ფაგებისგამოყოფა კლონირება...
TRANSCRIPT
![Page 1: ფაგებისგამოყოფა კლონირება …immunoschool.tsu.ge/public/img/leqcia/10leqcia.pdf · freezing-melting out, thermal treatment, electrolise,](https://reader031.vdocuments.site/reader031/viewer/2022031807/5c12b38c09d3f2f42a8b9326/html5/thumbnails/1.jpg)
ფაგების გამოყოფა, კლონირება,
კონცენტრირება და გასუფთავება
ბესარიონ ლასარეიშვილი
აგრარული უნივერსიტეტი, უჯრედული იმუნოლოგიის
ლაბორატორია
გ.ელიავას სახელობის ბაქტერიოფაგიის, მიკრობიოლოგიის,
ვირუსოლოგიის ინსტიტუტი
![Page 2: ფაგებისგამოყოფა კლონირება …immunoschool.tsu.ge/public/img/leqcia/10leqcia.pdf · freezing-melting out, thermal treatment, electrolise,](https://reader031.vdocuments.site/reader031/viewer/2022031807/5c12b38c09d3f2f42a8b9326/html5/thumbnails/2.jpg)
ბაქტერიების ვირუსების მოკლედახასიათება
![Page 3: ფაგებისგამოყოფა კლონირება …immunoschool.tsu.ge/public/img/leqcia/10leqcia.pdf · freezing-melting out, thermal treatment, electrolise,](https://reader031.vdocuments.site/reader031/viewer/2022031807/5c12b38c09d3f2f42a8b9326/html5/thumbnails/3.jpg)
რატომ იმსახურებენ ფაგები ინტერესს?
• მედიცინა და ვეტერინარია
• ეკოლოგია და გარემოს დაცვა
• ბიოტექნოლოგია და გენეტიკური ინჟინერია
• ინჯინერია
• კვლევის მოდელი ფუნდამენტურ მეცნიერებებში
![Page 4: ფაგებისგამოყოფა კლონირება …immunoschool.tsu.ge/public/img/leqcia/10leqcia.pdf · freezing-melting out, thermal treatment, electrolise,](https://reader031.vdocuments.site/reader031/viewer/2022031807/5c12b38c09d3f2f42a8b9326/html5/thumbnails/4.jpg)
Historical Background
Eliava Institute of
Bacteriophages,Tbilisi
Since 1923
G. Eliava and F. D’Herelle,
Tbilisi, 1930
Therapeutic phage
preparations (2016, Georgia)
![Page 5: ფაგებისგამოყოფა კლონირება …immunoschool.tsu.ge/public/img/leqcia/10leqcia.pdf · freezing-melting out, thermal treatment, electrolise,](https://reader031.vdocuments.site/reader031/viewer/2022031807/5c12b38c09d3f2f42a8b9326/html5/thumbnails/5.jpg)
ბაქტერიების ვირუსების ძირითადი
მორფოლოგიურ ტიპები
• ძაფისებური (ფილამენტური) ფაგები
• უკუდო, სფეროსებური ფაგები
• მოკლე კუდით (პოდოვირიდე)
• გრძელი, უკუმშველი კუდით (სიფოვირიდე)
• შედარებით გრძელი, მკუმშავი კუდით (მიოვირიდე)
![Page 6: ფაგებისგამოყოფა კლონირება …immunoschool.tsu.ge/public/img/leqcia/10leqcia.pdf · freezing-melting out, thermal treatment, electrolise,](https://reader031.vdocuments.site/reader031/viewer/2022031807/5c12b38c09d3f2f42a8b9326/html5/thumbnails/6.jpg)
ფაგების გენომი და ზომები
• ორჯაჭვიანი ან ერთჯაჭვიანი დნმ
• ორჯაჭვიანი ან ერთჯაჭვიანი რნმ
რგოლისებური (შედარებით იშვიათად), გახსნილი /ხაზოვანი/ ან
ფრაგმენტირებული ფორმით
• ზომები: 20-დან 100 ნმ-მდე
კუდის დიამეტრი 12-25 ნმ-ია, მისი სიგრძე 14-250 ნმ-ია
![Page 7: ფაგებისგამოყოფა კლონირება …immunoschool.tsu.ge/public/img/leqcia/10leqcia.pdf · freezing-melting out, thermal treatment, electrolise,](https://reader031.vdocuments.site/reader031/viewer/2022031807/5c12b38c09d3f2f42a8b9326/html5/thumbnails/7.jpg)
სიმწიფის მიხედვით განასხვავებენ
• ინფექციურ (მომწიფებულ) ფაგები
ვირულენტური (მალიზირებელი) ფაგები ანუ ფაგი-აგრესორები
ზომიერი (ლიზოგენური, ლატენტური) ფაგები ანუ ფაგი-
კომენსალები
• არაინფექციური ანუ ვეგეტაციური (მოუმწიფებელი)
ფაგები
![Page 8: ფაგებისგამოყოფა კლონირება …immunoschool.tsu.ge/public/img/leqcia/10leqcia.pdf · freezing-melting out, thermal treatment, electrolise,](https://reader031.vdocuments.site/reader031/viewer/2022031807/5c12b38c09d3f2f42a8b9326/html5/thumbnails/8.jpg)
