6 分子生物学研究法（下）——基因功能研究技术

本章主要介绍研究基因功能的各种分子生物学技术和方法，比如通过这些方法研究：

（ 1 ）单或多个基因在生物体的某些特定发育阶段或在不同环境下的表达模式；

（ 2 ）某基因缺失后生物体表型变化分析该基因功能；

（ 3 ）蛋白质相互作用认识信号转导通路等。

6.1.1 基因表达系列分析技术基因表达系列分析技术（ SAGE ）是一种以 DNA 序列测定为基础定量分析全基因组表达模式的技术。

SAGE 的操作过程如下图或书中图 6-1 所示。

6.1 基因表达研究技术

生物素酰化的Ol i go-dT引导合成cDNA双链

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锚定酶（设为Nl a)酶切，磁珠吸附

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CATGGTAC

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计算机数据分析

克隆，测序

连接，形成多联体

PCR扩增，锚定酶酶切

BA

A B

B

A

平端连接

标签酶酶切，释放标签，末端补平

分成两池，加入接头A，B

mRNA

RNA 选择性剪接是指用不同的剪接方式从一个mRNA 前体产生不同的 mRNA 剪接体的过程。选择性剪接一般分为：平衡剪接， 5’ 选择性剪接， 3’ 选项择性剪接，外显子遗漏和相互排斥性剪接。如 6-2 。发现新的可变剪接体（ splice variant ），确定每个异构体（ isoform ）的独特功能和生物学意义并阐明其调节机制，是功能基因组时代的一个重要特征。

6.1.2 RNA 的选择性剪接技术

BTLA 剪接体基因的结构分析

RT-PCR 法克隆人 BTLA 编码区基因电泳结果

BTLAs （ BTLA splice variant ）

BTLAsBTLAs 编码的异构体蛋白编码的异构体蛋白 BTLAiBTLAi 序列分析及其预测序列分析及其预测

异构体 BTLAi （ BTLA isoform ）的氨基酸序列比对及其结构分析

BTLAiBTLAi 和和 BTLABTLA 跨膜预测跨膜预测

A: BTLAi; B: BTLA

BTLA 和 BTLAi 的跨膜螺旋段预测结果

融合蛋白融合蛋白 BTLAs-DsRed2BTLAs-DsRed2 和和 BTLAs-DsRed2BTLAs-DsRed2的在转染细胞膜上表达的检测的在转染细胞膜上表达的检测

图 3.5 流式细胞术检测 HVEM-Fc 融合蛋白和单抗 MIH26 与基因转染细胞结合的结果

激光共聚焦观察激光共聚焦观察 DsRed2DsRed2 和和 GFPGFP 在转染细胞的分在转染细胞的分布布

基因转染细胞培养上清中融合蛋白分泌的检测结果基因转染细胞培养上清中融合蛋白分泌的检测结果

reactivity of 293T/HVEM with culture supernants of transfectants, followed by mAb 7D7 or 8H9

基因转染细胞培养上清中融合蛋白分泌的流式细胞术检测结果

原位杂交是用标记的核酸探针，经过放射自显影或放射检测体系，在组织、细胞、间期核及染色体上对核酸进行定位和相对定量的一种方法。RNA 原位杂交：在 mRNA 水平上，用标记的探针与固定的组织切片反应后进行显色反应，从而对该基因的表达进行定性定量分析。

6.1.3 原位杂交技术

荧光原位杂交 (fluorescence in situ hybridizatio

n, FISH) 是在 20 世纪 80 年代末在放射性原位杂交技术的基础上发展起来的一种非放射性分子细胞遗传技术。 FISH 的基本原理是首先对寡核苷酸探针进行特殊的修饰和标记，然后用原位杂交法与靶染色体或 DNA 上特定的序列结合，再通过与荧光素分子相偶联的单克隆抗体来确定该 DNA 序列在染色体上的位置。

荧光原位杂交（ FISH ）

基因定点突变技术常用于研究某个（些）氨基酸残基对蛋白质的结构、催化活性以及结合配体能力的影响，也可用于改造 DNA 调控元件特征序列，修饰表达载体，引入新的酶切位点等。

主要采用 PCR 法：重叠延伸技术和大引物诱变法。

6.1.4 基因定点突变技术

6.2.1 基本原理

* 经典遗传学：从表型出发，研究基因型。

* 现代遗传学：从基因序列出发，推测表型，从而推导出该基因功能。

基因敲除：又称为基因打靶，该技术通过外源DNA 与染色体 DNA之间的同源重组，进行精确的定点修饰和基因改造，具有专一性强、染色体 DNA 可与目的片段共同稳定遗传等特点。

