110

技 术 支 撑

猫细小病毒 VP2 基因克隆与生物信息学分析

姜　伟，郭明佳，吴树康

（龙口市动物疫病预防控制中心，山东省龙口市　265701）

摘　要：为了解猫细小病毒（feline parvovirus，FPV）VP2 蛋白的分子特点及变异规律，克隆 FPV 山东分离株

SD-01 的 VP2 基因，对其进行生物信息学分析。首先，以 FPV 阳性病料基因组 DNA 为模板，PCR 扩增 VP2基因并克隆获得重组质粒 pMD18-T-FPV SD-01-VP2。测序结果显示：VP2 基因全长 1 755 bp，编码 584 个氨基

酸；氨基酸同源性比对发现，与其他 FPV 分离株的 VP2 基因氨基酸同源性较高，可达 99.0%~100%。生物信息

学分析结果显示：VP2 蛋白为非分泌型的亲水性蛋白，无信号肽和跨膜区域；二级结构中 α 螺旋、延伸链、β转角和无规则卷曲分别占 8.7%、24.5%、4.3% 和 62.5%；三级结构预测发现，VP2 蛋白以无规则卷曲为主，与

二级结构预测结果一致。亚细胞定位预测显示，VP2 蛋白不含有线粒体导肽（mTP）或分泌通道信号肽（SP），定位在细胞质和细胞核中的概率较高，分别为 47.8% 和 26.1%。B 细胞抗原表位预测结果显示，VP2 蛋白的抗

原性及表面可及性较高，共含有 11 个潜在的优势 B 细胞抗原表位。蛋白翻译后修饰预测结果显示，VP2 蛋白

可能含有 49 个潜在磷酸化修饰位点，6 个 N- 糖基化修饰位点和 21 个 O- 糖基化修饰位点，且这些修饰位点在

FPV VP2 蛋白内高度保守。本研究有助于了解我国 FPV 流行情况，掌握其重要结构蛋白 VP2 的理化性质和特性，从而为下一步 VP2 蛋白功能研究和疫苗研发奠定了基础。关键词：猫细小病毒；VP2 基因；克隆；生物信息学；遗传变异

中图分类号：S852.65　　文献标识码：A　　文章编号：1005-944X（2021）11-0110-08DOI ：10.3969/j.issn.1005-944X.2021.11.019　　开放科学（资源服务）标识码（OSID）：

Cloning and Bioinformatics Analysis of VP2 Gene of Feline Parvovirus

Jiang Wei，Guo Mingjia，Wu Shukang

（Longkou Animal Disease Prevention and Control Center，Longkou，Shandong　265701，China）

Abstract：In order to study the molecular characteristics and variation rule of VP2 gene of feline parvovirus（FPV），the VP2 gene of Shandong strain，SD-01，was cloned to conduct bioinformatics analysis. The VP2 gene was amplifi ed by PCR and cloned by taking genomic DNA of FPV positive lesions as a template to obtain the recombinant plasmid，pMD18-T-FPV SD-01-VP2. It was sequenced that the VP2 gene was 1 755 bp in length，encoding 584 amino acids；it was compared that it shared the highest amino acid homology with VP2 gene of other FPV strains，which could be up to 99.0% to 100%. It was found that，by bioinformatics analysis，VP2 protein was a non-secretory hydrophilic protein without a signal peptide and a transmembrane region. In the secondary structure，α-helix，extended chain，β-turn and irregular coil accounted for 8.7%，24.5%，4.3% and 62.5%，respectively；it was found that，by prediction of tertiary structure，VP2 protein was mainly irregular coil，which was consistent with the results obtained by prediction of secondary structure. It was shown that，by prediction of subcellular localization，neither a mitochondrial guide peptide（mTP）nor a secretion channel signal peptide（SP）was contained in the VP2 protein that was most likely located in

cytoplasm and nucleus，accounting for 47.8% and 26.1%，respectively. It was shown that，by prediction of B-cell epitopes，VP2 protein had high antigenicity and surface accessibility，containing 11 potential dominant epitopes. And it was shown that，by prediction of post-translational modifi cation，49 potential phosphorylation sites，6 N-glycosylation sites and 21 O-glycosylation sites were likely contained in VP2 protein，all of which were highly conserved in FPV VP2

