实验十 DNA片段从琼脂糖凝胶中的分离
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实验十 DNA片段从琼脂糖凝胶中的分离. DNA fragment recovery from the agrose gel. 一.实验目的及背景. 在生物技术实验中,PCR反应获得的目的片段,酶切后所得特定的DNA序列, 分子杂交中所制备的探针等,经过琼脂糖凝胶电泳后,目的片段与其它DNA分开, 这就需要有一套方法将目的DNA从凝胶中分离出来,通过处理后得到纯化的目的DNA, 以用于以后分子杂交,重组子构建,序列分析等. 从凝胶中分离回收DNA的方法. 现在常用的技术有: 电洗脱法 低熔点琼脂糖凝胶法 DEAE滤膜插片法等 - PowerPoint PPT PresentationTRANSCRIPT
实验十 DNA片段从琼脂糖凝胶中的分离
DNA fragment recovery from the agrose gel
一.实验目的及背景 在生物技术实验中,PCR反应获得的目的
片段,酶切后所得特定的DNA序列, 分子杂交中所制备的探针等,经过琼脂糖凝胶电泳后,目的片段与其它DNA分开, 这就需要有一套方法将目的DNA从凝胶中分离出来,通过处理后得到纯化的目的DNA, 以用于以后分子杂交,重组子构建,序列分析等 .
从凝胶中分离回收DNA的方法
现在常用的技术有: 电洗脱法 低熔点琼脂糖凝胶法 DEAE滤膜插片法等 其中电洗脱法,经济节省,操作方便, 对D
NA的回收效果好。
低熔点琼脂糖凝胶法
65oC 琼脂糖凝胶熔点
低熔点琼脂糖凝胶 37oC 液体
DEAE滤膜插片法 High efficient DNA high quality for microinjection <5kb fragment 100ng DNA fragment 10mmol/L EDTA(pH8.0) 5 minutes 0.5 mol/L NaOH 5 minutes 低盐缓冲液 50mM/LTris .Cl 0.15M/L NaCl 10mM/L
EDTA(pH8.0)
高盐缓冲液 50mM/LTris .Cl 1M/L NaCl 10mM/L EDTA(pH8.0)
电洗脱法基本原理 将电泳分离后含目的DNA片段的琼脂糖切
割下来, 装于透析袋中,继续在高电压下电泳,这时目的DNA会从凝胶中电泳出进入透析袋中, 由于DNA分子量大,不能透过透析袋,从而保留于透析袋中。
取出透析袋中含DNA的溶液, 进一步用酚、氯仿抽提纯化。
二.实验试剂及仪器
NaHCO3 2% EDTA-Na2 0.01M TBE 电泳液10.8g Tris 碱0.93g EDTA
5.5g 硼酸 调 pH8.2 定容 1000ml
琼脂糖 透析袋 TE 酚 氯仿 乙醇
三、实验方法
一、透析袋的处理: 1.切取适当长度适析袋。 2.在2% NaHCO3 1mM EDTA 溶液中
煮沸10分钟。 3.弃去煮沸液,加无菌水内外反复洗净
透析袋。
二、电洗脱
1.在长波紫外灯下(300-360 nm )将含目标DNA片段的凝胶条带切下装入透析袋中。
2.向透析袋内加入2 ml 电泳缓冲液,使之浸没凝胶,并排空汽泡。
3.将透析袋水平放入电泳槽(长度方向与电泳平行), 加入适量缓冲液将透析袋浸没(约6-7 mm )。
4.接通电源,150伏电洗,在紫外灯下观察待DNA全部移出凝胶。
5.改变电场方向继续通电1分钟。 6.从透析袋中吸出缓冲液于1-5 ml Eppendorf 管中。
7.加入1.5倍体积正丁醇,混匀抽提去EB。
8.在台式离心机上最高速2分钟。 9.吸去上层,正丁醇溶液。 10.重复7,8,9二次。 11.自下层言DNA的溶液中加入等体积酚
氯仿(2个)抽提2次。 12.上清转入另一 Eppendorf 管中加入
1/10 倍体积 3M NaAc 2倍体积预冷无水乙醇,于20℃过夜。
13. 12000g , 4℃ 下离心10分钟,得DNA沉淀。
14.弃上清,加入70%乙醇洗涤2次后弃干乙醇。
15.加入50 μl TE溶解DNA。 16.取10 μl DNA溶液加入 2μl Loading
buffer 于0.8%琼脂糖上, 40伏电泳,3小时。 17.在紫外透射仪上观察结果。 18.测定DNA溶液 OD260,OD280值。
结果与分析
1.计算DNA回收效率,判断DNA纯度。
2.记录电泳结果 问题与讨论: 1.电洗脱过程后,为什么要反向电泳1
分钟? 2.电洗脱后的DNA如何去除EB?
