木鳖子提取物通过调节 MAPKs 通路 诱导黑色素瘤 B16 细胞分化的实验研究

河北医科大学第四医院 科研中心河北医科大学第四医院 科研中心 // 肿瘤研究所肿瘤研究所 赵连梅赵连梅

研究背景（一）

• 目前认为，肿瘤的形成同细胞分化异常有关，即肿瘤细胞不能进行正常分化，或是分化能力降低，从而导致肿瘤克隆的形成。进一步的研究发现，肿瘤细胞有可能在适当的刺激下被诱导分化，使之向正常细胞转变。

• 在特定药物作用下，恶性肿瘤细胞向正常细胞演变分化，表现为形态学、生物学和生物化学诸标志物方面向正常细胞接近，甚或转变为正常细胞，这种现象即称为肿瘤的诱导分化（ differenation ）或再分化、肿瘤逆转。这些能够诱导肿瘤细胞逆转的化学物质称为分化诱导剂。

• “诱导分化”概念的提出，为肿瘤治疗提供了一个新的治疗途径。它是针对肿瘤细胞特异性杀伤，而不损伤正常人体组织细胞的药物，也是肿瘤治疗方面一个较好的，具有潜力的方向。

肿瘤的分化治疗

黑色素瘤（ melanoma ）

Treatment-resistant

Median survival :6-9month

Normal chemotherapy protocol

new drugs or novel therapy

Information is limited

Early invasion

and metastasis

Differentiation inducer

研究背景（二）

黑色素瘤细胞是研究肿瘤细胞分化的理想模型

• Add your title in here• 黑色素瘤细胞向正常细胞分化后，出现典型的树突状突起结构，黑色

素生成及酪氨酸酶活性增加。

tyrosinase activity

Dendrite-like outgrowth

Melanin production

find out the agent that induce melanoma cell differentiation from

plants

（图片来自文献）

中药木鳖子

• 本实验将探讨中药木鳖子提取物对黑色素瘤 B16 细胞的诱导分化作用及其相关机制

主产：广西、四川、 湖北。主治：消肿散结，祛毒。　　治痈肿、疔疮、痔疮、无名肿毒 。多在治疗肿瘤的方剂中出现，但是文献中并未见木鳖子提取物抗肿瘤的研究报道。

实验路线和方法：

活性成分提取乙醇浸泡 7 天 , 加热回

流提取 2 次

旋转蒸发仪冷冻浓缩成浸膏

萃取

乙酸乙酯 ( 石油醚 ) 正丁醇 乙醚 水相

木鳖子

MTT 法、形态学检测筛选出具有生物活性的液

相

大孔树脂

硅胶柱层析

筛选出活性

单体化合物

阳性对照：α-MSH

B16 cells

细胞增殖抑制和集落形成率

木鳖子

活性成分

细胞活性

检测

细胞功能

形态观察

黑色素 \ 酪氨酸酶 \ 细胞转移侵袭能力检测

P38\ERK\JNK 基因水平表达变化

特异性通路抑制剂SB203580(P38 ）、 PD98059(MEK) 对药物诱导分化的影响

P38\ERK\JNK 蛋白水平及活性（磷酸化水平）的变化

选择活性改变显著的通路

检测该通路下游基因及蛋白表达的变化

MAPKs 通路上游PKA 、 PKC 活性的变化

Giemsa 染色 / 超微结构观察 / 荧光染色（ AlexaFluor488 phalloidin)

Compare with Control, P<0.01, **P<0.001

Table 1 Inhibitory effect of CMSEE on melanoma B16 cells

1

2

3 4

Fig.1 Effect of CMSEE on the clone forming of B16 cellsA: The representative picture of clone forming(×200).

1.Control ； 2.CMSEE (10mg/L) ； 3.CMSEE (20 mg/L);4.CMSEE(40mg/L) B: Clones counting.Compare with control group, *P<0.05,**P<0.01

A

B

CMSEE 对 B16 细胞增殖活性及克隆形成率的影响

The cell viability and modality of B16 cells after treatment by CMSEE(×200). Morphological changes of B16 cells observed under the microscope. 1: untreated cell; 2: CMSEE (20mg/L); 3: CMSEE (100mg/L)

1 3

x200 x200 x400

Fig.2 Morphological changes of B16 cells after treated with CMSEE (20mg/L) for 48h.

Untreated cell

CMSEE Treated cell

CMSEE 对 B16 细胞形态的影响

细胞体积增大，细胞核大小均一，核浆比例减少，

出现典型的树突状和网状结构，呈梭形排列

CMSEE 作用于 B16 细胞的透射电镜形态变化

Control （ × 4K ）

CMSE(20mg/L （ × 4K ）

Control （ × 20K ）

CMSE(20mg/L （ × 20K ）

正常细胞核大，圆形，常染色质丰富，异染色质较少。未见黑色素小体 。高倍镜下可见细胞质表面可见许多微绒毛，包膜完整，细胞质内细胞器少。

经过 CMSEE 处理后，细胞体积变大，细胞核缩小，异染色质增多，呈多边形，细胞表面微绒毛减少，核内异染色质增多，核质比减小，可见不同的黑色素小体，部分细胞大量黑色素小体聚集成团。

Fig.2 Morphological changes of B16 cells electron microscopeobserved by electron microscope after treated with CMSEE by (20mg/L) for 48h.

