สวพ.

มทร.ส

วรรณภ

ม

รายงานการวจย

การศกษาการสรางฮอรโมนออกซน และการตรงไนโตรเจน

โดยเชออะโซโตแบคเตอร

The Study of Auxin Production and Nitrogen Fixation by

Azotobacter

ผวจย

นางสาวอรณ คงสอน

สาขาวชาพชศาสตร คณะเทคโนโลยการเกษตรและอตสาหกรรมเกษตร

มหาวทยาลยเทคโนโลยราชมงคลสวรรณภม

งบประมาณกองทนสงเสรมงานวจยป 2556

สวพ.

มทร.ส

วรรณภ

ม

สารบญ

หนา

สารบญ (1)

สารบญตาราง (2)

สารบญภาพ (3)

บทนา 2

วตถประสงค 2

งานวจยทเกยวของ 3

วธการดาเนนการวจย 14

ผลและวจารณ 16

สรปผลการทดลอง 20

เอกสารและสงอางอง

ภาคผนวก

ภาพผนวก

21

23

26

(1)

สวพ.

มทร.ส

วรรณภ

ม

สารบญตาราง

ตารางท หนา

1 ตวอยางเชออะโซโตแบคเตอรแบงตามพนทเกบตวอยางดน 17

2 ปรมาณการตรงไนโตรเจนของเชออะโซโตแบคเตอรทเวลา 7 วน 18

3 ปรมาณการสรางออกซนของเชออะโซโตแบคเตอรทเวลา 3 วน 19

(2)

สวพ.

มทร.ส

วรรณภ

ม

สารบญภาพ

ภาพท หนา

1 การแยกเชอ, ลกษณะของโคโลน, ลกษณะทางสณฐานวทยาของเซลล และการสราง

เมดสของเชออะโซโตแบคเตอรทแยกไดจากพนทเกษตร จ. พระนครศรอยธยา

16

ภาพผนวกท

1

2

การเตรยมแกสอะเซทธลน

การวเคราะหฮอรโมนออกซน

27

27

(3)

สวพ.

มทร.ส

วรรณภ

ม

1

รายงานการวจย

การศกษาการสรางฮอรโมนออกซน และการตรงไนโตรเจน โดยเชออะโซโตแบคเตอร

The Study of Auxin Production and Nitrogen Fixation by Azotobacter

อรณ คงสอน1

Arunee Kongsorn1

บทคดยอ

จากการศกษาการสรางฮอรโมนออกซน และการตรงไนโตรเจน โดยเชออะโซโตแบคเตอร

ดวยการเกบตวอยางดน (composite sampling) ทความลก 15 เซนตเมตร ในพนทเกษตรจงหวด

พระนครศรอยธยา (16 ตวอยาง ) ซงสามารถแยกเปนเชออะโซโตแบคเตอรบรสทธได 16 ไอโซเลต

ทดสอบประสทธภาพการตรงไนโตรเจนของเชออะโซโตแบคเตอร ดวยวธ acetylene reduction

โดยวางแผนการทดลองแบบสมตลอด (Completely Randomized Design, CRD) จานวน 4 ซา

พบวาเชออะโซโตแบคเตอรทสามารถตรงไนโตรเจนไดสงทสดจานวน 10 ไอโซเลต คอ A1, A2, A3,

A4, A5, A6, A7, A8, A9 และ A10 สามารถตรงไนโตรเจนไดหลงการเลยงเชอ 3 วน เทากบ 0.94

0.98 0.98 0.98 0.97 0.96 0.98 0.99 0.96 และ 0.99 mg N/hr ตามลาดบ และเชออะโซโตแบค-

เตอรไอโซเลต A10 สามารถสรางฮอรโมนออกซนไดสงทสด รองลงมาคอไอโซเลต A4 และ A8

สามารถสรางฮอรโมนออกซนได 35.00 20.48 และ 19.76 mg/ml ตามลาดบ

คาสาคญ : อะโซโตแบคเตอร การตรงไนโตรเจน ออกซน

Abstract

The study of auxin production and nitrogen fixation by azotobacter was used

by soil composite sampling of 15 cm of soil depth from plantation area in Phra

Nakhon Si Ayutthaya province (16 example). The efficiency of 16 azotobacters

isolates was used as Completely Randomized Design (CRD) four replicates on

nitrogen fixation by acetylene reduction. Ten of sixteen isolates are the base of

nitrogen fixing as A1, A2, A3, A4, A5, A6, A7, A8, A9 and A10. The nitrogen fixation at 3

day after incubation are 0.98 0.98 0.98 0.97 0.96 0.98 0.99 0.96 and 0.99 mg N/hr

respectively. Three isolate are the base of auxin production as A10 A4 and A8 (35.00

20.48 and 19.76 mg/ml) respectively.

