viskvisk.nu/wp-content/uploads/2013/04/visk-slutkonferens... · realtids rt-pcr t4 gene 32 protein...
TRANSCRIPT
![Page 1: VISKvisk.nu/wp-content/uploads/2013/04/VISK-Slutkonferens... · Realtids RT-PCR T4 gene 32 protein Rexeed-25SX (olika storlekar) Fresenius FX-1000 ... Noro. GGII: Norovirus Genogrupp](https://reader031.vdocuments.site/reader031/viewer/2022021716/5ccff9f888c993966d8d2800/html5/thumbnails/1.jpg)
VISK Hur går vi tillväga för att analysera virus från
vattenprover?
Oslo Slutkonferens VISK
19 mars 2013
Fredrik Nyström
![Page 2: VISKvisk.nu/wp-content/uploads/2013/04/VISK-Slutkonferens... · Realtids RT-PCR T4 gene 32 protein Rexeed-25SX (olika storlekar) Fresenius FX-1000 ... Noro. GGII: Norovirus Genogrupp](https://reader031.vdocuments.site/reader031/viewer/2022021716/5ccff9f888c993966d8d2800/html5/thumbnails/2.jpg)
Agenda
• Problematiken kring virusanalyser i råvatten
• Analysmetodik för virus i:
– Råvatten
– Avloppsvatten
• Erfarenheter och möjligt vidare arbete
![Page 3: VISKvisk.nu/wp-content/uploads/2013/04/VISK-Slutkonferens... · Realtids RT-PCR T4 gene 32 protein Rexeed-25SX (olika storlekar) Fresenius FX-1000 ... Noro. GGII: Norovirus Genogrupp](https://reader031.vdocuments.site/reader031/viewer/2022021716/5ccff9f888c993966d8d2800/html5/thumbnails/3.jpg)
Analysering av virus i råvattenprover
• Problem: Direktanalys ej möjlig
– “Normalhalten” av virus i råvatten långt under känslighetsnivån i de molekylära analyserna.
– Någon form av anrikning behövs
![Page 4: VISKvisk.nu/wp-content/uploads/2013/04/VISK-Slutkonferens... · Realtids RT-PCR T4 gene 32 protein Rexeed-25SX (olika storlekar) Fresenius FX-1000 ... Noro. GGII: Norovirus Genogrupp](https://reader031.vdocuments.site/reader031/viewer/2022021716/5ccff9f888c993966d8d2800/html5/thumbnails/4.jpg)
Anrikning av virus från råvattenprov
• Stor volym • Låg koncentration
• Liten volym • Hög koncentration
![Page 5: VISKvisk.nu/wp-content/uploads/2013/04/VISK-Slutkonferens... · Realtids RT-PCR T4 gene 32 protein Rexeed-25SX (olika storlekar) Fresenius FX-1000 ... Noro. GGII: Norovirus Genogrupp](https://reader031.vdocuments.site/reader031/viewer/2022021716/5ccff9f888c993966d8d2800/html5/thumbnails/5.jpg)
Filtrering av råvattenprov
![Page 6: VISKvisk.nu/wp-content/uploads/2013/04/VISK-Slutkonferens... · Realtids RT-PCR T4 gene 32 protein Rexeed-25SX (olika storlekar) Fresenius FX-1000 ... Noro. GGII: Norovirus Genogrupp](https://reader031.vdocuments.site/reader031/viewer/2022021716/5ccff9f888c993966d8d2800/html5/thumbnails/6.jpg)
Norovirus transportegenskaper
• Vi utnyttjar norovirus transportegenskaper
– Dess isoelektriska punkt
– Aggregationsdynamik
– Vidhäftningsförmåga vid olika jonstyrkor
Da Silva et al., 2011. Environmental Science & Technology. “Adsorption and aggregation properties of norovirus GI and GII virus-like particles demonstrate differing responses to solution chemistry. “
![Page 7: VISKvisk.nu/wp-content/uploads/2013/04/VISK-Slutkonferens... · Realtids RT-PCR T4 gene 32 protein Rexeed-25SX (olika storlekar) Fresenius FX-1000 ... Noro. GGII: Norovirus Genogrupp](https://reader031.vdocuments.site/reader031/viewer/2022021716/5ccff9f888c993966d8d2800/html5/thumbnails/7.jpg)
Filtreringsmetoden i VISK för råvattenprover
• “Dead-end” filtrering
• Enkel adsorption / eluering
• Tre-stegs isoleringsmetod med två olika filter samt en mikrokoncentrator