6.2 基因敲除技术

完全基因敲除：通过同源重组法完全消除细胞或动物个体中的靶基因活性。

一般采用取代型或插入型载体在 ES 细胞中根据正负双向选择原理进行完全基因敲除。

图 6-9 ；图 6-10 。

1 、完全基因敲除

条件型基因敲除：通过定位重组系统实现特定时间和空间的基因敲除。

对有重要生理功能的基因，完全基因敲除使有关基因功能的研究无法开展。

Cre/LoxP 和 FLP/FRT 系统，具有可调节性。

图 6-11 。

2 、条件型基因敲除

6.3.1 酵母单杂交系统

20 世纪 90 年代发展，用于研究蛋白质— DNA

相互作用。在酵母细胞内研究真核生物 DNA

— 蛋白质相互作用，并通过 DNA文库直接获得靶序列相互作用蛋白的编码基因。

6.3 蛋白质及 RNA 相互作用技术

酵母单杂交的原理与方法酵母单杂交的原理与方法

在实验中，首先将报告质粒整合入酵母基因组，产生带有目的基因的酵母报告株；再将文库质粒转化入报告株，若存在文库蛋白与目的基因的相互作用，可通过对报告基因的表达将文库蛋白的基因筛选出来。

基本原理示意图：图 6-15 。

酵母双杂技术主要用于研究蛋白质之间的相互作用。

酵母双杂系统利用了真核生物转录调控因子的组件式结构特征： DNA 结合结构域；转录激活结构域。

酵母双杂原理示意图：图 6-17 。

6.3.2 酵母双杂交系统

1 、 Far Western 印迹技术

2 、 GST 融合蛋白沉淀技术

3 、蛋白质芯片技术

4 、等离子表面共振技术

5 、免疫共沉淀技术

6.3.4 体外蛋白质相互作用技术

将蛋白质标上荧光探针，当蛋白质间不发生相互作用时，其相对距离较大，无 FRET 现象；而蛋白质发生相互作用时，其相对距离缩小，FRET 发生。

6.3.4 细胞内蛋白质相互作用技术—— FRET 技术

RNAi （ RNA interference ， RNA 干扰）技术：利用双链小 RNA高效、特异性降解细胞内同源 mRNA 从而阻断靶基因的表达，使细胞胞出现靶基因缺失的表型。

dsRNA ：双链 RNA ； siRNA ： short interfer

ing RNA ，小分子干扰 RNA 。

RNAi 作用机制示意图：图 6－ 24 。

6.3.5 RNAi 技术及其应用

基因芯片（ gene chip ）或又称为 DNA微列阵（ DNA microarray ）技术：能够同时监测大量靶基因表达的实验手段，迅速准确地在基因组水平上阐棕不同生物组织或细胞中各种转录本的变化规律。

6.4 基因芯片及数据分析

用机械手把已知或未知的 DNA 片段点到玻片或其它载体上并使之固定，用不同细胞周期发育阶段的 cDNA 作探针系统性地研究细胞中任何时期特异表达的基因。

若把某一生物体内全部基因分别点到 DN

A微列阵或者基因芯片上，再用不同发育阶段的 cDNA 与之杂交，就能了解某些基因对特定生长发育阶段的重要性。

基因芯片还可用于进行基因诊断。先建立正常人特定组织、器官的基因芯片，给出标准杂交信号图，用可疑病人的 cDNA做探针与之杂交，检哪些基因的表达受抑制或激活。

凝胶滞缓实验（ EMSA ）：是体外分析 DNA

与蛋白质相互作用的一种特殊的凝胶电泳技术。基本原理是蛋白质与 DNA 结合后将大增加相对分子质量，没有结合蛋白的 DNA 片段跑得快，而与蛋白质形成复合物的 DNA由于受到阻滞而跑得慢。

6.6 其它分子生物学技术

噬菌体展示技术：是将外源蛋白或多肽的 DN

A 序列插入到噬菌体外壳蛋白结构基因的适当位置，使外源基因随外壳蛋白的表达而表达，同时 , 外源蛋白随噬菌体的重新组装而展示到噬菌体表面的生物技术。

被展示的多肽或蛋白可以保持相对独立的空间结构和生物活性，以利于靶分子的识别和结合。 因而可用于筛选目的蛋白。

图 6-36