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H. Emil Fischer:
structural proof of glucose and othermonosaccharides
J. MacLean: heparin isolation and use as ananticoagulant
P.A. Levene:
structure of 2-deoxyribose inDNA
W.N. Haworth:
monosaccharidering structures(pyranose, furanose)
;L>L)
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.&);LQRO)
C.F. Cori and G.T.
Cori: role of glucose-1-phosphatein glycogen synthesis
;LQP)MB1:%$)7-.N%)
.&);LSRO)
L. Leloir: role of nucleotide sugars in glycanbiosynthesis
;LSL)MB1:%$)7-.N%)
.&);LR?O)
G.E. Palade:
ER-Golgi pathwayfor glycoprotein biosynthesis and secretion
;LP;T;LP<)MB1:%$)
7-.N%).&);LRSO)
K.O. Lloyd, J. Porath, I. J. Goldstein: affinity purification of glycoproteins using lectins
;LR?)
P.K. Qasba, J. Shaper,N. Shaper: cloning of the first animalglycosyltransferase
;LKP)
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N-acetylglucosamine (GlcNAc) N-acetylgalactosamine (GalNAc) Fucose (Fuc)
Xylose (Xyl)Glucuronic acid (GlcA) Iduronic acid (IdA) Sialic acid (Sia)
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OH
O
HOHOHO
OH
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1,4
1,3
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2. RCHO, Et3SiH
3. (R1CO)2O
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1. cat. TMSOTf, ArCHO2. RCHO, Et3SiH3. TBAF4. base, electrophile
OR
1. cat. TMSOTf, ArCHO2. RCHO, Et3SiH3. acid anhydrideO
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-10 oC
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-78 oC
TTBP (1 equiv)
5 min
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120 min
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O
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OO
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OCB(5 equiv)
Tf2O (5 equiv) DTBMP (15 equiv)
CH2Cl2, -30 oC
TBAF (equiv)THF
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PhOBn
OCB(5 equiv)
RuPh
PCy3
PCy3
Cl
ClH2C CH2
CH2Cl2, overnight
O
BnO
OO
PhOBn
O
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OO
PhOBn
O
BnO
BnOO
OPiv
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CB =
CO2H
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G77$.4#,.1&),1)3$/4#&)+/&,"%(.()
Y&N/8%()f&J1$J%*).&)3$/4#&)@-14%((.&')
M96982E)&04$%1,.*%)(0'#-()#&*)*1$.4"1$T7"1(7"#,%T$.&V%*)81&1(#44"#-.*%()#&*)
1$.'1(#44"#-.*%()
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NH
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iI@T'$040-1&.4)#4.*=)3I@T8#&&1(%=)3I@T2041(%=)!5@T(.#$.4)
#4.*)
nO PO
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HODolichol-P-glucose
G$(1)I1$.4"1$T@T8#&&1(%W)I1$.4"1$T@T@T
M'$041(%QT8#&&1(%LT3$4BG4>W)i&*%4#7-%&/$T@T
@T2T#4%,/$80-#8.4)#4.*T7%&,#7%7,.*%T3$4BG4)
H<<,?7982=%9$.'1(#44"#-.*%(=)81&1(#44"#-.*%(=)7-1,%.&(=)$.7.*(=)IBG%
Glycosyl Donor +Acceptor Glycosyltransferase
Acceptor
Glycosylated+
Nucleotide orisoprenoid-P
Y&N/8%()f&J1$J%*).&)3$/4#&)@-14%((.&')H-%#V.&')3$/41(.*.4)H1&*(E)F"%)G4,.1&)12)3$/41(.*#(%(E)
Tf&".:.,1-()12)'$/41(.*#(%()*1)%b.(,W)'$/41(.*#(%()#-%)81-%)7-18.(4010(),"#&)
'$/41(/$,-#&(2%-#(%()
OHO
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Enzyme
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Enzyme
H
OR
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OHO
OO
Enzyme
O O
Enzyme
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OHO
H
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OO
Enzyme
OH
H
OO
Enzyme
OHO OH
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Enzyme
OHO
Enzyme
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OHO
OH
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O O
