ΕΦΑΡΜΟΣΜΕΝΗ ΜΟΡΙΑΚΗ ΒΙΟΛΟΓΙΑ

ΜΑΘΗΜΑ 3&4

ΡΑΜΠΙΑΣ ΘΕΟΔΩΡΟΣ

ΕΦΑΡΜΟΣΜΕΝΗ ΜΟΡΙΑΚΗ ΒΙΟΛΟΓΙΑ

• Η Μοριακή Βιολογία, προϊόν της σύζευξης της Βιοχημείας με τη Γενετική παρέχει μια σειρά μεθόδων με ευρεία εφαρμογή σε όλες σχεδόν τις ιατρικές ειδικότητες και ιδιαίτερα στα λοιμώδη νοσήματα, τα κληρονομούμενα νοσήματα, τον καρκίνο κ.λ.π.

Ενότητες• Απομόνωση DNA, RNA• Ηλεκτοφόρηση σε πήκτωμα αγαρόζης• Περιοριστικά ένζυμα• Αλυσιδωτή αντίδραση πολυμεράσης • Κλωνοποίηση, τεχνολογία ανασυδιασμένου DNA• Παραγωγή ανασυνδιασμένων πρωτεινών• Εφαρμογές της αλυσιδωτής αντίδρασης πολυμεράσης• Αλληλούχιση DNA μορίων (Sanger Sequencing)• BLAST και εργαλεία στοίχισης DNA αλληλουχιών • Εισαγωγή γονιδίων σε ευκαρυωτικά κύτταρα• Σύνθεση cDNA μορίων• Ποσοτική αλυσιδωτή αντίδραση πολυμεράσης (qPCR, qRT-PCR)• Μικροσυστοιχίες γονιδίων (Microarrays)• Deep sequencing• Δημιουργία διαγονιδιακών ζώων

ΑΠΟΜΟΝΩΣΗ ΝΟΥΚΛΕΙΝΙΚΩΝ ΟΞΕΩΝ (DNA, RNA)

28S

18S

ΑΠΟΜΟΝΩΣΗ RNA

ΑΠΟΜΟΝΩΣΗ ΟΛΙΚΟΥ RNA ΜΕ ΧΡΗΣΗ ΚΟΛΩΝΩΝ ΦΥΓΟΚΕΝΤΡΗΣΗΣ

ΑΠΟΜΟΝΩΣΗ ΓΕΝΟΜΙΚΟΥ DNA

A B

ΙΟΝΤΟΑΝΤΑΛΛΑΚΤΙΚΕΣ ΡΗΤΙΝΕΣ ΑΠΟΜΟΝΩΣΗΣ DNA

ΙΟΝΤΟΑΝΤΑΛΛΑΚΤΙΚΕΣ ΡΗΤΙΝΕΣ ΑΠΟΜΟΝΩΣΗΣ DNA

ΕΛΕΓΧΟΣ ΠΟΙΟΤΗΤΑΣ ΑΠΟΜΟΝΩΜΕΝΟΥ DNA 1/2

ΕΛΕΓΧΟΣ ΠΟΙΟΤΗΤΑΣ ΑΠΟΜΟΝΩΜΕΝΟΥ DNA 2/3

ΕΛΕΓΧΟΣ ΠΟΙΟΤΗΤΑΣ ΑΠΟΜΟΝΩΜΕΝΟΥ DNA 3/3

Αλυσιδωτή Αντίδραση Πολυμεράσης (PCR)

• Η αλυσιδωτή αντίδραση πολυμεράσης είναι μέθοδος παραγωγής μεγάλου αριθμού αντιγράφων συγκεκριμένων μικρών αλληλουχιών DNA – λογαριθμική αύξηση

PCR: 1985, Βραβείο Nobel για τον Kary Mullis in 1993

Αναλώσιμα

+ MgCl2

+ Buffer διάλυμα

+ dNTPs

+ Taq polymerase

+ εκκινητές

ηλεκτροφόρηση

χρησιμοποιείται ένα ζεύγος εκκινητών

(primers) που έχουν συμπληρωματική

αλληλουχία με τα άκρα του DNA στόχου

Ένας χώρος χρήση θαλάμων βιολογικής ασφάλειας, χρήση απολυμαντικών και UV•Όχι σε χώρο καλλιεργειών μικροοργανισμών!•Χρονικός χωρισμός!

Αλυσιδωτή Αντίδραση Πολυμεράσης (PCR)

• Βασίζεται στην ιδιότητα των αλυσίδων του DNA α) να αποχωρίζονται σε υψηλή θερμοκρασία και να επανενώ νονται σε χαμηλότερη θερμοκρασία και β) να αντιγράφονται

• Παράγονται εκατομμύρια αντιγράφων

PCR απαιτούνται:

• Magnesium chloride: .5-2.5mM

• Buffer: pH 8.3-8.8

• dNTPs: 20-200µM

• Primers: 0.1-0.5µM

• DNA Polymerase: 1-2.5 units

• Target DNA: 1–10 μg/ml

ΕΚΚΙΝΗΤΕΣ (PRIMERS)

Εκκινητές : 20-30 νουκλεοτίδια GC = 40-6-% ομοιογενώς κατανεμημένα.

Περίπου 104 αντίγραφα DNA απαιτούνται για την ανίχνευση προϊόντος PCR μετά από 25-30 κύκλους αντίδρασης... 1–10 μg/ml DNA.

… ↑ DNA + αριθμοί κύκλων ↓ ειδικότητα εκκινητή

Τm Wallace formula: Tm = 4x (#C+#G) + 2x (#A+#T) °C

ΜgCl 2 απαραίτητο για την Taq polymerase!!!

Κινητική της αντίδρασης της PCR

ΒΕΛΤΙΣΤΟΠΟΙΗΣΗ ΜΕΘΟΔΩΝ PCR

Αντιδραστήρια PCR

συγκέντρωση Mg++

συγκεντρώσεις εκκινητών που επιδρούν στην ευαισθησία και ειδικότητα

θερμοκρασίες πρόσδεσης –(annealing)

Βελτιστοποίηση της συγκέντρωσης MgCl2 στην PCR.

•Εφαρμογή της μεθόδου χρησιμοποιώντας διαφορετικές συγκεντρώσεις MgCl2 οι οποίες κυμαίνονταν από 1 mM ως και 3mM

Βελτιστοποίηση της συγκέντρωσης των εκκινητών•Stock of primers: 100pmol/μl•Υποδιπλάσιες αραιώσεις:

50pmol/μl, 25pmol/μl, 12,5pmol/μl,6,25pmol/μl και 3,125pmol/μlγια κάθε έναν από τους εκκινητές.

Βελτιστοποίηση της συγκέντρωσης των εκκινητών

Π.χ.

Βελτιστοποίηση της θερμοκρασίας για την πρόσδεση των εκκινητών

•Εφαρμογή της μεθόδου σε εύρος θερμοκρασιών 42-57,5ºC

Π.χ.

Εφαρμογές PCR

• Ανίχνευση DNA και RNA με τεράστια ευαισθησία ανίχνευση ιών κ.α. μικροοργανισμών σε πολύ μικρές συγκεντρώσεις

• Ανίχνευση μεταλλάξεων