ფაგების სასიცოცხლო ციკლი
• პროდუქციული (ლიზისური)
• რედუქციული (ლიზოგენური, ინტეგრაციული)
• აბორტული ინფექცია
![Page 9: ფაგებისგამოყოფა კლონირება …immunoschool.tsu.ge/public/img/leqcia/10leqcia.pdf · freezing-melting out, thermal treatment, electrolise,](https://reader031.vdocuments.site/reader031/viewer/2022031807/5c12b38c09d3f2f42a8b9326/html5/thumbnails/9.jpg)
ფაგების პროდუქციული (ლიზისური)
სასიცოცხლო ციკლი 20-40 წთ-ი გრძელდება
• ადსორბცია (მოქმედების სპექტრი)
ტიპოსპეციფიკური (ტიპიურ ანუ T-ფაგები)
მონოვალენტური (მონოფაგები, სახეობასპეციფიკური)
პოლივალენტური (პოლიფაგები) ფაგები
• გენომის ინექციის (ეჟექციის)
• ვირიონების ბიოსინთეზიდა აწყობა
• ბაქტერიულიუჯრედისლიზისიდა ვირიონების გამოსვლა
![Page 10: ფაგებისგამოყოფა კლონირება …immunoschool.tsu.ge/public/img/leqcia/10leqcia.pdf · freezing-melting out, thermal treatment, electrolise,](https://reader031.vdocuments.site/reader031/viewer/2022031807/5c12b38c09d3f2f42a8b9326/html5/thumbnails/10.jpg)
გარემოდან ფაგების გამოყოფა,
კონცენტრირებულიდა გასუფთავებული
ფაგური პრეპარატის მომზადება
![Page 11: ფაგებისგამოყოფა კლონირება …immunoschool.tsu.ge/public/img/leqcia/10leqcia.pdf · freezing-melting out, thermal treatment, electrolise,](https://reader031.vdocuments.site/reader031/viewer/2022031807/5c12b38c09d3f2f42a8b9326/html5/thumbnails/11.jpg)
კონცენტრირებული და გასუფთავებული
პრეპარატების გამოყენება
• იმუნობიოლოგიური მოქმედების შესწავლა
• ფიზიკო-ქიმიური თვისებების შესწავლა
• მოლეკულურ-ბიოლოგიური თვისებების შესწავლა
• ინტრავენურად საინექციო პრეპარატის წარმოება
![Page 12: ფაგებისგამოყოფა კლონირება …immunoschool.tsu.ge/public/img/leqcia/10leqcia.pdf · freezing-melting out, thermal treatment, electrolise,](https://reader031.vdocuments.site/reader031/viewer/2022031807/5c12b38c09d3f2f42a8b9326/html5/thumbnails/12.jpg)
კონცენტრირებული და გასუფთავებული
პრეპარატების გამოყენება
• ფაგის იზოლაცია გარემოდან
• ფაგის გენეტიკურად სუფთა ხაზის მიღება და
დახასიათება
• ფაგის დაკონცენტრირება
• გაწმენდა
![Page 13: ფაგებისგამოყოფა კლონირება …immunoschool.tsu.ge/public/img/leqcia/10leqcia.pdf · freezing-melting out, thermal treatment, electrolise,](https://reader031.vdocuments.site/reader031/viewer/2022031807/5c12b38c09d3f2f42a8b9326/html5/thumbnails/13.jpg)
ფაგების გამოყოფა: ნიმუშის გამდიდრება დადეტექცია
ნიმუშის გაწმენდა მასში არსებული ბაქტერიებისგან
მასპინძელი ბაქტერია
საკვები არე
გამდიდრებული სუსპენზიიდან დაუშლელი
ბაქტერიების მოცილება და ფაგების დეტექცია
![Page 14: ფაგებისგამოყოფა კლონირება …immunoschool.tsu.ge/public/img/leqcia/10leqcia.pdf · freezing-melting out, thermal treatment, electrolise,](https://reader031.vdocuments.site/reader031/viewer/2022031807/5c12b38c09d3f2f42a8b9326/html5/thumbnails/14.jpg)
ფაგური იზოლატის კლონირება - სუფთა
გენეტიკური ხაზის ფაგის გამოსაყოფა
ნეგატიური კოლონიები (ფაგური ბალთა) ფინჯანზე მეჩხრად
იყოს
ავარჩიოთ კონკრეტული ფორმის და ზომის ნეგატიურ ი
კოლონია
ამოვჩხვლიტოთ სხვა კოლონიებისგან კარგად გამიჯნული,
იზოლირებული ფაგური ბალთა
ერთი მორფოლოგიის ნეგატიური კოლონიის მქონე ფაგების 3-7
-ჯერადი პასირება
![Page 15: ფაგებისგამოყოფა კლონირება …immunoschool.tsu.ge/public/img/leqcia/10leqcia.pdf · freezing-melting out, thermal treatment, electrolise,](https://reader031.vdocuments.site/reader031/viewer/2022031807/5c12b38c09d3f2f42a8b9326/html5/thumbnails/15.jpg)
ფაგური სუსპენზიის სერიული განზავება
