第四章 柠檬酸发酵机制•

柠檬酸又名枸橼酸，学名α-羟基丙烷三羧酸，是生物体主要代谢产物之一。

• 性质：

• 分子式 C6H8O7，分子量 192.12

有两种形式

• 水合物： 100℃时融解，密度 1.542g/cm3(18℃) 无水物：无色晶体或粉末，熔点 153℃ 有强酸味。溶于水、乙醇和乙醚

用途：

• 1 ）食品行业

• 2 ）医药行业

• 3 ）化工行业

• 4 ）其它行业

柠檬酸的生产：

• 1874 年首次从柠檬汁中提出柠檬酸并结晶成固体； 1913 年首次实现利用黑曲霉发酵生成柠檬酸。

一、柠檬酸合成途径

葡萄糖

丙酮

酸 柠檬酸

乙酰 -CoA

草酰乙酸

EMP 途径 氧化脱羧

羧化

• 1953 年， Jagnnathan 等证实了黑曲霉中存在 EMP 途径的所有酶；

• 1954 年， Shu 提出葡萄糖分解代谢中约80％走 EMP 途径；

• 1958 年， MeDomough 等发现黑曲霉还存在 HMP 途径的酶，但 HMP 途径主要存在于孢子形成阶段；

• 1954 － 1955 年， Ramakrishman 和 Martin 研究发现黑曲霉中存在三羧酸循环；

淀粉 葡萄糖 6-磷酸果糖

1， 6- 二磷酸果糖

磷酸丙糖

磷酸烯醇丙酮酸

丙酮酸 乙酰 CoA

苹果酸

草酰乙酸 柠檬酸

顺乌头酸

异柠檬酸

α-酮戊二酸琥珀酸

富马酸

CO2

Fe 2+

CO2CO2

•存在两个 CO2固定系统（需 Mg2 ＋、 K ＋）：

• 1 ）丙酮酸（ PYR ）在丙酮酸羧化酶作用下，生成草酰乙酸（此作用更强）

• 2 ）磷酸烯醇丙酮酸（ PEP ）在 PEP激酶的作用下，生成草酰乙酸

碳平衡和能量平衡

C6H12O6 EMP 途径

2ADP2ATP

2H2

9ADP 9ATP

2×C3H4O3

丙酮酸脱羧CO2 固定C4C2 缩合

H2O

3/2O23H2O

C6H8O7

柠檬酸

• （一）、糖酵解及丙酮酸代谢的调节• 1 、正常情况下，柠檬酸、 ATP 对磷酸果糖激酶有抑制作用，而 AMP 、无机磷、铵离子对该酶则有激活作用，特别是还能解除柠檬酸、 ATP 对磷酸果糖激酶的抑制作用。