สวพ.

มทร.ส

วรรณภ

ม

2

Key Word : Azotobacter, Nitrogen fixation, Auxin

1 สาขาวชาพชศาสตร คณะเทคโนโลยการเกษตรและอตสาหกรรมเกษตร มหาวทยาลยเทคโนโลยราชมงคลสวรรณภม อยธยา 1 Department of Plant Science, Faculty of Agriculture and Agro- Industry, Rajamangala University of

Technology Suvarnabhumi, Ayutthaya

บทนา

เชอจลนทรยหลายชนดมความสามารถตรงไนโตรเจนได โดยกระบวนการตรงไนโตรเจน

(nitrogen fixation) จากอากาศซงอยในรปแกสไนโตรเจนเปลยนเปนสารประกอบอนทรยโดยใช

เอนไซมไนโตรจเนส (nitrogenase) อะโซโตแบคเตอรเปนจลนทรยทอยอยางอสระในดน สามารถตรง

ไนโตรเจนได 10-20 กโลกรมไนโตรเจนตอเฮกแตรตอฤดปลก (Esmaeil et. al., 2008) ไนโตรเจน

เปนธาตทสาคญและจาเปนตอการเจรญเตบโตของพช เพราะเปนองคประกอบสาคญของกรดอะมโน

โปรตน นวคลโอไทด โดยโปรตนเปนสวนประกอบทสาคญทสดของโปรโตพลาสซมและคลอโรฟลล

และภายในคลอโรพลาสตมไนโตรเจนเปนองคประกอบประมาณ 70 เปอรเซนต (Stocking and

Ongum, 1962) และมความสาคญตอบทบาทของผลผลตและคณภาพในแตละฤดปลกอกดวย

(Sisson et al., 1991; Gastal and Lemaire, 2002; Wang et al., 2000) จากรายงานของ

Brown (1964) เกยวกบการคลกเชออะโซโตแบคเตอรใหกบดนทปลกผกและธญพช สงผลใหผลผลต

เพมขนโดยเฉลย 11 เปอรเซนต Ridvan (2008) พบวา A. chroococcum มผลสงเสรมผลผลต และ

ความเขมขนไนโตรเจนของขาวสาล ไดดกวาการไมใสเชอ เหมอนกบผลการศกษาของ Pandey et

al. (1998) พบวาการใสเชออะโซโตแบคเตอร สามารถเพมเมลด สของเมลด และความเขมขนของ

ไนโตรเจนไดเชนเดยวกน ซงเชออะโซโตแบคเตอรจดเปนปยชวภาพอกชนดหนงสาหรบการเกษตร

ปจจบน ทสามารถนามาประยกตใชในการจดการปยเพอลดตนทนในดานการใชปยเคมลง

วตถประสงค

เพอศกษาเปรยบเทยบประสทธภาพการตรงไนโตรเจน และการสรางฮอรโมนออกซนของเชอ

อะโซโตแบคเตอรไอโซเลตตางๆ ทไดจากพนทเกษตรของจงหวดพระนครศรอยธยา

สวพ.

มทร.ส

วรรณภ

ม

3

งานวจยทเกยวของ

1. ไนโตรเจน

ไนโตรเจนเปนธาตทสาคญสาหรบสงมชวต เปนองคประกอบของกรดอะมโน โปรตน กรด

นวคลอก คอโรฟลล และสารทมไนโตรเจนเปนองคประกอบอน ๆ สงมชวตไมสามารถเจรญเตบโตได

ถาขาดธาตไนโตรเจน (ยงยทธ, 2546) แหลงสะสมไนโตรเจนในชนบรรยากาศ มกาซไนโตรเจน (N2)