收稿日期：2021-08-06　修回日期：2021-08-24通信作者：郭明佳。E-mail：252415713@qq.com

2021年第38卷第11期

111

技 术 支 撑

protein. In a conclusion，the study was helpful to learn the prevalence status of FPV in China，to identify the physical and chemical properties and characteristics of its important structural protein VP2，and subsequently to lay a foundation for future study on functions of VP2 protein and development of vaccines.Key words：FPV；VP2 gene；cloning；bioinformatics；genetic variation

猫细小病毒（feline parvovirus，FPV）又被称为猫泛白细胞减少症病毒（feline panleuko penia virus），是一种可以感染猫科、浣熊科及鼬科等多种动物的急性、致死性烈性传染病病原 [1]。该病原主要通过带毒的粪便、尿液及口腔分泌物传播，可以导致感染动物出现体温升高、呕吐、腹泻及白细胞数量严重减少等多种临床症状，且小型猫科动物对其易感性最高 [2]。

FPV属于细小病毒科（Paroviridae）细小病毒属（Parvovrius），是无囊膜的单股正链DNA病毒，其基因组主要有两个开放阅读框（open reading frame，ORF）组成，其中右侧 ORF编码重要的病毒结构蛋白——VP1和 VP2[3]。FPV衣壳主要由VP2结构蛋白组成，其含量可高达 90%。同时，VP2结构蛋白也是 FPV的主要抗原蛋白及受体结合蛋白，可以有效刺激机体产生针对 FPV的中和抗体并影响其致病性、宿主范围及血凝活性等多种生物学特性 [4-5]。

因此，本研究通过对龙口市动物疫病预防控制中心分离保存的 FPV毒株（SD-01）VP2基因进行克隆及生物信息学分析，了解 VP2蛋白的分子特点及变异规律，以期为后续疫苗及诊断试剂盒研发提供参考及理论依据。1　材料与方法

1.1　主要试剂全基因组 DNA提取试剂盒（D1800）、质粒

小量提取试剂盒（D1100），购自于北京索莱宝科技有限公司；DL 2 000 DNA Marker（3427A）、DH5α感受态细胞（9057）、pMD18-T（6011），购自于宝生物工程（大连）有限公司；Easy Taq DNA Polymerase（AP111）酶，购自于北京全式金生物技术有限公司。1.2　毒株

FPV毒株（SD-01）由龙口市动物疫病预防控

制中心从 2021年 5月山东省龙口市采集病料中分离鉴定及保存。1.3　主要方法1.3.1　引物设计与合成　参照 GeneBank中公布的 FPV全基因组序列（登录号 MT614366），使用 Primer 5.0软件设计 1对引物用于扩增 SD-01毒株的 VP2基因及其两端非编码区（上游引物序列：5'-aagtaaaaagagacaatcttgcacca-3'；下游引物序列：5'-catacttactatgtttttatg-3'），预期扩增目的片段大小约为 1 755 bp。引物序列送至上海生工生物工程有限公司合成。1.3.2　VP2基因克隆及序列分析　参考说明书使用全基因组 DNA提取试剂盒提取 SD-01毒株的全基因组 DNA，然后以此为模板使用 1.3.1中设计的引物进行 PCR扩增。PCR反应体系：Easy Taq

