregante i vasoconstrictoare (serotonina, ADP, TX A2). Bibliografie: 1. Abe K., Morita S., Kikuchi T., Itoyama Y. Protective effect of a novel free radical scavenger, OPC-14117, on wobbler mouse motor neuron disease. J Neurosci Res, 1997, 48, 63-70. 2. Babbs C.F. - Histochemical demonstration of O2 - generation by rat lung endothelium. Free Radic Biol Med, 1990, 9 [Suppl 1], 29. 3. Ballinger S.W., Patterson C., Yan C.N., Doan R., Burow D.L., Young C.G., Yakes F.M., Van Houten B., Ballinger C.A., Freeman B.A., Runge M.S. - Hydrogen peroxide and peroxynitrite-induced mitochondrial DNA damage and dysfunction in vascular endothelial and smooth muscle cells. Circ Res, 2000, 86, 960-966. 4. Bardenheuer H.J., Fabry A., Hfling B., Peter K. - Adenosine: a sensitive marker of myocardial ischaemia in man. Cardiovasc Res, 1994, 28, 656-662. 5. Chen S.F., Chan P.H., Yu A.C.H. Induction of intracellular superoxide radical formation by arachidonic acid and by polyunsaturated fatty acids in primary 30

J.M.B.astrocytic cultures. J Neurochem, 1988, 50, 1185-1193. 6. Daneshrad Z., Garcia-Riera M.P., Verdys M., Rossi A. - Differential responses to chronic hypoxia and dietary restriction of aerobic capacity and enzyme levels in the rat myocardium. Mol Cell Biochem, 2000, 210, 159-166. 7. Furchgott R.F., Vanhoutte P.M. - Endothelium-derived relaxing and contracting factors. FASEB J, 1989, 3, 2007-2018. 8. Ivanics T., Mikls Z., Dzsi L., Ikrnyi K., Tth A., Roemen T.H.M., Van der Vusse G.J., Ligeti L. - Concomitant accumulation of intracellular free calcium and arachidonic acid in the ischemic-reperfused rat heart. Mol Cell Biochem, 2001, 226, 119-128. 9. Kliment C.R., Suliman H.B., Tobolewski J.M., Reynolds C.M., Day B.J., Zhu X., McTiernam C.F., McGaffin K..R, Piantadosi C.A., Oury T.D. - Extracellular superoxide dismutase regulates cardiac function and fibrosis. Mol Cell Cardiol., 2009 Nov, 47(5), 730-742. 10. Kokura S., Wolf R.E., Yoshikawa T., Granger D.N., Aw T.Y. - T-Lymphocyte derived tumor necrosis factor exacerbates anoxia-reoxygenationinduced neutrophil endothelial cell adhesion. Circ Res, 2000, 86, 205-213. 11. Lefer A.M., Carey C., Siegfried M.R., Ma X.-l., Weyrich A.S. - Antishock and endothelial protective actions of a NO donor in mesenteric ischemia and reperfusion. Circ Shock, 1992, 38, 209-216. 12. Maxwell D.S., Kruger L. - Changes in oligodendrocyte organelles during neuronal degeneration. In: VIII. Internationaler Anatomenkongress. Wiesbaden, 8.-13. August 1965. Zusammenfassungen der Vortrge, wissenschafliche Demonstrationen und Filme. Zusammenfassung der Vortrge in den Symposien. Thieme, Stuttgart, 1965, S 76-77 13. Mehta J.L., Li D. - Epinephrine upregulates superoxide dismutase in human coronary artery endothelial cells. Free Radic Biol Med, 2001, 30, 148-153. 14. Moncada S., Moilanen E., Moilanen T., Knowles R., Charles I., Kadoya Y., AlSaffar N., Revell P.A. - Nitric oxide synthase is expressed in human macrophages

Referat generalduring foreign body inflammation. Am J Pathol, 1997, 150, 881-887. 15. Radovsky A., Katz L., Ebmeyer U., Safar P. - Ischemic neurons in rat brains after 6, 8, and 10 minutes of transient hypoxic ischemia. Toxicol Pathol, 1997, 25, 500-505. 16. Sybers H.D., Ingwall J., Deluca M., Ross J. Jr - Effects of transient hypoxia on ultrastructure in fetal mouse heart organ culture. 10th International Congress, International Academy of Pathology, Hamburg, Germany, September 16-21, 1974, p 10 [Abstract]. 17. Tritto I., DAndrea D., Eramo N., Scognamiglio A., De Simone C., Violante

J.M.B.A., Esposito A., Chiariello M., Ambrosio G. - Oxygen radicals can induce preconditioning in rabbit hearts. Circ Res, 1997, 80, 743-748. 18. Ward B.J., Scoote M. - Antioxidants attenuate postischemic endothelial cell swelling and luminal membrane blebbing in cardiac capillaries. Microvasc Res, 1997, 53, 179-186. 19. Willerson J.T., Pasceri V., Wu H.D., Yeh E.T.H. - Modulation of vascular inflammation in vitro and in vivo by peroxisome proliferator-activated receptor activators. Circulation, 2000, 101, 235-238.

31