อยมากถง 78% ซงพชและสตวไมสามารถนามาใชประโยชนได ไนโตรเจนจะเขาสระบบของสงมชวต

ไดโดยกาซไนโตรเจนจากชนบรรยากาศถกแบคทเรยตรงไนโตรเจน (Nitrogen-fixing bacteria)

เปลยนกาซไนโตรเจนใหอยในรปของแอมโมเนย โดยกระบวนการตรงไนโตรเจน (Nitrogen fixation)

ซงแอมโมเนยทเกดขนนพชสามารถนาไปใชไดโดยตรง หรอละลายนารวมกบไฮโดรเจนไอออน

กลายเปนแอมโมเนยมไอออน ซงแบคทเรยและพชสามารถนาไปใชในการสงเคราะหกรดอะมโน สราง

โปรตนได แบคทเรยพวกไนตรฟายอง (Nitrifying bacteria) ซงไดพลงงานจาการออกซไดส

แอมโมเนย กจะเปลยนแอมโมเนยไปเปนไนไตรตและเปลยนไนไตรตไปเปนไนเทรต โดยกระบวนการ

ไนตรฟเคชน (Nitrification) พชจะดดซมไนเทรตไปใช สตวไดรบไนโตรเจนโดยการกนพชและสตว

อนๆ ผานทางสายใยอาหาร (Food web) สงขบถายของเสยจากสตว พชสตวและจลนทรยทตายลง

กจะมจลนทรยมาทาหนาทยอยสลายของเสย ซากพช ซากสตว และซากจลนทรย โปรตนจะถกยอย

สลาย และปลดปลอยไนโตรเจน ออกมาในรปของแอมโมเนย และยงมแบคทเรยพวกดไนตรฟายอง

(Denitrification bacteria) ซงจะรดวซไนเทรตไปเปนกาซไนโตรเจนกลบคนสชนบรรยากาศวฏจกร

ไนโตรเจนกสมบรณ (กญญา, 2544)

1.1 การตรงกาซไนโตรเจน

1.1.1 การตรงไนโตรเจนทไมใชขบวนการทางชวภาพ เชน ฟาแลบ (Lightning) ทาให

เกดสารประกอบออกไซดของไนโตรเจน การเผาไหมนามนเชอเพลง และฝนจะชะลางสารประกอบ

ออกไซดของไนโตรเจนเหลานลงสดนในรปไนเตรท ในอตสาหกรรมการผลตปย โดยกระบวนการ

Haber-Bosch Process ขบวนการนเปนการนากาซไนโตรเจนไปทาปฏกรยากบกาซไฮโดรเจน เกด

ผลลพธเปนแอมโมเนย (ธงชย, 2546)

1.1.2 การตรงไนโตรเจนทางชวภาพ (Biological nitrogen fixation) เปนกระบวนการ

รดวสกาซไนโตรเจนใหเกดแอมโมเนยโดยเอนไซมไนโตรจเนส (nitrogenase) กระบวนการนเกดใน

สวพ.

มทร.ส

วรรณภ

ม

4

ปมรากถว หรอในโครงสรางพเศษทแบคทเรยสรางขนมาเพอควบคมปรมาณออกซเจนไมใหรบกวน

กระบวนการทางานของเอนไซมไนโตรจเนส (nitrogenase) และบงคบใหเกดสภาพรดกชน แตตองม

ออกซเจนอยในระดบพอเพยงตอการหายใจของจลนทรยในแตละปประมาณวา การตรงไนโตรเจน

ทางชวภาพเกดขนมากกวา 2 เทาของการตรงไนโตรเจนทไมใชทางชวภาพ (ธงชย, 2546)

1.2 การตรงไนโตรเจนทางชวภาพ

การตรงไนโตรเจนทางชวภาพทเกดจากสงมชวตเกดขนประมาณ 175 x 10 6 เมตรกตน

ตอป คดเปนประมาณ 60 % ของการตรงไนโตรเจนโดยสงมชวตนน พบเฉพาะในกลมของจลนทรย

จลนทรยบางชนดตรงไนโตรเจนไดเฉพาะเมออยรวมกบพชชนสง การตรงไนโตรเจนจากอากาศโดย

จลนทรยแบงไดเปน 2 ประเภท คอ การตรงไนโตรเจนโดยจลนทรยทเจรญอยอยางอสระในธรรมชาต

(Free living หรอ Non-Symbiosis Nitrogen Fixation) และการตรงไนโตรเจนโดยจลนทรยทเจรญ