![Page 16: ფაგებისგამოყოფა კლონირება …immunoschool.tsu.ge/public/img/leqcia/10leqcia.pdf · freezing-melting out, thermal treatment, electrolise,](https://reader031.vdocuments.site/reader031/viewer/2022031807/5c12b38c09d3f2f42a8b9326/html5/thumbnails/16.jpg)
ფაგების დაკონცენტრირებითვის ფაგის დაბაქტერიის ოპტიმალურითანაფარდობა უნდა
დადგინდეს
ფაგის გამრავლების შედეგად პეტრის ფინჯანზე
კულტურის 95-98 %-ზე მეტი ნაწილისლიზისი
ფაგის და ბაქტერიის გამრავლების სიჩქარის თანაფარდობა
ფაგის გამოსავალი 1 ბაქტერიულიუჯრედიდან
კულტურა ექსპონენციალური ზრდის ფაზაში
ბაქტერიის ოპტიმალური კონცენტრაცია - 1×109 -1×1010
ფაგის ოპტიმალურ კონცენტრაციად 103-105 CFU/მლ-ში
![Page 17: ფაგებისგამოყოფა კლონირება …immunoschool.tsu.ge/public/img/leqcia/10leqcia.pdf · freezing-melting out, thermal treatment, electrolise,](https://reader031.vdocuments.site/reader031/viewer/2022031807/5c12b38c09d3f2f42a8b9326/html5/thumbnails/17.jpg)
ფაგების დაკონცენტრირება (2)
მიღებული ფაგოლიზატის შეგროვება
აგარის და დაუშლელი ბაქტერიების მოცილება
ფინჯნიდან მომზადებულფაგოლიზატში ფაგების
კონცენტრაციამ შეიძლება მიაღწიოს 8 ×1011 - 2×1012
CFU/მლ-ში
მაღალსიჩქარიანი ცენტრიფუგირებით ფაგების ,,დაჯენა”
ბუფერის დამატება და დაყოვნება 1-2 დღით
ფაგური ნალექის ფრთხილი გახსნა
გაუხსნელი აგრეგატების მოცილება
![Page 18: ფაგებისგამოყოფა კლონირება …immunoschool.tsu.ge/public/img/leqcia/10leqcia.pdf · freezing-melting out, thermal treatment, electrolise,](https://reader031.vdocuments.site/reader031/viewer/2022031807/5c12b38c09d3f2f42a8b9326/html5/thumbnails/18.jpg)
ფაგების დაკონცენტრირება (3)
გახსნილ ნალექში ფაგების რაოდენობა შეადგენს 7-9×1012
CFU/მლ-ში.
მომზადებული მაღალ კონცენტრირებული პრეპარატი
გარდა ინტაქტური ფაგური ვირიონებისა, დიდი
რაოდენობით შეიცავს დაზიანებულ ვირიონებს,
ბაქტერიის უჯრედის კედლის კომპონენტებს, ნუკლეინის
მჟავებს
![Page 19: ფაგებისგამოყოფა კლონირება …immunoschool.tsu.ge/public/img/leqcia/10leqcia.pdf · freezing-melting out, thermal treatment, electrolise,](https://reader031.vdocuments.site/reader031/viewer/2022031807/5c12b38c09d3f2f42a8b9326/html5/thumbnails/19.jpg)
ფაგების გაწმენდა ბაქტერიული
დებრიზისგან და ნუკლეინის მჟავებისგან (1)
• ულტრაცენტრიფუგირება ცეზიუმის ქლორიდის ორმაგ
გრადიენტზე
• ხსნარები მზადდება PH 7,4 ბუფერზე და ემატება ვირიონების
სტაბილიზატორები
• პირველი ფენა: ცეზიუმის ქლორიდის 1,52-1,6 ρ სიმკვრივის
ხსნარი
• მეორე ფენა: ცეზიუმის ქლორიდის 1,35-1,4 ρ სიმკვრივის
ხსნარი
• მესამე ფენა ,,ბალიშის” სახით: საქაროზის 30-40 %-ანი ხსნარი
• ულტრაცენტრიფუგირება
![Page 20: ფაგებისგამოყოფა კლონირება …immunoschool.tsu.ge/public/img/leqcia/10leqcia.pdf · freezing-melting out, thermal treatment, electrolise,](https://reader031.vdocuments.site/reader031/viewer/2022031807/5c12b38c09d3f2f42a8b9326/html5/thumbnails/20.jpg)
ფაგების გაწმენდა ორმაგ გრადიენტზე
ულტრაცენტრიფუგირებით
1,6 ρ CsCl
1,4 ρ CsCl
40% საქაროზა
![Page 21: ფაგებისგამოყოფა კლონირება …immunoschool.tsu.ge/public/img/leqcia/10leqcia.pdf · freezing-melting out, thermal treatment, electrolise,](https://reader031.vdocuments.site/reader031/viewer/2022031807/5c12b38c09d3f2f42a8b9326/html5/thumbnails/21.jpg)
ულტრაცენტრიფუგირება
(ფიქსირებულროტორიან ცენტრიფუგაზე)
![Page 22: ფაგებისგამოყოფა კლონირება …immunoschool.tsu.ge/public/img/leqcia/10leqcia.pdf · freezing-melting out, thermal treatment, electrolise,](https://reader031.vdocuments.site/reader031/viewer/2022031807/5c12b38c09d3f2f42a8b9326/html5/thumbnails/22.jpg)