不同浓度 CMSEE 对 B16 细胞分化率的影响

•

Figure.3 Enhancing effect of CMSEE on B16 cell differentiation B16 cells were treated for 48h with CMSEE. The cells were assessed by morphologic analysis using Giemsa stain. The arrows indicate differentiated B16 cells with dendrite formation. A: untreated cell;. B, C, D: treated with CMSEE (10, 20, 40mg/L)

A B C

0

20

40

60

80

100

Cont rol DMSO 10mg/ L 20mg/ L 40mg/ L

CMSEE

% Di

ffer

enti

atio

n(%)分化率

D

Table.3 The effect of CMSEE on the production of melanochrome and the activity of tyrosinase

GroupsMelanin/106 cells

（ A405 ）Tyrosinase （ Folds ）

Control 0.037±0.002 —

DMSO 0.040±0.002 1.02

CMSEE(mg/L)

10 0.057±0.007* 1.39±0.32

20 0.173±0.005** 2.00±0.44

40 0.249±0.002** 2.80±0.52

100 0.020±0.004* 0.57±0.34

0

0. 05

0. 1

0. 15

0. 2

0. 25

0. 3

Control DMSO 1Omg/ L 20mg/ L 40mg/ L 100mg/ L

CMSEE

Mela

nins

is(A

405) A405

Compare with control group, *P<0.05, **P<0.01

**

**

**

*

**

**

*

*

CMSEE 对 B16 细胞黑色素生成及酪氨酸酶活性的影响

原理：碱裂解法和比色法

**

**

*

CMSEE 对 B16 细胞迁徙和转移的影响

Control 5-Fu CMSEE(20mg/L)

划痕试验

侵袭实验

MAPK 信号通路对肿瘤细胞分化的调节作用

丝裂原活化蛋白激酶 (MAPK) 信号转导通路是近年来信号转导方面最活跃的研究领域。研究表明 ,它们与肿瘤细胞的凋亡、分化、侵袭和转移等有着重要关系 , 将为肿瘤的治疗提供新的靶点。 ERK 是受外界刺激时决定细胞命运的关键性因素 ,它能促进增殖 , 决定细胞向终末期分化或发生凋亡。 JNK 和 P38 主要被应激刺激和病理性损伤信号所激活 , 介导细胞凋亡反应 ,但在某些细胞类型也被有丝分裂原激活 , 介导细胞分化与增殖。

研究表明， MAPKS 通路的活性参与了黑色素瘤细胞的分化调节

CMSEE 对 B16 细胞 MAPKs 通路活性的影响

Fig.4 The MAPKs activition (P38, JNK, ERK1/2) in CMSEE-induced B16 differentiation

20mg/L CMSEE能显著提高 p-P38 和 p-JNK的表达水平 (P<0.01)，在第 2h 时最明显。且能降低 p-ERK1/2的蛋白表达水平，在第 4h 时最明显。表明 CMSEE对黑色素瘤 B16细胞的诱导分化作用与其提高 P38通路和 JNK通路和阻滞 ERK1/2通路的活性相关。

p-p38

PD98059 对 CMSEE 诱导 B16 细胞分化的影响

  Control PD CMSEE CMSEE+PD

CMSEE － — ＋ ＋PD － ＋ － ＋

p-ERK1/2

GAPDH

(B)

Fig.5 The effect of PD98059 on the CMSEE-induced differentiation of melanoma B16 cells. A: Differentiation morphology of B16 induced by different agents. B: the expression of p-ERK1/2 influenced by different agents

(A)

经 40μM的 ERK通路阻滞剂 PD98059预处理 1h 后， 20mg/L的 CMSEE对 B16细胞的分化作用明显增强， p-ERK1/2蛋白表达水平进一步降低，黑色素 B16细胞树突状结构明显，证明了ERK1/2通路活性的降低促进了 CMSEE对黑色素瘤细胞的诱导分化作用 。

1 2 3 4

SB302580 对 CMSEE 诱导 B16 细胞分化的影响

Control SB 203580 CMSEE CMSEE+SB203580

CMSEE － － ＋ ＋SB － ＋ － ＋

p-p38

GAPDH

 

 

Fig.6 The effect of SB302580 on the CMSEE-induced differentiation of melanoma B16 cells. A: Differentiation morphology of B16 induced by different agents. B: the expression of p-ERK1/2 influenced by different agents

(A)

(B)

经 20μM的 P38 MAP通路阻滞剂 SB302580预处理 B16细胞 1h 后加入 20mg/L的 CMSEE， B16细胞分化形态部分被阻滞，证明 SB302580阻滞了 CMSEE对 p38通路的激活作用，证实 CMSEE诱导B16细胞分化与 P38 MAP通路活性降低相关

结论：

中药木鳖子醇提物能显著抑制恶性黑色素瘤 B16 细胞的增殖和集落形成能力，并呈时间和浓度依赖性。小鼠黑色素瘤 B16 细胞经较低浓度 CMSEE 作用后，细胞形态发生明显改变，细胞体积增大，细胞核大小均一，核浆比例减少，出现树突状和网状结构。 B16 细胞经 CMSEE （ 10-40mg/L ）作用后，黑色素合成能力和酪氨酸酶活性均明显增加，同时酪氨酸酶活性升高，且呈浓度依赖性，进一步证明了 CMSEE 对 B16 细胞的诱导分化作用 。

CMSEE 能显著提高 P38 和 JNK 通路的活性，降低 ERK1/2

通 路 的 活 性 ，且经 ERK 通 路阻滞剂 PD98059 预处理后 ， CMSEE 对 B16 细 胞 的 分 化 作 用明显增强 , 证明了ERK1/2 通路活性的降低促进了 CMSEE 对黑色素瘤细胞的诱导分 化 作 用 ， 而经 P38 MAP 通 路阻滞剂 SB302580 预处理B16 细胞后加入 CMSEE ， B16 细胞分化形态部分被阻滞 , 证实 CMSEE 诱导 B16 细胞分化与 P38 MAP 通路活性增强相关。因为我们暂未购买到 JNK 通路的阻滞剂，因此后继实验还有待于完成。

更深入的分化诱导机制