Бруцеллез(Brucellosis)

Скляров О.Д. ФГУ «Всероссийский государственный бюджетный Центр

качества и стандартизации лекарственных средств для животных и кормов» (ФГБУ «ВГНКИ»)

Тел. 8 (499) 213 01 93Scliarov@yandex.ru

ДИАГНОСТИКА БРУЦЕЛЛЕЗА ЖИВОТНЫХ

WORLD ORGANISATION FOR ANIMAL HEALTH and RUSSIA Название

реакции/тестаМеждународное /

Русское

Продолжительность постановки

Оценка результата

1. Indirect ELISAНепрямой ИФА

Подготовка плашек требует 18-часовой

инкубации. Сама постановка – 6-7 ч.

Предписанный для международной торговли подтверждающий тест. Но: при исследовании вакцинированного скота – более скрининговый, чем подтверждающий.

2. Competitive ELISA Конкурентный ИФА

Инкубация плашек – 18 ч. Сама

постановка – 6-7 ч.

Предписанный для международной торговли подтверждающий тест.

3. Rose bengal testРоз бенгал тест

Несколько мин. Предписанный для международной торговли скрининговый тест, как для благополучных, так и для неблагополучных стад.

4. Buffered plate agglutination test (PBAT) Реакция агглютинации на стекле с забуференным Аг

Несколько мин. Предписанный для международной торговли скрининговый тест.

5. Complement fixation test (CFT)Реакция связывания комплемента

6-7 ч. Предписанный для международной торговли подтверждающий тест.

Название реакции/тестаМеждународноеРусское

Продолжительность постановки

Оценка результата

6. Fluorescence polarization assay (FPA)Реакция поляризацонной флюоресценции

Неск. минут. Как для скрининга, так и для подтверждения диагноза. В 2004 г. была предложена в качестве предписанного подтверждающего теста.

7. Milk iELISAИФА с молоком

6-7 ч. Скрининговый. Особенно подходит для крупных стад.

8. Milk ring test (MRT)КР с молоком

Чуть больше 1 ч Скрининговый тест. Для небольших стад.

9. Serum agglutination test (SAT)Реакция агглютинации

Около суток В настоящее время не является ни предписанной, ни альтернативной реакцией

10 Native hapten and poly B tests Нативный гаптен и поли В тесты

Альтернативные подтверждающие тесты.

11. Brucellin skin test*Аллергическая проба

48-72 ч. Альтернативный иммунологический тест. Используется в невакцинированных стадах. Подтверждает специфичность других серологических реакций.

Название реакции илиметода

Видживотных

 

Интерпретациярезультата

1. Реакция агглютинации (РА) с S-антигеном

Крупный рогатый скот, яки, зебу, буйволы, овцы, козы, лошади, верблюды, олени, маралы, собаки, другие виды животных

Подтверждающийдиагноз

2. РА с R-антигеном Собаки Подтверждающийдиагноз

3. Реакция связывания комплемента / реакция длительного связывания комплемента с S-антигеном (РСК/РДСК)

Крупный рогатый скот, яки, зебу, буйволы, овцы, козы, лошади, верблюды, олени, маралы, собаки, свиньи, другие виды животных

Подтверждающий диагноз

РСК с R-антигеном Крупныйрогатый скот

Подтверждающий диагноз (дифференциальный)

4. Реакция непрямой гемагглютинации (РНГА)

Крупный рогатый скот, яки, зебу, буйволы, овцы, козы

Подтверждающий диагноз (альтернативный)

5. Непрямой иммуноферментный анализ (ИФА)

Крупный рогатый скот, овцы Подтверждающий диагноз(альтернативный)

6. Конкурентный иммуноферментный анализ (ИФА)

Крупный рогатый скот, яки, зебу, буйволы, мелкий рогатый скот, свиньи, собаки

Подтверждающий диагноз (дифференциальный )

Диагностические реакции (методы) на бруцеллез, применяемые в РФ

7. Иммунохроматографический (ИХА)