ულტრაცენტრიფუგირება
(Swing-out როტორიან ცენტრიფუგაზე)
![Page 23: ფაგებისგამოყოფა კლონირება …immunoschool.tsu.ge/public/img/leqcia/10leqcia.pdf · freezing-melting out, thermal treatment, electrolise,](https://reader031.vdocuments.site/reader031/viewer/2022031807/5c12b38c09d3f2f42a8b9326/html5/thumbnails/23.jpg)
გაწმენდილფაგური ბენდში ფაგების
კონცენტრაცია 1-2×1013 CFU/მლ
![Page 24: ფაგებისგამოყოფა კლონირება …immunoschool.tsu.ge/public/img/leqcia/10leqcia.pdf · freezing-melting out, thermal treatment, electrolise,](https://reader031.vdocuments.site/reader031/viewer/2022031807/5c12b38c09d3f2f42a8b9326/html5/thumbnails/24.jpg)
გაწმენდილი ფაგური ბენდის გამოტანა
![Page 25: ფაგებისგამოყოფა კლონირება …immunoschool.tsu.ge/public/img/leqcia/10leqcia.pdf · freezing-melting out, thermal treatment, electrolise,](https://reader031.vdocuments.site/reader031/viewer/2022031807/5c12b38c09d3f2f42a8b9326/html5/thumbnails/25.jpg)
ფაგების დიალიზი ერთ-ერთი ყველაზესაფრთხილოდა მგრძნობიარე ეტაპია
სადიალიზო ბუფერი უნდა შეიცავდეს ფაგური ვირიონების
სტაბილიზატორებს
ბუფერის მოცულობა სადიალოზო მოცულობას 100-1000 -ჯერ
უნდა აღემატებოდეს
უნდა გრძელდებოდეს მინიმუმ 3-4 საათის განმავლობაში.
დიალიზის დროს ოსმოსური წნევა თანდათან უნდა
შემცირდეს:
3M NaCl, 0,1M Tris-HCl, 10 mM MgSO4;
0, 3 M NaCl, 0,1M Tris-HCl, 10 mM MgSO4
0,9% NaCl, 0,1M Tris-HCl, 10 mM MgSO4 ხსნარში
![Page 26: ფაგებისგამოყოფა კლონირება …immunoschool.tsu.ge/public/img/leqcia/10leqcia.pdf · freezing-melting out, thermal treatment, electrolise,](https://reader031.vdocuments.site/reader031/viewer/2022031807/5c12b38c09d3f2f42a8b9326/html5/thumbnails/26.jpg)
ფაგების დიალიზი ერთ-ერთი ყველაზე
კრიტიკული და მგრძნობიარე ეტაპია
![Page 27: ფაგებისგამოყოფა კლონირება …immunoschool.tsu.ge/public/img/leqcia/10leqcia.pdf · freezing-melting out, thermal treatment, electrolise,](https://reader031.vdocuments.site/reader031/viewer/2022031807/5c12b38c09d3f2f42a8b9326/html5/thumbnails/27.jpg)
სადიალიზო სისტემა შეიძლება ატარებდეს
ფაგების მცირე რაოდენობას
თუ გვაქვს სხვადასხვა ტიპის ფაგები, მათი დიალიზიარ უნდა განხორცილედეს ერთ კონტეინერში
![Page 28: ფაგებისგამოყოფა კლონირება …immunoschool.tsu.ge/public/img/leqcia/10leqcia.pdf · freezing-melting out, thermal treatment, electrolise,](https://reader031.vdocuments.site/reader031/viewer/2022031807/5c12b38c09d3f2f42a8b9326/html5/thumbnails/28.jpg)
ნეგატიური შეღებვა TEM-ის
P.S. ბადეებზე მუშაობისას ვისუნთქოთ ნელა და ფრთხილად
![Page 29: ფაგებისგამოყოფა კლონირება …immunoschool.tsu.ge/public/img/leqcia/10leqcia.pdf · freezing-melting out, thermal treatment, electrolise,](https://reader031.vdocuments.site/reader031/viewer/2022031807/5c12b38c09d3f2f42a8b9326/html5/thumbnails/29.jpg)
ფაგებზე მუშაობის კრიტიკული ეტაპები
• კლონირება
• ფილტრიანი პიპეტის წვერების ან ინდივიდუალური
პიპეტების გამოყენება
• ნეგატიური შეღებვისას ბადეებზე ფრთხილი მუშაობა
• ვირიონების სტაბილიზატორების გამოყენება
• გრადიენტის ფრთხილი დაფენა
• გაწმენდილი ფაგური ბენდის ნატიფი გამოღება
• დიალიზი
![Page 30: ფაგებისგამოყოფა კლონირება …immunoschool.tsu.ge/public/img/leqcia/10leqcia.pdf · freezing-melting out, thermal treatment, electrolise,](https://reader031.vdocuments.site/reader031/viewer/2022031807/5c12b38c09d3f2f42a8b9326/html5/thumbnails/30.jpg)
რა დრო სჭირდება მთელ პროცედურას?
ყველა აღწერილი პროცედურის ბოლომდე შესრულება
ოპტიმალურ პირობებში 4-6 კვირამდე პერიოდს საჭიროებს!