![Page 8: VISKvisk.nu/wp-content/uploads/2013/04/VISK-Slutkonferens... · Realtids RT-PCR T4 gene 32 protein Rexeed-25SX (olika storlekar) Fresenius FX-1000 ... Noro. GGII: Norovirus Genogrupp](https://reader031.vdocuments.site/reader031/viewer/2022021716/5ccff9f888c993966d8d2800/html5/thumbnails/8.jpg)
Flödesschema
P U M P
F I L T E R
2 u m
Positive control
MNV-1
Flocculation
MgCl2
4.5 l
Source water
200 ul
Molecular analysis
F I L T E R
0 . 4 5 u m
Microconcentration
50,000 kDa
![Page 9: VISKvisk.nu/wp-content/uploads/2013/04/VISK-Slutkonferens... · Realtids RT-PCR T4 gene 32 protein Rexeed-25SX (olika storlekar) Fresenius FX-1000 ... Noro. GGII: Norovirus Genogrupp](https://reader031.vdocuments.site/reader031/viewer/2022021716/5ccff9f888c993966d8d2800/html5/thumbnails/9.jpg)
Flödesschema
P U M P
F I L T E R
2 u m
Positive control
MNV-1
Flocculation
MgCl2
4.5 l
Source water
200 ul
Molecular analysis
F I L T E R
0 . 4 5 u m
Microconcentration
50,000 kDa
Recovery: 0.01 – 15 %
![Page 10: VISKvisk.nu/wp-content/uploads/2013/04/VISK-Slutkonferens... · Realtids RT-PCR T4 gene 32 protein Rexeed-25SX (olika storlekar) Fresenius FX-1000 ... Noro. GGII: Norovirus Genogrupp](https://reader031.vdocuments.site/reader031/viewer/2022021716/5ccff9f888c993966d8d2800/html5/thumbnails/10.jpg)
Analysöversikt av råvattenprover
![Page 11: VISKvisk.nu/wp-content/uploads/2013/04/VISK-Slutkonferens... · Realtids RT-PCR T4 gene 32 protein Rexeed-25SX (olika storlekar) Fresenius FX-1000 ... Noro. GGII: Norovirus Genogrupp](https://reader031.vdocuments.site/reader031/viewer/2022021716/5ccff9f888c993966d8d2800/html5/thumbnails/11.jpg)
Virusanalys av avloppsvatten
• “Lättare” att arbeta med
– Högre viruskoncentrationer
– Enklare upparbetningsmetodik
100 gångers anrikning
![Page 12: VISKvisk.nu/wp-content/uploads/2013/04/VISK-Slutkonferens... · Realtids RT-PCR T4 gene 32 protein Rexeed-25SX (olika storlekar) Fresenius FX-1000 ... Noro. GGII: Norovirus Genogrupp](https://reader031.vdocuments.site/reader031/viewer/2022021716/5ccff9f888c993966d8d2800/html5/thumbnails/12.jpg)
PEG-fällning av avlopssvatten
System Biosciences http://www.systembio.com/
![Page 13: VISKvisk.nu/wp-content/uploads/2013/04/VISK-Slutkonferens... · Realtids RT-PCR T4 gene 32 protein Rexeed-25SX (olika storlekar) Fresenius FX-1000 ... Noro. GGII: Norovirus Genogrupp](https://reader031.vdocuments.site/reader031/viewer/2022021716/5ccff9f888c993966d8d2800/html5/thumbnails/13.jpg)
PCR METODIK
http://www.gmotesting.com
![Page 14: VISKvisk.nu/wp-content/uploads/2013/04/VISK-Slutkonferens... · Realtids RT-PCR T4 gene 32 protein Rexeed-25SX (olika storlekar) Fresenius FX-1000 ... Noro. GGII: Norovirus Genogrupp](https://reader031.vdocuments.site/reader031/viewer/2022021716/5ccff9f888c993966d8d2800/html5/thumbnails/14.jpg)
Erfarenheter av metoden
• Bra effektivitet under utvärdering
• Ojämn effektivitet under provtagning
– Känslig för heterogeniteten hos proverna
• Indikationer på relativt höga koncentrationer, men metodiken ej känslig nog för noggrann kvantifiering
• Vidare metodikutveckling
– Byte av metodik
– Öka provolymerna (ex. ultrafiltrering)
![Page 15: VISKvisk.nu/wp-content/uploads/2013/04/VISK-Slutkonferens... · Realtids RT-PCR T4 gene 32 protein Rexeed-25SX (olika storlekar) Fresenius FX-1000 ... Noro. GGII: Norovirus Genogrupp](https://reader031.vdocuments.site/reader031/viewer/2022021716/5ccff9f888c993966d8d2800/html5/thumbnails/15.jpg)
Tack för uppmärksamheten Frågor?