• 铵离子浓度与柠檬酸生成速度有密切关系，正是由于细胞内浓度升高，使磷酸果糖激酶对细胞内积累的大量柠檬酸不敏感。

二、柠檬酸生物合成的代谢调节

淀粉

葡萄糖

6-磷酸果糖

1， 6- 二磷酸果糖

磷酸丙糖

磷酸烯醇丙酮酸丙酮酸 乙酰 CoA

草酰乙酸 柠檬酸

CO2

CO2CO2

NH4+

Pi

K+

AMP ATP

• 2. 比较底物锰充足、锰缺乏时分批培养物的最大活力时发现，锰缺乏时黑曲霉的组成（合成）代谢受损伤，这与柠檬酸的积累有关。

• 锰缺乏时，细胞内 NH4＋ 浓度高， Aa浓度高

（蛋白合成受阻，导致升高）。因此，锰离子效应是通过 NH4

＋升高而减少柠檬酸对磷酸果糖激酶的抑制来实现的。

• 3. 丙酮酸激酶是 EMP 途径的第 2个调节点，在某些真菌得到证实，但黑曲霉未被证实。

（二） TCA 循环的调节

• 1 、 TCA 环的起始酶：柠檬酸合成酶是一种调节酶。但

在黑曲霉中，柠檬酸合成酶没有调节作用，这是黑曲霉 TCA 环的第一个特点。

• 顺乌头酸酶失活，阻断 TCA 环是柠檬酸积累的必要条件，顺乌头酸水合酶需要 Fe2 ＋。顺乌头酸酶、异柠檬酸酶在 pH2.0 时失活，线粒体顺乌头酸酶在催化时有柠檬酸：顺乌头酸：异柠檬酸 =90 ： 3： 7的平衡，这个平衡可能就是造成柠檬酸的最初积累而使 pH值降低。

• 2. 第二个特点：黑曲霉菌体内α-酮戊二酸脱 氢酶缺

失或活力很低（ TCA 环被阻断），它被葡萄糖和 NH4＋

抑止 。（是 TCA 循环中唯一不可逆的反应步骤）

• 3. 氧和 pH值对柠檬酸发酵的影响很大。

• 氧是发酵过程（ EMP 途径和丙酮酸脱 氢）生成的 NADH2

重新氧化时所需

• 标准呼吸链产生 ATP 积累，侧呼吸链不产生 ATP ，缺氧导致侧呼吸链失活，使 ATP 积累，柠檬酸积累减少。

磷酸烯醇丙糖酸

丙酮酸 乙酰 CoA

苹果酸

草酰乙酸 柠檬酸

顺乌头酸

异柠檬酸

α-酮戊二酸琥珀酸

富马酸

CO2

Fe 2+

CO2

CO2

抑制

α- 酮戊二酸脱 氢酶系

TCA 循环在柠檬酸积累中所起作用可归纳为：

• （ 1）大量生成草酰乙酸是积累柠檬酸的关键

• （ 2）丙酮酸羧化酶和柠檬酸合成酶基 本上不受代谢调节的控制或其控制及微弱，而且这两个反应的平衡保证了草酰乙酸的提供，增加了柠檬酸的合成能力

• （ 3） TCA 循环的阻断微弱，导致循环中间代谢物积累。由于各种酶处于平衡状态，使柠檬酸积累，当柠檬酸浓度超过一定水平时，就通过抑止异柠檬酸脱氢酶活力来提高自身的积累。

柠檬酸的积累机制归纳：①Mn 抑制蛋白

合成 NH4 解除磷酸果糖激酶的代谢调节，促进EMP 途径的畅通

有一条呼吸活力强的不产生 ATP的侧系呼吸链

② 由于丙酮酸羧化酶是 组成型酶，不被调节控制。

2+ ﹢缺乏

③丙酮酸氧化脱羧生成乙酰 CoA 和 CO2 固定两个反应的平衡，以及柠檬酸合成酶不被调节，增强了合成柠檬酸的能力。

④由于顺乌头酸水合酶在催化时建立了以下平衡：

柠檬酸：顺乌头酸：异柠檬酸 =90 ： 3： 7 同时控制 Fe2+含量时，顺乌头酸酶活力降低，使柠檬酸积累。

⑤随着柠檬酸积累， pH降低到一定程度时，使顺乌头酸酶和异柠檬酸脱氢酶失活，更有利于柠檬酸的积累及排出细胞外。

三、乙醛酸循环和醋酸发酵柠檬酸

• 丙酮酸脱羧 反应是不可逆的，草酰乙酸的供给只能由乙醛酸循环来完成

• 存在异柠檬酸裂解酶，合成柠檬酸的 C4二羧酸只能由乙醛酸提供。

乙醇 乙酸

乙酰 CoA

CoA

烃类 β- 氧化

草酰乙酸 柠檬酸

异柠檬酸

琥珀酸

乙醛酸

乙酰 CoA

苹果酸

富马酸

乙醛酸循环

• 作业：• 简述柠檬酸生物合成的代谢调节