თუმცა ხშირად ამ პროცედურების გასავლელად მკვლევარები
წელიწადზე მეტ დროს კარგავენ
![Page 31: ფაგებისგამოყოფა კლონირება …immunoschool.tsu.ge/public/img/leqcia/10leqcia.pdf · freezing-melting out, thermal treatment, electrolise,](https://reader031.vdocuments.site/reader031/viewer/2022031807/5c12b38c09d3f2f42a8b9326/html5/thumbnails/31.jpg)
გმადლობთ ყურადღებისთვის!
![Page 32: ფაგებისგამოყოფა კლონირება …immunoschool.tsu.ge/public/img/leqcia/10leqcia.pdf · freezing-melting out, thermal treatment, electrolise,](https://reader031.vdocuments.site/reader031/viewer/2022031807/5c12b38c09d3f2f42a8b9326/html5/thumbnails/32.jpg)
Production and Application of Phagelysates as New Generation of Immunomodulators
Besarion Lasareishvili
Eka Jaiani, Merina Tediashvili
Agricultural University of Georgia, Tbilisi, Georgia
G. Eliava Institute of Bacteriophages, Microbiology and
Virology, Tbilisi, Georgia
![Page 33: ფაგებისგამოყოფა კლონირება …immunoschool.tsu.ge/public/img/leqcia/10leqcia.pdf · freezing-melting out, thermal treatment, electrolise,](https://reader031.vdocuments.site/reader031/viewer/2022031807/5c12b38c09d3f2f42a8b9326/html5/thumbnails/33.jpg)
Why it’s necessary to stimulate immune
system?
Frequency of immune dysfunctions in population is
increasing
Stimulation of the immune system is important for:
Treatment of malignancies
Treatment of immunodeficiency
Treatment of recurrent, indolent infections
Speed up the healing of chronic wounds and Ulcers
Increase efficacy of antibiotic therapy
Also
Decrease the susceptibility to an emerging infectious agent
Minimize the effects of bio-terroristic attacks
![Page 34: ფაგებისგამოყოფა კლონირება …immunoschool.tsu.ge/public/img/leqcia/10leqcia.pdf · freezing-melting out, thermal treatment, electrolise,](https://reader031.vdocuments.site/reader031/viewer/2022031807/5c12b38c09d3f2f42a8b9326/html5/thumbnails/34.jpg)
Thinking globally
კლინიკა „კაცთა მაცხოვარი“
Development of immunostimulators
with maximal therapeutic and minimal
adverse effects is of the great practical
value
![Page 35: ფაგებისგამოყოფა კლონირება …immunoschool.tsu.ge/public/img/leqcia/10leqcia.pdf · freezing-melting out, thermal treatment, electrolise,](https://reader031.vdocuments.site/reader031/viewer/2022031807/5c12b38c09d3f2f42a8b9326/html5/thumbnails/35.jpg)
Groups of Immunothrophic Medications
Immunostimulants
Immunodepressants (immunosupresants)
Immunocorrectors
The microbial lysates were found to be most
effective and cheapest immunostimulants
![Page 36: ფაგებისგამოყოფა კლონირება …immunoschool.tsu.ge/public/img/leqcia/10leqcia.pdf · freezing-melting out, thermal treatment, electrolise,](https://reader031.vdocuments.site/reader031/viewer/2022031807/5c12b38c09d3f2f42a8b9326/html5/thumbnails/36.jpg)
Immunotherapy by Bacterial Lysates was first
Implemented in 1895
Serratia marcescens (Bact. prodigiosum)
Streptococcus pyogenes
Pioneer of Immunotherapy
William Coley
(1862 – 1936)
![Page 37: ფაგებისგამოყოფა კლონირება …immunoschool.tsu.ge/public/img/leqcia/10leqcia.pdf · freezing-melting out, thermal treatment, electrolise,](https://reader031.vdocuments.site/reader031/viewer/2022031807/5c12b38c09d3f2f42a8b9326/html5/thumbnails/37.jpg)
Immunotherapy by Very Low dose of Microbial Lysates
Hoya, Germany
Medications based of Lysates:
Bacillus subtilis (Utilin® “H“ )
Mycobacterium phlei (Utilin® “S“ )
Bacillus cereus (Latensin® )
Bacillus firmus (Recarcin® )
![Page 38: ფაგებისგამოყოფა კლონირება …immunoschool.tsu.ge/public/img/leqcia/10leqcia.pdf · freezing-melting out, thermal treatment, electrolise,](https://reader031.vdocuments.site/reader031/viewer/2022031807/5c12b38c09d3f2f42a8b9326/html5/thumbnails/38.jpg)
Three Major Methods for Obtaining of
Bacterial Lysates
• Physical degradation of microbes (Mechanical, Ultrasound,
freezing-melting out, thermal treatment, electrolise, electrodialise,
etc.)
