Γονιδιακή Θεραπεία (Gene Therapy)

Α. Ηλιόπουλος

Καθηγητής Βιολογίας

MIT

Technology Review

Rewriting Life:

2017 Was the Year of Gene-Therapy Breakthroughs Gene-fixing treatments have now cured a number of patients with cancer and rare diseases.

2017: Η γονιδιακή θεραπεία στο προσκήνιο

Θαλασσαιμία

Τι είναι η γονιδιακή θεραπεία?

Τεχνολογία για την επιδιόρθωση ελαττωματικών γονιδίων που είναι υπεύθυνα για την ανάπτυξη νοσημάτων στον άνθρωπο.

Στόχος

Η μεταφορά και έκφραση του θεραπευτικού γονιδίου στα κύτταρα-στόχο

Ιδανικά: διόρθωση του ελαττωματικού γονιδίου εντός του κυττάρου

Εναλλακτικά: Προσθήκη του θεραπευτικού γονιδίου

Οι ιοί χρησιμοποιούνται ως φορείς γονιδίων

• Γενετικά στοιχεία (όχι μικρόβια!)

• Bασίζονται στο κύτταρο-ξενιστή για τις βασικές

βιοχημικές τους ιδιότητες (π.χ. Ριβοσώματα, ATP)

• Γενετικό υλικό μέσα σε πεπτιδικό περίβλημα (καψίδιο)

• Αναπαράγονται μέσα στο ζωντανό κύτταρο

• Σχήμα: ελικοειδές ή πολυγωνικό

• Ακανθες: πρωτεϊνικές προεκβολές για διευκόλυνση

προσκόλλησης

• Ορισμένοι (αλλά όχι όλοι) ιοί θανατώ-

νουν το κύτταρο ξενιστή ή προκαλούν

την οριστική μετατροπή του.

Το γενετικό υλικό των ιών

Ρετροϊοί, πολιοϊός, βακτηριοφάγος R17

Ιός της δαμαλίτιδας αδενοϊός

Παρβοϊός,

ρεοϊός βακτηριοφάγος Τ4, ερπητοϊός

Βακτηριοφάγος Μ13

SV40, polyoma

Ιός Epstein-Barr

• Δίκλωνο DNA. Kωδικοποιεί για περίπου 80 ιικές πρωτεϊνες.

• Μολύνει >90% του πληθυσμού αλλά είναι εν γένει ασυμπτωματικός

• Μόλυνση σε ενήλικες επιφέρει λοιμώδη μονοπυρήνωση (υψηλός πυρετός,

κακουχία, λεμφανδενοπάθεια, φαρυγγαλγία).

• Σε ασθενείς σε ανοσοκαταστολή επανεργοποιείται και συμβάλλει στην

ανάπτυξη κακοηθειών ( Λέμφωμα Burkitt, ρινοφαρυγγικό κακρκίνωμα κ.α.)

Epstein-Barr virus Καρκίνωμα του ρινοφάρυγγα

•Ρετροϊοί: μονόκλωνο RNA •8500 nt •Αντίστροφη μεταγραφάση του ιού •RNA Πολυμεράση του κυττάρου •Ενσωματώνονται στο DNA • Επιφέρουν μεταβολές στην λειτουργία του κυττάρου

Ρετροϊοί

Εργαλεία: Ιικοί φορείς

Γιατί να χρησιμοποιήσουμε ιούς? Εξελικτικά, οι ιοί έχουν αναπτύξει μηχανισμούς ενθυλάκωσης και εισαγωγής γονιδίων σε κύτταρα του ανθρώπου. Πρακτικά, μπορούν να επιμολύνουν όλα τα κύτταρα-στόχους ανάλογα με τον τροπισμό τους. Γενετικά τροποποιήσιμοι ώστε να μην αντιγράφονται εντός του κυττάρου ξενιστή

Iικοί φορείς για γονιδιακή θεραπεία (Gene Therapy Vectors)

Τρεις τύποι φορέων χρησιμοποιούνται:

• Αδενοϊοί (Adenoviruses)

• Ρετροϊοί (Retroviruses) – περιλαμβάνουν τους λεντι-ιούς

• Σχετιζόμενοι με τους αδενοϊούς (Αdeno-associated viruses)

Αδενοϊοί •Αποκτούνται σε μεγάλες συγκεντρώσεις (τίτλους).