玻璃奶法快速纯化回收 DNA片段
本方法有多种用途,主要包括: 从琼脂糖凝胶中分离纯化 DNA 片段; 从 DNA 反应物中纯化目的 DNA 片段,如回收纯化 PCR产
物、酶切连接反应中的 DNA 片段; 从探针制备反应物中去除未标记上的核苷酸以及小的 DNA
片段(比如引物); DNA浓缩、去盐及去除杂质。 本试剂盒的主要成分“基因纯”试剂是无毒、无味、无腐蚀
作用的白色颗粒,能专一性结合 0.2kb 到 50kb 大小的 DNA(双链或单链,线性、环状或超螺旋),不结合 RNA 、蛋白质、寡聚核苷酸、有机溶剂、去污剂及其它可能抑制酶活性的有机或无机物。
使用本法回收 DNA 片段有以下优点:
高纯度:回收的 DNA 片段基本上不含 RNA 、蛋白质及其它有机分子,可直接用于酶切、连接、探针制备、序列测定等;
简便:所需主要仪器是一架台式离心机; 快速:整个回收过程只需半个小时; 高效:回收得率达到 70% 以上; 多用途:可以同时作胶回收、 PCR产物回
收、 DNA 片段及探针的纯化浓缩等; 安全:不接触苯酚、氯仿等有害物质。
二、试剂盒组成
1 .碘化钠溶液: 50ml 2 . DNA 洗涤液( 20 倍浓缩液): 10ml 3 .“基因纯”试剂: 1ml 4 .超纯水: 1ml 使用前,将 DNA 洗涤浓缩液( 10ml )倒入
一玻璃瓶中,加 140ml 无水乙醇及 50ml蒸馏水(由使用者自配),混匀后置于 -20℃冰箱中,其余溶液置于 4℃冰箱。
三、操作步骤
从琼脂糖凝胶中分离纯化 DNA片段a. 常规 DNA 电泳。按常规方法用溴化乙锭( EB )染
色 DNA ,而后将欲分离的 DNA 带从胶上切割下来,置于一 1.5ml 离心管中。
b. 称出凝胶带的重量,加入三倍量( V/W )的碘化钠溶液。(如 0.1g 凝胶中加入 0.3ml碘化钠溶液)。
c. 置于 55℃ 水浴 5-10 分钟,直至凝胶完全溶化。d. 加入 20ul充分混匀的“基因纯”试剂(建议使用前
用漩涡振荡器振荡 3 分钟),室温放置 5 分钟(期间不时将管子颠倒几次以混匀)。
e. 离心 10秒( 10,000rpm ),倒去上清液。f. 加 0.8ml刚从冰箱中取出的 DNA 洗涤液,充分摇匀,
离心 10秒,去上清。g. 重复步骤 f两次(共洗涤三次)。h. 用吸水纸仔细将管壁上及管底残留的洗涤液吸干。i. 加入 20ul超纯水,混匀后置于 55℃ 水浴 5 分钟。j. 离心 3 分钟,将上清液小心吸至另一个离心管,即为
纯化的 DNA 。可直接用于酶切、亚克隆、 PCR 、标记、探针制备、序列测定、细胞转染等。
注意事项:
溴化乙锭染色后的 DNA易受紫外光破坏,故尽量放置于暗室,切带时应使用长波长紫外灯,切胶时间尽量短。
DNA 洗涤液应保持在低温,否则可能使 DNA 从“基因纯”试剂上脱落而导致回收率降低。
步骤 h是另一关键,管壁和管底残留的洗涤液若不完全除去,可能导致“基因纯”试剂上结合的 DNA无法由蒸馏水洗脱。
PCR反应物中纯化目的 DNA片段
PCR 反应完毕后,加蒸馏水至 100ul (最后体积)。
加入 300ul碘化钠溶液,混匀。以下步骤与“从琼脂糖凝胶中分离纯化 DNA 片
段”中步骤 d 到 j相同。
从探针制备反应中除去未标记上的核苷酸及小的 DNA片段
探针制备反应完毕后,加蒸馏水至 100ul (最后体积)。
加入 300ul碘化钠溶液,混匀。以下步骤与“从琼脂糖凝胶中分离纯化 DNA 片
段”中步骤 d 到 j相同。
DNA浓缩,去盐及去除杂质
加入 3 倍量的碘化钠溶液于样品 DNA 溶液中(若 DNA为固态,则先将之溶于适量水或 TE 中,再加 3 倍体积的碘化钠溶液)。
加 20ul或更多的“基因纯”试剂(每 ul该试剂可吸附 0.3ugDNA ,操作者可根据这一指标自行决定“基因纯”试剂的用量,但不应少于 10ul )。
以下步骤与“从琼脂糖凝胶中分离纯化 DNA 片段”中步骤 d 到 j相同。