β-sitosterol y triterpenos del tipo oleaneno y urseno...
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Determinación de la estructura química: La estructura química se definió por comparación de los datos reportados en la literatura de IR, SM, 1H y 13C, identificando el 65TE como β-sitosterol y 65TF como la mezcla del ácido 2a,3a-dihidroxi-urs-12-en-28-oico y el ácido 2a,3a-dihidroxi-olean-12-en-28-oico.
El fraccionamiento biodirigido del extracto clorofórmico de L. hastata condujo al aislamiento del β-sitosterol activo contra M. tuberculosis (MIC: 128g/mL) [9] y la mezcla de ácidos: 2a,3a-dihidroxi-urs-12-en-28-oico y el ácido 2a,3a-dihidroxi-olean-12-en-28-oico aislados por primera vez de esta planta. Esta mezcla presentó actividad contra B. subtillis y S. aureus por el método bioautográfico y la determinación preliminar de la citotoxicidad mostró actividad contra las líneas celulares tumorales de Colon (HCT-15), mama (MCF-7), leucemia (K-562), sistema nervioso Central (U251 Glia) cuando fue evaluada a 50µM, lo que explica su uso en la Medicina Tradicional. La destilación por arrastre de vapor de L. hastata produjo 0.12% de aceite esencial y fue activo contra B. subtilis por el método Autobiográfico y contra B. subtillis y S.aureus por el MDA. La determinación de los componentes del aceite esencial por CG-MS se encuentra en proceso. Agradecimientos: Los autores agradecen al Dr. Scott Franzblau de la Escuela de Farmacia de la Universidad de Illinois en Chicago, USA por la determinación de la actividad antimicobacteriana, al Instituto de Química de la UNAM por el apoyo brindado y a Zaida Piñuelas Cota por el trabajo técnico realizado. El proyecto fue financiado por UABCS-SEP. Programa integral de fortalecimiento institucional. Bibliografia: 1.- Encarnación-Dimayuga R.1996. Medicina Tradicional y Popular de Baja California Sur. Ed. Artes Graficas-UABCS. México. p.69. 2.- Morley B and Dutkiewicz DL. J. Adelaide Bot. Gard; 1978; (1)3: 197. 3.- Encarnación Dimayuga R.1992. Doctoral Thesis. Repro-C HSC, Upsala, Sweden. 4.- Singletary K, MacDonald C, and Walling M. Cancer Letters; 1996;104, 43. 5.- Okunade AL, Lewis WH. Phytochemistry;2004;65,1017. 6.- Rahalison R. Hamburguer M. and Hostettman K. Phytochemical Analysis; 1991;2, 199. 7.- Cantrell CL, Fischer NH, Orbatch L, McGuire MS, Franzblau SG. Phytomedicine; 1998; 5:139.8.- Monks A, Scudiero D, Skehan P, Shoemaker R, Paull K. Vistica DJ. et al. Natl.Cancer Inst. 1991; 83:757-766. 9.- Coop BR. Natural Product Review. 2003; 20: 535.
β-sitosterol y triterpenos del tipo oleaneno y urseno aislados de Lepechinia hastata (A. Gray) Epling (Lamiaceae).
Encarnación-Dimayuga, R.1*, Nieto F., Z.1, García A., y Delgado, G.2 1.- Universidad Autónoma de Baja California Sur. Departamento de Agronomía. A. P. 19-B, La Paz, B. C. S., C.P. 23080. México. 2.-Universidad Nacional Autónoma de México. Instituto de Química. Circuito exterior. Ciudad Universitaria. Coyoacán 04510. Mèxico D.F.º *Correspondencia:1Dra. Rosalba Encarnación-Dimayuga. e-mail:[email protected]
INTRODUCCIÓN: Lepechinia hastata (A. Gray) Epling (Lamiaceae), conocida en Baja California Sur como “Chicura de la Sierra”, “Lavanda” o “Lengua de buey”, es una hierba perenne utilizada en la medicina tradicional. Su raíz hervida y tomada como té se emplea para curar las infecciones uterinas o vaginales [1]. Crece en la sierra de La Laguna, B. C. S, (Fig. 1) en la cumbre de las Islas Socorro y Revillagigedo, México y en las Islas Maui, en Hawai [2].