• Chemical degradation of microbes (Acid and/or alkaline
thermohydrolysis)
• Biological degradation of microbes (Use of enzymes, burst by
antibiotics, phages…)
![Page 39: ფაგებისგამოყოფა კლონირება …immunoschool.tsu.ge/public/img/leqcia/10leqcia.pdf · freezing-melting out, thermal treatment, electrolise,](https://reader031.vdocuments.site/reader031/viewer/2022031807/5c12b38c09d3f2f42a8b9326/html5/thumbnails/39.jpg)
Microbe derived drugs – The most potent
immunostimulators
Microbial Lysates
PolyMICROBIAL (Bronchomunal, Immudon, IRS-19, Immunovac vp-4,
Respibrin, Paspat, Dentavacs, Respivax, Urostim)
MonoMICROBIAL(Ruzam, Posterizan)
Partially Purified Components
Lypopolisaccharide - LPS (Prodigiosane, Pirogenale, Salmosane,
Zimosane, Lentinane, Krestine)
Peptidoglycan (Ribomunil, Imunomacs, Biostim, Immunopherone)
Nucleic Acides (Sodium Nucleinat, Ridostin, Lariphan, Ridostin)
Immune active Minimal Phragments
Glucosaminylmuramyl dipeptide - GMDP (Lycopide)
CpG -oligonucleotide (Promune, Actilone, Vacsimune)
![Page 40: ფაგებისგამოყოფა კლონირება …immunoschool.tsu.ge/public/img/leqcia/10leqcia.pdf · freezing-melting out, thermal treatment, electrolise,](https://reader031.vdocuments.site/reader031/viewer/2022031807/5c12b38c09d3f2f42a8b9326/html5/thumbnails/40.jpg)
Microbial Lysates as a pharmaceuticals (1)
Name Manufacturer Country Count of Mycrobial
Species
Pasterisane Dr. Kade, Germany 1
Pasterisane Phorte Dr. Kade, Germany 1
Paspate (autolisate) Germany 6
Spremmunane France 10
Respibrine 8
Respivax Bulgaria 6
Dentivax Bulgaria 5
Urostime Bulgaria 4
MPV Germany 48
BP-4 Immunovac Russia 4
Ribommunil P. Fabre Medicament,
France
4
![Page 41: ფაგებისგამოყოფა კლონირება …immunoschool.tsu.ge/public/img/leqcia/10leqcia.pdf · freezing-melting out, thermal treatment, electrolise,](https://reader031.vdocuments.site/reader031/viewer/2022031807/5c12b38c09d3f2f42a8b9326/html5/thumbnails/41.jpg)
Name Manufacturer Country Count of Mycrobial
Species
Broncho-munal “LEK” Slovenia 8
Broncho-Vaxome “OM pharma”
Switzerland
8
Immudone “Solvey Pharma“
France
14
IRS-19 “Solvey-Dufart”
Germany
19
Sebreum “ОМ pharma”
Switzerland
18
Uro-Vaxome “OM” pharma”
Switzerland
18
Solkourovake “Solco” Switzerland 5
Solkotriphage “Solco’’ Switzerland 8 (Strain)
Pacibanile (OK-
432)
Japan 1
La (Mega)-Iomolle Japan 1
Microbial Lysates as a pharmaceuticals (2)
![Page 42: ფაგებისგამოყოფა კლონირება …immunoschool.tsu.ge/public/img/leqcia/10leqcia.pdf · freezing-melting out, thermal treatment, electrolise,](https://reader031.vdocuments.site/reader031/viewer/2022031807/5c12b38c09d3f2f42a8b9326/html5/thumbnails/42.jpg)
Microbes Often Used to Obtain Bacterial
Lysates
• Staphylococcus aureus
• Streptococcus pneumonie, S.viridans,
S.pyogenes, S.sanguis, S.dysgalactie
• Proteus vulgaris
• Serratia marcescens
• Klebsiella pneumonie, Kl.ozoenae
• Haemophilus influenza
• Moraxella catarrhalis, M. flava, M.
pervlava
• Neisseria perflava, N. catarrhalis
• Corynebacterium pseudodiphteriticum
• Acinetobacter calcoaceticus
• Enterococcus fecalis, E. faecium
• Candida albicans
• Hafnia tetragena,
• Fuzobacterium nucleatum
• Lactobaccilus acidophilus, L.helveticus,
L.delbrueckii, L.fermentum
![Page 43: ფაგებისგამოყოფა კლონირება …immunoschool.tsu.ge/public/img/leqcia/10leqcia.pdf · freezing-melting out, thermal treatment, electrolise,](https://reader031.vdocuments.site/reader031/viewer/2022031807/5c12b38c09d3f2f42a8b9326/html5/thumbnails/43.jpg)
Main Component of Microbial Lysates –
PAMPs and their receptors PRR
Agonists of following receptors :
Expressed on membranes
TLR (Toll-Like Receptors)
Expressed on cytosole
NLR (Nucleotide-binding
Oligomerization Domain)
RLR (RIG-Like Receptors)
DAI- Receptors
Microbial patterns expressed in high amount
by microbial cells
Microbial Patterns can activate all
type of immune cells
![Page 44: ფაგებისგამოყოფა კლონირება …immunoschool.tsu.ge/public/img/leqcia/10leqcia.pdf · freezing-melting out, thermal treatment, electrolise,](https://reader031.vdocuments.site/reader031/viewer/2022031807/5c12b38c09d3f2f42a8b9326/html5/thumbnails/44.jpg)
13
Receptors Mon/Macr.
