методические указания оспы овец, коз и птицы
DESCRIPTION
TRANSCRIPT
Министерство сельского хозяйства Республики Казахстан
Акционерное общество «КазАгроИнновация»
ТОО «КАЗАХСКИЙ НАУЧНО-ИССЛЕДОВАТЕЛЬСКИЙ
ВЕТЕРИНАРНЫЙ ИНСТИТУТ»
МЕТОДИЧЕСКИЕ УКАЗАНИЯ
по выделению, культивированию и поддержанию вирусов
оспы овец, коз и птицы
Астана 2010
2
УДК 616.912:578.821.21
МЕТОДИЧЕСКИЕ УКАЗАНИЯ
по выделению, культивированию
и поддержанию вирусов
оспы овец, коз и птицы
Автор: Кутумбетова Л.Б.
Для руководства при проведении научно-исследовательских,
производственных и музейно-коллекционных работ,
а также учебно-познавательных занятий для студентов ветеринарного
и вирусологического профилей.
Издано в рамках программы 056
«Повышение конкурентоспособности сельскохозяйственной продукции»
Рассмотрено и одобрено на заседании научно-технической комиссии АО
«КазАгроИнновация», 2 августа 2010 года.
ОБОЗНАЧЕНИЯ И СОКРАЩЕНИЯ
В настоящих методических указаниях использованы следующие
обозначения и сокращения:
РКЭ – развивающиеся куриные эмбрионы;
ФКЭ – фибробласты куриных эмбрионов;
РН – реакция нейтрализации;
АП – аллантоисная полость;
АЖ – аллантоисная жидкость;
ХАО – хорион-аллантоисная оболочка;
ПЯ – первичная культура клеток почки ягнят;
ТТ – перевиваемая линия клеток тестикул теленка;
ТЯ-КК49 – культура клеток тестикул ягнят с диплоидным набором
хромосом, поддерживаемая и производимая пересевами;
ПО – перевиваемая линия клеток почки овцы;
ОП – оспа птиц;
ВОП – вирус оспы птиц;
ИД50 – 50%-ая инфицирующая доза;
ЭИД50 – 50%-ая эмбриональная инфицирующая доза;
Gh-91 – перевиваемая культура клеток гонад 3-х дневной козы;
ТЦД50 – 50%-ая тканевая цитопатическая доза;
СПФ – свободные от патогенной микрофлоры;
КРС – крупный рогатый скот;
Игла – питательная среда для выращивания культур клеток, изготовленная
по рецептуре Eagle
4
ОПРЕДЕЛЕНИЯ
В настоящих методических указаниях применены следующие термины с
соответствующими определениями:
КУЛЬТУРА КЛЕТОК – клетки, способные в искусственных условиях in
vitro находиться в функционально активном состоянии.
ВИРУСЫ – автономные генетические структуры, способные
функционировать и репродуцироваться в восприимчивых к ним клетках
животных, растений, простейших, грибов, бактерий.
СЫВОРОТКА СПЕЦИФИЧЕСКАЯ – сыворотка крови животных,
полученная после иммунизации определенным видом микроорганизма (вируса)
и содержащая антитела специфические микроорганизму который использован
для иммунизации.
ОСВЕЖЕНИЕ – возвращение исходных биологических свойств
микроорганизма путем репродукции или культивирования в чувствительных
биологических моделях (субстратах) после консервирования.
РЕПРОДУКЦИЯ – продуктивный тип взаимодействия вируса с клеткой.
ПАССАЖ – культивирование вируса в культуре ткани, курином эмбрионе
или в организме восприимчивых животных путем последовательного переноса
вируссодержащего материала из одной популяции в другую.
СУБСТРАТ – см. Биологическая модель.
БИОЛОГИЧЕСКАЯ МОДЕЛЬ – культура клеток, развивающийся эмбрион
животных или птицы, животное и птица, чувствительные или восприимчивые к
испытуемому возбудителю болезни (вирусу), которые применяются для
репродукции и размножения микроорганизмов.
ВЫДЕЛЕНИЕ ВИРУСА– изоляция из источника возбудителя болезни.
ИДЕНТИФИКАЦИЯ – определение родовой, видовой и типовой
принадлежности вирусов, установление их сходства или различия при
сравнении с уже известными вирусами.
КУЛЬТИВИРОВАНИЕ – размножение клеток вне организма.
КОНСЕРВИРОВАНИЕ – временное приостановление репродуктивности
вирусов, размножения микроорганизмов, в том числе культур клеток, с
сохранением их репродуктивности и жизнеспособности.
ПОДДЕРЖАНИЕ – сохранение репродуктивных свойств вирусов или
жизнеспособности культур клеток или других микроорганизмов в
биологически активном состоянии.
СТАБИЛИЗАТОР – см. Защитная среда.
ЗАЩИТНАЯ СРЕДА – раствор, содержащий в своем составе протективные
по отношению к микроорганизмам (вирусам) компоненты. Защитная среда
применяется для протекции биологической активности и морфологической
структуры микроорганизмов при лиофильной сушке.
ТИТР ВИРУСА – наименьшее количество вирионов, способных проявлять
биологическую активность и выражается в единицах активности:
5
бляшкообразующей (БОЕ), инфекционной (ИД50), цитотоксической (ТЦД50),
летальной (ЛД50) и определяется с помощью специальных методик.
ИММУНОГЕННОСТЬ – способность антигена индуцировать гуморальный
и клеточный иммунитет. Зависит от величины частиц, конформации,
конфигурации, химической структуры, степени чужеродности и
восприимчивости организма.
АНТИГЕННОСТЬ – мера антигенного качества. Определяется
способностью антигена вызывать специфический иммунный ответ и
взаимодействовать с продуктами иммунного ответа.
ПАТОГЕННОСТЬ – потенциальная способность вирусов и микробов в
естественных условиях вызывать заболевание.
ВИРУЛЕНТНОСТЬ – количественная характеристика патогенности
возбудителей инфекционных болезней. Выражают условными величинами -
минимальной летальной дозой (МЛД), 50%-й летальной дозой (ЛД50) или 50%-
й инфицирующей дозой (ИД50).
МОДИФИЦИРОВАННЫЙ – относится к популяции микроорганизмов
(вирусов), с полезными иммунобиологическими свойствами, полученная в
результате направленного воздействия с помощью определенных методов:
пассирование, клонирование или аттенуирование или данное понятие заменяет
слово аттенуированный.
АТТЕНУИРОВАННЫЙ – относится к популяции микроорганизмов
(вирусов), патогенные и вирулентные свойства которых ослаблены или
утрачены в результате направленных воздействий или впоследствии
природной селекции.
ИЗОЛЯТ ВИРУСА – популяция вируса, выделенная из организма хозяина
или переносчика.
ШТАММ ВИРУСА – однородная популяция вируса, происходящая из
одного вириона и у которой изучены биологические свойства.
ПЕРВИЧНАЯ КУЛЬТУРА КЛЕТОК – клетки, полученные путем
ферментативного разделения из живой ткани макроорганизма и растущие вне
организма в специальных сосудах с помощью питательных сред до образования
монослоя. Для ее получения чаще используют клетки эмбриональных органов,
обладающих наибольшей потенцией к росту.
ПЕРЕВИВАЕМАЯ КУЛЬТУРА КЛЕТОК – клетки, способные к
размножению в искусственных условиях неопределенно долгое время. Ее
получают из первично-трипсинизированных культур клеток и поддерживают в
лабораторных условиях путем последовательных пересевов (пассажей) с
заменой питательной среды.
ПЕРЕСЕВАЕМАЯ ИЛИ ШТАММОВАЯ КУЛЬТУРА КЛЕТОК – культура
клеток с диплоидным набором хромосом, обладающая свойствами первичной.
ПИТАТЕЛЬНАЯ СРЕДА – субстраты, поддерживающие
жизнедеятельность различных культур микроорганизмов и клеток. Содержат
неорганические соли, низкомолекулярные синтетические вещества и
сывороточные компоненты.
6
ВВЕДЕНИЕ
В природе широко распространены вирусные возбудители болезней,
которые ярко проявляют свое присутствие, вызывая специфические
заболевания среди восприимчивых животных. Для индикации и выделения
вирусов используются специальные средства и методы. Обнаружение
вирусного возбудителя дает возможность ставить соответствующий диагноз на
заболевания. Кроме того, вирусные возбудители сами по себе являются
основным источником для изготовления специфических диагностических и
профилактических препаратов. Используемые для таких целей вирусы в начале
выделяют (изолируют), подвергают идентификации и с помощью специальных
методов получают штаммовые популяции с направленными свойствами.
Штаммы вирусов по своим предназначениям имеют определенные
отличающиеся от других иммунобиологические свойства и распределяются на
основные три группы. Первую группу составляют штаммы вирусов,
предназначенные для референции и их биологические свойства, условно,
считают типичными для данного вида возбудителя. Во вторую группу входят
штаммы, обладающие биологическими свойствами, которые близки к
природным и пригодны для осуществления контроля иммуногенности
вакцинных препаратов. Из таких же штаммов можно готовить
инактивированные вакцины или диагностические препараты. Третью группу
представляют штаммы вирусов, которые претерпели определенные изменения
в условиях самой природы или с помощью исследовательских воздействий и не
обладают патогенностью по отношению к восприимчивым животным и птице,
но имеют иммуногенные свойства. Вирусы этой группы чаще используются в
изготовлении живых видов вакцинных препаратов. Их можно применять также
при получении диагностических средств.
Известно, что популяция микроорганизмов, в том числе вирусов в процессе
репродукции подвержена изменчивости, тогда как технологии изготовления
вакцинных и диагностических препаратов требуют применения вирусных
образцов со стабильными биологическими показателями. Поэтому, для
исключения вероятного изменения необходимых стандартизированных
биологических свойств популяцию штаммов вирусов поддерживают в
условиях, которые не стимулируют такие изменения или стимулируют в
наименьшей степени. К таким условиям относятся консервирование путем
сублимационного высушивания и хранение при температуре минус 20 о
С и
ниже.
В настоящих методических указаниях приведены технологические
приемы, биологические объекты, физико-химические и биологические
параметры, используемые при выделении, культивировании и поддержании, а
также определении биологических параметров вирусов оспы овец, оспы коз и
оспы птицы.
7
1 ОБЩАЯ ЧАСТЬ
Работу по подготовке лабораторной посуды, приготовлению культур
клеток и развивающихся куриных эмбрионов, выделению, культивированию и
поддержанию вирусов осуществляют лица, хорошо владеющие техникой
вирусологических исследований, предварительно прошедшие специальное
обучение, получившие инструктаж и владеющие техникой по получению
данного препарата.
Место проведения работ (лаборатория) должно располагать боксовыми
помещениями для раздельного проведения технологических манипуляций по
стерильной фильтрации питательных сред и растворов, получению культур
клеток и развивающихся куриных эмбрионов, выделению, культивированию,
консервированию и освежению вирусов. В боксах, используемых для
приготовления культур клеток и работы с вирусами, необходимо соблюдать
идеальную чистоту. Стены предбоксников и боксов должны быть облицованы
плиткой, а пол и потолок – иметь гладкую поверхность. Боксы оборудуются
бактерицидными лампами и принудительной вентиляцией с целью создания в
них более высокого давления воздуха по сравнению с другими помещениями.
Лабораторное помещение, в котором расположены боксы, должно быть
обеспечено также водопроводной и дистиллированной водой, паром, воздухом
с положительным и отрицательным давлением, углекислотой и азотом.
Персонал, работающий в боксах, должен иметь специальные комнаты для
переодевания и стерильную спецодежду (халаты, комбинезоны,
косынку/колпак) и тапочки. Лица, не имеющие отношения к процессам,
описанных в данных методических указаниях, на посещение место работы с
целью инспекции, обеспечиваются спецодеждой и тапочками. В лабораторных
помещениях, используемых для выделения, культивирования и поддержания
вируса оспы, работа с другими вирусами и микроорганизмами запрещается.
При работе с биологическими объектами соблюдают специальный
санитарный режим. Работу с культурами клеток и тканей, развивающимися
куриными эмбрионами и вирусами производят в стерильных условиях, поэтому
поддержанию чистоты и стерильности боксовых помещений предъявляются
повышенные требования. Перед началом работы, в обеденный перерыв и в
конце рабочего дня необходимо обязательно включать бактерицидные лампы
на 30 минут. При появлении массовых проростов в культуре клеток
бактериальной и грибковой микрофлоры бактерицидные лампы включают на
ночь в течение 2-3 дней подряд. Входить в бокс разрешается только в
специально предназначенной для этой цели одежде и обуви. Халаты, чепчики и
маски предварительно стерилизуют автоклавированием. Работа в боксе
проводится у пламени спиртовки или газовой горелки.
Резиновые пробки флаконов, бутылей матрасов с растворами, средами,
сывороткой или культурой клеток протирают тампонами, смоченными
спиртом, и фламбируют над пламенем спиртовки. Во время работы
своевременно убирают раздельно «стерильную и загрязненную» вирусом
посуду в специальные контейнеры. Обезвреживание посуды осуществляют
8
автоклавированием при 2,0 кг/см2 в течение 2 часов. В конце рабочего дня
проводят влажную уборку полов, стола, стульев и поверхности других
предметов 1,5-2,0% раствором хлорамина. Один раз в неделю проводят
санитарный день, во время которого моют полы, стены и окна с последующим
4-5-часовым облучением боксов ультрафиолетовыми лучами.
2 ОСНОВНАЯ ЧАСТЬ
2.1 Подготовка лабораторной посуды и резиновых изделий
В процессе приготовления культур клеток, выделения, культивирования и
поддержания вирусов используют бутыли, колбы, матрасы, пипетки, пробирки,
флаконы, воронки, резиновые пробки и трубки. Лабораторная посуда и
резиновые изделия должны быть тщательно вымыты и простерилизованы. В
качестве моющих средств применяют тринатрийфосфат, моющий порошок,
кальцинированную и двууглекислую соду, соляную и серную кислоты.
