聚合酶链式反应 (PCR) (Polymerase Chain Reaction)

实验目的

掌握 PCR 技术的原理及技术

PCR （ Polymerase Chain Reaction ）法，又称为聚合酶链反应或 PCR 扩增技术，是一种高效快速的体外 DNA 聚合程序。利用 PCR 技术可在短时间内获得数百万个特异的 DNA 序列的拷贝。 PCR 技术在分子克隆、遗传病的基因诊断等方面得到了广泛的应用。使用 PCR 法的前提条件是：已知待扩增目的基因或 DNA 片段两侧的序列，根据该序列化学合成聚合反应必需的双引物。

实验原理

PCR 技术实际上是在模板 DNA 、引物和 4 种脱氧核苷酸存在的条件下依赖于 DNA 聚合酶的酶促合成反应。 PCR技术的特异性取决于引物和模板 DNA 结合的特异性。反应分为三步： 1 变性：在高温条件下， DNA 双链解离形成单链 DNA ； 2 退火：当温度突然降低时引物与其互补的模板在局部形成杂交链； 3 延伸：在 DNA 聚合酶、 dNTPs 和Mg2+ 存在的条件下，聚合酶催化以引物为起始点的 DNA链延伸反应。以上三步为一个循环，每一循环的产物可以作为下一个循环的模板，几十个循环之后，介于两个引物之间的特异性 DNA 片段得到了大量复制，数量可达到 106~

7 个拷贝。

PCR技术原理

主要有 7 个：聚合酶、引物、 dNTPs、反应 buffer 、二价离子、模板、一价离子

PCR 技术的参数

模 板 单、双链 DNA 或 RNA 都可以作为 PCR 的样品。虽然

PCR 可以仅用极微量的样品（甚至是来自单一细胞的 DNA ），但是为了保证反应的特异性，一般用 ng 量级的克隆 DNA ， μg 水平的染色体 DNA 或 104 拷贝的待扩增片段来做起始材料。原料可以是粗制品，但不能混有任何蛋白酶，核酸酶， TaqDNA 聚合酶抑制剂以及能结合 DNA 的蛋白，因此 DNA 样品纯度要尽可能的高。

引 物

PCR 反应产物的特异性由一对上下游引物所决定。下列原则有助于引物的合理设计：

* 引物长度以 15 ～ 30 个碱基为宜。 * (G ＋ C)含量最好保持在约 40%～ 60%，应尽量避免数 个嘌呤或嘧啶的连续排列。

* 避免引物内部形成二级结构。

* 两个引物之间不应发生互补。

* 引物浓度不宜偏高。

dNTP浓度 高浓度 dNTP易产生错误掺入，而浓度过低，势必降低反应产物的产量。 PCR常用 50－ 200μmol/L的 dNTP ，此外，dNTP 能与 Mg2＋结合，使游离 Mg2＋浓度降低。因此， dNTP 的浓度直接影响到反应中起重要作用的 Mg2＋浓度。

反应 buffer 反应缓冲液一般含 10-50mmol/L Tris·Cl (20℃下 pH8.3-8.8), 50mmol/L KCl 和适当浓度的 Mg2+ 。 50mmol/L的 KCl 有利于引物的退火。另外 ,反应液可加入5mmol/L的二硫苏糖醇 (DDT) 或 100μg/ml 的牛血清白蛋白 (BSA), 它们可稳定酶活性 , 各种 Taq DNA 聚合酶商品都有自己特定的一些缓冲液。

Mg2＋浓度

* Mg2＋浓度对反应物的特异性及产量有显著影响。浓度过高，则 DNA 不易变性；浓度过低，使产物减少。

* 在各种单核苷酸浓度为 200μmol/L时， Mg2+ 为 1.5mmol/L 较适合。若样品中含EDTA 或其他螯合物，可适当增加Mg2+ 的浓度。在高浓度 DNA 及 dNTP 条件下进行反应时，也必须相应调节Mg2+ 的浓度。

PCR 用酶的特性

温泉中水生嗜热杆菌

TaqDNA 聚合酶 Taq多聚酶从嗜热菌分离得到，现在经基因克

隆的重组体产物 Taq 酶最适pH8.3-8.8(室温 8.3-8.4),反应温度 75-80℃, 95℃以上失活明显。无 3´→5´校读活性，对 SDS敏感。 在 100μl 反应液中，一般加入 2.5U的酶量，足以达到每分钟延伸 1000～ 4000 个核苷酸的掺入速度。酶量过多导致产生非特异性产物。

PCR 反应参数

变性温度与时间

94-95度 /1min 可以满足一般要求 变性时间过长易造成酶失活

退火温度 一般设定比理论 Tm 低 5℃，但实际上与

引物一级结构序列有关，设计不当可造成非特异性扩增，此时应调整温度和相应的时间，一般提高温度会增加扩增的特异性。短时间退火有利于产物的特异性。

延伸温度和时间

延伸温度一般 72 度。延伸时间决定于酶的反应速度和扩增片段长度。

实验操作1 取一个 0.2ml eppendorf 管，添加以下各种成分反应液

ddH2O 11.8 µl 模板 DNA 1 µl 上游引物 (2.5µmol/L) 1.6 µl 下游引物 (2.5µmol/L) 1.6 µl dNTP mixture(2.5mmol/L) 1.6 µl 10倍×缓冲液 + MgCl2 2 µl Taq 酶 （ 2.5 U /ul ） 0.4 µl 总体积 20 µl 2 稍作离心 ,将反应管放入 PCR仪中。

3. 设定反应程序： 94℃条件下使模板 DNA预变性 3min 。 变性 94℃ 30sec 退火 54℃ 30sec 30 cycles 延伸 72℃ 1min 30sec 最后在 72℃条件进行延伸 7-10min 。 4 ℃保温4. 取 5 µl 反应液用 1%琼脂糖凝胶进行电泳 ,鉴定 P

CR 产物是否存在以及大小。

1 2 3 M 4 5

PCR 产物 的琼脂糖凝胶电泳

1 ， 2 ， 4 ， 5： PCR 产物； 3 ，阴性对照；M ， DNA 分子量标准（从上向下： 2000bp，1000bp， 750bp， 500bp， 250bp， 100bp）