DNA Polymerase 25.0 μL，上、下游引物各 2.5 μL，DNA模板 2.0 μL，DEPC水补足 50.0 μL。PCR反应程序：95 ℃预变性 5 min；95 ℃变性 30 s，55 ℃退火 30 s，72 ℃延伸 2 min，共 35个循环；72 ℃延伸 10 min，4 ℃保存。使用 1.0%的琼脂糖凝胶对 PCR产物进行电泳检测，并使用胶回收试剂盒回收 PCR阳性产物，将回收产物于 -20 ℃保存备用。将回收的扩增片段与 pMD18-T载体连接。连接体系：5.0 μL Solution、4.5 μL胶回收产物、0.5 μL

pMD18-T载体，16 ℃连接 30 min。将连接产物转化至 DH5α感受态细胞后涂布于含有氨苄青霉素的LB固体培养基，37 ℃恒温培养 16 h，挑取单个菌落培养并进行菌液鉴定。将菌液鉴定阳性的样品送至上海生工生物工程有限公司进行测序，并参考NCBI上公布的 FPV VP2基因序列，以犬细小病毒（CPV）毒株作为对照，使用 DNAstar及Mega

5.0[6]软件进行同源性分析并构建发育进化树。参考序列详情见表 1。

112

技 术 支 撑

1.3.3　VP2基因生物信息学分析　使用多种软件对 FPV VP2基因进行生物信息学分析，具体软件

见表 2。

2　结果与分析

2.1　VP2基因扩增与克隆

以 1.3.2 中提取的 SD-01 株 DNA 为模板，

1.3.1中设计的序列为引物，成功扩增出片段大小

为 1 755 bp的 PCR产物，与预期结果一致。将PCR产物回收后连接至 pMD18-T载体上，进行菌

液鉴定后送至生物公司进行测序，并将测序结果

进行 BLAST比对。比对结果显示，扩增出的 PCR

产物为 FPV VP2基因，并成功构建了重组质粒，

将其命名为 pMD18-T-FPV SD-01-VP2。

2.2　VP2蛋白氨基酸同源性比对及系统进化树分析

从 GeneBank中下载已公布的国内 FPV毒

株序列及部分国外代表株序列（表 1），使用DNAstar 和 Mega 5.0 软件，对 SD-01 株及其他FPV毒株的 VP2蛋白进行氨基酸同源性分析并

构建系统进化树。氨基酸同源性比对结果显示，

表 1　NCBI 上公布的参考毒株 VP2 基因序列信息

毒株 年份 国家 / 地区 登录号

FPV

— — 日本 AB262659389/07 — 匈牙利 EU145593933/07 — 匈牙利 EU3609581335/07 — 匈牙利 EU360959PT09 2009 葡萄牙 JF422105TH091301 2013 泰国 KP019617TH091302 2013 泰国 KP019618TH091308 2013 泰国 KT357493Sydney_11 2015 澳大利亚 MK570644Syd_01 2017 澳大利亚 MK570654Syd_02 2017 澳大利亚 MK570668Syd_01 2017 澳大利亚 MK570669216_NZ_06 2017 新西兰 MK570696

217_NZ_06

2017 新西兰 MK5706972017 迪拜 MK570722017 迪拜 MK5707232017 迪拜 MK570724

Syd_042017 澳大利亚 MK5707472017 迪拜 MN6039752010 澳大利亚 MN603976

HF1 2019 中国 MT614366Tiger-01 2017 中国 MK982094ChangC2007 2008 中国 FJ936171BFPV 2008 中国 GQ857595GD（12/09/YGP） 2012 中国 KC473946F2016019 2016 中国 MH329286Haerbin-05 2017 中国 MK266782Haerbin-01 2018 中国 MK266783Haerbin-13 2017 中国 MK266784Shenyang-5 2017 中国 MK266785Shenyang-19 2017 中国 MK266786Shenyang-41 2018 中国 MK266787Guiyang01 2017 中国 MK266788Guiyang01 2018 中国 MK266789Chengdu-03 2016 中国 MK266790Chengdu-01 2017 中国 MK266791Shenyang-01 2017 中国 MK266792Tanjin-01 2018 中国 MK266793Tianjin-02 2017 中国 MK266794Beijing-L3 2017 中国 MK266795Beijing-L4 2018 中国 MK266796Beijing-01 2017 中国 MK266797Shenyang-05 2018 中国 MK266798Jilin5 2018 中国 MK266799JL-3 2017 中国 MK29577

