専門海洋生命・分子工学基礎実験 タンパク質の取扱い （ 1 ）
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専門海洋生命・分子工学基礎実験 タンパク質の取扱い （ 1 ）. 細胞分子工学研究室担当. 1 ． 試薬の調製. 大事なポイント. 試薬の取り扱い（計算，計量） pH メーターの使い方 ピペッターの使い方. 溶液の濃度. パーセント濃度もそれほど単純じゃない。 小学校で習うのは重量パーセント（ weight/weight ） でも，これから重要なのは weight/volume ・・・つまり一定の溶液中に溶けている溶質の量。 Q: 10% (w/w) の食塩水（ NaCl 水溶液）と， 10% (w/v) の食塩水はどっちが濃い？ - PowerPoint PPT PresentationTRANSCRIPT
専門海洋生命・分子工学基礎実験専門海洋生命・分子工学基礎実験タンパク質の取扱いタンパク質の取扱い
（（ 11 ））
細胞分子工学研究室担当
11 ．試薬の調製（．試薬の調製（ 11 ））
大事なポイント大事なポイント
• 試薬の取り扱い（計算，計量）
• pH メーターの使い方
• ピペッターの使い方
溶液の濃度溶液の濃度
• パーセント濃度もそれほど単純じゃない。o 小学校で習うのは重量パーセント（ weight/weigh
t ）o でも，これから重要なのは weight/volume ・・・つまり一定の溶液中に溶けている溶質の量
Q: 10% (w/w) の食塩水（ NaCl 水溶液）と， 10%
(w/v) の食塩水はどっちが濃い？
• 「溶質」「溶媒」「溶液」という言葉は OK ？
溶液の濃度溶液の濃度
• モル濃度が重要o モルは分子の数をあらわす ・・・ 1 mol は 6.022 x 1023 分子 o モル濃度は，決まった体積の溶液に溶けている溶質
のモル数o 1 M は 1 mol/Lo 1 mol の NaCl （分子量 58.44 ）は， 58.44 g
Q ： 100 mM の NaCl 水溶液を 200 mL 作るために必要な NaCl は何グラム？
試薬の調製試薬の調製
A. 200 mM NaH2PO4 (pH 8.0) を 100 mL
o NaH2PO4 ・ 2H2O の分子量は 156.0
o さて，何グラムの粉が必要？
o 1 mol/L の溶液を 1 L 作るとしたら何グラム？
o 200 mM の溶液を 1 L なら？
o 200 mM の溶液を 100 mL なら？
【 簡単で失敗のない方法 】
暗算でできる方法を考えよう…筆算は間違いのもと！
試薬の調製試薬の調製
A. 200 mM NaH2PO4 (pH 8.0) を 100 mL
o NaH2PO4 ・ 2H2O の分子量は 156.0
o 前のスライドで計算した結果を踏まえて …
o 粉を 80 mL 程度の蒸留水に溶かす
o 10 N NaOH 溶液で pH を 8.0 に合わせる
o メスシリンダーで，全量を 100 mL に合わせる
試薬の調製試薬の調製
B. 3 M の NaCl を 50 mLo NaCl の分子量は 58.44
o さっきと同様に考えようo 3 M の溶液を 1 L 作るなら…？ から順に考えてい
くo 結局…何グラム？o 40 mL 程度の蒸留水に溶かすo pH は合わせなくていいo メスシリンダーで全量を 50 mL に合わせる。
試薬の調製試薬の調製
C. 1 M のイミダゾールを 50 mLo イミダゾールの分子量は 68.08
o さて，何グラム？
o 40 mL 程度の蒸留水に溶かすo pH を合わせるo メスシリンダーで全量を 50 mL に合わせる。
試薬の調製試薬の調製
各グループで以下の溶液を調製する（各 10 mL ）。
（ Wash Buffer ）50 mM NaH2PO4 （ pH 8.0 ） , 300 mM NaCl,
20 mM イミダゾール
（ Elution Buffer ）50 mM NaH2PO4 （ pH 8.0 ） , 300 mM NaCl,
250 mM イミダゾール
22 ．アフィニティークロマトグラフィー．アフィニティークロマトグラフィー