Стеклянную посуду (новую) ополаскивают в водопроводной воде,
заливают на 24 часа 25-30%-ым раствором серной кислоты (ГОСТ 4204-77),
ополаскивают 10 раз в водопроводной воде и помещают в ванну с моющим
раствором (150 г тринатрийфосфата на 100 л дистиллированной воды),
подогретым до 50-600С и моют с помощью ершей. Затем тщательно промывают
дистиллированной водой до полного удаления пены со стенок посуды,
помещают на 1-2 мин в 1%-ый раствор соляной кислоты (ГОСТ 3118-77) для
нейтрализации щелочи или 3-4 раза ополаскивают в этом же растворе и вновь
ополаскивают в 4-х сменах деминерализованной воды. Показателем того, что
посуда вымыта хорошо, является равномерное стекание со всей поверхности
сосудов и отсутствие капель воды на стенках. Если после ополаскивания
посуды видны капли на стенках, ее моют повторно по той же методике. При
этом обращают особое внимание на чистоту ванн, в которых моется и
ополаскивается посуда. Ванны и тазы должны быть обезжирены
кальцинированной содой или хромовой смесью. Вымытую посуду
устанавливают вниз горлышками, затем сушат в сухожаровом шкафу. Посуду,
бывшую в употреблении и не загрязненную парафином, воском или жиром,
ополаскивают холодной водой, моют по той же методике.
Посуду, загрязненную жиром, сначала необходимо прокипятить в растворе
тринатрийфосфата, затем промыть горячей водопроводной водой и вымыть, как
указано выше. Если при этом посуда остается «жирной», ее следует
дополнительно обработать серной кислотой и тщательно прополоскать
водопроводной водой, а затем в 3-х сменах деминерализованной воды. Пипетки
после работы, до мойки хранят в банке с деминерализованной водой, затем
обрабатывают серной кислотой, тщательно промывают сначала проточной
водопроводной, затем деминерализованной водой и высушивают в сушильном
шкафу. Высушенную стеклянную посуду монтируют и стерилизуют в
сушильном шкафу при температуре 1800С в течение 2-х часов. Контролем
стерильности посуды является почернение сахарозы, которую кладут на все
9
полки, где размещена посуда. Горячую посуду выгружать из сушильного
шкафа не рекомендуется, так как она при быстром остывании вне сушильного
шкафа отпотевает и в нее всасывается нестерильный воздух.
Новые, не бывшие в употреблении, резиновые трубки и пробки кипятят в
течение 30 минут двукратно в 5%-ом растворе двууглекислой соды (ГОСТ
2156-76). После каждого кипячения их тщательно отмывают водопроводной
водой до полного просветления промывной жидкости. После этого резиновые
пробки и трубки кипятят 10-15 минут в 2%-ом растворе соляной кислоты. Затем
промывают водопроводной и деминерализованной водой, кипятят 30 минут в
деминерализованной воде, промывают свежей деминерализованной водой,
высушивают на воздухе, монтируют, стерилизуют автоклавированием 2 часа
при 2 кг/см2. Не рекомендуется проводить одновременную обработку черных
резиновых пробок и резиновых трубок. Резиновые пробки и трубки, бывшие в
употреблении, промывают водопроводной, а затем деминерализованной водой,
кипятят 10 минут в деминерализованной воде, монтируют и стерилизуют
автоклавированием 2 часа при 2 кг/см2.
2.2 Приготовление солевых растворов, питательных и защитных сред.
2.2.1 Общие положения.
Для приготовления солевых растворов и питательных сред используют
деминерализованную воду, полученную на ионообменных установках.
Удельное сопротивление воды должно быть не менее 15х106 Ом и рН 5,7-7,0.
Допускается изготовление сред и растворов на дважды или трижды
дистиллированной воде. Воду получают в день приготовления растворов или
накануне. В последнем случае воду хранят в герметически закрытых емкостях
из нержавеющей стали или бутылях.
Среды и растворы готовят из солей квалификации «химически чистые» или
«чистые» для анализа. Соли растворяют в строгой последовательности,
указанной в прописях. Последующую соль добавляют только после полного
растворения предыдущей. Химические реактивы обязательно высушивают.
Параметры условий высушивания неорганических солей указаны в таблице 1.
Таблица 1 – Температурно-временной режим сушки неорганических солей.
№№
п/п
Формула соли
до высушивания
Температура сушки, 0С Формула соли
после
высушивания
Примеча-
ние 37 50 80 180
1 NaCl
-
5-8
суток
-
-
NaCl
- 2 KCl KCl
3 KH2PO4 KH2PO4
4 NaH2PO42H2O - 8-12
суток
- - NaH2PO4 или
NaH2PO4H2O
Темп. не
выше 500С
5 Na2HPO4 12H2O 15-18
суток
15-18
суток
- - Na2HPO4 2H2O или
Na2HPO4H2O
-
10
Для стерилизации питательных сред и растворов используют пластины
«СФ» или ЕКS-2, смонтированные на фильтре Сальникова. Рабочее давление
воздуха в системе 0,3-0,5 кг/см2. Пластины предварительно промывают
деминерализованной или бидистиллированной водой из расчета 2,0 л на одну
пластину. Первую порцию растворов в количестве 0,5-1,0 л на одну
фильтровальную пластину не используют. Нагрузка на одну пластину СФ до 10
л раствора, на пластину ЕКS-2 – до 30 л.
Готовые питательные среды, солевые растворы и сыворотку крови
крупного рогатого скота контролируют на стерильность согласно ГОСТ 28085.
Среды и растворы каждой серии выдерживают 5 суток при температуре 370С и
14 суток при комнатной температуре. При необходимости серию
расфасовывают в мелкую посуду и выдерживают дополнительно 14 суток при
комнатной температуре. Среды и растворы должны быть стерильными,
прозрачными, не иметь осадка. Растворы и среды, содержащие индикатор
феноловый красный, должны быть красно-оранжевого цвета. Среды с наличием
бактериального и грибкового загрязнения утилизируют.
Ростовые свойства питательных сред и сыворотки крови крупного рогатого
скота проверяют путем сравнения с заведомо качественными образцами сред и
сыворотки. Смесь заведомо известных сред и сыворотки с вновь
приготовленными используют для выращивания культур клеток. Среда Игла с
10% сыворотки крови должна обеспечить образование сплошного монослоя
клеток куриных эмбрионов в матрасах через 48 часов при посевной дозе 200
000 клеток/мл. Если в матрасах обнаруживается недостаточный рост культуры
и очаги дегенерации клеток, то проводят повторное испытание. При получении
отрицательных показателей серию среды бракуют.
2.2.2 Приготовление 10-кратного основного раствора Хенкса.
Вначале готовят отдельно раствор А по прописи, приведенной в таблице 2,
а затем раствор Б по прописи, указанной в таблице 3.
Таблица 2 - Пропись раствора А.
Компоненты Количество, г/л ГОСТ Марка
Натрий хлористый (NaCl) 80,0 4233-77 хч
Калий хлористый (КCl) 4,0 4234-77 хч
Магний сернокислый (MgSO4) 1,0 4523-77 хч
Магний хлористый (MgCl) 1,0 4209-77 хч
Кальций хлористый (CaCl2 6H2O)* 1,4 4151-77 хч
Примечание: * - навеску кальция хлористого берут в пересчете на безводный
Готовят точный 40%-ый раствор CaCl2 6H2O (плотность dn20
- 1,3957) и
20%-ый раствор MgCl2 6H2O (плотность dn20
- 1,175). Необходимую
количественную навеску каждой соли растворяют в 30-50 мл воды и
небольшими порциями добавляют к раствору остальных солей. Полученный
раствор А доводят водой до 500 мл.
Таблица 3 - Пропись раствора Б.
11
Компоненты Количество, г/л ГОСТ Марка
Натрий фосфорнокислый
однозамещенный (NaH2PO4 2H2O)
0,75
245-76
Хч
Натрий фосфорнокислый двузамещенный
(Na2HPO4 12H2O)
1,5
4172-76
Хч
Калий фосфорнокислый однозамещенный
(КH2PO4)
0,6
4198-75
Хч
Глюкоза кристаллическая гидратная 10,0 975-75 Хч
Феноловый красный 0,2 ГФХ с. 829
Фенол сульфофталеина аммонийная соль
0,2
МРТУ 6-09-
1647-64
Хч
Конечный объем раствора Б доводят до 460 мл. Затем к раствору Б при
непрерывном перемешивании добавляют раствор А и после этого 20 мл 1%-го
раствора фенолового красного. Полученный основной раствор Хенкса
фильтруют через бумажный или ватно-марлевый фильтр и стерилизуют
фильтрацией через пластины «СФ» или ЕКS-2. Основной раствор Хенкса
хранят при температуре 40С в течение 6 месяцев.
2.2.3 Приготовление рабочего раствора Хенкса.
К одному литру основного раствора Хенкса добавляют 9 л
деминерализованной воды. Доводят рН до 7,2-7,4 с помощью 7,5%-ым
раствором двууглекислого натрия (NaHCO3, ГОСТ 2156-76). Стерилизуют
раствор фильтрованием через пластины «СФ» или ЕКS-2 и хранят при
комнатной температуре (18-200С) 3 месяца, без двууглекислого натрия – 6
месяцев. Рабочий раствор Хенкса без добавления хлористого кальция (CaCl2
6H2O) стерилизуют автоклавированием при 0,7 кг/см2 в течение 40 мин. После
автоклавирования в стерильных условиях устанавливают рН (7,2-7,4) 7,5%-ым
раствором двууглекислого натрия. Срок годности – 3 месяца.
2.2.4 Приготовление 7,5%-го раствора двууглекислого натрия.
Раствор двууглекислого натрия применяют для установки рН солевых
растворов и питательных сред. Навеску соды засыпают в бутыль, заливают
соответствующим количеством деминерализованной воды, закрывают пробкой
и помещают в термостат (37+0,50С) на 2-3 суток. После полного растворения
соды раствор стерилизуют фильтрованием через пластины «СФ» или ЕКS-2.
Стерильный раствор соды расфасовывают во флаконы, плотно закрывают
резиновыми пробками и хранят при температуре 4-60С в течение месяца.
2.2.5 Приготовление 20%-го раствора фосфатно-кислого однозамещенного
калия.
Раствор применяют для подкисления растворов и питательных сред. Для
его приготовления в 1 л деминерализованной воды растворяют 200 г КН2РО4
(ГОСТ 4198-75, хч) и стерилизуют фильтрованием через пластины «СФ» или
ЕКS-2.
2.2.6 Приготовление 0,25%-го раствора трипсина.
Для трипсинизации ткани используют 0,25%-ый раствор трипсина
«Дифко» или другого производства с равными ферментативными свойствами в
12
солевом буферном растворе без ионов Са+ и Mg
+. Состав этого солевого
буферного раствора приведен в таблице 4.
Таблица 4 - Пропись компонентов 0,25%-го раствора трипсина.
Компоненты Количество, г/л ГОСТ Марка
Натрий хлористый (NaCl) 8,0 4233-77 Хч
Калий хлористый (КCl) 0,2 4234-77 Хч
Натрий фосфорнокислый
двузамещенный (Na2HPO4 2H2O)
1,447
4172-76
Xч
Калий фосфорнокислый
однозамещенный (КH2PO4)
0,2
4198-75
Хч
Деминерализованная вода до 1 л
Навеску трипсина 2,5 г предварительно растворяют в небольшом объеме
воды (100-150 мл), перемешивают и ставят на ночь в холодильник. Критерием
растворения трипсина служит хорошая видимость контуров предметов через
бутыль с раствором. Растворенный трипсин при помешивании добавляют в
колбу. Полученный раствор доводят водой до 1 л. К общей смеси добавляют
пенициллин и стрептомицин по 100 000 ЕД. (антибиотики растворяют в
небольшом объеме раствора и наливают в колбу). Добавлением 1N раствора
едкого натрия – NaOH (ГОСТ 4328-77) устанавливают рН раствора, который до
фильтрации должен быть в пределах 7,2-7,3, после фильтрации 7,4-7,5.
Полученный раствор стерилизуют фильтрованием через пластины «СФ»
или ЕКS-2. Готовый раствор трипсина хранят в герметически закрытых
бутылях при температуре 4-6 о
С не более 1 месяца, в замороженном виде при
температуре минус 30 оС
до 1 года.
2.2.7 Приготовление 0,5%-го гидролизата лактальбумина.
Гидролизат лактальбумина в концентрации 0,5% растворяют на растворе
Хенкса и используют в качестве питательной среды для выращивания культур
клеток ПЯ, ТЯ-КК49, ФКЭ. Среду готовят по прописи, указанной в таблице 5.
Таблица 5 - Пропись компонентов для приготовления 0,5%-го раствора
гидролизата лактальбумина.
Компоненты Количество, г/л ГОСТ Марка
Натрий хлористый (NaCl) 8,0 4233-77 Хч
Калий хлористый (КCl) 0,4 4234-77 Хч
Магний сернокислый (MgSO46Н2О)
или
Магний сернокислый безводный
0,1
0,053
4523-77
-
Хч
-
Магний хлористый (МgCl26Н2О) или
Магний хлористый безводный
0,1
0,47
4209-77
-
Хч
хч
Натрий фосфорнокислый
двузамещенный (Na2HPO4 12H2O)
0,075
4172-76
Хч
13
Калий фосфорнокислый
однозамещенный (КH2PO4)
0,06
4198-75
Хч
Глюкоза кристаллическая гидратная 1,0 975-75 Хч
Кальций хлористый безводный (СаСl2)
0.2
4460-77
Хч
Феноловый красный 0,02 ГФХ с.829 Хч
Натрий двууглекислый (NaHCO3) 2156-76 Хч
Гидролизат лактальбумина 5
Пенициллин 100 тыс. ед. ГФХ с.521
Стрептомицин 100 тыс. ед. ГФХ с. 636
Вода деминерализованная до 1л.