CPV9 — 中国 AB054213T1 — — AB054214V123 — — AB054218

　　注：“—”表示信息未知。

表 2　本研究所使用的生物信息学工具

工具名称 网站 功能

ProtParamhttps://web.expasy.org/protparam/

蛋白质理化性质

SignalP-5.0http://www.cbs.dtu.dk/services/SignalP-5.0/

信号肽预测

TMHMM Server v. 2.0

http://www.cbs.dtu.dk/services/TMHMM/

跨膜区预测

SOPMAhttps://npsa-prabi.ibcp.fr/cgi-bin/npsa_automat.pl?page=npsa_sopma.html

二级结构预测

SWISS-Model https://swissmodel.expasy.org/ 三级结构模拟

TargetP 1.1http://www.cbs.dtu.dk/services/TargetP-1.1/index.php

亚细胞定位预测

PSORT II Prediction

https://psort.hgc.jp/form2.html 亚细胞定位预测

BepiPred-2.0http://tools.immuneepitope.org/bcell/

B 细胞表位分析

NetPhos 3.1http://www.cbs.dtu.dk/services/NetPhos/

磷酸化修饰预测

NetOGlyc 4.0http://www.cbs.dtu.dk/services/NetOGlyc/

O- 糖基化修饰预测

NetNGlyc 1.0http://www.cbs.dtu.dk/services/NetNGlyc/

N- 糖基化修饰预测

2021年第38卷第11期

113

技 术 支 撑

SD-01株 VP2蛋白与其他 FPV株 VP2蛋白相比，

氨基酸同源性为 99.0%~100%，与 CPV参考序列VP2蛋白的氨基酸同源性为 97.9%~98.1%（图 2）。

氨基酸序列进化树结果显示，SD-01株 VP2基因

与其他 FPV毒株的 VP2基因处于同一个大分支，且

与葡萄牙分离株 PT09的亲缘关系最为相近（图 3）。

2.3　VP2蛋白基本理化性质

使用在线软件 Prot-Param 对 SD-01 株 VP2

蛋白的基本理化性质进行预测 [5]。结果显示：VP2蛋白共由 584个氨基酸组成，其分子式为

C2884H4357N785O882S17，共含有 8 925个原子，理论相

对分子质量为 64 683.07 u；含有 56个负电荷氨基

酸残基，44个正电荷氨基酸残基，理论等电点为

5.44；理论的不稳定系数为 27.80，属于稳定蛋白。

蛋白的亲疏水性预测结果为 -0.508，表明 VP2蛋

白可能为亲水性蛋白。

2.4　VP2蛋白结构分析

使用在线软件 SignalP-5.0和 TMHMM Server

v. 2.0，预测 SD-01株 VP2蛋白信号肽和跨膜区域，

发现信号肽预测值为 0.002（图 4），表明 VP2蛋

白无信号肽区域，推测其可能为非分泌型蛋白。跨

膜区预测结果（图 5）显示，VP2蛋白可能为非跨

膜蛋白，且主要定位于膜外区域。

应用 SOPMA软件和 SWISS-Model数据库，

对 SD-01株 VP2蛋白的二级结构和三级结构进行

预测。结果（图 6）显示，VP2蛋白二级结构中含

有 51个 α螺旋（蓝色）、143个延伸链（红色）、

25个 β转角（绿色）和 365个无特定结构的卷曲

（橘色），分别占二级结构的 8.7%、24.5%、4.3%

和 62.5%。SWISS-Model同源建模结果（图 7）显示，VP2蛋白三级结构中，以无规则卷曲为主，该结果

与二级结构预测结果相一致。

M. DL 2 000 Marker；1. 阴性对照；2. SD-01 毒株。

图 1　FPV SD-01 株 VP2 基因 PCR 扩增结果

图 2　SD-01 株 VP2 基因氨基酸同源性分析结果

114

技 术 支 撑

图 3　SD-01 株 VP2 基因氨基酸序列系统进化树

图 4　SD-01 株 VP2 蛋白信号肽预测结果