Крупный рогатый скот, овцы Подтверждающий диагноз(альтернативный)

8. Реакция иммунодиффузии в агаровом геле с О-ПС –антигеном (РИД)

Крупный рогатый скот, яки, зебу, буйволы, овцы, козы, олени, маралы

Подтверждающий диагноз(дифференциальный)

9. РИД с R-антигеном Собаки Подтверждающий диагноз

10. Роз бенгал проба (РБП) Крупный рогатый скот, яки, зебу, буйволы, овцы, козы, свиньи, лошади, верблюды, олени, маралы

Ориентировочный

11. Кольцевая реакция с молоком (КР)

Крупный рогатый скот Ориентировочный

12. Аллергическое исследование Свиньи 

Ориентировочный

13. Полимерная цепная реакция (ПЦР)

Животные всех видов 

Подтверждающий диагноз

Название диагностического средства

Название реакции или метода

Интерпретация результата

1.Набор компонентов для диагностики бруцеллеза животных в РА, РСК, РДСК(ОАО «ПЗБ»)

Реакция агглютинации (РА)

Подтверждающий диагноз

Реакция связывания комплемента

Подтверждающий(для международной

торговли)2. Набор для серологической диагностики бруцеллеза крупного и мелкого рогатого скота в реакции непрямой гемагглютинации (РНГА) (ООО «Ветмедсервис»)

Реакция непрямой гемагглютинации (РНГА)

Подтверждающий (альтернативный)

3. Набор для диагностики бруцеллеза крупного рогатого скота иммуноферментным методом (ФГУП «Курская биофабрика)

Непрямой ммуноферментный анализ (ИФА)

Подтверждающий (альтернативный)

4. Набора для выявления антител к антигену S-LPS Brucella abortus и Brucella melitensis иммуноферментным методом«Бруцелла-СЕРОТЕСТ» (ООО «Ветбиохим)

Конкурентный иммуноферментный анализ

Подтверждающий (альтернативный)

5. Набор компонентов для диагностики бруцеллеза животных в роз бенгал пробе (ОАО «ПЗБ»)

Роз бенгал проба (РБП) (экспресс-тест)

Ориентировочный

6. Набор компонентов для диагностики бруцеллеза животных в кольцевой реакции с молоком (ОАО «ПЗБ»)

Кольцевая реакция с молоком (КР)

Ориентировочный

7. Тест-система для диагностикибруцеллеза крупного и мелкого рогатого скота и северных оленей в РИД (ООО НПЦ «ВетБиоТест»)

Реакция иммунодиффузии в агаровом геле с О-ПС –антигеном

Подтверждающий (дифференциальный)

Средства и методы диагностики бруцеллеза, зарегистрированные в РФ

1 2 3

8. Набор для диагностики и дифференциальной диагностики бруцеллеза животных иммуноферментным методом (ФГУП Курская биофабрика»)

Конкурентный иммуноферментный анализ

Подтверждающий (дифференциальный)

9. Набор для выявления иммуноферментным методом собак и других плотоядных, инфицированных B.canis (ФГУП «Курская биофабрика»)

Конкурентный иммуноферментный анализ

Подтверждающий (альтернативный)

10. Набор для диагностики бруцеллеза собак, вызываемого B.canis, в реакции агглютинации и реакции иммунодиффузии (ООО «Агровет)

РА и РИД Подтверждающий

11. Набор для дифференциальной серологической диагностики бруцеллеза и контроля иммунного ответа крупного рогатого скота, иммунизированного вакциной из штамма B. abortus 82 (ФГБУ «ФЦТРБ»)

РСК Подтверждающий (дифференциальный)

12. «Иммунохроматографическая тест-системы для определения антител к ЛПС антигену B. abortus и B. melitensis в сыворотке крови крупного рогатого скота и овец» - ФГУП «Курская биофабрика»

Иммунохорматография Подтверждающий

13. «Набор диагностический для выявления индивидуальных специфических антител класса G к бактериям рода Brucella в сыворотке (плазме) крови крупного рогатого скота иммуноферментным методом» - «Сиббиотест» (г. Новосибирск)*