• Επιμολύνουν πολλούς τύπους κυττάρων (διαιρούμενων και μη).

• Μπορούν να φέρουν μεγάλα ενθέματα (διαγονίδια).

Ισχυρή ανοσολογική απόκριση που τους απενεργοποιεί. Δεν ενσωμα-τώνονται στο γονιδίωμα (παροδική έκφραση διαγονίδιου).

Ρετροϊοί • Δεν είναι τοξικοί για το κύτταρο • Αντίγραφα ενσωματώνονται

(μαζί με το διαγονίδιο) στο DNA

Σχετικά μικρά ενθέματα (μέχρι 8 kb). Στοχεύουν μόνο διαιρούμενα κύτταρα. Κίνδυνος από την ενσωμάτωση σε περιοχές γονιδίων.

Λεντι-ιοί Επιμολύνουν διαιρούμενα και μη-διαιρούμενα κύτταρα.

Κίνδυνος από την ενσωμά-τωση σε περιοχές γονιδίων.

Αdeno-associated

• Επιμολύνουν διαιρούμενα και μη-διαιρούμενα κύτταρα.

• Με την μορφή επισώματος ή σταθερά ενσωματωμένα σε περιοχή του chr.19.

Ισχυρή ανοσολογική απόκριση που τους απενεργοποιεί.

Παραδείγματα εφαρμογών γονιδιακής θεραπείας

IL2Rγ

• Ο υποδοχέας IL-2R (IL-2 receptor) εκφράζεται σε Τ, Β και ΝΚ κύτταρα: η έλλειψη της γ αλυσίδας οδηγεί σε απουσία λειτουργικών Β, Τ και ΝΚ κυττάρων.

• Άτομα με X-SCID είναι επιδεκτικά σε μολύνσεις και πεθαίνουν σε μικρή ηλικία (< 3 μήνες). • Μόνο το 1/3 των ασθενών με X-SCID έχουν οικογενειακό ιστορικό για SCID, εξηγείστε τα 2/3…

IL2Rγ

• Ο υποδοχέας IL-2R (IL-2 receptor) εκφράζεται σε Τ, Β και ΝΚ κύτταρα: η έλλειψη της γ αλυσίδας οδηγεί σε απουσία λειτουργικών Β, Τ και ΝΚ κυττάρων.

• Άτομα με X-SCID είναι επιδεκτικά σε μολύνσεις και πεθαίνουν σε μικρή ηλικία (< 3 μήνες). • Μόνο το 1/3 των ασθενών με X-SCID έχουν οικογενειακό ιστορικό για SCID, τα 2/3 οφείλονται σε de novo μεταλλάξεις στη γαμετική σειρά (ή το γονιμοποιημένο ωάριο)

IL2Rγ

• Ο υποδοχέας IL-2R (IL-2 receptor) εκφράζεται σε Τ, Β και ΝΚ κύτταρα: η έλλειψη της γ αλυσίδας οδηγεί σε απουσία λειτουργικών Β, Τ και ΝΚ κυττάρων.

• Άτομα με X-SCID είναι επιδεκτικά σε μολύνσεις και πεθαίνουν σε μικρή ηλικία (< 3 μήνες). • Μόνο το 1/3 των ασθενών με X-SCID έχουν οικογενειακό ιστορικό για SCID, τα 2/3 οφείλονται σε de novo μεταλλάξεις στη γαμετική σειρά (ή το γονιμοποιημένο ωάριο)

• Υπολειπόμενο πρότυπο κληρονόμησης. Γιατί μια μητέρα-φορέας θα έχει πάντα 50% πιθανότητα να γεννήσει παιδί με X-SCID αφού το ένα Χ αδρανοποιείται ?

IL2Rγ

• Ο υποδοχέας IL-2R (IL-2 receptor) εκφράζεται σε Τ, Β και ΝΚ κύτταρα: η έλλειψη της γ αλυσίδας οδηγεί σε απουσία λειτουργικών Β, Τ και ΝΚ κυττάρων.