Порядок растворения компонентов:
Раствор 1: натрий хлористый, калий хлористый, магний сернокислый,
глюкоза.
Раствор 2: натрий фосфорнокислый однозамещенный растворять в воде,
нагретой до температуры 90 оС.
Раствор 3: гидролизат лактальбумина растворять в воде, нагретой до 90 о
С,
или автоклавировать при 0,7 кг/см2 в течение 10 минут.
Раствор 4: хлористый кальций, тщательно перемешивать.
Раствор 5: феноловый красный.
Раствор 6: натрий двууглекислый.
Газирование среды углекислым газом, подвести рН среды до 7,0-7,2.
Раствор 7: антибиотики.
Смешать растворы и стерилизовать фильтрованием через пластины «СФ»
или ЕКS-2. Среду хранят 3 месяца в герметически закрытых бутылях при
температуре 4-6 о
С.
2.2.8 Приготовление питательной среды по рецептуре Игла
Таблица 6 - Пропись компонентов для приготовления питательной среды по
рецептуре Игла.
Компоненты Состав (мг в 1000,0
мл раствора) для L-
клеток
Состав (мг в 1000,0 мл
раствора) для HeLa-
клеток
л-аргинин 17,4 17,7
л-цистин 4,8 12,0
л-гистидин
3,1
7,8
л-изолейцин 26,2 26,2
л-лейцина 13,1
26,2
л-лизин 14,6
29,2
л-метионин 7,5 7,5
14
л-фенилаланин 8,3 16,5
л-треонин 11,9 23,8
л-триптофан 2,0 4,1
л-тирозин 18,1 18,1
л-валин 11,7 23,4
биотин 0,24 0,24
холин 0,12 0,12
холина-хлорид 0,14 0,14
витамин В12 (птероилглютаминовая
кислота)
0,44 0,44
никотинамид 0,12 0,12
пантотеновая кислота 0,22 0,22
пантотенат кальция 0,48 0,48
пиридоксаль (пиридоксин хлоргидрат) 0,20 0,20
тиамин-хлоргидрат 0,34 0,34
рибофлавин 0,04 0,04
хлористый натрий 5850,0 5850,0
хлористый калий 373,0 373,0
фосфат натрия однозамещенный
(NaH2PO4*1H2O)
138,0 138,0
кальций хлористый 111,0 111,0
двууглекислый натрий (NaHCO3) 1680,0 1680,0
магний хлористый (MgCl2*6H2O) 102,0 102,0
глюкоза 900,0 900,0
л-глютамин 146,2-292,3 146,2-292,3
пенициллин 50,0 50,0
стрептомицин 50,0 50,0
фенол красный 5,0 5,0
вода до 1000,0 до 1000,0
Раствор 1. В 500 мл воды, нагретой приблизительно до 80 о
С, помешивая,
растворяют указанные выше количества аминокислот, после чего добавляют л-
глютамин и фенол-красный.
Раствор 2. В 100,0 мл воды растворяют неорганические соли, за
исключением двууглекислого натрия (NaHCO3), смешивают с предыдущим
раствором неорганических солей и добавляют биотин и птероилглютаминовую
кислоту (витамин В12).
Раствор 3. В 200,0 мл воды растворяют все витамины, кроме биотина и
птероилглютаминовой кислоты, и антибиотики – пенициллин и стрептомицин.
Все растворы стерилизуют фильтрованием через стеклянный фильтр-нутч
(Шотт, Иена, Германия) либо через асбестоцеллюлозные пластины Зейтца или
отечественные пластины СФ (стерилизующий фильтр) после предварительного
промывания водой, а затем – приготовленным раствором.
500 мл раствора 1 + 200 мл раствора 2 + 200 мл раствора 3 смешивают и
доводят стерильной водой до 1000,0 мл. Можно добавить 1мг инозита на1 л.
2.2.9 Получение сыворотки крови крупного рогатого скота.
15
В условиях относительной стерильности от клинически здоровых
животных 2-3 –летнего возраста берут кровь из яремной вены. Через
стерильный резиновый шланг кровь подается по стенке в бутыли вместимостью
10 л. В каждую бутыль берут до 5 л крови. Для полного отделения сыворотки
кровь выдерживают 48-72 часа при температуре 25 оС. Прозрачную сыворотку
отсасывают в бутыли через сифонное устройство и стерилизуют через
пластины «СФ» или ЕКS-2. Сыворотку проверяют на стерильность и ростовые
свойства. Допускается использование сыворотки без консерванта, выпускаемой
мясокомбинатами. Сыворотку хранят при температуре 4-6 о
С в течение 6
месяцев. Сыворотка, имеющая хлопьевидный осадок фибрина, пригодна для
работы с культурами клеток и тканей.
2.2.10 Приготовление 0,01%-го раствора бромкрезола.
Для приготовления раствора в мерную посуду вносят 0,1 г
бромкрезолового красного и его растворяют в 100 мл 96о спирта ректификата.
Полученный раствор доводят деминерализованной водой до 1000 мл. Раствор
хранят при температуре 18-25 о
С не более 1 месяца. Используют раствор для
проверки качества мойки и ополаскивания стеклянной посуды. В чистую
посуду добавляют 2-3 мл 0,01%-го раствора бромкрезола. Изменение цвета от
желтого к синему свидетельствует о низком качестве мойки (желтый-хорошая
мойка, синий-плохая).
2.2.11 Приготовление защитной среды для лиофилизации вируса.
В качестве защитной среды для вируса оспы при сублимационном
высушивании используют среду, состоящую из пептона или гидролизата
лактальбумина, сахарозы и желатина. Допускается использование в этих же
целях обезжиренного молока коров.
Защитную среду, состоящую из пептона или гидролизата лактальбумина,
сахарозы и желатина готовят следующим образом:
- для получения 12 л среды растворяют 2 кг пептона (ГОСТ 13805-76) или
столько же сухого гидролизата лактальбумина и 2 кг сахарозы (ТУ6-092293-77)
в 10 л калийфосфатного буферного раствора (52,8 г К2НРО4 и 10,9 г КН2РО4 на
10 л дистиллированной воды, используют соли предварительно
перекристализованные и высушенные), а также 0,2 кг желатина в 0,5 л
дистиллированной воды;
- растворение производят при нагревании до 70-800С и перемешивают до
полного растворения сахарозы;
- после растворения жидкости смешивают, охлаждают до комнатной
температуры и отделяют осадок в виде крупных, рыхлых серо-белых хлопьев,
пропуская раствор через ватно-марлевый фильтр;
- рН среды должен быть в пределах 6,8-7,2;
- затем среду стерилизуют фильтрацией через пластины типа ЕКS-2,
подавая жидкость на фильтр при избыточном давлении или «самотеком»,
пропускная способность одной пластины – 8 л жидкости;
- суммарные потери при фильтрации составляют 1,5-2,0 л на 12 л
первоначального объема среды. Стерилизующую фильтрацию среды проводят
в день ее изготовления.
16
Плотность среды после стерилизующей фильтрации должна быть не ниже
1,07 г/мл определяют с помощью ареометра (ГОСТ 18481-81Е).
Приготовленную защитную среду стерильно расфасовывают в стерильные
бутыли на 3-5-10 л, хранят при температуре 2-6 оС не более 30 суток и
используют для стабилизации вируса после получения положительных
результатов о ее стерильности.
Стерильность образцов защитной среды определяют по ГОСТ 28085.
Для приготовления защитной среды из молока берут свежее коровье
молоко, обезжиривают его сепарированием, фасуют в стеклянные колбы или
флаконы высотой столба жидкости (обрата) не выше 10 см, сосуды с
обезжиренным молоком закрывают ватно-марлевыми пробками и подвергают
двукратному автоклавированию текучим паром при 0,5 кг/см2 в течение 30 мин
с интервалом в 18-24 час.
Стерилизованное обезжиренное молоко проверяют на стерильность и
хранят до использования не более 10 сут.
2.3 Приготовление субстратов репродукции вирусов оспы.
В качестве субстрата для репродукции вируса оспы птицы используют 10-
12-суточные развивающиеся куриные эмбрионы и культуру фибробластов
развивающихся куриных эмбрионов, а для вирусов оспы овец и оспы коз –
культуру первичных клеток ПЯ, пересеваемых ТЯ-КК49 и перевиваемых линий
ПО и ТТ.
2.3.1 Приготовление развивающихся куриных эмбрионов.
Для получения развивающихся куриных эмбрионов закладывают на
инкубацию СПФ яйца кур, не имеющих трещин и загрязнений. Инкубацию яиц
проводят в течение 10-12 суток при температуре 37,5-38,00С в специальных
инкубаторах для вывода цыплят с обеспечением в камере влажности воздуха не
менее чем 60% и периодической вентиляции, а также переворачивания яиц на
полках. Для определения наличия и развития эмбрионов яйца овоскопируют на
5-7 сутки инкубации. Яйца без эмбрионов выбраковывают, а эмбрионы с
наличием кровеносных сосудов инкубируют до 10-12 суточного возраста и
используют в эти сроки для репродукции вируса или приготовления культуры
фибробластов.
2.3.2 Приготовление фибробластов куриных эмбрионов.
Для приготовления культуры фибробластов отбирают хорошо развитые
подвижные 10-11-суточные эмбрионы кур. Яйца с погибшими эмбрионами и не
оплодотворенные утилизируют. Отобранные для трипсинизации
инкубационные яйца с эмбрионами укладывают в специальные лотки пугой
вверх, двукратно, на 2-3 секунды погружают в 2%-ый раствор йодистого калия
на 960 этиловом спирте и подают в бокс.
В боксе поверхность яиц прожигают спиртом, а по окружности пуги
прожигают при помощи «устройства для электротермического вскрытия
эмбрионов птиц». Затем стерильным пинцетом снимают скорлупу, разрывают
хорион-аллантоисную оболочку (ХАО), извлекают эмбрионы и помещают их
17
по 50-60 или 100-120 штук в 2-х литровую колбу Эрленмейера, где трижды
отмывают рабочим раствором Хенкса (рН 7,2-7,4) с антибиотиками (по 100 ЕД
пенициллина и 100 мкг стрептомицина на 1 мл раствора). Затем эмбрионы
размельчают ножницами, заливают 0,25%-ым раствором трипсина, подогретого
до температуры 370С (в среднем по 75 мл трипсина на 8-10 куриных
эмбрионов), опускают в колбу с размельченными эмбрионами стерильный
магнитик, ставят колбу с содержимым на магнитную мешалку и проводят
трипсинизацию со средней скоростью вращения магнитика в течение 7-8 мин.
После чего суспензию клеток сливают через 4-х слойный марлевый фильтр во
флаконы. Во взвесь клеток добавляют 2-3% сыворотки крови крупного
рогатого скота и осаждают их центрифугированием при 1000 об/мин в течение
10 минут. Осадок ресуспендируют в питательной среде и диспергированные
клетки фильтруют через 4 слоя стерильной марли.
В камере Горяева под малым увеличением микроскопа (10х20)
подсчитывают концентрацию и жизнеспособность клеток в полученной
трипсинизацией суспензии.
Для выращивания монослойной культуры клеток фибробластов эмбрионов
используют суспензию, содержащую 90-95% жизнеспособных клеток. Процент
жизнеспособных клеток определяют по формуле: у = х/с ,100, где:
Х – количество жизнеспособных клеток в 1 мл суспензии (неокрашенные);
С – общее число (окрашенных и не окрашенных) клеток в 1 мл суспензии.
Для подсчета клеток пипеткой отбирают по 0,2 мл суспензии и сливают ее
в пробирку. В эту же пробирку вносят 0,8 мл краски (0,2%-ый раствор
трипанового синего на физиологическом растворе) и получают разведение
суспензии клеток в 5 раз. Содержимое пробирки тщательно перемешивают,
выдерживают 5 мин + 30 сек при температуре 37+0,50С и заполняют камеру
Горяева. Подсчитывают живые (неокрашенные клетки). Конгломераты считают
за одну клетку. Подсчет производят в 25 больших квадратах камеры.
Полученное количество клеток умножают на 5 (степень разведения суспензии
краской) и умножают на 10 000 (величина постоянная). Полученное
произведение означает общее количество клеток в 1 мл суспензии. Например, в
25 больших квадратах камеры Горяева насчитывается 100 клеток.
Следовательно, 100 х 5 х 10 000 = 5 000 000 клеток в 1 мл суспензии.
Для засева культуры клеток в матрасы вместимостью 1,5 л концентрация
клеток в суспензии должна быть 200-300 тыс. клеток в 1 мл, следовательно,
необходимо данный объем всей клеточной суспензии развести в 25 или 16 раз
питательной средой.
Для выращивания культуры клеток роллерным методом концентрация
клеток в суспензии должна быть 700-800 тыс. кл/мл.
Для получения культуры клеток, необходимой в определении числовых
значений вирусов, суспензию клеток высевают в пенициллиновые флаконы в
концентрациях 200-400 тыс. кл/мл.
Суспензию клеток разводят до необходимой концентрации питательной
средой с 5-10% сыворотки крови крупного рогатого скота. В общий объем
суспензии вносят по 1000 ЕД пенициллина и 1000 мкг стрептомицина на 1 л и
18
разливают суспензию по 180-200 мл в матрасы вместимостью 1,5 л или по 450-
500 мл в 5-литровые бутыли. Разлив суспензии производят в стерильном боксе
над пламенем горелки. Матрасы и бутыли плотно закрывают резиновыми
пробками. Матрасы размещают горизонтально, а бутыли – на роллерные
установки и инкубируют при температуре 37+0,50С в течение 24-48 часов.