Stort tack till personal vid vattenverk samt avloppsreningsverk som hjälpt i studien. Tack till kollegor inom VISK-projektet.
![Page 16: VISKvisk.nu/wp-content/uploads/2013/04/VISK-Slutkonferens... · Realtids RT-PCR T4 gene 32 protein Rexeed-25SX (olika storlekar) Fresenius FX-1000 ... Noro. GGII: Norovirus Genogrupp](https://reader031.vdocuments.site/reader031/viewer/2022021716/5ccff9f888c993966d8d2800/html5/thumbnails/16.jpg)
Ultrafiltrering för detektion av mikroorganismer i vatten
Ronnie Eriksson
Livsmedelsverket
![Page 17: VISKvisk.nu/wp-content/uploads/2013/04/VISK-Slutkonferens... · Realtids RT-PCR T4 gene 32 protein Rexeed-25SX (olika storlekar) Fresenius FX-1000 ... Noro. GGII: Norovirus Genogrupp](https://reader031.vdocuments.site/reader031/viewer/2022021716/5ccff9f888c993966d8d2800/html5/thumbnails/17.jpg)
Metodkrav
• Användningsområden
– Kartläggningar
– Utbrottsutredningar
– Beredskap mot antagonistiska händelser
• Detektera virus, bakterier och parasiter från samma prov
• Typer av vatten och önskade volymer
– Dricksvatten, DR, (~200 L)
– Ytvatten, YV, (~40 - 50 L)
– Grundvatten (~100)
![Page 18: VISKvisk.nu/wp-content/uploads/2013/04/VISK-Slutkonferens... · Realtids RT-PCR T4 gene 32 protein Rexeed-25SX (olika storlekar) Fresenius FX-1000 ... Noro. GGII: Norovirus Genogrupp](https://reader031.vdocuments.site/reader031/viewer/2022021716/5ccff9f888c993966d8d2800/html5/thumbnails/18.jpg)
Hollow Fiber Ultrafilter
Vattenprov in
Filtrerat vatten Mikroorganismer
Stora molekyler
Filter ”Cut Off” Filter area Filtrering
Rexeed-25SX 30kD 2,5 m2 1,4 L/min
Vattenprov in
Filtrerat vatten
Hollow fiber
![Page 19: VISKvisk.nu/wp-content/uploads/2013/04/VISK-Slutkonferens... · Realtids RT-PCR T4 gene 32 protein Rexeed-25SX (olika storlekar) Fresenius FX-1000 ... Noro. GGII: Norovirus Genogrupp](https://reader031.vdocuments.site/reader031/viewer/2022021716/5ccff9f888c993966d8d2800/html5/thumbnails/19.jpg)
Dead End Filtrering
I fält Direkt från kranen Labb
![Page 20: VISKvisk.nu/wp-content/uploads/2013/04/VISK-Slutkonferens... · Realtids RT-PCR T4 gene 32 protein Rexeed-25SX (olika storlekar) Fresenius FX-1000 ... Noro. GGII: Norovirus Genogrupp](https://reader031.vdocuments.site/reader031/viewer/2022021716/5ccff9f888c993966d8d2800/html5/thumbnails/20.jpg)
Olika vatten olika resultat
Dricksvatten Sjövatten Eluat Ytråvatten Eluat
Badsjö 20 L Almunge vattenverk 40 L Görvelns vattenverk 40 L
Eluat
![Page 21: VISKvisk.nu/wp-content/uploads/2013/04/VISK-Slutkonferens... · Realtids RT-PCR T4 gene 32 protein Rexeed-25SX (olika storlekar) Fresenius FX-1000 ... Noro. GGII: Norovirus Genogrupp](https://reader031.vdocuments.site/reader031/viewer/2022021716/5ccff9f888c993966d8d2800/html5/thumbnails/21.jpg)
200 L Dricksvatten / 40 L Ytvatten -> 500 mL
”Dead end” Filtrering
Sekundär koncentrering DV 500 mL / YV 140-300 mL -> 2mL