Конкурентный иммуноферментный анализ

Подтверждающий

14. Тест-система «Бру-ком» для выявления возбудителя бруцеллеза животных методом полимеразной цепной реакции ОО«ИнтерЛабСервис»)

Полимерная цепная реакция (ПЦР) Подтверждающий

15. Бруцеллин ВИЭВ (ФГУП «Щелковский биокомбинат»)

Аллергическое исследование Ориентировочный

Дата исследования

ЛабораторияРезультат

метод материал кол-во пол сом отр Примечание

10.12.11 Валуйская РСК сыворотка 637 7   630 первичное

20.12.11 Валуйская РСК сыворотка 8 7 - 1подтверждены результаты

исследований от 10.12.2011г

24.12.11 БМВЛ РСК сыворотка 7 2 - 5

исследованы положительные пробы

крови в РСК от Валуйской лаборатории.

28.12.11 БМВЛ ПЦР сыворотка 7 0 - 7 ПЦР

17.01.12 ВГНКИ РСК сыворотка 2 2 - -подтверждены результаты

исследований БМВЛ от 24.12.2011

08.02.12 БМВЛ РСК сыворотка 630 28 15 588 повторное 1

19.04.12National Vet. Res. Institute, Poland, gorod

Pulawy

РСКин.

сыворотка28 1 - 27 19.04.12

19.04.12 РАин.

сыворотка28 3 - 25 19.04.12

19.04.12 ИФА ин.асыворотка

28 1 - 27 19.04.12

18.05.12 Валуйская РСК сыворотки 602 4 - 598 повторное 2Примечания. БМВЛ - ФГБУ «Белгородская МВЛ»; Валуйская - ОГБУ «Валуйская СББЖ» ин.сыворотки - инактивированные сыворотки

Результаты исследования на бруцеллез 637 голов свиней, ввезенных на территорию Российской Федерации Чехии 05-06.12.2011.

№п/п

№Инв.

Пол,год

рождения

 

Результат исследования

РБП РАМЕ/мл

 

РСК 

РИД РНГА 

ИФА ПЦР Бак. исследование

1* 2* «Бру-ком» «Интеркол»молоко л.у. молоко, л.у.

1 1250 корова2007

пол. пол.200

пол.1/10

отр. пол.6400

отр. отр. отр. отр. пол. пол. пол.

2 3629 теленок 2013

отр. отр. отр. отр. отр. отр. отр. н.и. н.и. н.и. н.и. н.и.

Результат серологического исследования на бруцеллез крупного рогатого скота, принадлежащих ООО «Аврора» с. Сабуровщино Бабынинского района

Калужской области

Примечание: - 1* - Набор для диагностики и дифференциальной диагностики бруцеллеза животных иммуноферментным методом (ФГУП «Курская биофабрика»); 2* - «Набор диагностический для выявления индивидуальных специфических антител класса G к бактериям рода Brucella в сыворотке (плазме) крови крупного рогатого скота иммуноферментным методом» - «Сиббиотест» (г. Новосибирск); л.у. – лимфатические узлы; н.и. – не исследовали. Выделена культура Yersinia enterocolitica с/в 09

Актуальные задачи в плане совершенствования диагностики бруцеллеза животных

1. Разработка высокоспецифичных антигенов для серологической диагностики бруцеллеза;

2. Сокращение периода между вакцинаций и проведением диагностических исследований вакцинированных животных:

- Тест-система для диагностики бруцеллеза крупного и мелкого рогатого скота и северных оленей в РИД (ООО НПЦ «ВетБиоТест») - к.р.с. - через 1,5 мес.;

- м.р.с. через 5 мес. - (только после однократного введения вакцины);

- Набор для дифференциальной серологической диагностики бруцеллеза и контроля иммунного ответа крупного рогатого скота, иммунизированного вакциной из штамма B. abortus 82 (ФГБУ «ФЦТРБ») - 3 мес. к.р.с.