これから行う実験の概要これから行う実験の概要
• 目的のタンパクが，特定の物質と結合する性質を利用して精製する
• クラゲ由来の蛍光タンパク EGFP を使う
• 青い光（励起光）を当てると緑色の蛍光を発する
• この実習で使う EGFP は， N 末端に 6 個の連続したヒスチジン（ His ）残基を人為的に付加されている
• 連続した His 残基が Ni2+-NTA と特異的に結合する性質を利用して EGFP を精製する
アフィニティークロマトグラフィーのアフィニティークロマトグラフィーの
原理原理
• ヒスチジン （ His ） と Ni2+-NTA の特異的結合
アフィニティークロマトグラフィーのアフィニティークロマトグラフィーの
原理原理
• ヒスチジンとイミダゾールの構造の類似性
アフィニティークロマトグラフィーアフィニティークロマトグラフィー
（（ 11 ））
• 各グループに 1.5 mL のタンパク溶液を渡す（試料 A ）
• タンパク溶液のうち 50 L を，新しい 1.5 mL
チューブに取り分ける
• 50 L のタンパク溶液に，等量の 2x SDS サンプルバッファーを加えて混ぜる （試料 a ）
（ 2x SDS サンプルバッファーについてはこのファイルの最後の方のスライドを参照）
アフィニティークロマトグラフィーアフィニティークロマトグラフィー
（（ 22 ））
• 250 L の Ni2+-NTA アガロースビーズが入った 2
mL チューブに， 1.5 mL のタンパク溶液（試料 A ） を入れて混ぜる
• そのまま，氷中に 30 分以上おく
o ときどき混ぜる。 30 分以上・・・できる限り長く
アフィニティークロマトグラフィーアフィニティークロマトグラフィー
（（ 33 ））
• 簡易カラムに移し，下から落ちてくる液を新しい 2
mL チューブで受け取る （試料 B ）
• 試料 B のうち， 50 L を新しい 1.5 mL チューブに取り分ける
• 50 l の試料 B に対して，等量の 2x SDS サンプルバッファーを加えて混ぜる （試料 b ）
アフィニティークロマトグラフィーアフィニティークロマトグラフィー
（（ 44 ））
• 2 mL の Wash Buffer をカラムに載せ，自然に溶液が落ちるのを待つ
• 落ちてくる溶液を新しい 2 mL チューブに受け取る （試料 C ）
• 試料 C のうち， 50 L を新しい 1.5 ml チューブに取り分ける
• 50 L の試料 C に対して，等量の 2x SDS サンプルバッファーを加えて混ぜる （試料 c ）
アフィニティークロマトグラフィーアフィニティークロマトグラフィー
（（ 55 ））
• 0.5 mL の Elution Buffer をカラムに載せ，落ちる溶液を，新しい 2 mL チューブに受け取る（試料 D ）
• 試料 D のうち， 50 L を新しい 1.5 mL チューブに取り分ける
• 50 L の試料 D に対して，等量の 2x SDS サンプルバッファーを加えて混ぜる （試料 d ）
アフィニティークロマトグラフィーアフィニティークロマトグラフィー
（（ 66 ））
• 試料 D と，試料 a, b, c, d を回収する
（大事な試料を捨てないように！！）
• 次回まで冷蔵保存しておく
• 次回は，回収した試料 D に溶けているタンパク質を定量する
サンプルの調製サンプルの調製• SDS サンプルバッファー
o 10% (w/v) グリセリン
o 5% (v/v) 2- メルカプトエタノール
o 2.3% (w/v) SDS
o 62.5 mM Tris-HCl (pH 6.8)
• 当日は上記のサンプルバッファーの 2 倍濃縮ストック溶液を使用します（次のスライド）
2x SDS 2x SDS サンプルバッファーサンプルバッファーのつくり方のつくり方
• 以下のものを混ぜて 10 mL とする
o 50% グリセリンを 4 mL
o 2- メルカプトエタノールを 1 mL
o SDS の粉を 0.46 g
o 0.5 M Tris-HCl (pH 6.8) を 2.5 mL
o 蒸留水を 2.5 mL
o 少量のブロモフェノールブルーの粉を溶かす