Enzyme
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OO
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CH3
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OHO
Enzyme
CH3
Enzyme
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EndoM-N175A
phosphate buffer (pH 7.0)
23 oC, 8 h
GlcNAc-RNase B
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O
OHHO O
OHHO
NH
ONB NFFBodipy-galactose
Example fluorescent acceptor sugar
O OH
HO
HOCO2HOH
HNAc
OH
Neu5Ac(sialic acid)
Neu5Ac-acceptor-dye
Neu5Ac
Acceptor-dye
Washing
unreacted
Acceptor-dye
Neu5Ac-acceptor-dyeFACS analysisand sorting
CstII gene library
gene library transformedand encoded in E. coli
Expressed in cytoplasm,along with CMP-Neu5Ac synthetase
CstII
CMP-Neu5Ac synthetase gene
incubation with donorsugars and fluorescent acceptor sugars
F"%)+.#$/$,-#&(2%-#(%)X%#4,.1&).&)I%,#.$)
O
HO
HOOH
HNAc
OH
O
O
O
PO O
O
O
HO OH
N
N
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CMP
O
HO
HOOH
HNAc
OH
O
OHO O
OHHO
NH
O
NB NFF
O O
O
OHHO O
OHHO
NH
O
NB NFF
CstII = sialyltransferase from Campyobacter jejuni
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O
HOHO
HO
O
HOO
HOF
OO
Enzyme
H
CH3
Mutated nucleophile (E335G)
O
HOHO
HO
O
HOO
HO
OHO
Enzyme
+ HF
H%&TI#J.*=)G6W)+"1"#8=)36W)+"1"#8=)k6)56#78)9&*(8)!"")$%?:;)<SPT<<;6)
gene library transformedand encoded in E. coli
phosphate buffer (pH 6.4)
O
HOHO
HOF(XylF)N
N NCO2Na
(methyl red)
Sort colonies that were fastest to turn red
collect similaramount of cells; centrifuge,
suspend pellet in phosphate buffer,incubate with XylF and methyl red;
look for enhanced reaction rate by absorbance at 535 nm
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Probe with lectinor glycan binding protein
1. Rinse2. Scan
Look for specificities
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NAcHOO OH
OH
OH
NAcHOO O
OH
1. Ar-NH2
2. NaCNBH3
OH
NAcHOO
HN
OH
Ar
CONH2 CO2H
NH
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NH4CO3O
HOHOO OH
OH
O
HOHOO NH2
OH O
Cl O
HOHOO
HN
OH
O
O3
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O
HOHOO
HN
OH
O
O
H
O
HOHOO
HN
OH
O
NH
H2N
NH
ONH2
NaCNBH3
OHN
NH2
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O
FmocHNAcO
AcO
OAc
O
NH
CCl3
O
R2OR3OR4O
OR6
O
NH
CCl3
O
R2OR3O
OR6
O
NH
CCl3
R4O
R2 = Lev, Ac
R3 = Lev, Ac
R4 = Lev, Ac
R6 = Lev, Ac
R2 = Lev, Ac
R3 = Lev, Ac
R4 = Lev, Ac
R6 = Lev, Ac
Building Blocks
H#&=)j6W)5-V(.4"=)56)B$0#N8)56#78)O$%8)!M8)
!"")$%<>;)QQLPTQQLL6)
Lev =
O
O
O
R2OR3OR4O
OR6
O
NH
CCl3
O
R2OR3OR4O
OR6
O SupportO
R2OR3OHO
OR6
O Support
I. Load Building Block ontoSupport
II. Remove Levulinate group for addition of second carbohydrate
III., IV. Selective deprotection stepsto reveal desired disaccharides and glycosaminosides
III. IV.
O
HOHOO
OH
O SupportO
AcHNHOHO
OH
O
HOHOO
OH
O SupportO
HOHOHO
OH
Au
S
O
O
O
OH
S
O
O
O
O
S
O
O
O
OH
HNO
HO
NaOMe/MeOH
H2NNH2•H2O
1. piperidine2. Ac2O, pyr3. NaOMe/MeOH
TMSOTf
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OO
O
AcHNHO
HO
OH
OR
variable 1st
monosaccharide
O
OO
O
HOHO
HO
OH
O
OO
O
HOHO
OH
O
HO
N
NH
O
O
O
OHHO
OP
O
OH
P
O
HO
O
O
OHHO
OH
UDP-Galactose
HO
!-1,4-galactosyltransferase I (!-GalT)
OO
O
AcHNHOO
OH
O
O
OHHO
OHHO
Products observed
in the absence of lactalbumin
OO
O
HOHO
OH
O
O
OHHO
OHHO
O Products observedin the prescence of lactalbumin
OO
O
HOHO
OH
O
HO
Galactose transferproduct not observed
G&#$/N%*)
H/)+%$2T#((%8:$%*)
81&1$#/%-()21-)
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M+G5IfTF9[)5+OE)
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,1)(,0*/):.14"%8.4#$)7-14%((%(6)
Chemical Reporter
Incorporation into biological system