• Άτομα με X-SCID είναι επιδεκτικά σε μολύνσεις και πεθαίνουν σε μικρή ηλικία (< 3 μήνες). • Μόνο το 1/3 των ασθενών με X-SCID έχουν οικογενειακό ιστορικό για SCID, τα 2/3 οφείλονται σε de novo μεταλλάξεις στη γαμετική σειρά (ή το γονιμοποιημένο ωάριο)

• Υπολειπόμενο πρότυπο κληρονόμησης. Η απενεργοποίηση του X αναστρέφεται στα γαμετικά κύτταρα, άρα 50% πιθανότητα να γεννηθεί παιδί με X-SCID από μητέρα-φορέα.

IL2Rγ

Αντιμετώπιση των ασθενών: 1) Προφύλαξη (στείρο περιβάλλον, αντιβιοτικά,

αντι-ιικά φάρμακα, ανοσοσφαιρίνες) 2) Μεταμόσχευση μυελού των οστών από υγιή δότη

για επαναδημιουργία του ανοσοποιητικού. Μειονέκτημα: ο δότης πρέπει να έχει το ίδιο τύπο πρωτεϊνών HLA που είναι υπεύθυνες για την ανίχνευση «ξένων» προς τον οργανισμό αντιγόνων.

3) Γονιδιακή θεραπεία χρησιμοποιώντας μυελό του πάσχοντος.

IL2Rγ

IL2Rγ

Προβλήματα: Σε 3 περιπτώσεις ασθενών εμφανίστηκε λευχαιμία: ένθεση του ρετροϊού στον γενετικό τόπο LMO2 που έχει συσχετισθεί με Τα λευχαιμίες.

Γονιδιακή θεραπεία θαλασσαιμίας

Μη ιικοί φορείς για γονιδιακή θεραπεία: λιποσώματα

Κυστική Ίνωση (Cystic Fibrosis)

•Κληρονομική μονογονιδιακή νόσος (μεταλλάξεις στο γονίδιο CFTR), αυτοσωμικό υπολειπόμενο πρότυπο κληρονόμησης.

• Προσβάλλει σχεδόν αποκλειστικά την καυκάσια φυλή σε συχνότητα 1/2500 γεννήσεις, ενώ το 4-5% είναι ασυμπτωματικοί φορείς (ετεροζυγώτες).

• Οδηγεί σε σταδιακή νόσο των πνευμόνων (χρόνια αποφρακτική πνευμονοπάθεια, επανειλημμένες λοιμώξεις του κατώτερου αναπνευστικού) και παγκρεατική ανεπάρκεια (στην εξωκρινή μοίρα) και ↑ ηλεκτρολύτες στον ιδρώτα (Να, Cl).

• Η CFTR είναι δίαυλος χλωρίου. Μεταλλάξεις επιφέρουν τη δυσλειτουργία του με αποτέλεσμα τη μειωμένη έκκριση χλωρίου από τα επιθηλιακά κύτταρα και απώλεια υγρών στους πνεύμονες που οδηγεί στη συσσώρευση βλέννας.

Λιποσώματα για τη θεραπεία της κυστικής ίνωσης

Μη ιικοί φορείς για γονιδιακή θεραπεία: λιποσώματα

Πλεονεκτήματα: Ευκολία στην προετοιμασία, ασφάλεια στη χρήση

Μειονεκτήματα: Μικρή ικανότητα διαμόλυνσης in vivo και απελευθέρωσης του γονιδίου ή siRNA

Για Μελέτη:

• Alberts, Κεφάλαιο 6, σελ 290-293

• Thomson, Κεφάλαιο 13, σελ. 483-491

• Διαφάνειες και σημειώσεις στο e-class

Ιοί (viruses): γενετικά στοιχεία που συσκευάζονται μέσα σ’ ένα πρωτεϊνικό ‘κέλυφος’

• Bασίζονται στο κύτταρο-ξενιστή για τις βασικές βιοχημικές τους ιδιότητες

(π.χ. Ριβοσώματα, ATP)

• Αναπαράγονται μέσα στο ζωντανό κύτταρο

• Ορισμένοι (αλλά όχι όλοι) ιοί θανατώνουν το κύτταρο ξενιστή ή προκαλούν

την οριστική μετατροπή του.