Nukleinsyraextraktion 0,4-2 mL -> 50-100 µl
Realtids RT-PCR
Rexeed-25SX (olika storlekar) Fresenius FX-1000
Millipore Centricon-70 Polyetylenglykol (PEG)
Upprening 2 mL -> 2mL
Kloroform:Butanol Ingen
Qiagen QuantiTect Virus Invitrogen UltraSens Tataa Grandmaster Quanta Toughmix
Inhibitionsbortagning Zymo PCR Inhibitor removal Qiagen RNA Cleanup Kit Ingen
Biomeriux NucliSens MiniMAG Qiagen EZ1 Biorobot MN NucleoSpin® Virus
BSA T4 gene 32 protein Ingen
![Page 22: VISKvisk.nu/wp-content/uploads/2013/04/VISK-Slutkonferens... · Realtids RT-PCR T4 gene 32 protein Rexeed-25SX (olika storlekar) Fresenius FX-1000 ... Noro. GGII: Norovirus Genogrupp](https://reader031.vdocuments.site/reader031/viewer/2022021716/5ccff9f888c993966d8d2800/html5/thumbnails/22.jpg)
200 L Dricksvatten / 40 L Ytvatten -> 500 mL ”Dead end” Filtrering med ”Back flush” eluering
Sekundär koncentrering DV Centricon-70, 500 mL -> 2 mL
YV PEG, 150-300 mL -> 2 mL
Nukleinsyraextraktion NucliSens MiniMAG, 2 mL -> 100 µl
Realtids one-step RT-PCR Quanta Toughmix, 5 µL = 10 L DV / 0,6-1,2 L YV
Centrifugering ger pellet med bakterier och parasiter. Får även bort fast material.
Upprening Kloroform:Butanol, 2 mL -> 2 mL
![Page 23: VISKvisk.nu/wp-content/uploads/2013/04/VISK-Slutkonferens... · Realtids RT-PCR T4 gene 32 protein Rexeed-25SX (olika storlekar) Fresenius FX-1000 ... Noro. GGII: Norovirus Genogrupp](https://reader031.vdocuments.site/reader031/viewer/2022021716/5ccff9f888c993966d8d2800/html5/thumbnails/23.jpg)
Resultat
Utbyte från 40 L ytråvatten
MNV: Murint Norovirus FCV: Felint Calicivirus Noro. GGI: Norovirus Genogrupp I Noro. GGII: Norovirus Genogrupp II MS2: Bakteriofag MS2
VTEC Campylobakter Cryptosp. Giardia
Utbyte (%) 80 60 50 60
MNV FCV MS2
Utbyte (%) 18 12 89/44
Nv. GGI Nv. GGII FCV
Plasm. Ekv/L 100 <150 <100 U
Sensitivitet 200 L dricksvatten
![Page 24: VISKvisk.nu/wp-content/uploads/2013/04/VISK-Slutkonferens... · Realtids RT-PCR T4 gene 32 protein Rexeed-25SX (olika storlekar) Fresenius FX-1000 ... Noro. GGII: Norovirus Genogrupp](https://reader031.vdocuments.site/reader031/viewer/2022021716/5ccff9f888c993966d8d2800/html5/thumbnails/24.jpg)
Slutsatser - Filtrerar ”stora” volymer ytvatten (40 L) och dricksvatten (200 L) med UF
- Högt utbyte över UF (~90% MS2)
- Detekterar virus, bakterier och parasiter från samma prov
Problem
• Fortfarande inhibition i PCR som ökar med volymen
• Volymen vi faktiskt analyserar
• Hela eluatvolymen från UF utnyttjas inte till sek. konc.
![Page 25: VISKvisk.nu/wp-content/uploads/2013/04/VISK-Slutkonferens... · Realtids RT-PCR T4 gene 32 protein Rexeed-25SX (olika storlekar) Fresenius FX-1000 ... Noro. GGII: Norovirus Genogrupp](https://reader031.vdocuments.site/reader031/viewer/2022021716/5ccff9f888c993966d8d2800/html5/thumbnails/25.jpg)
Vi som arbetar med Ultrafiltrering
Magnus Simonsson
Ronnie Eriksson
Karin Jacobsson
Sofia Persson