Скорость вращения бутыли на роллерном аппарате устанавливают в пределах
10-15 оборотов в час. Через 24-48 часов все матрасы и бутыли с культурой
клеток просматривают под малым увеличением микроскопа и визуально.
Макроскопически – среда в матрасах и бутылях должна быть прозрачной.
Микроскопически – клетки должны покрывать всю поверхность стенки сосуда
сплошным слоем.
2.3.3 Приготовление первичной культуры клеток почек ягнят.
Для приготовления первичной культуры клеток ПЯ используют ягнят
доноров 1-2 месячного возраста, полученных от здоровых овцематок
благополучной по инфекционным заболеваниям отары.
Ягнят убивают, выпуская кровь из яремной вены и сонной артерии,
отделяют шкуру препарированием, вскрывают брюшную полость и открывают
доступ к почкам, раздвигая органы вскрытой полости.
Для убоя и вскрытия полости брюшины, а также других режущих
манипуляций используют остро заточный нож или скальпель.
С помощью карцанга и пинцета, не травмируя наружную оболочку, почки
освобождают от жирового слоя, фиксируют орган карцангом, захватывая
оболочку вместе с мочеточниками и сосудами, отделяют из туши, отрезая
ножом или ножницами. Почки переносят поочередно в эмалированный
металлический лоток, в который заранее наливают этиловый спирт ректификат.
Почку погружают в спирт на 2-3 секунды, захватив за сосуды, извлекают ее из
спирта и сразу же поджигают. В состоянии горения спирта почки быстро
переносят в банку с широким горлом, в которую заранее налит раствор Хенкса
с антибиотиками в дозе 200 ЕД/мл пенициллина и 200 мг/мл стрептомицина.
Банку закрывают стерильной крышкой и переносят в бокс в специальном биксе.
В боксе, строго соблюдая все правила асептики, почки переносят на
стерильный металлический с эмалированной поверхностью лоток или на чашку
Петри. Почки освобождают от наружной оболочки с помощью стерильных
ножниц, пинцетов и карцанга. Ополаскивают раствором Хенкса с
антибиотиками, удаляют ножницами корковый слой, а мозговой - помещают в
стерильную банку с широким горлом, в которой его тщательно размельчают на
мелкую гомогенную массу с размером частиц 2-4 мм. Размельченную массу
заливают раствором Хенкса (рН 7,2-7,4) с антибиотиками и прополаскивают
двух-трех кратно. Кусочки ткани почечного органа переносят в плоскодонную
колбу и заливают их 0,25%-ым раствором трипсина, подогретого до
температуры 370С (в среднем по 75 мл трипсина на тканевую массу одной
почки). В колбу с размельченными почками опускают стерильную магнитную
палочку, ставят колбу с содержимым на магнитную мешалку и проводят
трипсинизацию в течение 7-8 мин со средней скоростью вращения магнитика,
которая не допускает образования пены. По истечению времени трипсинизации
19
суспензию клеток сливают через 4-х слойный марлевый фильтр во флаконы.
Оставшиеся кусочки ткани почек повторно заливают раствором трипсина и
повторяют трипсинизацию в тех же режимах и продолжительности времени.
Трипсинизацию тканей повторяют трех и более кратно, до полного истощения
тканей от клеток. Во взвесь клеток добавляют 2-3% сыворотки крови крупного
рогатого скота и осаждают их центрифугированием при 1000 об/мин в течение
10 минут. Осадок ресуспендируют в питательной среде и диспергированные
клетки фильтруют через 4 слоя стерильной марли.
В камере Горяева под малым увеличением микроскопа (10х20)
подсчитывают концентрацию и жизнеспособность клеток в полученной
трипсинизацией суспензии.
Для выращивания монослойной культуры клеток почек ягнят используют
суспензию, содержащую 90-95% жизнеспособных клеток. Процент
жизнеспособных клеток определяют по формуле: у = х/с ,100, где:
х – количество жизнеспособных клеток в 1 мл суспензии (неокрашенные);
с – общее число (окрашенных и не окрашенных) клеток в 1 мл суспензии.
Для подсчета клеток пипеткой отбирают по 0,2 мл суспензии и сливают ее
в пробирку. В эту же пробирку вносят 0,8 мл краски (0,2%-ый раствор
трипанового синего на физиологическом растворе) и получают разведение
суспензии клеток в 5 раз. Содержимое пробирки тщательно перемешивают,
выдерживают 5 мин + 30 сек при температуре 37+0,50С и заполняют камеру
Горяева. Подсчитывают живые (неокрашенные клетки). Конгломераты считают
за одну клетку. Подсчет производят в 25 больших квадратах камеры.
Полученное количество клеток умножают на 5 (степень разведения суспензии
краской) и умножают на 10 000 (величина постоянная). Полученное
произведение означает общее количество клеток в 1 мл суспензии. Например, в
25 больших квадратах камеры Горяева насчитывается 100 клеток.
Следовательно, 100 х 5 х 10 000 = 5 000 000 клеток в 1 мл суспензии.
Для засева культуры клеток в матрасы вместимостью 1,5 л концентрация
клеток в суспензии должна быть 200-300 тыс. клеток в 1 мл, следовательно,
необходимо данный объем всей клеточной суспензии развести в 25 или 16 раз
питательной средой.
Для выращивания культуры клеток роллерным методом концентрация
клеток в суспензии должна быть 700-800 тыс. кл/мл.
Для получения культуры клеток, необходимой в определении числовых
значений вирусов, суспензию клеток высевают в пенициллиновые флаконы в
концентрациях 200-400 тыс. кл/мл.
Суспензию клеток разводят до необходимой концентрации питательной
средой с 5-10% сыворотки крови крупного рогатого скота. В общий объем
суспензии вносят по 1000 ЕД пенициллина и 1000 мкг стрептомицина на 1 л и
разливают суспензию по 180-200 мл в матрасы вместимостью 1,5 л или по 450-
500 мл в 5-литровые бутыли и по 1,0 мл в пенициллиновые флаконы. Разлив
суспензии производят в стерильном боксе над пламенем горелки. Матрасы и
бутыли плотно закрывают резиновыми пробками. Матрасы и пенициллиновые
флаконы размещают горизонтально, а бутыли – горизонтально в роллерные
20
аппараты и инкубируют при температуре 37+0,50С в течение 24-72 часов.
Скорость вращения бутыли в роллерном аппарате устанавливают в пределах
10-15 оборотов в час. Через каждые 24 часа все матрасы и бутыли с культурой
клеток просматривают визуально и под малым увеличением микроскопа.
Макроскопически – среда в матрасах и бутылях должна быть прозрачной.
Микроскопически – клетки должны покрывать всю поверхность стенки сосуда
сплошным слоем.
2.3.4 Приготовление пересеваемых клеток ТЯ-КК49.
Культуру клеток ТЯ-КК49 поддерживают непрерывными пассажами или в
замороженном состоянии в жидком азоте при температуре минус 196 оС.
Для сохранения клеток в жидком азоте клетки концентрируют до
концентрации 5х106 кл./см
3, помещают в специальную защитную среду,
состоящую из диметилсульфоксида – 20%, питательной среды ИГЛА – 60% и
сыворотки крови крупного рогатого скота (фетальной или телячьей) – 20%, и
разливают в ампулы по 5 см3. Ампулы с клетками закрывают специальными
крышками или запаивают. Ампулы с клетками замораживают, вначале до
температуры минус 70 оС со скоростью охлаждения 1
оС/мин, а затем переносят
в жидкий азот в специальных металлических стаканах. Замороженные таким
образом клетки в ампулах или пробирках хранят в течение нескольких лет,
постоянно пополняя жидким азотом камеру сосуда Дъюара, где содержатся
ампулы с клетками.
Для приготовления монослойной культуры клеток, суспензию клеток в
ампулах, хранящуюся в жидком азоте, вынимают и размораживают, помещая в
воду с температурой 40 оС. Ампулу асептически вскрывают, содержимое
переносят в матрас с питательной средой, подсчитывают количество
жизнеспособных клеток, и помещают для культивирования в термостат с
температурой нагрева 37-38 о
С. Количество жизнеспособных клеток должно
быть не менее 80%. Для восстановления исходных цитологических свойств
культуры клеток проводят 2-3 освежающих пассажа. В связи с этим посеянные
клетки выдерживают до образования монослоя на поверхности матраса, затем
ее пересевают двукратным индексом и дожидаются образования полной
монослойной культуры клеток. В следующей генерации культуру клеток
пересевают четырех кратным индексом, и после получения монослоя, культуру
клеток используют для производства и репродукции вируса.
Для поддержания клеток в растущем состоянии их культивируют в
матрасах при температуре 37-38 оС с индексом пересева 6-8, высевая в каждой
генерации по 100 тыс. кл./см3. Такая методика дает возможность более
длительному образованию монослоя и сравнительно длительному сохранению
клеток без пересева. Для культивирования клеток ТЯ-КК49 используют
питательную среду ИГЛА-МЕМ с содержанием 10% сыворотки крови крупного
рогатого скота и температуру инкубации 37-38 оС. Культуру клеток
поддерживают в той же среде, но с содержанием 5% и менее сыворотки крови
того же вида животного.
21
Клетки ТЯ-КК49 выращивают в матрасах и круговых сосудах различной
емкости, биологических пробирках и пенициллиновых флаконах. Культуру
клеток, выращенную в пробирках и пенициллиновых флаконах, используют для
первичного выделения вируса из патологических материалов, титрования
вируса и постановки реакции нейтрализации, а культуру клеток, выращенную в
матрасах и сосудах – для продукции биологической массы вируса.
2.3.5 Приготовление перевиваемых клеток ПО и ТТ.
Культуру клеток линий ПО и ТТ поддерживают также как и культуру
клеток ТЯ-КК49 непрерывными пассажами или в замороженном состоянии в
жидком азоте при температуре минус 196 оС. Методики их приготовления,
хранения и поддержания такая же, как и при использовании пересеваемых
клеток ТЯ-КК49 (п.п.2.3.4).
2.4 Подбор и подготовка экспериментальных животных.
Работы по выделению, идентификации и установлению биологических
свойств вирусов оспы животных и птицы требуют использования
экспериментальных животных и птицы. Такие животные и птица должны
отвечать требованиям, которые предусматривают использования животных и
птицы, свободных от возбудителей инфекционных заболеваний, имеющих
упитанность не ниже средней и интактных (не иммунных против оспы) от
возбудителей оспы и не содержащих в организме специфических антител
против вирусов оспы.
В экспериментальных работах с вирусом оспы овец используются овцы
различного возраста, а вирусом оспы коз – козы, также различного возраста.
Предпочтителен возраст этих животных от 6 месяцев до 2-х лет. Для работы с
вирусом оспы птицы используются молодые куры в возрасте 2-5 месяцев.
2.5 Выделение, идентификация и культивирование вирусов оспы.
2.5.1 Выделение, идентификация и культивирование вируса оспы овец.
Для выделения вируса оспы овец используют патологический материал,
собранный от больных и павших овец с клиническими признаками,
характерными для оспенной болезни. Такими признаками являются узелковые
поражения кожи, которые проявляются в виде розеолы, папулы, пустулы и
везикулы. Узелковые образования или экссудативное содержимое папул
собирают в стерильную посуду, доставляют в лабораторию и подвергают
двукратному замораживанию и размораживанию при температурных значениях
минус 40оС и плюс 20-25
оС. Из узелковых образований кожи готовят 20%
суспензию на растворе Хенкса или физиологическом растворе натрия хлорида,
растирая в фарфоровой ступке с песком нейтрального стекла. Гомогенат
очищают от грубых частиц центрифугированием при 3000 g в течение 30 мин.
В надосадочную жидкость добавляют антибиотики в дозе 200 ЕД/см3
пенициллина, 200 мг/см3 стрептомицина и 50 мг/см
3 нистатина, выдерживают
при температуре 4-8 оС в течение 6 ч и затем используют для выделения вируса
22
заражением соответствующей чувствительной биологической модели. Такими
объектами для выделения вируса оспы овец служат овцы, подобранные
согласно требованиям п.п. 2.4., культура клеток ПЯ, ТЯ-КК49, ПО и ТТ.
При использовании для биологической пробы овец, суспензию
испытуемого патологического материала вводят этим животным внутрикожно в
бесшерстный участок кожи в дозе 0,5 см3. За зараженными животными ведут
клиническое наблюдение в течение не менее 17 суток с ежедневным
измерением температуры тела. В случае наличия вируса оспы овец у
зараженных животных через 3-7 суток проявляется гипертермия и кожные
поражения в виде папулезно-пустулезных образований в месте инокуляции
исследуемого патологического материала. Через 3-5 суток после проявления
гипертермии и кожных поражений в месте введения патологического
материала, в различных участках тела образуются вторичные кожные оспенные
узелки, которые свидетельствуют о генерализации оспенного процесса. В
качестве источника вируса служат оспенные узелки кожи, в которых обычно
накапливается вирус в титре до 106,5
ИД50/0,5см3.
При использовании для выделения вируса культуры клеток, суспензию
испытуемого патологического материала вводят на монослой клеток в
пробирках или пенициллиновых флаконах в дозе 0,1 см3. Зараженные клетки
выдерживают при температуре 37-38 оС в течение 60 мин, затем инокулят
сливают, монослой несколько кратно промывают раствором Хенкса,
содержащим антибиотики, вносят поддерживающую среду и культивируют при
температуре 37-38 оС в течение 10-12 суток. В течение указанного срока
ежедневно проводят микроскопию монослоя с целью выявления признаков
наличия оспенного вируса. О присутствии вируса свидетельствует
цитопатогенное действие, которое проявляется в монослое клеток с 4-7 суток
после инокуляции суспензии испытуемого патологического материала.