Chemical Reporter
Modified protein,monosaccharide, or nucleicacid
Target
Reactive Partner
"Probe"
Chemical Reporter
Target
Reactive Partner
"Probe"
O OHOH
HOHO
N3
Yb#87$%)-%71-,%-E)
F
F
Yb#87$%)-%#4,.J%)7#-,&%-E)
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O
O
CO2H
H2N
BiosyntheticIncorporation
O O
CO2H
HO
NH
OS
O
H2NHN
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R
HSHS SH
SH
O O
CO2
HO
As AsSS SS
helical CCXXCC domain
FlAsH-EDT2
R
O O
CO2
HO
As AsSS SS
Yb,%&*.&')H.11-,"1'1&#$)X%#4,.1&()),1)
3$/4#&()
O O
HO
HO
O
HOHO
HO
OH
HN
O
O
Cellular
metabolism
CO2OH
HN
OH
O
OCell
O
NHNH2RO O
HO
HOCO2
OH
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OH
O
NCell
HN
OR
S
NHHN
O
(CH2)4-C(O)NH(CH2)5R =
!#&)*%,%4,)0(.&')[fF!T#J.*.&)
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H1/4%=)56W)H%-,1NN.=)!6)X6)2'%34#)L#%6*M")!"''$%P;)PQKTPS>6)
I%J%$178%&,)12),"%)+,#0*.&'%-)j.'#,.1&)
OCH3
O
PRPhPh
+
R'-N3
N2
OCH3
O
PR
PhPh
N R'
N
O
PRPhPh
R' H2O NH
O
PR
R'
OPhPh
U9:1[1,:%O73;:16>,8%8,3<7196%P98%;2,%16%?+521949>1<34%2527,@2=%
H??41<37196%79%<,44%2;8P3<,%P;6<7196341T37196=%
O
HOHO
HO
OH
HN
O
N3 Cellular
Metabolism O O
HO
HOCO2
OH
HN
OH
O
N3
Cell
Ph2PO
H3CO
OHN
O
O
O
HN
O
S
NHHN
O
+
O O
HO
HOCO2
OH
HN
OH
O
HNCell
Ph2P
O
O
HN
OO
O
HN
O
S
NHHN
O O
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>??RT>?;?6)
!%$$0$#-)51*.C.4#,.1&).&)5.4%)
OCH3
O
PPh2
HN
O
O2C-KDDDDKYD
Flag1.) 2.)
FITC anti-Flag
O
PPh2
HN
O
O2C-KDDDDKYD
Flag O O
HO
CO2
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ONH
OHOHHO
O
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56#78)O$%8)!M8)!""#$)<P;)PLRSTPLLK)
O
AcOAcO
AcO
OAc
HN
ON3
injected soln for7 days
isolated splenocytes
O O
HO
HOCO2
OH
OH
HN
ON3
H.11-,"1'1&#$)!$.4V)!"%8.(,-/)
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1-'#&.(8()
Biomolecule N3"Cu"
Biomolecule NNN
Biomolecule NNN
+ regioisomer
S;%C8,,%S41<W%S+,@12785%
+$%,,%&=)Y6)56W)H%-,1NN.=)!6X6)B$0#N8)56#78)O$%8)!M8)!""#$)<P;)
PLRSTPLLK)
!/4$114,/&%)!$.4V)X%#'%&,()
O
CO2H
k = 10-3M-1s-1
Second orderrate constant forreaction with alkyl azide:
CO2H
ca. 60-fold
rate increase
FF
F
O
CO2H
k = 10-1M-1s-1
+$%,,%&=)Y6)56W)H%-,1NN.=)!6X6)B$0#N8)56#78)O$%8)!M8)!""#$)<P;)PLRSTPLLK)
FF
k = 0.22 M-1s-1
(stabilized by !-cyclodextrin)
+$%,,%&=)Y6)56W)B#V#80-#=)A6W)Z%^%,,=)Z6)!6W)H%-,1NN.=)
!6X6)A8)B78)56#78)C*.8)!"'"$%?I@;);;RLL6)
B.&'=)m6W)301=)Z6W)\1$2%-,=)56)G6W)H11&(=)36TZ6)B$0#N8)56#78)O$%8)!M8)!"")$%
?@D;)>>K<T>>KR6)
O
AcOAcO
AcO
OAc
HN
O
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Esterases
O
HO
OH
OH
NH
HO
N3
O
O
HO
OHHO
OPO3-2NH
N3
O
O
HO
OH
NH
HO
UDP
N3
O
O
AcO
OAc
OAc
NH
AcO
N3
O
O
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HO
N3
O
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H$0%)t)3#$BGN)
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Golgi apparatus
Glycosyltransferase
GlcNAc Kinase,then N-acetylglucosamine-phosphate mutase
UDP-GlcNAcpyrophosphorylase
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O
AcO
OAc
OAc
NH
AcO
N3
O
60 h
N3N3
N3
N3N3
N3N3
N3
F
F
N3
N3
N3
N3
Total O-linked glycosylation
(TCEP)O
HO P
O
OH
O OH
DIFO-647
O
AcO
OAc
OAc
NH
AcO
N3
O
1 h
N3 N3
N3N3
N3
F
F
DIFO-488
N3
N3
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2.)
FITC anti-Flag
Analyzed by
Western Blot or flow "
cytometry"O
AcOAcO
AcO
OAc
HN
ON3
injected soln for7 days
Day 8: Injected with probe (FLAG conjugates)
3 h post injection;euthanized
organs homogenized and labeled with
N
MeO
MeO
OO
HN FLAG
F
F
O
HN
O
FLAG
MeO
O PPh2
NH
O
DYKDDDDK-CO2-
FLAG
DIMAC-FLAG
DIFO-FLAG PHOS-FLAG
OO
NH
FLAG
ALO-FLAG
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