อยรวมกบสงมชวตชนดอน (Symbiotic Nitrogen Fixation)

1.2.1 การตรงไนโตรเจนโดยจลนทรยทเจรญอยอยางอสระในธรรมชาต (Free living

หรอ Non-symbiotic Nitrogen Fixation) เปนการตรงไนโตรเจนโดยจลนทรยทอาศยอยอยาง

อสระในดน ในนา บรเวณใบ (Phyllosphere) และในบรเวณรากพช (Rhizophere) พบในแบคทเรย

และไซยาโนแบคทเรย ทงพวกแบคทเรย ทตองการออกซเจน (Aerobe) ตองการออกซเจนตา

(Facultative Anaerobe) และไมตองการออกซเจน (Anaerobe) โดยไดพลงงานจากสารอนทรย สา

รอนนทรย หรอจากแสงโดยตรง (Tate, 2000) จลนทรยอสระทตรงไนโตรเจนได เชน Azotobacter,

Azospirillum, Anabaena และ Thiobacillus เปนตน

1.2.2 การตรงไนโตรเจนโดยจลนทรยทอาศยอยรวมกบสงมชวตชนดอน (Symbiotic

Nitrogen Fixation) เปนการตรงไนโตรเจนทเกดจากสงมชวตอยางนอยสองชนด อาศยอยรวมกน

ตางฝายตางชวยเหลอใหประโยชนซงกนและกน เชน แบคทเรย Rhizobium และ Bradyrhizobium

ซงทาใหเกดปม (Nodule) ทรากของพชตระกลถว (Leguminous plan) การตรงไนโตรเจนเกดขน

จากการอยรวมกนของแบคทเรยกบพช โดยพชทาใหเกดสภาวะทไมมออกซเจน และใหแหลงคารบอน

และแหลงพลงงานในการตรงไนโตรเจนแกแบคทเรย แบคทเรยจะตรงไนโตรเจน และสงเคราะห

กรดอะมโน ซงพชสามารถนาไปใชสรางเนอเยอของพชไดตางฝายตางไดรบประโยชนรวมกน ไร

โซเบยมแตละชนดมความสามารถในการสรางปมจากพชตระกลถวไดอยางเฉพาะเจาะจง (Host

specificity) และตรงไนโตรเจนไดในปรมาณทแตกตางกนขนอยกบชนดของพช (สมศกด, 2541) ยงม

สวพ.