Цитопатогенное действие характеризуется округлением клеток,
формированием ими гроздевидных образований в монослое, в последующем -
разрывов между клетками, приводящих к полной деструкции монослоя клеток.
Цитопатогенное действие вируса оспы овец примерно одинаково
проявляется во всех чувствительных культурах клеток и накапливается в них от
105,0
до 107,5
ТЦД50/см3.
В случае отсутствия цитопатогенного действия вируса культуру клеток в
пробирках или флаконах подвергают двукратному замораживанию и
размораживанию, полученную культуральную суспензию вносят на монослой
свежей аналогичного вида культуры клеток. Также как и при заражении
патологическим материалом, свежую культуру клеток, инокулированную
исследуемой культуральной суспензией, выдерживают при температуре 37-38 оС в течение 60 минут, инокулят заменяют на поддерживающую питательную
среду и продолжают культивирование при той же температуре до проявления
цитопатогенного действия. В случае отсутствия ЦПД и на втором пассаже
проводят аналогическим образом третий пассаж. Отсутствие ЦПД на третьем
«слепом» пассаже принимают за отсутствие репродуктивного вируса в
исследуемом образце патологического материала. При наличии
23
цитопатогенного действия, в каком либо пассаже, считают вирус выделенным и
проводят его идентификацию.
Идентификацию выделенного вируса проводят с помощью реакции
нейтрализации, поставленной на животных или в культуре клеток. Для этого
выделенный вирус в титре 1000 ИД50 в равных объемных соотношениях
смешивают со специфической на вирус оспы овец сывороткой, полученную
смесь выдерживают в течение 60 минут при температуре 37-38 оС и ею
инокулируют одну из культур клеток чувствительных к вирусу оспы овец или
овец, не иммунных к оспе. Параллельно вирусом в указанной дозе, но без
добавления сыворотки заражают культуру клеток и овец. За зараженной и
контрольной культурами клеток и овцами ведут ежедневное наблюдение,
выявляя цитопатогенное действие или кожные узелковые поражения.
Наблюдение за монослоем зараженной культуры клеток продолжают в течение
12 суток, а за овцами – 14 суток.
Вирус считают идентифицированным как вирус оспы овец в случае
отсутствия ЦПД в культуре клеток и оспенных узелков у животных,
зараженных смесью испытуемого вируса со специфической сывороткой на
вирус оспы овец, при развитии ЦПД в культуре клеток и оспенных узелков у
овец, инфицированных испытуемым вирусом без добавления специфической
сыворотки на вирус оспы овец.
Культивирование вируса оспы овец, в зависимости от его биологических
свойств и предназначения, проводят в организме овец и чувствительной
культуре клеток. Патогенные штаммы вируса оспы овец культивируют в
организме молодых интактных овец, а модифицированные - в одной из
чувствительных культур клеток.
Вирулентные штаммы вируса оспы овец, предназначенные для проверки
иммуногенности вакцинных препаратов, культивируют в организме овцы. Для
этого, вирус вводят овцам внутрикожно в дозе 0,5 см3
и наблюдают за
развитием кожного оспенного поражения. На 5-6 сутки на месте введения
возбудителя формируется отечность с покраснением, который в последующем
приобретает темно-красную окраску. За день до появления отека кожи у овцы
повышается температура тела. Для получения биомассы вирулентного вируса
на 6-7 сутки, в зависимости от развития местного воспаления и температуры
тела, животное убивают, участок воспаленной кожи срезают, которую очищают
от механических примесей, дезинфицируют этиловым спиртом и подвергают
гомогенизации растиранием в ступке в смеси с песком нейтрального стекла.
Гомогенат разводят до 20% физиологическим раствором хлорида натрия с рН
7,2-7,4, центрифугируют при 3000 g в течение 30 минут, осадок удаляют, а
оставшуюся жидкость используют в качестве вируссодержащего материала.
Модифицированные штаммы вируса, предназначенные для приготовления
живых вакцин культивируют в культуре первичных клеток, полученных из
почечной и тестикулярной клеток ягнят, а штамм «КазНИВИ» - в пересеваемой
культуре клеток ТЯ-КК49 и линии ПО. Для этого готовят монослойную
культуру клеток соответствующего вида, высевая клетки в концентрации 200-
300 тыс. клеток/см3 в матрасы и 600-800 тыс. клеток/см
3 - в круговые сосуды,
24
заражают их модифицированным вакцинным штаммом вируса в дозе 0,05-0,1
ТЦД50/кл, которые затем культивируют при температуре 37-38 оС в течение до
развития цитопатогенного действия в 80% и более площади монослоя.
Цитопатогенное действие вируса в таких культурах клеток проявляется на 3-4
сутки, а на 6-7 сутки вирусному поражению подвергается максимальное
количество клеток монослоя культуры. В сосудах с культурой клеток, в сроки
заражения вирусом и проявления ЦПД, заменяют питательную среду
поддерживающей. В момент максимального развития ЦПД, но без деструкции
монослоя культуры клеток, сосуды с зараженной культурой клеток подвергают
замораживанию. Культуральную суспензию после размораживания и
определения в ней титра вируса используют в качестве вирусной биомассы для
изготовления вакцинного препарата.
2.5.2 Выделение, идентификация и культивирование вируса оспы коз.
Для выделения вируса оспы коз используют патологический материал,
собранный от больных и павших коз с клиническими признаками,
характерными для оспенной болезни. Такими признаками являются узелковые
поражения кожи, которые проявляются в виде розеолы, папулы, пустулы и
везикулы. Узелковые образования или экссудативное содержимое папул
собирают в стерильную посуду, доставляют в лабораторию и подвергают
двукратному замораживанию и размораживанию при температурных значениях
минус 40оС и плюс 20-25
оС. Из узелковых образований кожи готовят 20%
суспензию на растворе Хенкса или физиологическом растворе натрия хлорида,
растирая в фарфоровой ступке с песком нейтрального стекла. Гомогенат
очищают от грубых частиц центрифугированием при 3000 g в течение 30 мин.
В надосадочную жидкость добавляют антибиотики в дозе 200 ЕД/см3
пенициллина, 200 мг/см3 стрептомицина и 50 мг/см
3 нистатина, выдерживают
при температуре 4-8 оС в течение 6 ч и затем используют для выделения вируса
заражением соответствующей чувствительной биологической модели. Такими
объектами для выделения вируса оспы коз служат козы, подобранные согласно
требованиям п.п. 2.4., культура клеток ПЯ, ТЯ-КК49.
При использовании для биологической пробы коз, суспензию испытуемого
патологического материала вводят этим животным внутрикожно в
бесшерстный участок кожи в дозе 0,5 см3. За зараженными животными ведут
клиническое наблюдение в течение не менее 14 суток с ежедневным
измерением температуры тела. В случае наличия вируса оспы коз у
зараженных животных через 3-7 суток проявляется гипертермия и кожные
поражения в виде папулезно-пустулезных образований в месте инокуляции
исследуемого патологического материала. Через 3-5 суток после проявления
гипертермии и кожных поражений в месте введения патологического
материала, в различных участках тела образуются вторичные кожные оспенные
узелки, которые свидетельствуют о генерализации оспенного процесса. В
качестве источника вируса служат оспенные узелки кожи, в которых обычно
накапливается вирус в титре до 107,25
ИД50/0,5см3.
При использовании для выделения вируса культуры клеток, суспензию
испытуемого патологического материала вводят на монослой клеток в
25
пробирках или пенициллиновых флаконах в дозе 0,1 см3. Зараженные клетки
выдерживают при температуре 37-38 оС в течение 60 мин, затем инокулят
сливают, монослой несколько кратно промывают раствором Хенкса,
содержащим антибиотики, вносят поддерживающую среду и культивируют при
температуре 37-38 оС в течение 10-12 суток. В течение указанного срока
ежедневно проводят микроскопию монослоя с целью выявления признаков
наличия оспенного вируса. О присутствии вируса свидетельствует
цитопатогенное действие, которое проявляется в монослое клеток с 4-7 суток
после инокуляции суспензии испытуемого патологического материала.
Цитопатогенное действие характеризуется округлением клеток,
формированием ими гроздевидных образований в монослое, в последующем -
разрывов между клетками, приводящих к полной деструкции монослоя клеток.
Цитопатогенное действие вируса оспы коз примерно одинаково
проявляется во всех чувствительных культурах клеток и накапливается в них от
105,0
до 106,25
ТЦД50/см3.
В случае отсутствия цитопатогенного действия вируса культуру клеток в
пробирках или флаконах подвергают двукратному замораживанию и
размораживанию, полученную культуральную суспензию вносят на монослой
свежей аналогичного вида культуры клеток. Также как и при заражении
суспензией патологического материала, свежую культуру клеток,
инокулированную исследуемой культуральной суспензией, выдерживают при
температуре 37-38 оС в течение 60 минут, инокулят заменяют на
поддерживающую питательную среду и продолжают культивирование при той
же температуре до проявления цитопатогенного действия. В случае отсутствия
ЦПД и на втором пассаже проводят аналогическим образом третий пассаж.
Отсутствие ЦПД на третьем «слепом» пассаже принимают за отсутствие
репродуктивного вируса в исследуемом образце патологического материала.
При наличии цитопатогенного действия, в каком либо пассаже, считают вирус
выделенным и проводят его идентификацию.
Идентификацию выделенного вируса проводят с помощью реакции
нейтрализации, поставленной на животных или в культуре клеток. Для этого
выделенный вирус в титре 1000 ИД50 в равных объемных соотношениях
смешивают со специфической на вирус оспы коз сывороткой, полученную
смесь выдерживают в течение 60 минут при температуре 37-38 оС и ею
инокулируют одну из культур клеток чувствительных к вирусу оспы коз или
коз, не иммунных к оспе. Параллельно вирусом в указанной дозе, но без
добавления сыворотки заражают культуру клеток и коз. За зараженной и
контрольной культурами клеток и козами ведут ежедневное наблюдение,
выявляя цитопатогенное действие или кожные узелковые поражения.
Наблюдение за монослоем зараженной культуры клеток продолжают в течение
12 суток, а за козами – 14 суток.
Вирус считают идентифицированным как вирус оспы коз в случае
отсутствия ЦПД в культуре клеток и оспенных узелков у животных,
зараженных смесью испытуемого вируса со специфической сывороткой на
вирус оспы коз, при развитии ЦПД в культуре клеток и оспенных узелков у коз,
26
инфицированных испытуемым вирусом без добавления специфической
сыворотки на вирус оспы коз.
Культивирование вируса оспы коз, в зависимости от его биологических
свойств и предназначения, проводят в организме коз и чувствительной
культуре клеток. Патогенные штаммы вируса оспы коз культивируют в
организме молодых интактных коз, а модифицированные - в одной из
чувствительных культур клеток.
Вирулентные штаммы вируса оспы коз, предназначенные для проверки
иммуногенности вакцинных препаратов, культивируют в организме козы. Для
этого, вирус вводят козам внутрикожно в дозе 0,5 см3
и наблюдают за
развитием кожного оспенного поражения. На 5-6 сутки на месте введения
возбудителя формируется отечность с покраснением, который в последующем
приобретает темно-красную окраску. За день до появления отека кожи у коз
повышается температура тела. Для получения биомассы вирулентного вируса
на 6-7 сутки, в зависимости от развития местного воспаления и температуры
тела, животное убивают, участок воспаленной кожи срезают, которую очищают
от механических примесей, дезинфицируют этиловым спиртом и подвергают
гомогенизации растиранием в ступке в смеси с песком нейтрального стекла.
Гомогенат разводят до 20% физиологическим раствором хлорида натрия с рН
7,2-7,4, центрифугируют при 3000 g в течение 30 минут, осадок удаляют, а
оставшуюся жидкость используют в качестве вируссодержащего материала.
Модифицированные штаммы вируса, предназначенные для приготовления
живых вакцин культивируют в культуре первичных клеток, полученных из
почечной и тестикулярной клеток ягнят, а штамм «ГК-35» - в пересеваемой
культуре клеток ТЯ-КК49 и линии ПО. Для этого готовят монослойную
культуру клеток соответствующего вида, высевая клетки в концентрации 200-
300 тыс. клеток/см3 в матрасы и 600-800 тыс. клеток/см
3 - в круговые сосуды,
заражают их модифицированным вакцинным штаммом вируса в дозе 0,05-0,1
ТЦД50/кл, которые затем культивируют при температуре 37-38 оС в течение до
развития цитопатогенного действия в 80% и более площади монослоя.
Цитопатогенное действие вируса в таких культурах клеток проявляется на 3-4
сутки, а на 6-7 сутки вирусному поражению подвергается максимальное
количество клеток монослоя культуры. В сосудах с культурой клеток, в сроки
заражения вирусом и проявления ЦПД, заменяют питательную среду
поддерживающей. В момент максимального развития ЦПД, но без деструкции
монослоя культуры клеток, сосуды с зараженной культурой клеток подвергают
замораживанию. Культуральную суспензию после размораживания и
определения в ней титра вируса используют в качестве вирусной биомассы для
изготовления вакцинного препарата.
2.5.3 Выделение, идентификация и культивирование вируса оспы птицы.
Для выделения вируса оспы птицы используют патологический материал,
собранный от больных и павших кур с клиническими признаками,
характерными для оспенной болезни. Такими признаками являются узелковые
поражения гребешков, сережек и кожи. Узелковые образования собирают в
стерильную посуду, доставляют в лабораторию и подвергают двукратному
27
замораживанию и размораживанию при температурных значениях минус 40оС
и плюс 20-25 оС. Из узелковых образований гребешков, сережек и кожи готовят
20% суспензию на растворе Хенкса или физиологическом растворе натрия
хлорида, растирая в фарфоровой ступке с песком нейтрального стекла.