图 5　SD-01 株 VP2 蛋白跨膜区预测结果

图 6　SD-01 株 VP2 蛋白二级结构预测结果

图 7　SD-01 株 VP2 蛋白三级结构预测结果

2021年第38卷第11期

115

技 术 支 撑

2.5　VP2蛋白亚细胞定位预测

使 用 在 线 软 件 TargetP 1.1 和 PSORT II

Prediction，对 FPV SD-01株 VP2蛋白的亚细胞定

位进行预测。结果显示：VP2蛋白不含有线粒体

导肽（mTP）或分泌通道信号肽（SP）；VP2蛋

白定位在细胞质和细胞核中的概率较高，分别为

47.8%和 26.1%；定位在线粒体、细胞质膜和细胞

骨架的可能较低，分别为 17.4%、4.3%和 4.3%。

同时，VP2蛋白的 C端含有一个过氧化物酶靶向

信号，可能会被过氧化物酶识别从而发挥其生物学

功能。

2.6　VP2蛋白 B细胞抗原表位分析

采 用 在 线 软 件 Bepipred Linear Epitope

Prediction 2.0，对 VP2蛋白的 B细胞抗原表位进

行预测，并结合蛋白的二级结构、表面可及性及

抗原指数性等因素，预测 VP2蛋白可能存 11个

氨基酸数目大于 7的抗原表位，分别为 4~56、

86~99、156~167、213~239、270~279、294~315、

322~328、337~445、507~520、551~562 和

574~580，抗原趋势最高值为 0.681，是 位于第 18

位氨基酸残基精氨酸上（表 3、图 8）。

表 3　SD-01 株 VP2 蛋白 B 细胞抗原表位预测结果

氨基酸

位点氨基酸序列

抗原指数

平均值

86~99 NMDKTAVKGNMALD 0.617 286

507~520 TNEYDPDASANMSR 0.603 43

294~315 LPQSEGATNFGDIGVQQDKRRG 0.595 45

4~56

GAVQPDGGQPAVRNER-ATGSGNGSGGGGGG 0.594 075

GSGGVGISTGTFNNQTEFKFLEN

337~445

GYSAPYYSFEASTQGPFKT-PIAAGRGGAQTDENQA

0.586 08ADGDPRYAFGRQHGQKTT-TTGETPERFTYIAHQDTG

RYPEGDWIQNINFNLPVTND-NVLLPTDPIGGKTGINYT

551~562 MSINVDNQFNYV 0.539 83

156~167 SATQPPTKVYNN 0.538 5

574~580 EKSQLAP 0.531 14

270~279 CKPCRLTHTW 0.527 9

322~328 TDYITEA 0.524 57

213~239QWDRTLIPSHTGTS-GTPTNVYHGTDPD

0.582 44

图 8　SD-01 株 VP2 蛋白的 B 细胞抗原表位预测结果

116

技 术 支 撑

2.7　VP2蛋白翻译后修饰位点预测

本研究采用多种蛋白翻译后修饰预测软件

（NetPhos 3.1、NetOGlyc 4.0、NetNGlyc 1.0），

对 FPV VP2蛋白进行修饰位点预测。结果显示：VP2蛋白可能存在 49个磷酸化修饰位点，其中丝

氨酸（S）12个、酪氨酸（T）9个、苏氨酸28个（图9）；

6个 N-糖基化修饰位点，分别为第 25、47、64、

180、443、505位（图 10）；21个 O-糖基化修饰

位点，分别为第 2、21、23、27、41、221、223、

225、226、228、230、348、349、355、388、

389、390、391、394、399、433位。这些修饰位

点在 FPV VP2蛋白内高度保守，因此推测这些位

点可能影响了 VP2蛋白的构象或生物学功能。

3　讨论

无囊膜病毒主要由衣壳蛋白及遗传物质组成。

其中衣壳蛋白在无囊膜病毒感染细胞及其复制过程

中发挥着关键作用，影响着病毒的宿主嗜性、细胞

敏感性、致病性以及对宿主天然免疫的拮抗能力。

同时，衣壳蛋白也是无囊膜病毒的重要抗原蛋白，

具有良好的免疫原性，可以诱导机体产生高水平的

细胞免疫和体液免疫。FPV衣壳蛋白主要由结构

蛋白 VP1和 VP2组成。VP1虽占衣壳蛋白的总量

不高，不足 15%，但其是产生具有感染性病毒粒