Neutr. Eusin. Mast cells
MyeloidDC
Plasm.DC
NK cells
B cells T cells T reg
TLR1 + + + + + - + + + +
TLR2 + + + + - + ++ - - + + +
TLR3 ++/+ - + - ++ - ++ - + -
TLR4 + + + + + + ++ - + - - +
TLR5 + + - - - + - + + - +
TLR6 + + + - + + - + + ++ +
TLR7 + + + - - + - + + +
TLR8 + + + - - + - + - - +
TLR9 + + + - - + + + + -
TLR10 + + + - + - - + + -
Microbial Patterns can activate all type of immune cells
![Page 45: ფაგებისგამოყოფა კლონირება …immunoschool.tsu.ge/public/img/leqcia/10leqcia.pdf · freezing-melting out, thermal treatment, electrolise,](https://reader031.vdocuments.site/reader031/viewer/2022031807/5c12b38c09d3f2f42a8b9326/html5/thumbnails/45.jpg)
Interaction between PAMP and PRR
Amplification of various
immunological effects:
Production of Proinflamatory
mediators (Cytokines and Lypid
metabolits)
Production of α- and β- IFNs
Secretion of Cytotoxic Molecules
Stimulation of Phagocytic Activity
Stimulation of Antigen Presentation
14
![Page 46: ფაგებისგამოყოფა კლონირება …immunoschool.tsu.ge/public/img/leqcia/10leqcia.pdf · freezing-melting out, thermal treatment, electrolise,](https://reader031.vdocuments.site/reader031/viewer/2022031807/5c12b38c09d3f2f42a8b9326/html5/thumbnails/46.jpg)
Various Microbial Patterns cause different type deviation CD4+ T Lymphocytes what can be used in the treatment of
Allergies an Cancers
![Page 47: ფაგებისგამოყოფა კლონირება …immunoschool.tsu.ge/public/img/leqcia/10leqcia.pdf · freezing-melting out, thermal treatment, electrolise,](https://reader031.vdocuments.site/reader031/viewer/2022031807/5c12b38c09d3f2f42a8b9326/html5/thumbnails/47.jpg)
Bacterial Phagelysates: Complex preparations
Combination of a Vaccine, Adjuvant, Immunostimulant and
specific antimicrobial agent
Pathogen Associated Molecular Patterns
(PAMPs)
Highly Immunogenic Antigens
Viruses of Bacteria (Phages)
![Page 48: ფაგებისგამოყოფა კლონირება …immunoschool.tsu.ge/public/img/leqcia/10leqcia.pdf · freezing-melting out, thermal treatment, electrolise,](https://reader031.vdocuments.site/reader031/viewer/2022031807/5c12b38c09d3f2f42a8b9326/html5/thumbnails/48.jpg)
Potential of Phagelysates: Historical Background
Eliava Institute of
Bacteriophages,Tbilisi
Since 1923
G. Eliava and F. D’Herelle,
Tbilisi, 1930
Therapeutic phage
preparations (2016, Georgia)
Bacteriophages:
highly specific for the target bacteria
Effective against multiple drug-resistant bacteria
Do not affect normal microflora
Do not cause significant side effects (allergy, intoxication etc).
Ecologically safe - do not accumulate in the environment;
Phage preparations express immunomodulatory properties
( Meipariani et al, 1967; Chanishvili et al, 2009)
![Page 49: ფაგებისგამოყოფა კლონირება …immunoschool.tsu.ge/public/img/leqcia/10leqcia.pdf · freezing-melting out, thermal treatment, electrolise,](https://reader031.vdocuments.site/reader031/viewer/2022031807/5c12b38c09d3f2f42a8b9326/html5/thumbnails/49.jpg)
How to lyse bacteria by use of phages
Lysis from outside
without phage propagation
Phage/Bacteria ratio : 10/1 to 70/1
Lysis from inside
active propagation of phages in
bacterial cells
Phage/Bacteria ratio: 1/10 to 1/100
Lysates prepared by biologycal methods appear to have better
stimulatory effect on the immune system
![Page 50: ფაგებისგამოყოფა კლონირება …immunoschool.tsu.ge/public/img/leqcia/10leqcia.pdf · freezing-melting out, thermal treatment, electrolise,](https://reader031.vdocuments.site/reader031/viewer/2022031807/5c12b38c09d3f2f42a8b9326/html5/thumbnails/50.jpg)
Phage Lysates in Experimental Studies
Three species of Gram negative bacteria and their specific phages were
used to obtain phagelysates
E.coli - phage Un (Myoviridae, elongated head)
Erw. carotovora - phage ET9 (Myoviridae, isometric head)
P.aeruginosa - phage PNM (Podoviridae)
100nm
100nm
![Page 51: ფაგებისგამოყოფა კლონირება …immunoschool.tsu.ge/public/img/leqcia/10leqcia.pdf · freezing-melting out, thermal treatment, electrolise,](https://reader031.vdocuments.site/reader031/viewer/2022031807/5c12b38c09d3f2f42a8b9326/html5/thumbnails/51.jpg)
Obtaining and testing of phagelysates –
experimental study
Phage infection at the different
stages of Exponential Growth phase
Important parameters :
Proper selection of bacteria and phage
Phage / bacteria ratio
Time of phage inoculation
Lysis time
Concentration of live phage particles
Content of Nucleic acids and
proteins, LPS
Fractionation procedure