Гомогенат очищают от грубых частиц центрифугированием при 3000 g в
течение 30 мин. В надосадочную жидкость добавляют антибиотики в дозе 200
ЕД/см3 пенициллина, 200 мг/см
3 стрептомицина и 50 мг/см
3 нистатина,
выдерживают при температуре 4-8 оС в течение 6 ч и затем используют для
выделения вируса заражением соответствующей чувствительной
биологической модели. Такими объектами для выделения вируса оспы птицы
служат цыплята старше 2-х месяцев и РКЭ, подобранные согласно требованиям
п.п. 2.4., а также культура клеток ФКЭ.
При использовании для биологической пробы кур, суспензию испытуемого
патологического материала вводят птице в дозе 0,01 см3
внутрикожно путем
прокола перепонки крыла двуигольным инъектором. За зараженными
цыплятами ведут клиническое наблюдение в течение не менее 14. В случае
наличия вируса оспы кур у зараженных цыплят через 7-9 суток проявляются
кожные поражения в виде узелковых образований в месте инокуляции
исследуемого патологического материала. Через 3-5 суток после проявления
кожных поражений в месте введения патологического материала, в различных
участках тела образуются вторичные кожные оспенные узелки и
дифтеритические наложения в гортани, которые свидетельствуют о
генерализации оспенного процесса. В качестве источника вируса служат
оспенные узелки кожи.
При использовании для выделения вируса РКЭ, суспензию испытуемого
патологического материала наносят на ХАО в дозе 0,1-0,2 см3. Для этого на
скорлупе со стороны пуги проделывают отверстие диаметром 3-4 мм,
инъекционной иглой обнажают ХАО, удаляя подскорлупную оболочку. На
вскрытую ХАО наносят заражающий исследуемый материал. Зараженные
таким образом РКЭ инкубируют при температуре 37-38 оС в течение 7 суток
определяя ежедневно состояние эмбрионов овоскопированием. Эмбрионы,
погибшие, начиная с 3-х суток после заражения, и выжившие в течение срока
инкубирования охлаждают при температуре 4-8 оС. В асептических условиях
вскрывают охлажденные эмбрионы, собирают хорион-аллантоисную оболочку,
определяют в них наличие оспенных узелков и замораживают при температуре
минус 40 оС. Вместе с ХАО собирают АЖ. Замороженные, имеющие оспенные
узелки ХАО размораживают, готовят из нее 20% гомогенат растиранием в
ступке с песком нейтрального стекла на забуференном физиологическом
растворе хлорида натрия и АЖ. Полученная таким образом суспензия ХАО на
АЖ и ЗФР, используется в качестве вирусной биомассы.
При использовании для выделения вируса культуры клеток, суспензию
испытуемого патологического материала вводят на монослой клеток в
пробирках или пенициллиновых флаконах в дозе 0,1 см3. Зараженные клетки
выдерживают при температуре 37-38 оС в течение 60 мин, затем инокулят
сливают, монослой несколько кратно промывают раствором Хенкса,
28
содержащим антибиотики, вносят поддерживающую среду и культивируют при
температуре 37-38 оС в течение 5-7 суток. В течение указанного срока
ежедневно проводят микроскопию монослоя с целью выявления признаков
наличия оспенного вируса. О присутствии вируса свидетельствует
цитопатогенное действие, которое проявляется в монослое клеток с 4-5 суток
после инокуляции суспензии испытуемого патологического материала.
Цитопатогенное действие характеризуется округлением клеток,
формированием ими очаговых образований в монослое, в последующем -
разрывов между клетками, приводящих к деструкции монослоя клеток. Вирус
оспы птицы накапливается в ФКЭ в титрах до 107,5
ТЦД50/см3 и выше.
В случае отсутствия цитопатогенного действия вируса в монослое
культуры клеток при первичном заражении, проводят дополнительно два
«слепых» пассажа с использованием свежей культуры клеток ФКЭ, так же как и
при выделении вирусов оспы овец и оспы коз. Отсутствие ЦПД на третьем
«слепом» пассаже принимают за отсутствие репродуктивного вируса в
исследуемом образце патологического материала. При наличии
цитопатогенного действия, в каком либо пассаже, считают вирус выделенным и
проводят его идентификацию.
Идентификацию выделенного вируса проводят с помощью реакции
нейтрализации, поставленной на цыплятах или РКЭ или в культуре клеток
ФКЭ. Для этого выделенный вирус в титре 1000 ИД50 в равных объемных
соотношениях смешивают со специфической на вирус оспы птицы сывороткой,
полученную смесь выдерживают в течение 60 минут при температуре 37-38 оС
и ею инокулируют одну из чувствительных биологических субстратов.
Параллельно вирусом в указанной дозе, но без добавления сыворотки заражают
цыплят или РКЭ или ФКЭ. За зараженными цыплятами ведут клиническое
наблюдение в течение 12 суток, состояние РКЭ определяют овоскопированием
в течение 7 суток, монослой ФКЭ микроскопируют в течение 6-7 суток.
Вирус считают идентифицированным как вирус оспы птицы в случае
отсутствия оспенных бляшек на ХАО РКЭ, ЦПД в культуре клеток ФКЭ и
оспенных узелков у цыплят, зараженных смесью испытуемого вируса со
специфической сывороткой на вирус оспы кур, при развитии оспенных бляшек
на ХАО РКЭ, наличии ЦПД в культуре клеток ФКЭ и оспенных узелков у
цыплят, инфицированных испытуемым вирусом без добавления специфической
сыворотки на вирус оспы кур.
Культивирование вируса оспы кур, в зависимости от его биологических
свойств и предназначения, проводят в РКЭ и культуре клеток ФКЭ. Патогенные
штаммы вируса оспы кур культивируют в РКЭ, а модифицированные - в РКЭ и
ФКЭ.
Вирулентные штаммы вируса оспы кур, предназначенные для проверки
иммуногенности вакцинных препаратов, культивируют в РКЭ. Для этого, вирус
вводят в АП РКЭ в дозе 0,3 см3
и инкубируют эмбрионы при температуре 37-38 оС в течение 7 суток. Зараженные эмбрионы ежедневно овоскопируют,
погибшие после 72 ч и выжившие после 7 суток охлаждают при температуре 4-
8 оС. Охлажденные РКЭ асептически вскрывают, собирают ХАО с оспенными
29
бляшками и АЖ. Готовят 20% суспензию ХАО на АЖ и ЗФР путем растирания
в ступке с помощью песка нейтрального стекла. Суспензию очищают
центрифугированием при 3000 g в течение 30 минут. Осадок удаляют, а
оставшуюся жидкость используют в качестве вирусной массы.
Модифицированные штаммы вируса, предназначенные для приготовления
живых вакцин, культивируют в РКЭ или культуре клеток ФКЭ, а штамм «КП-
4» - в культуре клеток ФКЭ. Для этого готовят монослойную культуру клеток
ФКЭ, высевая клетки в концентрации 200-300 тыс. клеток/см3 в матрасы и 600-
700 тыс. клеток/см3 - в круговые сосуды, или готовят суспензию клеток в
концентрации 1000-1200 тыс. клеток/см3 для культивирования в суспензионном
ферментере. Монослойную культуру клеток в матрасах и круговых сосудах, а
также суспензию клеток в ферментере заражают модифицированным
вакцинным штаммом «КП-4» вируса оспы птицы в дозе 0,05-0,1 ТЦД50/кл,
которые затем культивируют при температуре 37-38 оС в течение до развития
цитопатогенного действия в 80% и более площади монослоя и дегенерации
более 90% клеток в суспензии, культивируемой в реакторе. Цитопатогенное
действие вируса в монослойной культуре клеток проявляется на 3-4 сутки, а на
5-6 сутки дегенеративному изменению подвергается максимальное количество
клеток монослоя культуры. В сосудах с культурой клеток, в сроки заражения
вирусом и проявления ЦПД, заменяют питательную среду поддерживающей. В
момент максимального развития ЦПД, но без деструкции монослоя культуры
клеток, сосуды с зараженной культурой клеток подвергают замораживанию.
Культуральную суспензию, инкубированную с вирусом в состоянии суспензии
подвергают замораживанию при остаточном количестве живых клеток не более
20%. Культуральную суспензию после размораживания и определения в ней
титра вируса используют в качестве вирусной биомассы для изготовления
вакцинного препарата. Модифицированный штамм «КП-4» вируса оспы кур
накапливается в ФКЭ в титрах 107,5
-109,0
ТЦД50/см3.
2.6 Консервирование и хранение вирусов оспы животных и птицы.
Для консервации отбирают вирусную суспензию, свободную от
бактериального и грибкового загрязнения с биологической активностью не
ниже 105,5
ТЦД50/см3 оспы овец и оспы коз и 10
7,5 ТЦД50/см
3 вируса оспы птицы, в
которую добавляют пенициллин в дозе 100-200 ЕД/мл и стрептомицин - 100-
200 мкг/мл. Вирусную массу, не зависимо от вида, смешивают со стерильной
стабилизирующей защитной средой в равных объемных соотношениях. Смесь
тщательно перемешивают. Вируссодержащую суспензию разливают с
соблюдением правил асептики, в зависимости от потребности, по 1,0 см3
или
2,0 см3
или 4,0 см3 в стерильные ампулы по ОСТ 64-2-180-85 или флаконы по
ТУ 64-2-100-78. Ампулы/флаконы с жидкой вирусной суспензией немедленно
закрывают стерильной двухслойной марлевой салфеткой или стерильной
гигроскопической ватой. Вирусный материал в ампулах/флаконах
замораживают столбиком в низкотемпературных холодильных установках при
30
температуре минус 45-500С и выдерживают при этом температурном режиме в
течение 8-10 часов.
Камеру сублимационной установки дезинфицируют (фламбируют),
охлаждают конденсор установки до температуры минус 45-500С, быстро
загружают замороженную в ампулах/флаконах вирусную суспензию со
стабилизатором в сушильные вакуум-камеры (в течение 2-3 мин), не допуская
оттаивания биопрепарата в фасовках, и герметично закрывают крышку (дверь)
камеры. Включают вакуум-насос и в течение 15-20 минут создают вакуум до
100 микрон, который выдерживают на протяжении всего периода сушки.
Через 1-3 часа после загрузки вируса, в вакуум сушильном аппарате включают
медленный подогрев полок с повышением температуры биопрепарата на 1-20С
в час. Общая продолжительность сушки вируса около 36-48 часов, в том числе
первый период сушки (сублимация) составляет около 18-30 часов. Плюсовая
температура в вируссодержащем материале не должна превышать 250С.
Контроль над процессом сушки ведут по температурным данным биопрепарата
и давлению в сушильной камере.
После окончания высушивания в камеру впускают стерильный воздух,
пока давление в ней не уровняется с наружным.
Открыв камеру, ампулы/флаконы быстро перекладывают в вакуум-камеры,
в которых вирус содержат под вакуумом в 200-250 микрон до момента запайки
ампул и перекрытия флаконов.
Ампулы с сухим вирусом герметически запаивают в день разгрузки
аппарата на вакуумных коллекторах при вакууме не более 250 микрон (при
остаточном давлении в пределах 0,1-0,25 мм рт.ст.), а флаконы герметизируют
под аналогичным вакуумом резиновыми пробками и закатывают
алюминиевыми колпачками (ОСТ 64-009-86).
Наличие вакуума в ампулах/флаконах проверяют вакуумным
трансформатором типа Тесла или прибором Д/Арсенваля. При отсутствии
светящегося разряда или разряда с фиолетовым свечением в форме тонкого
шнура (признак отсутствия вакуума или низкий вакуум) такую ампулу или
флакон выбраковывают и уничтожают кипячением или автоклавированием.
Допускается ампулы/флаконы с вирусом герметизировать без создания в
них вакуума. При этом ампулы/флаконы заполняют инертным стерильным
газом.
Датой изготовления сухого образца вируса считается день окончания
лиофилизации.
Высушенные образцы вирусов в ампулах или флаконах, после
паспортизации биологических параметров, этикируют и хранят в опечатанных
металлических контейнерах при температуре минус 40 оС.
2.7 Освежение вирусов оспы животных и птицы.
Вирулентные штаммы вируса оспы овец и оспы коз, а также вируса оспы
птицы, консервированные лиофильной сушкой в ампулах или флаконах,
освежают на овцах, козах и РКЭ, соответственно, по той же методике, которая
31
описана в п.п. 2.5.1, 2.5.2, 2.5.3. При этом в качестве заражающего вирусного
материала, вместо суспензии патологического материала, применяют сухое
содержимое ампул или флаконов, представленное для освежения. Вирусы
второго или третьего пассажа с достаточными титрами и стерильные по
отношению бактерий и грибков используются как освеженные.
Модифицированные штаммы вирусов оспы овец и оспы коз освежают
репродукцией в культуре клеток ТЯ-КК49 или ПЯ. Для этого флаконы с
высушенными образцами вирусов, хранившиеся при минусовой температуре,
асептически вскрывают, растворяют с помощью раствора Хенкса и разводят
десятикратно этим же раствором. Полученным разведением каждого вида
вируса заражают культуру клеток в 2-3 матрасах, предварительно удалив
ростовую питательную среду. Зараженную культуру клеток инкубируют в
течение 1-2 ч при температуре 37-38 оС, сливают инокулят, наливают, свежую
поддерживающую питательную среду, содержащую 5% сыворотки крови
крупного рогатого скота, и продолжают инкубацию при той же температуре.