3. Сравнительный анализ репрезентативных данных серологических исследований крупного и мелкого рогатого скота в разных реакциях.

4. Необходимо изменить критерии, определяющие заболевание бруцеллезом животных всех видов. Так, животных следует считать больными, при:

- выделении вирулентной культуры бруцелл;- положительном результате биопробы у невакцинированных животных;- положительном результате ПЦР у невакцинированных животных,

подтвержденном положительными результатами исследования хотя бы в одной из серологических реакций (РСК, РНГА, ИФА, РИД);

- положительном результате РИД, подтвержденной положительными результатами исследований хотя бы в одной из других серологических реакций (РСК, РНГА, ИФА);

- увеличении титра антител вдвое и выше при повторном серологическом исследовании через 15-30 суток.

5. Единичные положительные результаты серологического исследования животных без клинических проявлений болезни, неиммунизированных или иммунизированных против бруцеллеза неагглютиногенными или слабоагглютиногенными вакцинами, полученные впервые в благополучных по бруцеллезу хозяйствах, независимо от титра антител в РА, РСК, РНГА следует интепретировать, как «сомнительные».

С целью уточнения диагноза необходимо:

- исследование этих же образцов сыворотки в других серологических реакциях, а также в ПЦР - на бруцеллез и иерсиниоз;

- повторное серологическое исследование данных животных через 15 и 30 суток.

6. Максимально широко использовать способ полной замены поголовья неблагополучного по бруцеллезу пункта здоровыми животными, в частности:

- во всех случаях установления диагноза на бруцеллез в благополучных облас тях, краях, республиках;

- в случаях инфицирования крупного рогатого скота, свиней, лошадей B.melitensis;

- в неблагополучных областях, краях, республиках при установле нии бруцеллеза животных в хозяйствах благополучных районов, не проводящих иммуни зацию скота против бруцеллеза;

- во всех случаях острого течения бруцеллеза, сопровождающегося массовыми абортами;

- в случаях, если оздо ровление хозяйств, проводимое с применением или без применения противобруцеллезных вакцин, не достигается в течение 3-х лет.

№п/п

Инв.ном.

РА РСК РПБ ИФА0,244

РНГА1:200+++

КР ПЦР/бак.исследование ПЦР"Энтеркол

"кровь молоко Л.узлы,

Внутр.органы

1 99 200+ 10+ + 0,362 + 1600 + - +/- +/- +10/+4 -2 3787 100+ 10+ + 0,303 + 800+ - +/- +/- Не иссл. -3 3466 100+ 20+ + 0,304 + 1600 + - +/- -/- +3/+1 -4 3113 200+ 5+ + 0,454 + 800+ + -/- +/- Не иссл. -5 3260 200+ 10+ + 0,387 + 3200 + - -/- +/- +12/+7 -6 3471 200+ 10+ + 0,262 + 800+ + +/- +/- Не иссл. -7 2344 - - - 0,281 + - - +/- +/- Не иссл. -8 230 200+ - - 0,141- 400+ + +/- +/- -/- -9 3089 100+ 10+ + 0,306 + 400+ + +/- +/- Не иссл. -

10 3457 - - - 0,210- - - +/- +/- +1/- -11 3491 400+ 40+ + 0,245 + 3200 + + +/- +/- +8/+2 -12 3699 50 - + 0,238- 400+ - +/- Н.л. Не иссл. -13 3157 - - - 0,349 + 50- - +/- Н.л. +3/+1 -14 3572 100+ - + 0,278 + 400+ - +/- Н.л. Не иссл. -

Всего:положительно

10 8 10 11 11 5 12/- 10/- (6) 37-40,4 % /

(5) 15-15,3 %

-

Результаты исследования на бруцеллез и иерсиниоз образцов сыворотки крови (14), молока (11), лимфатических узлов и внутренних органов (96) от коров

из неблагополучного по бруцеллезу хозяйства

Кожные пробы на бруцеллин

Альтернативным иммунологическим тестом является кожная проба на бруцеллин, которая может использоваться для скрининга невакцинированных стад, при использовании очищенного (свободного от гЛПС) и стандартизированного антигенного препарата (напр. бруцеллин INRA).