![Page 52: ფაგებისგამოყოფა კლონირება …immunoschool.tsu.ge/public/img/leqcia/10leqcia.pdf · freezing-melting out, thermal treatment, electrolise,](https://reader031.vdocuments.site/reader031/viewer/2022031807/5c12b38c09d3f2f42a8b9326/html5/thumbnails/52.jpg)
Induction of Rapid Active Immunity by
Bacterial Phage Lysates
Non-specific (Universal defence)
Effective against various infectious agents
Rapid development (12-24 hours) after
injection of a phagelysate (Rapid defence)
Short-lasting defense : Developed resistance
lasts for 10-14 days
Potential use (e.g. in Veterinary): to minimaze
the results of bioterrorisitic attacks or natural
epidemics ( e.g. in industrial farming)
![Page 53: ფაგებისგამოყოფა კლონირება …immunoschool.tsu.ge/public/img/leqcia/10leqcia.pdf · freezing-melting out, thermal treatment, electrolise,](https://reader031.vdocuments.site/reader031/viewer/2022031807/5c12b38c09d3f2f42a8b9326/html5/thumbnails/53.jpg)
Defensive effects of phagelysates
Injection of lysates
After 24 hours
(up to 7 days)
Injection of lethal doses S.aureus
100 % survival
Injection of lethal
doses S.aureus
100 % died
After 2-4 hr
Control group
Experimental group
Total survival (100%) of animals observed after stimulation by
PhL - in 24 hr and up to 7 days
![Page 54: ფაგებისგამოყოფა კლონირება …immunoschool.tsu.ge/public/img/leqcia/10leqcia.pdf · freezing-melting out, thermal treatment, electrolise,](https://reader031.vdocuments.site/reader031/viewer/2022031807/5c12b38c09d3f2f42a8b9326/html5/thumbnails/54.jpg)
Rapid Defense developed against
Dosis certae lethalis (Dcl) of S.aureus 3
PhL-Pae
PhL-Erc
PhL-Eco
Control0
10
20
30
40
50
60
70
80
90
100
8 hr12 hr
15 hr24 hr
72hr5 days
7 days10 days
14days
PhL-Pae
PhL-Erc
PhL-Eco
Control
%
of
su
rviv
al
Phage lysates
P.aeruginosa/PMN, Erwinia corotovora/TE9 and E.coli/Un
![Page 55: ფაგებისგამოყოფა კლონირება …immunoschool.tsu.ge/public/img/leqcia/10leqcia.pdf · freezing-melting out, thermal treatment, electrolise,](https://reader031.vdocuments.site/reader031/viewer/2022031807/5c12b38c09d3f2f42a8b9326/html5/thumbnails/55.jpg)
1 2
Structural changes in liver and kidney of experimental
animals after inoculation of phagelysates
A
B
3
A – Liver; B- kidney; 1 - control ( intact) animals; 2 - phagelysate inoculation;
3 - Thermolysate inoculation (5 days after inoculation)
Minor transient influence of phagelysates
![Page 56: ფაგებისგამოყოფა კლონირება …immunoschool.tsu.ge/public/img/leqcia/10leqcia.pdf · freezing-melting out, thermal treatment, electrolise,](https://reader031.vdocuments.site/reader031/viewer/2022031807/5c12b38c09d3f2f42a8b9326/html5/thumbnails/56.jpg)
Phage Lysates in Erlich Carcinoma
immunotherapy
Immunomoregulatory properties of phagelysates:
Increase in numbers of CD3 + CD8 +, CD3 + CD4 + and CD16 + CD56+ cells,
Decrease of T-reg’s (CD4CD25, CD25Foxp3 )K. Gambashidze, P. Khorava,E. Jaiani, B. Lasareishvil,M. Tediashvili, Antitumor and adjuvant effects of phagelysates of E.coli in mice with erlich carcinoma, Exp Oncol, 34, 2, 107–111, 2013
![Page 57: ფაგებისგამოყოფა კლონირება …immunoschool.tsu.ge/public/img/leqcia/10leqcia.pdf · freezing-melting out, thermal treatment, electrolise,](https://reader031.vdocuments.site/reader031/viewer/2022031807/5c12b38c09d3f2f42a8b9326/html5/thumbnails/57.jpg)
Application Fields - Perspectives
Immunodeficiency Status
Chronic, indolent infections
Unhealed wounds and Ulcers
Tumors
Infectious coused by drug-resistent bacteria
Counter Bioterorism
![Page 58: ფაგებისგამოყოფა კლონირება …immunoschool.tsu.ge/public/img/leqcia/10leqcia.pdf · freezing-melting out, thermal treatment, electrolise,](https://reader031.vdocuments.site/reader031/viewer/2022031807/5c12b38c09d3f2f42a8b9326/html5/thumbnails/58.jpg)
Cass73,9 nm
BL-260,8 nm
Ec-C56,5 nm
Ec-0969,1nm
BL-161,9 nm
Ps.a.65,2 nm
W.P.63,9 nm
lansing56,2 nm
New Podoviridae Phages isolated from Tbilisi’s
and Michigan’s Rivers and Lakes – for use in
future experiments
![Page 59: ფაგებისგამოყოფა კლონირება …immunoschool.tsu.ge/public/img/leqcia/10leqcia.pdf · freezing-melting out, thermal treatment, electrolise,](https://reader031.vdocuments.site/reader031/viewer/2022031807/5c12b38c09d3f2f42a8b9326/html5/thumbnails/59.jpg)
THANK YOU
Acknowledgment:
Dr. Marina Tediashvili - Eliava Institute, Tbilisi
Dr. Eka Jaiani – Eliava Institute, Tbilisi
Dr. Ketevan Gambashidze – Tbilisi State Medical University