Наличие и репродукцию вирусов контролируют микроскопией монослоя
культуры клеток и определяют по цитопатогенному воздействию. Развитие
ЦПД принимается за наличие продуктивного вируса. В момент развития ЦПД
вируса на сравнительно максимальной площади монослоя клеток, который
наступает обычно на 5-7 сутки после заражения, матрасы с культурой клеток,
пораженной вирусом, замораживают при температуре минус 20-40 оС. Не менее
чем, через 12 ч замороженное содержимое матрасов размораживают при
комнатной температуре и проводят дополнительно еще один-два пассажа в
свежей культуре клеток, до стабилизации скорости репродукции и
концентрации вируса в единице объема. Полученный таким образом
культуральный вирус с титром цитопатогенности не менее 105,5
ТЦД50/см3,
считается освеженным и используется в дальнейшем для получения активной
биомассы вируса или для закладки свежей партии вируса на продолжительный
срок хранения.
Для освежения модифицированного штамма вируса оспы кур, высушенный
его образец, растворяют в растворе Хенкса или физиологическом растворе
хлорида натрия, разводят этим же раствором десятикратно, которым заражают
первичную культуру клеток ФКЭ. Для этого из матраса и кругового сосуда, со
сформированным монослоем клеток, сливают ростовую среду и вносят
разведенный вирус в объеме 3-5 см3. Один или два матраса или сосуда с
культурой клеток оставляют не зараженными для контроля. Адсорбция вируса
проводится в течение 1 часа при температуре 37+0,50С. После завершения
времени адсорбции вируса, в матрасы или сосуды добавляют поддерживающую
среду. Одновременно меняют среду и в контрольных сосудах с незараженной
культурой клеток. В поддерживающую культуральную среду добавляют
антибиотики из расчета по 100 ЕД пенициллина и 100 мкг стрептомицина на
100 мл среды. Зараженную культуру клеток инкубируют при температуре 37-38 оС ежедневно микроскопируя монослой на наличие, характер и интенсивность
развития ЦПД. На 3-4 сутки после заражения в монослое клеток проявляется
ЦПД, которое в течение последующих 2-3 суток развивается в 80% площади
32
монослоя. Культуру клеток с такой интенсивностью развития ЦПД
замораживают при температуре минус 40 оС в течение не менее 3 ч, затем
размораживают, устанавливают стерильность и титр вируса. Полученную
культуральную суспензию используют в качестве вирусной биомассы для
дальнейшего пассирования в свежей партии культуры клеток. Вирус
модифицированного штамма «КП-4» второго или третьего пассажей с титром
от 107,5
ТЦД50/см3 используется как освеженный.
2.8 Определение биологической активности (титра) вирусов оспы.
Инфекционную активность вирусов оспы овец, оспы коз и оспы птицы
определяют титрованием в соответствующей чувствительной монослойной
культуре клеток. Вирусы оспы овец и оспы коз титруют в культурах клеток ПЯ,
ТЯ-КК49 или ПО, ТТ, вирус оспы птицы – в ФКЭ, выращенных в
пенициллиновых флаконах или пробирках и РКЭ.
Для титрования содержимое трех ампул/флаконов с сухим вирусом
разводят стерильной поддерживающей питательной средой до первоначального
объема вируса перед сушкой, объединяют и из средней пробы готовят на той
же среде 10-кратные разведения от 10-1
до 10-9
.
При использовании для титрования культур клеток каждое разведение
вируса вносят в 4 флакона/пробирки с монослойной культурой клеток в дозе по
1,0 см3, предварительно удалив ростовую питательную среду из них, и
культивируют при температуре 37+0,5оС. Зараженную культуру клеток
микроскопируют ежедневно. Поддерживающую питательную среду во
флаконах с культурой клеток заменяют через каждые 48 ч.
Результаты титрования учитывают при каждой микроскопии по наличию
цитопатогенных изменении в культуре клеток. ЦПИ характеризуется
образованием видоизмененных (округлых, интенсивно преломляющих свет)
клеток, располагающихся одиночно или группами в виде виноградных
гроздьев, подвергающихся в последующем деструкции.
Результаты титрования вирусов оспы овец и коз устанавливают по данным
микроскопии, проведенных до 12 суток, а вируса оспы кур – до 7 суток. Титр
вирусов в культурах клеток определяют в ТЦД50.
При использовании для титрования овец и коз каждое разведение вируса
вводят внутрикожно в дозе 0,5 см3 в 4 точки на выбритую поверхность кожи
туловища и ведут за животными клиническое наблюдение в течение 7 суток,
регистрируя изменения в месте инокуляции испытуемого вируса.
На 5-7 сутки после титрования в месте введения вируса формируются
очаги тканевого отека с гиперемией, по которым проводится расчет титра
возбудителя. Вторичные оспенные узлы, которые появляются после 7 дня, не
учитываются. Титр вируса определяют в ИД50
При использовании для титрования цыплят каждое разведение вируса
вводят внутрикожно в дозе 0,01 см3 в одну точку перепонки крыла с помощью
33
двуигольного инъектора путем прокола. На каждое разведение используют 4-6
цыплят.
Учет результатов титрования проводят на 7-9 сутки после титрования по
сформированным оспенным узелкам в месте прокола крыла. Титр вируса
определяют в ИД50.
При использовании для титрования РКЭ каждое разведение вируса наносят
на ХАО 4-6 РКЭ в дозе по 0,2 см3.
Учет результатов титрования проводят на 7 сутки после титрования по
оспенным узелкам на ХАО РКЭ. Титр вируса определяют в ЭИД50.
Титр вирусов рассчитывают по методу Рида и Менча. Инфекционная
активность вируса оспы овец и оспы коз должна быть не ниже 105,0
УЕ50/см3, а
вируса оспы кур – 107,0
УЕ50/см3.
2.9 Определение патогенности и вирулентности вирусов оспы.
Патогенность и вирулентность вируса оспы овец определяют на овцах,
вируса оспы коз - на козах, а вируса оспы птицы - на цыплятах. Для этого
испытуемым вирусом заражают животных соответствующего вида путем
внутрикожного введения возбудителя и ведут клиническое наблюдение за
инфицированными животными и птицей. У овец и коз ежедневно проводят
термометрию температуры тела.
При заражении овец и коз вирусом гомологических оспенных болезней на
5-7 сутки появляются кожные поражения в местах инокуляции вирусов,
характеризующиеся плотным воспалительным отеком, которая имеет ярко
красную окраску, переходящая затем в папулезно-пустулезное образование
(Рисунок 1, 2). Пустулы переходят в везикулы, напоминая некротизирующийся
участок ткани. За сутки до появления местной кожной реакции у овец и коз
повышается температура тела, которая остается на высоком уровне до перехода
папул в пустулы. Вслед за появлением гипертермии и оспенных узлов в месте
введения вируса, болезнь принимает генерализованную форму, при которой
развиваются вторичные оспенные узлы в коже различных участков тела. В этот
период часто развивается отек головы больных животных и, вместе везикул,
образуются сухие тканевые корочки. Вследствие воспалительного поражения
слизистой оболочки носовых полостей из носовых отверстий появляются
слизисто-серозные истечения. Болезнь обычно длится несколько недель и в 30-
60% случаев заканчивается летальным исходом больного животного. Процент
летальности может достигать значений и 80-90.
Вирулентность вирусов, как меру патогенности, определяют титрованием
вируса на восприимчивых животных.
Вирулентность вирусов оспы овец и оспы коз достигает до 106,0
-107,25
ИД50/см3.
При заражении цыплят вирусом оспы птицы на 7-9 сутки в месте
внутрикожной инокуляции вируса образуются оспенные узелки. Через
несколько суток происходит генерализация оспенного процесса, и вторичные
узелки появляются в других участках тела, особенно на гребешках, сережках и
34
конечностях. Болезнь заканчивается в 20-40% случаях летальным исходом
больных цыплят.
Вирулентность вируса, определяемая титрованием на цыплятах, составляет
107,5
-108,5
ИД50/см3.
2.10 Определение антигенности вирусов оспы животных и птицы.
Антигенность вирусов оспы овец, оспы коз и оспы птицы определяют по
титрам вируснейтрализующих антител, вырабатываемых в ответ на введение
испытуемых штаммов указанных возбудителей. Для этого вирусами оспы овец,
оспы коз и оспы птицы в дозах по 103 ТЦД50 прививают двух овец, двух коз и
трех цыплят, соответственно и через 30 суток, от всех привитых собирают
пробы сыворотки крови, в которых, с помощью реакции нейтрализации
устанавливают титр вируснейтрализующих антител.
Испытуемые вирусы считаются антигенно активными в случае
формирования в организме животных и птицы, привитых ими,
противовирусных антител в титре от 1,0 log2.
Реакцию нейтрализации с вирусами оспы овец и оспы коз ставят в одной из
чувствительных культур клеток (ТЯ-КК49, ПЯ, ПО, ТТ), а с вирусом оспы
птицы в культуре ФКЭ. Для постановки реакции из каждой пробы сыворотки
крови, после предварительной термической обработки при температуре 56 оС в
течение 30 мин готовят двукратные разведения на растворе Хенкса. Затем
каждое разведение смешивают с равным объемом испытуемого вируса с титром
100 ТЦД50/0,5 см3. Смесь выдерживают в течение 60 мин при температуре 37-38
оС и каждым разведением инокулируют культуру клеток в 4-х пробирках или
флаконах. За культурами клеток наблюдают в течение 7-12 суток и
регистрируют ЦПД. Наличие ЦПД означает об отсутствии нейтрализующей
способности сыворотки, а отсутствие ЦПД – о наличии такой способности.
Наивысшее разведение сыворотки, нейтрализовавшее репродукцию вируса,
считается нейтрализующим титром сыворотки.
2.11 Определение иммуногенности вирусов оспы животных и птицы.
Иммуногенность вакцинного вируса оспы овец устанавливают на 3-х овцах
2-3 летнего возраста. Для этого, содержимое трех флаконов/ампул с вирусом
растворяют, объединяют и разводят физиологическим раствором до
биологической активности 1000 ТЦД50/см3. После тщательного перемешивания
разведенный вирус в дозе по 1,0 см3/гол вводят овцам подкожно с помощью
шприца.
Через 14 сут после прививки всех трех вакцинированных и еще трех не
привитых овец аналогичного возраста заражают вирулентным штаммом
«Казахстан-К» вируса оспы овец путем внутрикожного ведения в дозе 1000
ИД50/гол в объеме 0,5 см3 в области вентральной поверхности хвоста.
35
Учет результатов контрольного заражения проводят в течение 14 суток по
устойчивости к вирулентному вирусу оспы овец контрольных и
вакцинированных животных.
Вирус считают иммуногенным, в случае если у всех овец, привитых
модифицированным вирусом, после инфицирования вирулентным вирусом не
развиваются какие либо признаки заболевания оспой, в то время как у
контрольных – они должны развиться в полной мере.
Испытуемый модифицированный штамм «КазНИВИ» вируса оспы овец
должен быть иммуногенным.
Иммуногенность вакцинного штамма «ГК-35» вируса оспы коз определяют
также как и вакцинного вируса оспы овец, но с использованием такого же
количества и возраста коз. Из содержимого трех флаконов/ампул с вирусом
путем растворения на физиологическом растворе и объединения готовят
среднюю пробу. Среднюю пробу вируса разводят на том же растворе до
биологической активности 1000 ТЦД50/см3. Разведенный вирус в дозе по 1,0
см3/гол вводят козам подкожно.
Через 14 сут после прививки всех трех вакцинированных и еще трех не
привитых коз аналогичного возраста заражают вирулентным штаммом «Р-4»
вируса оспы коз путем внутрикожного ведения в дозе 1000 ИД50/гол в объеме 0,5
см3 в области вентральной поверхности хвоста.
Учет результатов контрольного заражения проводят в течение 14 суток по
устойчивости к вирулентному вирусу оспы коз контрольных и
вакцинированных животных.
Вирус считают иммуногенным, в случае если все привитые козы, после
заражения вирулентным вирусом не заболевают оспой, в то время как
контрольные – заболевают с характерными признаками оспы коз.
Испытуемый штамм «ГК-35» вируса оспы коз должен быть
иммуногенным.
Для определения иммуногенности штамма «КП-4» вируса оспы птицы, из
содержимого трех ампул или флаконов на физиологическом растворе хлорида
натрия готовят среднюю пробу, разводят на том же растворе до биологической
активности 100 ИД50/0,01 см3. Разведенной вакциной прививают 10 цыплят от 2-х
месячного возраста путем внутрикожной инокуляции вируса проколом
перепонки крыла с помощью двуигольного инъектора. Через 12 суток всех
привитых испытуемым штаммом вируса и 10 аналогичных цыплят, не
привитых вирусом, заражают вирулентным штаммом «К» вируса оспы птицы.
Вирулентный вирус вводят также как и аттенуированный внутрикожно в дозе
по 1000 ИД50/0,01 см3. За зараженными цыплятами ведут наблюдение в течение 14
суток. Об иммуногенности судят по результатам заражения цыплят
вирулентным вирусом. Вирус считается иммуногенным, если у привитых
цыплят после заражения вирулентным вирусом в месте введения возбудителя и
в общем состоянии не проявятся какие либо патологии, при развитии оспенных
узелков в месте введения вируса у контрольных цыплят.
Испытуемый штамм «КП-4» вируса оспы птицы должен быть
иммуногенным.
36
ЗАКЛЮЧЕНИЕ
Разработанные методические указания предназначены для руководства при
проведении работ по выделению, идентификации, культивированию и
длительному хранению, а также освежению полевых популяций, лабораторных
и производственных штаммов вирусов оспы овец, оспы коз и оспы птицы. В
документе приведены методы обработки и контроля качества лабораторной
посуды, методы приготовления и рецептура необходимых солевых растворов,
питательных и защитных сред, методы получения и приготовления
биологических субстратов для выделения, культивирования, освежения и
титрования вирусов оспы, методы определения и оценки патогенности,
вирулентности, антигенности, иммуногенности указанных видов вирусов.