Обязательно следует использовать стандартизированный, препарат бруцеллина, который не содержит антигена гладкого липополисахарида, поскольку может вызвать неспецифические воспалительные реакции или повлиять на последующие серологические тесты.

Кожные пробы на бруцеллин имеют высокую специфичность, такую, что серологически

отрицательные невакцинированные животные, которые являются положительно реагирующими при проведении теста на бруцеллин, должны считаться зараженными животными.

Так же, результаты этого теста могут содействовать интерпретации серологических реакций, даже являющихся ложно положительными серологическими результатами из-за заражения перекрестно-реагирующими бактериями, особенно в зонах, свободных от бруцеллеза.

Однако, не у всех зараженных животных наблюдается реакция, поэтому собственно этот тест не может быть рекомендован в качестве единственного диагностического теста для международной торговли.

Хотя внутрикожная реакция на бруцеллин является наиболее специфичным тестом при бруцеллезе (у невакцинированных животных), диагноз не должен ставиться только на основе положительных внутрикожных реакций, наблюдаемых у нескольких животных в стаде, он должен подтверждаться надежным серологическим тестом.

СПЕЦИФИЧЕСКАЯ ПРОФИЛАКТИКА БРУЦЕЛЛЕЗА ЖИВОТНЫХ

ВАКЦИНЫ ПРОТИВ БРУЦЕЛЛЕЗА, ВЫПУСКАЕМЫЕ И ПРИМЕНЯЕМЫЕ В РОССИЙСКОЙ ФЕДЕРАЦИИ

(для иммунизации крупного рогатого скота)• вакцина против бруцеллеза из слабоагглютиногенного штамма Бруцелла

абортус № 82 живая сухая;

• вакцина против бруцеллеза сельскохозяйственных животных из штамма B.abortus 19 живая сухая;

• вакцина против бруцеллеза крупного рогатого скота из штамма B.abortus 75/79-АВ живая сухая.

(для иммунизации мелкого рогатого скота)

• вакцина против бруцеллеза сельскохозяйственных животных из штамма B.abortus 19 живая сухая;

• вакцина против бруцеллеза овец и коз и инфекционного эпидидимита баранов из штамма Brucella melitensis REV-1 живая сухая.

Сегодня не представляется возможным использовать для профилактики бруцеллеза крупного рогатого скота вакцину из штамма B.abortus 19 вместо наиболее широко применяемой вакцины из штамма B.abortus 82.

Также нельзя переоценивать значимость специфической профилактики бруцеллеза животных. В первую очередь по причине относительной иммуногенной активности всех известных в мире бруцеллезных вакцин, в том числе и вакцины из штамма RB-51.

Равно как нельзя сразу отказаться от применения вакцин на эндемичных по бруцеллезу территориях.

Во-первых, потому что при относительно небольшой дозе возбудителя и умеренной его вирулентности вакцинированные животные успешно противостоят инфицированию.

Во-вторых, в случае периодической иммунизации животных, абортов бруцеллезной этиологии, как правило, не наблюдают или их меньше, что имеет важнейшее эпидемическое значение.

Актуальные задачи в плане совершенствования специфической профилактики бруцеллеза животных

1. Широкое применение новых препаратов зарегистрированных в РФ в 2013 г.:

- «Антигена из штамма Brucella abortus R-1096 для выявления латентных форм бруцеллеза у крупного рогатого скота» - ФГУ «ФЦТРБ-ВНИВИ»

Антиген предназначен для:

- провокации S-бруцеллезных антител у инфицированных бруцеллами животных с латентной или скрытой формой болезни с целью выявления и удаления их стада;

- сенсибилизации неиммунизированного против бруцеллеза крупного рогатого скота в неблагополучных по бруцеллезу хозяйствах или в благополучных хозяйствах, угрожаемых по заносу возбудителя инфекции, перед иммунизацией вакциной из штамма B. abortus 82 с целью профилактики, вызываемых ею абортов;

- ежегодного в течение 2-3 лет введения коровам, иммунизированным вакциной из штамма В. аbortus 82 с целью поддержания перманентного иммунитета без поствакцинальной серопозитивности.