มทร.ส

วรรณภ

ม

5

การตรงไนโตรเจนแบบพงพาอาศยในพชทไมใชพชตระกลถว (Nonlegumimous plant) เชน แอคต

โนมยซส Fankia ทอยรวมกบตน alder แลวทาใหเกดปมรากทตรงไนโตรเจน นอกจากนยงมไลเคนส

การอยรวมกนระหวางรากบสาหรายหรอไซยาโนแบคทเรย Anabaena azollae ทอาศยอยใน

ชองวางทมอยบนใบของพชอวบนาพวกเฟรน เชน แหนแดง เปนตน

1.3 ชวเคมของการตรงไนโตรเจน

กระบวนการลดออกซเจนของกาซไนโตรเจน ไปเปนแอมโมเนยโดยจลนทรยตรง

ไนโตรเจนเกดขนโดยการกระตนของเอนไซมไนโตรจเนส กาซไนโตรเจนจะถกรดวซไปเปนแอมโมเนย

ดงสมการ

N2 + 8ferridoxin- + 8H- + 16MgATP2- + 18H2O 2NH4 + 2OH- + 8ferridoxin

+ 16MgADP4- + 16H2PO4

- + H2

การตรงไนโตรเจนเปนกระบวนการทตองการพลงงานเปนอยางมาก ในสภาวะแวดลอมทเหมาะสม

จลนทรยตรงไนโตรเจนจะตองใชพลงงานเกอบทงหมดในการรดวซกาซไนโตรเจน 1 โมเลกลไปเปน

แอมโมเนยมไออน 2 โมเลกล ซงความตองการพลงงานสง เปนตวจากดปรมาณกาซไนโตรเจนทจะถก

รดวซโดยจลนทรยดนซงไดพลงงานจากการยอยสลายสารอนทรย การเปลยนกาซไนโตรเจนไปเปน

แอมโมเนยมใหเกดขนสงสด จาเปนตองมแหลงพลงงานทมากพอและคงท เชนทเกดขนในธรรมชาต

บรเวณรอบรากพช (Rhizosphere) ซงแบคทเรยไดพลงงานจากสารทปลดปลอยออกมาจากราก หรอ

จาการอยรวมกบสงมชวตอน หรอโดยตรงจากพลงงานแสง ในพวกไซยาโนแบคทเรย หรอแบคทเรยท

สงเคราะหดวยแสง โดยทวไปในธรรมชาตสารอนทรยทจาเปนตอแบคทเรยมกไมเพยงพอทจะทาให

เกดการตรงไนโตรเจนไดมาก ยกเวนพวกทตรงไนโตรเจนแบบพงพาอาศยกบพชโดยจะไดรบพลงงาน

จากการยอยสลายสารอาหารทไดจากการสงเคราะหดวยแสงของพช เชน ไรโซเบยม กบพชตระกลถว

1.4 เอนไซมไนโตรจเนส

ไนโตรจเนสเปนเอนไซมทเรงปฏกรยาการลดออกซเจนของ กาซไนโตรเจนไปเปน

แอมโมเนย ประกอบดวยโปรตนทตางกน 2 สวนคอ Dinitrogenase หรอ MoFe protein หรอ

protein I และ Dinitrogenase reductase หรอ Fe protine หรอ protein ll Dinitrogenase เปน

โปรตนขนาดใหญประมาณ 220-240 Kdaltons ซงจะจบและรดวซกาซไนโตรเจน ขณะท

สวพ.

มทร.ส

วรรณภ

ม

6

Dinitrogenase reductase จะเปนตวสงผานอเลดตรอนใหกบเอนไซม Dinitrogenase (Tate,

2000; กญญา, 2544)

ปฏกรยาการลดกาซออกซเจนของไนโตรเจน ถกกระตนโดยเอนไซมไนโตรจเนส จะตอง

อาศย

1) ตวใหอเลคตรอน (electron doner) ไดแก α-hydrtoxy-butyrate,

glyceraldehyde-3-phosphate, isocitrate, glucose-6-phohphate, H2,

NADPH และ ascorbate เปนตน

2) ตวรบอเลคตรอน (electron acceptor) ในปฏกรยานตวรบอเลคตรอนคอ N2

3) แหลงพลงงาน ซงไดแก ATP (adenosine triphosphate)

4) divalent metal ion Mg++ Mn++ Co++ Fe++ และ Ni++ เปนตน ซงชวยให ATP

ทาปฏกรยาไดตามปกต

ปฏกรยาโดยทวไปอาจเขยนไดดงน (Simpson and Burris, 1984; Kim and Rees,

1994; กญญา, 2544)

N2+8H++8e-+16MgATP 2NH3+H2+16MgADP+16Pi

เอนไซมไนโตรจเนสมความไวตอออกชเจนเปนอยางมาก (Oxygen sensitive) จะไม

ทางานเมอมออกซเจน กระบวนการตรงไนโตรเจนจงไมตองการออกซเจน การตรงไนโตรเจนจะ

เกดขนไดในตาแหนงทไมมออกซเจน แบคทเรยทสามารถรดวซกาซไนโตรเจนสวนใหญมกลไกในการ

หลกเลยงหรอจากดออกซเจน เพอปองกนเอนไซมไนโตรจเนส ซงวธทจะปองกนเอนไซมไนโตรจเนสท

จะสมผสกบออกซเจนมดงน (Fuchs, 1999; Giller and Wilson, 1991; Postgate, 1982; Tate,

2000; กญญา, 2544)

1) การหลกเลยงทจะสมผสกบออกซเจน ( Avoidance of Oxygen contact)

ในแบคท เร ยพวกท ไม ต องการออกซ เจนในการ เจรญ เชน Clostridium

pasteurianum พวกทตองการออกซเจนเพยงเลกนอย (Facultative anaerobes) เชน Klebsiella

pneumonia มลกษณะทางพนธกรรมเปนตวควบคมใหสงเคราะหเอนไซมไนโตรจเนส ภายใต

สภาวะทม ปรมาณออกซเจนตาเทานน (Gussin et. al, 1986; Giller and Wilson, 1991)

2) การปองกนโดยการหายใจ (Respiratory protection)

สวพ.