ANTECEDENTES: Los extractos de éter de petróleo, cloroformo y etanol, de la parte aérea de esta planta, mostraron actividad antimicrobiana contra Stafilococcus aureus , streptococcus faecalis y Bacillus subtillis por el Método de Difusión en Agar (MDA). Del extracto clorofórmico fueron aislados el carnosol, β-hidroxicarnosol y ácido ursólico como sus principales componentes activos (Fig. 2). El carnosol y β-hidroxicarnosol mostraron inhibición significativa de exocitosis sobre el Factor de Actividad de Plaquetas (PAF) inducida en neutrófilos humanos [3]. El carnosol ha sido aislado de varias especies de Salvias y han sido demostrados sus efectos antioxidantes, antitumorales y antimicrobianos [4].El ácido ursólico tiene un MIC de 15µg/mL contra M. tuberculosis [5].
OBJETIVO: Aislar y caracterizar químicamente los compuestos bioactivos del extracto clorofórmico, así como extraer y determinar los componentes del aceite esencial de la parte aérea de la planta.
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MATERIALES Y MÉTODOS:
Extracción, fraccionamiento y purificación: La parte aérea, seca y molida de L. hastata (630g) fue extraída en forma exhaustiva con éter de petróleo (b. p. 30-60 oC), cloroformo y etanol sucesivamente en un equipo soxhlet. Los solventes fueron evaporados para obtener los extractos crudos, de los cuales el extracto clorofórmico fue el más activo, por lo que éste fue sometido a varios fraccionamientos biodirigidos por cromatografía en columna, hasta obtener los compuestos 65TE y 65TF según se muestra en el siguiente diagrama.
B) Método Autobiográfico: Fue aplicado para determinar la actividad del aceite esencial contra B. subtillis y la actividad de la mezcla de terpenos 65TF contra S. aureus, S. faealis y B. subtillis, empleando una concentración de células de 1.5X108
UFC/mL [6] en agar Mueller Hinton. La mezcla 65TF (20µg) y el aceite esencial (20µg) fueron corridos por separado en placas de sílica gel K6F, empleando Hex:EtOAc:EtOH (6.0:3.5:0.5) como sistema eluyente para 65TF, CH2CL2:Me2CO (95:5) para el aceite y el carnosol como estándar (20µg) en ambos casos (Fig. 4).
C) Actividad antimicobacteriana: La actividad antimicobacteriana de los extractos crudos fue determinada a 300 mg/mL, 200 mg/mL y 33 mg/mL contra M. tuberculosis y M. avium por medio del sistema BACTEC 460 [7], empleando como estándar Rifampina y Claritromicina.
Extracción del aceite esencial L. hastata (200 g parte aérea seca) fue destilada con dos litros de agua destilada en un equipo Clevenger durante 2 horas. El aceite obtenido fue retenido en 0.5 ml de Hexano y separado del equipo Clevenger con ayuda de una pipeta Pasteur. La mezcla aceite-hexano fue transferida a un vial tarado, evaporando el hexano a temperatura ambiente, para determinar peso.
A) Método de Difusión en Agar. La actividad antimicrobiana de los extractos y fracciones fue determinada por el MDA [3] (Fig. 3).
Porcentajes de inhibición de extractos de L. hastata M. Tuberculosis M. avium Extracto 300µg/mL 100µg/mL 33µg/mL 300µg/mL 100µg/mL 33µg/mL Cloroformo 98% 82% 97% ------- ----------- Eter de petroleo 99% --------- --------- --------- -------- ----------- Etanol --------- --------- --------- --------- -------- -----------
RESULTADOS Y CONCLUSIÓN:
B. subtillis a 1.5X108 UFC.
Control +: eritromicina, cloranfenicol y Extracto de Garambullo: Lophocereus schotii
Control - : El solvente utilizado.