Приведенные в документе методические правила и строгое соблюдение их
при работе с вирусами оспы даст возможность изолировать и
идентифицировать полевой возбудитель этой болезни, культивировать и
получать активную биомассу, а также поддерживать его в репродуктивном
состоянии длительное время в условиях лаборатории. Методические указания
могут являться руководством при получении производственных штаммов,
изготовлении вакцинных и диагностических препаратов, используемых при
диагностике и профилактике оспенных болезней животных и птицы.
Данные методические указания составлены на основе результатов
собственных исследований авторов.
37
СПИСОК ИСПОЛЬЗОВАННОЙ ЛИТЕРАТУРЫ
1 Кутумбетов Л.Б., Курченко Ф.П., Иванющенков В.Н., Уфимцев К.П.
Эффективность сухой культуральной вирусвакцины из штамма «НИСХИ»
против оспы овец. Журнал Ветеринария. № 10, 1994, - С.111-113.
2 Кутумбетов Л.Б., Кульбаева К.Р. Способ получения биомассы вируса
оспы овец из штамма «НИСХИ». Авторское свидетельство РК №25167, от
07.11.1997.
3 Кутумбетов Л.Б., Кульбаева К.Р., Майхин К.Т. Способ культивирования
вируса оспы овец. Авторское свидетельство РК №24863, от 07.11.1997.
4 Кульбаева К.Р. Разработка технологии приготовления пылевидной
вирусвакцины из штамма «НИСХИ» для аэрозольной иммунизации овец
против оспы//Автореф. дисс. .. канд.вет.наук. Алматы, 1997, 27 с.
5 Майхин К.Т. Технология изготовления вакцины против оспы овец из
аттенуированного штамма с использованием перевиваемой культуры
клеток//Дисс…. канд.вет.наук, Алматы, 2003, 97 с.
6 Кутумбетов Л.Б., Абдураимов Е.О., Мамбеталиев М. Изучение свойств
вируса оспы коз в клеточных культурах. Журнал Биотехнология. Теория и
практика. №1-2 (5-6) 1998 г. - С. 9-11.
7 Кутумбетов Л.Б., Майхин К.Т. Штамм вируса оспы овец «VO-98» для
изготовления инактивированной вакцины против оспы овец. Авторское
свидетельство РК №25168, от 07.05.1998.
8 Кутумбетов Л.Б., Майхин К.Т. Чувствительность различных
перевиваемых культур клеток к вирусу оспы овец. Материалы научной
конференции молодых ученых КазНИВИ «Инфекционные и паразитарные
болезни сельскохозяйственных животных», Алматы,1999 г. - С. 157-162.
9 Кутумбетов Л.Б. Штамм вируса Variola caprina «VCP-97/G7»,
используемый для изготовления культуральной вакцины против оспы коз.
Авторское свидетельство РК №9518, от 31.05.1999.
10 Кутумбетов Л.Б., Майхин К.Т., Кульбаева К.Р. Репродукция вируса
оспы овец в культуре клеток перевиваемой линии почки эмбриона овцы.
Материалы международной научно-практической конференции «Роль
ветеринарной науки в развитии животноводства», посвященной 75-летию
КазНИВИ, Алматы, 2000 г. - С. 131-133.
11 Корпусова Т.И., Кутумбетов Л.Б., Куляшбекова Ш.К., Зиновьева М.С.
Культивирование аттенуированного вируса оспы овец штамма «ВНИИЗЖ» в
культуре клеток гонад козы роллерным методом. Материалы международной
научно-практической конференции «Роль ветеринарной науки в развитии
животноводства», посвященной 75-летию КазНИВИ, Алматы, 2000 г. - С. 128-
129.
12 Корпусова Т.И., Кутумбетов Л.Б., Манин Б.Л., Михалишин В.В.
Исследование перевиваемой культуры клеток гонад козы при культивировании
вирусов животных. Материалы международной научно-практической
конференции «Роль ветеринарной науки в развитии животноводства»,
посвященной 75-летию КазНИВИ, Алматы, 2000 г. - С. 121-122.
38
13 Кутумбетов Л.Б., Корпусова Т.И., Манин Б.Л., Михалишин В.В.
Чувствительность перевиваемой линии клеток гонад козы к вирусу оспы птиц.
Материалы международной научно-практической конференции «Роль
ветеринарной науки в развитии животноводства», посвященной 75-летию
КазНИВИ, Алматы, 2000 г. - С. 130-131.
14 Кутумбетов Л.Б., Корпусова Т.И., Манин Б.Л., Михалишин В.В.
Роллерный метод культивирования вируса оспы птиц. Материалы
международной научно-практической конференции «Роль ветеринарной науки
в развитии животноводства», посвященной 75-летию КазНИВИ, Алматы, 2000
г. - С. 119-120.
15 Кутумбетов Л.Б., Кульбаева К.Р., Майхин К.Т. Способ культивирования
вируса Variola ovina. Авторское свидетельство РК №8413, от 05.6.1998. Бюлл.
№1, 14.1.2000 г.
16 Кутумбетов Л.Б., Кульбаева К.Р., Майхин К.Т. Штамм вируса Variola
ovina «КазНИВИ» для изготовления культуральной вакцины против оспы овец.
Авторское свидетельство РК №9442, от 11.3.1999. Бюлл. №9, 15.9.2000 г.
17 Кутумбетов Л.Б., Зиновьева М.С., Корчагина Н.И. Цитопатогенная
активность клона Г-35 вируса оспы коз в культуре клеток гонад козы.
Материалы конференции молодых ученых «Актуальные проблемы патологии
свиней, крупного и мелкого рогатого скота», Владимир, 2002 г. - С. 7-12.
18 Кутумбетов Л.Б., Назаров А.С., Хлебопашникова С.В. Результаты
изучения антигенного родства между вирусами оспы овец и оспы коз.
Материалы международной научно-практической конференции «Актуальные
проблемы ветеринарной медицины Восточной Сибири», посвященной 70-
летию Иркутской НИВС. РАСХН. Иркутск, 2002 г. - С.80-81.
19 Кутумбетов Л.Б., Корпусова Т.И.,Зиновьева М.С. Результаты
культивирования вируса оспы птиц в перевиваемой культуре клеток ВНК-21.
Материалы международной научно-практической конференции «Биолого-
экологические проблемы заразных болезней диких животных и их роль в
патологии сельскохозяйственных животных и людей» РАСХН ВНИИВВиМ.
Покров, 2002 г. - С. 301-303.
20 Кутумбетов Л.Б., Корпусова Т.И., Манин Б.Л., Зиновьева М.С.,
Михалишин В.В. Получение и использование стабильного производственного
трофоварианта клеток гонад козы для вирусологических исследований.
Материалы международной научно-практической конференции «Биолого-
экологические проблемы заразных болезней диких животных и их роль в
патологии сельскохозяйственных животных и людей» РАСХН. ВНИИВВиМ.
Покров, 2002 г. - С. 290-293.
21 Кутумбетов Л.Б., Ковалишина Н.И.,Корпусова Т.И.,Бочарников А.В.
Культивирование вируса оспы птиц. Материалы межведомственного
тематического научного сборника Ветеринарная медицина Академии Аграрной
науки Украины. Харьков, 2002 г. - С.355-359.
22 Кутумбетов Л.Б., Зиновьева М.С., Хлебопашникова С.В., Ковалишина
Н.И. Патогенность и иммуногенность вирусов оспы овец и оспы коз на
гетеровидовых животных. Материалы межведомственного тематического
39
научного сборника Ветеринарная медицина Академии Аграрной науки
Украины. Харьков, 2002 г. - С. 359-361.
23 Кутумбетов Л.Б., Майхин К.Т. Клонирование и адаптация вируса оспы
овец из штамма «НИСХИ» к перевиваемой линии культуры клеток. Материалы
5-ой Международной научно-практической конференции «Научное
обеспечение устойчивого развития агропромышленного комплекса Республики
Казахстан, Сибири, Монголии и Республики Беларусь», Абакан, 2002 г. – С.
242-243.
24 Кутумбетов Л.Б., Майхин К.Т., Маманова С.Б. Репродукция вируса
оспы овец из штамма «КазНИВИ» в перевиваемой культуре клеток. Материалы
5-ой Международной научно-практической конференции «Научное
обеспечение устойчивого развития агропромышленного комплекса Республики
Казахстан, Сибири, Монголии и Республики Беларусь» Абакан, 2002 г. - С. 243-
244.
25 Кутумбетов Л.Б., Майхин К.Т., Абеуов Х.Б. Культивирование вируса
оспы овец в перевиваемых культурах клеток с различной пролиферативной
активностью. Материалы научно-практической конференции «Состояние и
перспективы аграрной науки Казахстана и Западной Сибири» Петропавловск,
2003 г. – С. 251-257.
26 Кутумбетов Л.Б., Кульбаева К.Р., Назаров А.С. Патогенность вируса
оспы коз. Материалы международной научно-практической конференции
«Актуальные проблемы болезней животных в современных условиях» МСХ
РТ. Таджикский НИВИ. Душанбе, 2003 г. - С. 40-42.
27 Кутумбетов Л.Б., Майхин К.Т. Получение и цитопатогенная активность
клонового вируса оспы овец из модифицированного штамма «НИСХИ»,
Сборник научных трудов «Современные меры борьбы с инфекционными и
инвазионными болезнями сельскохозяйственных животных в Казахстане», ДГП
«НИВИ», Алматы, 2003 г. - С.91-95
28 Кутумбетов Л.Б., Кульбаева К.Р. Методические указания по
культивированию вируса оспы овец. Алматы, 2005 г. – 35 с.
29 Кутумбетов Л.Б. Оценка методов установления биологической
активности вируса оспы птиц. Вестник науки Казахского агротехнического
университета имени С.Сейфуллина. Астана, 2008. -№2 (49). – С. 132-137.
30 Кутумбетов Л.Б. Количественная оценка вирусов оспы овец и оспы коз.
Сборник научных трудов КазНИВИ «Теория и практика борьбы с болезнями
животных в Казахстане». Алматы, 2008. Т. LIV. – С. 259-263. Библ.14.
31 Кутумбетов Л.Б. Технологические параметры культивирования
клоновой популяции модифицированного вируса оспы коз. Вестник науки
Казахского агротехнического университета имени С.Сейфуллина. Астана, 2008.
-№3 (50). – С. 157-162.
32 Кутумбетов Л.Б. Репродуктивная активность вируса оспы птиц в
фибробластах куриных эмбрионов при использовании различных
технологических параметров культивирования. Сборник научных трудов
КазНИВИ «Теория и практика борьбы с болезнями животных в Казахстане».
Алматы, 2008. –Т. LIV. – С. 268-272.
40
33 Кутумбетов Л.Б. Способ получения биомассы вируса оспы кур для
изготовления вакцины. Авторское свидетельство РК №21434 от 03.06.2008 г.
34 Кутумбетов Л.Б. Иммуногенность вакцины против оспы птиц
культуральной живой сухой. Материалы международной конференции,
посвященной 80-летию Самарской НИВС Россельхозакадемии. Самара, 2009 г.
- С.256-260.
35 Кутумбетов Л.Б. Технологические основы изготовления вакцины
ассоциированной против оспы и инфекционного энцефаломиелита птиц.
Материалы международной научно-практической конференции «Высшее
образование и аграрная наука – сельскому хозяйству». Семей-Казахстан, 2009 г.
Т.1. – С. 87-90.
36 Кутумбетов Л.Б. Сохраняемость вируса оспы. Результаты.
Исследования. КазНАУ, №1, 2010 г.
37 Кутумбетов Л.Б. Чувствительность к вирусам оспы первичных культур
клеток, полученных из органов животных доноров с разным иммунным
статусом по отношению к указанным возбудителям. Гигиена, эпидемиология и
иммунобиология, №1, 2010 г.
38 Кутумбетов Л.Б. Ассоциированная живая сухая вакцина против оспы
овец и оспы коз. Вестник сельскохозяйственной науки, №5, 2010 г.
39 Кутумбетов Л.Б. Изменчивость вирусов оспы. Вестник науки
Семипалатинского Государственного Университета им. Шакарима №2, 2010 г.
40 Кутумбетов Л.Б. Биологические свойства эпизоотических полевых
изолятов вируса оспы овец. Вестник науки КазНУ имени Аль-Фараби, серия
биологическая, №3, 2010 г.
41 Кутумбетов Л.Б., Мырзахметова Б.Ш. Выделение вируса оспы коз из
организма больных овец. Материалы Республиканской научно-практической
конференции молодых ученых «Вклад молодых ученых в развитие сельского
хозяйства Республики» г.Ташкент. 2010 г.
41
ПРИЛОЖЕНИЯ
42
Рис. 1 – Оспенные узелки в месте введения вируса оспы коз.
Примечание: Цифрами показаны места внутрикожного введения
десятикратных разведений штамма «Р-4» вируса оспы коз, на выбритой
поверхности кожи козы. Цифры «1,2,3» обозначают последовательные
десятикратные разведения вируса. Стрелками показаны оспенные узелки,
развившиеся вторично (после генерализации оспенного процесса).
43
Рис. 2 – Оспенные узелки в месте введения вируса оспы коз.
Примечание: Цифрами показаны места первичного внутрикожного
введения десятикратных разведений штамма «Р-4» вируса оспы коз, на
выбритую поверхность кожи козы. Цифры «4,5,6,7» обозначают
последовательные десятикратные разведения вируса.
44
Рис. 3 – Монослой культуры клеток ТЯ-КК49.
45
Рис. 4 – Монослой культуры клеток ФКЭ.