มทร.ส

วรรณภ

ม

7

การเพมอตราการหายใจ ทาใหปรมาณออกซเจนลดลง เชน Azotobacter sp. ใน

สภาพทมออกซเจนจะออกซไดสแหลงคารบอนเพมขน การปองกนออกซเจนวธนพบไดในแบคทเรยท

อยอยางอสระทงหลายและไซยาโนแบคทเรย

3) การปองกนโดยการเปลยนรปแบบ (Conformational protection)

พบใน Azotobacter spp. โดยจบกบโปรตนขนาดเลก (Protective protein) ซงม

นาหนกโมเลกลประมาณ 24,000 ดาลตน การจบกบ Protective protein ทาใหรปแบบของเอนไซม

เปลยนไปอยในรปทไมทางานแตสามารถทนทานตอออกซเจนได เมอปรมาณออกซเจนลดลงอยใน

ระดบทยอมรบได เอนไซมไนโตรจเนสกจะมกจกรรมไดเหมอนเดม

4) การสรางเมอก (Gum or slime production)

เมอกหรอสารโพลแซคคารไรดทสะสมอยรอบนอกผนงเซลลของแบคทเรย ทาให

เซลลเซลลใหญขน และชวยเปนผนงกน ลดอตราการแพรของออกซเจนเขาสเซลล พบในพวก

Azotobacter spp. และ Derxia gummosa

5) การสรางเซลลทมผนงหนา (Heterocyst production)

พบในแบคทเรยทสงเคราะหแสงและไซยาโนแบคทเรยทตรงไนโตรเจน เอนไซมไน

โตรจเนสจะแยกไปอยในโครงสรางทมผนงหนา ทเรยกวา heterocyst เพอลดการสมผสกบออกซเจน

6) การสรางเลกเฮโมโกลบน (Leghemoglobin production)

ในปมรากพชตระกลถว-ไรโซเบยม จะมโมเลกลทคลายกบฮโมโกลบน เรยกวา

เลกฮโมโกลบนอยในปมราก เลกฮโมโกลบนมความสามารถในการจบออกซเจนไดสง ชวยลดปรมาณ

ออกซเจนทจะสมผสกบเอนไซมไนโตรจเนส

7) การยายไปอยในสภาพแวดลอมทเหมาะสม (Migration to suitable

environment)

แบคทเรยทเคลอนทได จะหลกเลยงออกซเจนโดยการยายไปอยในสภาพแวดลอมท

เหมาะสมตอการตรงไนโตรเจน อยรวมกนเปนกลม หรออยรวมกบพวกทตองการออกซเจน

สวพ.

มทร.ส

วรรณภ

ม

8

(Aerobic Heterotroph) ซงสามารถหลกเลยงการถกทาลายจากออกซเจนได เชน Azospirillum

Brasilens จะหลกเลยงออกซเจนโดยการการเคลอนตวไปอยในบรเวณทมแรงดนออกซเจนตา และ

พบในไซยาโนแบคทเรยทอยเปนเซลลเดยว และ Derxia gummosa

Giller and Wilson, 1991 กลาววา นอกจากตนทนแหลงพลงงาน (Energy cost)

ในการรดวซกาซไนโตรเจนและความไว (Sensitivity) ของเอนไซมไนโตรจเนสตอออกซเจนแลว

สารประกอบไนโตรเจนกเปนอกปจจยหนงทมผลตอการตรงไนโตรเจน ในแบคทเรยอสระทตรง

ไนโตรเจน กจกรรมเอนไซมไนโตรจเนสจะไมเกดขนถามสารประกอบไนโตรเจนปรมาณทเพยงพออย

ในเซลลของแบคทเรยแลว การขาดแคลนสารประกอบไนโตรเจน และลกษณะทางพนธกรรมการ

ควบคมการสรางเอนไซมไนโตรจเนสในสภาวะทมออกซเจนปรมาณตาจะเปนตวควบคมและชกนาให

เกดกจกรรมเอนไซมไนโตรจเนส แบคทเรยอสระทตรงไนโตรเจนไดบางชนดเอนไซมไนโตรจเนสจะ

หยดทางานชวคราวในสภาวะทมแอมโมเนย เนองจากเอนไซมถกทาใหเกดการเปลยนแปลง

(Covalent modification) ซงจากเอนไซม 2 ชนด คอ เอนไซม DART (Dinitrogenase reductase