Антиген вводят коровам, ранее не иммунизированным против бруцеллеза и (или) иммунизированным в возрасте 3-6 месяцев противобруцеллезными вакцинами из штаммов B. abortus 19 и 82 и реиммунизированным через 10 месяцев вакциной из штамма B.abortus 82.

 В неблагополучных по бруцеллезу и угрожаемых по заносу возбудителя хозяйствах

антиген применяют, соответственно, сразу после установления диагноза или при подозрении на заболевание животных.

Перед введением антигена проводят серологическое исследование животных на бруцеллез в РА и РСК или РА и РИД или в РНГА или в других серологических реакциях. Всех больных животных сдают на убой.

После введения антигена проводят серологическое исследование животных в тех же реакциях через 15 и 30 дней. Больных животных сдают на убой, оставшихся - иммунизируют вакциной из штамма В. аbortus 82.

Первое серологическое исследование животных проводят через 1,5 месяца после введения вакцины в РИД с О-ПС антигеном и через 3 месяца в РА и РСК с S-бруцеллезным антигеном (единым для РА, РСК и РДСК) и в РСК с R- бруцеллезным антигеном ВНИВИ.

- «Антигена БИВ для выявления скрытых форм бруцеллеза у крупного рогатого скота» - ФГУП «Щелковский биокомбинат»

Антиген предназначен для:

- выявления скрытых форм бруцеллеза у крупного рогатого скота в хозяйствах всех форм собственности неблагополучных и угрожаемых по заносу возбудителя, в которых не проводится специфическая профилактика болезни.

Антиген вводят крупному рогатому скоту, начиная с 3-х месячного возраста.Перед применением антигена животных исследуют на бруцеллез в РА и РСК или РНГА,

или ИФА. В хозяйствах неблагополучных по бруцеллезу на убой сдают положительно и сомнительно реагирующих животных; в угрожаемых - положительно реагирующих.

Антиген вводят животным не более 4 раз в год с интервалом 3 месяца. Через 15 и 30 суток животных исследуют на бруцеллез в РА и РСК (РДСК) или РНГА, или ИФА и далее через каждые 30 суток до получения двух подряд отрицательных результатов. Всех животных положительно и сомнительно реагирующих на бруцеллез сдают на убой.

2. Возобновления производства и внедрение в практику инактивированной адъювант-вакцина из штамма B.abortus КВ 17/100 против бруцеллеза крупного рогатого скота или аналогичной.

Однако даже в случае реализации всех вышеизложенных предложений искоренение бруцеллеза в РФ будет невозможно без решения следующих проблем:

- отсутствия в большинстве субъектов РФ мясокомбинатов и боен, выполняющих убой больных бруцеллезом животных (обусловливает несвоевременный убой и прочее);

- компенсации владельцам убытка, неизбежного при изъятии больных животных, в первую очередь, в условиях отгонного животноводства;

- несанкционированного перемещения животных на территории страны;

- торговли вакцинированными животными из субъектов неблагополучных по бруцеллезу, в субъекты благополучные, в которых вакцины не применяют;

- не применения экономических санкций к субъектам неблагополучным по бруцеллезу;

- ненадлежащего проведения организационно-хозяйственных мероприятий при бруцеллезе:

- без наложения ограничений на неблагополучные по бруцеллезу хозяйства;

- введения нетелей и ярок в стада и отары взрослых животных;

- концентрация поголовья в хозяйствах молочного направления деятельности;

- продолжительное, более 3 лет, применение способа оздоровления путем периодических исследований и вакцинации в стадах, в которых реагировало при серологическом исследовании на бруцеллез более 15 % поголовья.

Благодарю за внимание!