子的必要组分 [7]。VP2蛋白是衣壳蛋白的主要成分，

其含量占衣壳蛋白的 80%以上，同时也是 FPV主

要的抗原蛋白，可以诱导机体产生有效的中和抗

体 [8]。同时，VP2蛋白也是面对宿主压力重要的变

异蛋白，因此对细小病毒的遗传进化分析主要是针

对 VP2蛋白。

本研究克隆了 FPV SD-01株的 VP2基因，测

序得知 VP2基因全长为 1755 bp，共编码 584个

氨基酸。根据 VP2蛋白氨基酸序列构建的系统进

化树可知，分离毒株 SD-01虽为国内分离株，但

在亲缘关系上与葡萄牙分离株 PT09更为接近，而PT09株分离时间较早，因此推测 SD-01株可能是

从国外传播到国内的。目前 CPV虽有多种亚型的

报道，且新亚型有取代传统亚型成为主要流行 毒株

的趋势，但是关于 FPV亚型的分类还未见到相关

报道 [9-11]。本研究构建的 FPV VP2蛋白氨基酸序列

系统进化树显示，所有 FPV毒株位于一个大分支

上，但除了少数毒株外，大部分 FPV毒株又可被

分为 3个小分支。由此推测在宿主和免疫的双重压

力下，FPV有进一步进化从而产生亚型分化的趋势，

所以临床上要加强对 FPV的流行病学监测，以便

在新变异亚型出现时可以快速应对。

通过对 SD-01株 VP2蛋白的理化性质及高级

结构预测分析可知，VP2蛋白为亲水性非分泌性

蛋白，没有跨膜区，因此推测大肠杆菌、酵母、昆

虫细胞 -杆状病毒、真核细胞等多种表达系统都可

被用于高效表达 VP2蛋白。VP2蛋白上有两个主

要的抗原决定簇 A和 B，其中决定簇 A由第 93、

222、224、426位氨基酸残基组成，B由第 299、

300、302位氨基酸残基组成 [12]。通过对 SD-01株VP2蛋白的 B细胞抗原表位进行预测 可知，这两

个抗原决定簇都位于 SD-01株 VP2蛋白的 B细胞

优势表位内，且 SD-01株 VP2蛋白的两个抗原决

定簇与疫苗株一致，因此推测疫苗株可以给动物提

图 9　SD-01 株 VP2 蛋白的磷酸化修饰位点预测结果

图 10　SD-01 株 VP2 蛋白的 N- 糖基化修饰位点预测结果

2021年第38卷第11期

117

技 术 支 撑

供针对 SD-01株的有效保护。FPV、CPV、 猪 细 小 病 毒（porcine

parvovirus，PPV） 及 小 鼠 细 小 病 毒（mouse

parvovirus，MPV）等均属于细小病毒科、细小病

毒属。根据遗传进化分析可知，FPV与 CPV亲缘

关系最为接近，与 PPV亲缘关系次之，而与其他

细小病毒亲 缘关系较远。通过比较 F PV及其他细

小病毒 VP2的生物信息学差异发现，不同动物源

细小病毒的 VP2蛋白氨基酸序列存在差异，但生

理生化性质较为相似，均为亲水性无跨膜区的稳定

蛋白。蛋白质高级结构比较发现，不同种细小病毒VP2蛋白均主要由无规则卷曲组成，α螺旋及 β折

叠所占比重较小，且三级结构高度一致。除氨基酸

序列本身，蛋白翻译后修饰同样对抗原的免疫原性

有着重要作用，通过比对不同细小病毒 VP2蛋白

的重要抗原表位及潜在翻译后修饰位点，可见不同

细小病毒的 VP2蛋白存在部分一致的蛋白翻译后

修饰位点，但抗原表位仍具有明显差异。比较不同

细小病毒 VP2蛋白的生物信息学差异，有利于更

好地研究 VP2蛋白在不同细小病毒进化过程中所

发挥的作用，为广谱的抗细小病毒药物及分子制剂

筛选及研发奠定基础。

参考文献：

[1] AHMED N，RIAZ A，ZUBAIR Z，et al. Molecular analysis of partial VP-2 g ene amplified from rectal swab samples of diarrheic dogs in Pakistan confi rms the circulation of canine parvovirus genetic variant CPV-2a and detects sequences of feline panleukopenia virus（FPV）[J]. Virology journal，2018，15：45.