ADP-ribosyl transferase) ในสภาพทมแอมโมเนยมจะเตม ADP ใหกบเอนไซม dinitrogenase

reductase ทาใหเอนไซมไนโตรจเนสหยดทางานชวคราว และเมอความเขมขนของแอมโมเนยมลดลง

เอนไซม DRAG (Dinitrogenase reductase activating Glycohydrolase) จะทาใหเกดปฏกรยา

ยอนกลบของ ADP-ribosylation ทาใหเอนไซมไนโตรจเนสทางานไดตามปกตพบใน

Rhodospirillum rubrum, Azorhizobium caulinodans อยางไรกตามการหยดการทางาน

ชวคราวของเอนไซมไนโตรจเนสไมไดพบทวไปในแบคทเรยตรงไนโตรเจนทงหมด เชนไมพบใน

Azotobacter spp. หรอใน Klebsiella pneumonia

1.4 การวดการตรงไนโตรเจนทางชวภาพโดยสงมชวต

วธการวดการตรงของไนโตรเจนมหลายวธดวยกน เชน วดการเจรญของแบคทเรยใน

อาหารเลยงเชอทปราศจากไนโตรเจน เพอดความสามารถในการตรงไนโตรเจน (Tate, 2000)

วเคราะหปรมาณไนโตรเจน (N-analysis) โดยวธของ Kjeldahl โดยวดความแตกตางของปรมาณ

ไนโตรเจนทงหมด กอนและหลงการเจรญในสภาพทมไนโตรเจน (Burns and Hardy, 1975) ตดตาม

ธาตไนโตรเจนดวย 15N และใชวธการรดวซกาซอะเซทลนเปนตวบงชความสามารถในการตรง

ไนโตรเจน ไมมวธทสมบรณแบบ (Hardy et. al., 1973) แตละวธตางมขอบกพรองแตกตางกน

ออกไป วธวดการตรงไนโตรเจนมดงน

สวพ.

มทร.ส

วรรณภ

ม

9

1) วดการตรงไนโตรเจนโดยตรวจสอบการเจรญในอาหารเลยงเชอทปราศจากแหลง

ไนโตรเจน (Nitrogen-free Cultivation) ตรวจสอบการเจรญของแบคทเรยในอาหารเลยงเชอท

ปราศจากไนโตรเจน เปนวธทงายทสด วดการเจรญจากการเพมขนของมวลชวภาพ (Biomass) หรอ

(Optical density) ของอาหารเลยงเชอเนองจากมการเจรญของแบคทเรย

2) วเคราะหหาปรมาณไนโตรเจนทงหมด (Total Nitrogen)

โดยวธของเจลดาล (Kjeldahl mothod) เปนวธทมความไวนอยกวาวธอน ๆ มาก

ไมสามารถใชวดไนโตรเจนในปรมาณทตาได

3) วเคราะหปรมาณไนโตรเจนโดยวธไนโตรเจน-15(15N2 method)

เปนวธวดการตรงไนโตรเจนทางตรง โดยใชไอโซโทปทเสถยรของไนโตรเจน

วเคราะหหาปรมาณไนโตรเจนทตรงได สามารถตดตามแหลงไนโตรเจนไดแนนอนและถกตองทสด

โดยใช ไอโซโทป 15N เมอเลยงแบคทเรยภายใตบรรยากาศทม 15N แลวตรวจหาปรมาณ 15N ในเซลล

ของ แบคทเรยดวยเครอง Mass Spectrometer ซงวธนมความไวกวาวธเจลดาลถง 1000 เทา ใหผล

แมนยาเทยงตรง แตมขอเสย คอตองใชเทคนคขอนขางสง และมคาใชจายมาก

4) วเคราะหปรมาณไนโตรเจนโดยวธอะเซทลนรดกชน (Acetylene reduction assay)