Concentración: 2mg/disco
Fig. 3. Actividad Antimicrobiana. MDA
Curanderos: Miguel Venegas.1757 Noticia de la California y de su Conquista.
Determinación de la Actividad Antimicrobiana
65-TF
Aceite esencial de L. hastata
B. subtillis
Fig. 4. Método Autobiográfico
Determinación de la actividad citotóxica
Ácido ursólico
MIC: 15µg/mL M. tuberculosis
Fig. 2. Compuestos activos aislados de L. hastata
Carnosol 6β-OH-Carnosol
Cromatografía en columna (0.250g) CH2Cl2:Acetona (98:2 ) hasta (80:20). Rel. m/Si02=1:100 SiO2 (230-400 mesh)
La citotoxicidad de la mezcla de terpenos 65TF contra líneas celulares tumorales de Colon (HCT-15), mama (MCF-7), leucemia (K-562) y sistema nervioso Central (U251 Glia) fue evaluada por el método de sulforodamina B (RSB) [8] empleando Adriamicina como estándar.
Fig. 1. Sierra de la Laguna, B. C. S.
Sierra de la Laguna
L. hastata
Extracto clorofórmico (32g) M. tuberculosis y M. avium Extracto Etéreo Extracto etanólico
Extracción exhaustiva en soxhlet
FU10 0.903g. S. aureus
CC30F3 0.325g
CC40F5 0.077g
CC42F3 0.013g
CC50F3 0.007g
65-TF(7 mg)
FU 3-4-5 1.3444 g S aureus, B. subtillisd, S. faecalis y C. albicans
FU 3-4 0.241g S.aureus
65-TE
ácido 2a,3a-dihidroxi-urs-12-en-28-oico
FU12 4.2 g
FU11 3.8g
FU2 0.1747g
FU1 0.527g
FU8 3g
FU7 3.3g
FU9 0.393g
Cromatografía en columna CH2Cl2 :EtoAc en Gradiente Polaridad Rel. m/Si02=1:40 Si02 (70-230 mesh)
Cromatografía en columna (0.803g) Hex:EtOAc:EtOH (90:5:5 ) hasta (50:40:10). Rel. m/Si02=1:200 SiO2 (230-400 mesh)
Cromatografía en columna (0.045g) CHCl3: EtOH (99:1 ) hasta (97:3). Rel. m/Si02=1:200 SiO2 (230-400 mesh)
Cromatografía en columna (0.013g). Hex:EtOAc (90:10 ); Hex:EtOAc:EtOH (90:7:3); Hex:EtOAc:EtOH (90:5:5) Rel. m/Si02=1:400 SiO2 (230-400 mesh)
FU6 5.073g
Cromatografía en columna (0.94g) Hex:Me2CO hasta Me2CO en gradiente. Rel. m/Si02=1:140 SiO2 (230-400 mesh) CC30F2
0.0390g CC30F4 0.3307g
CC30F1 0.0474g
CC40F5 0.077g
CC40F5 0.077g
CC40F5 0.077g
CC40F5 0.077g
CC40F5 0.077g
CC42F4 0.011g
CC42F5 0.0109g
CC42F2 0.0039g
CC42F1 0.0081g
CC50F3 0.001g
CC50F3 0.001g
CC50F3 0.005g
CC50F3 0.005g
CC31FU7 0.0507g
CC31FU6 0.1737g
CC31FU5 0.1908g
CC31FU20.0468g
CC31FU1 0.0017g
CC31FU8 0.0686g
Varias cromatografías en columna Hex: CH2Cl2:EtOAc (88:10:2; 82:10:8) gradiente de polaridad hasta EtOAc 100% y EtOH 100% Rel. m/Si02=1:200 SiO2 (230-400 mesh)
β-sitosterol (12 mg) MIC: 128 µg/mL : M. tuberculosis
ácido 2a,3a-dihidroxi-olean-12-en-28-oico