[2] JUNGE R E，BAUMAN K，KING M，et al . A serologic assessment of exposure to viral pathogens and Leptospira in an urban raccoon（Procyon lotor）population inhabiting a large zoological park[J]. Journal of zoo & wildlife medicine，2007，38：18-26.

[3] STEINEL A，PARRISH C R，BLOOM M E，et al. Parvovirus infections in wild carnivores[J]. Wildlife disease association，2001，37：594-607.

[4] STEINEL A，MUNSON L，VUUREN M V，et al. Genetic characterization of feline parvovirus sequences from various carnivores[J]. Journal of general virology，2000，81（2）：345-350.

[5] SPITZER A L，PARRISH C R . Maxwe l l I H . Tropic determinant for canine parvovirus and feline panleukopenia virus functions through the capsid protein VP2[J]. Journal of general virology，1997，78（4）：925-928.

[6] KUMAR S. MEGA5：molecular evolutionary genetics analysis using maximum likelihood，evolutionary distance，and maximum parsimony methods[J] . Molecular biology & evolution，2011，28（10）：2731-2739.

[7] AGBANDJE M，ROSSMANN M G. The structure of parvoviruses[J]. Seminars in virology，1995，6（5）：299-309.

[8] CAVALLI A，MARTELLA V，DESARIO C，et al. Evaluation of the antigenic relationships among canine parvovirus type 2 variants[J]. Clinical and vaccine immunology，2008，15（3）：534-539.

[9] NAKAMURA M，TOHYA Y，MIYAZAWA T，et al. A novel antigenic variant of canine parvovirus from a Vietnamese dog[J]. Archives of virology，2004，149（11）：2261-2269.

[10] DECARO N，MARTELLA V，DESARIO C，et al. First detection of canine parvovirus type 2c in pups with haemorrhagic enteritis in Spain[J]. Zoonoses & public health，2010，53（10）：468-472.

[11] PARRISH C R，HAVE P，FOREYT W J，et al. The global spread and replacement of canine parvovirus strains[J]. Journal of general virology，1988，69（5）：1111-1116.

[12] LISA M，STRASSHEIM，ALLEN，et a l . Two dominant neutralizing antigenic determinants of canine parvovirus are found on the threefold spike of the virus capsid[J]. Virology，1994，198（1）：175-184.

（责任编辑：朱迪国）