เปนวธวดกจกรรมเอนไซมไนโตรจเนสทางออม โดยใชความสามารถของเอนไซมไน

โตรจเนสในการรดวซ substrate อนนอกจากกาซไนโตรเจน (Turner และ Gibson, 1980) ซง

อะเซทลนมความเหมาะสมมากทสด เนองจากปกตไมพบกาซอะเซทลนในบรรยากาศ และมราคาไม

แพง สามารถวเคราะหไดดวยเครอง GC โดยเอนไซมไนโตรจเนสจะรดวซกาซอะเซทลน (C2H2) ไป

เปนกาซเอธลน (C2H4) ซงสามารถตรวจสอบกาซทงสองชนดได แมในปรมาณตา ๆ ดวยเครอง GC

ขอดของวธนคอ มความไวสง ไวกวาวธไนโตรเจน -15 ถง 103-104 เทา เปนวธทสะดวก รวดเรวใช

เทคนคงาย ๆ ใชเครองมอไมยาก และราคาไมแพง

2. อะโซโตแบตเตอร

อะโซโตแบคเตอร เปนแบคทเรยทมรปรางเปนแทง สามารถตรงไนโตรเจนจากอากาศได จด

อยในวงศ Azotobacteraceae โดยเชอ Azotobacter chroococcum เปนชนดทพบมากในดนท

เหมาะแกการเพาะปลก อะโซโตแบคเตอรจะมเซลลเปนรปไขขนาดใหญ มเสนผานศนยกลาง

ประมาณ 1.5-2.0 ไมโครเมตรหรอใหญกวา รปรางอาจเปลยนแปลงไดตงแตเปนแทงถงกลมร อย

สวพ.

มทร.ส

วรรณภ

ม

10

เซลลเดยว เปนค หรอเปนกลม จดเปนพวกเคโมออกาโนโทรพ (chemoorganothroph) ใชนาตาล

แอลกอฮอล และเกลอของกรดอนทรยในการเจรญเตบโตได ตองการโมลบดนมในการตรงไนโตรเจน

แตอาจใชวานาเดยมแทนทบางสวนไดดวย ไมยอยโปรตน สามารถใชไนเตรต แอมโมเนยม และ

กรดอะมโนบางชนดเปนแหลงของไนโตรเจนได pH ทเหมาะสมตอการเตบโตทมเกลออยดวยอย

ในชวง 4.8-8.5 แต pH ทเหมาะสมตอการตรงไนโตรเจนอยระหวาง 7.0-7.5 พบในดนและนา และม

อยหนงชนดทอาศยอยทรากของพช (ธงชย, 2546)

แบคทเรยในสกลอะโซโตแบคเตอรแบงออกได 6 ชนด ดงนคอ

1) Azotobacter choococcum สามารถเคลอนทไดโดยอาศยแสรอบเซลล (peritrichous

flagella) โคโลนไมเปนเมอก แตโคโลนอาจเปลยนแปลงไปเนองจากการสรางโพลแซคคาไรดออกมา

มาก ใชแอมโมเนยและไนเทรตเปนแหลงของไนโตรเจนได แตทาใหการตรง ไนโตรเจนหยดลง ไม

สามารถใชกลตาเมต (glutamate) ได สรางรงควตถสดาไมละลายนา พบไดทวไปในดน สามารถ

ไฮโดรไลสแปงไดโดยเอนไซมอลฟาอะไมเลส (α-amylase) และเบตาอะไมเลส (β- amylase)

2) Azotobacter vinelandii รปพรรณสณฐานคลายกบ A. choococcum เคลอนทโดย

อาศยแสรอบเซลล (peritrichous flagella) โคโลนไมเปนเมอก สรางรงควตถสเขยวเหลอบแสง

ละลายนาได ใชแอมโมเนยมและไนเตรตเปนแหลงของไนโตรเจน แตยบยงการตรงไนโตรเจน ไม

ไฮโดรไลสแปง

3) Azotobacter beijerinckii รปพรรณสณฐานคลายกบ A. choococcum แตไมเคลอนท

โคโลนเรยบแตความเปลยนแปลงเกดขนไดเนองจากการผลต โพลแซคคาไรด จานวนมากขนมา ใช

แอมโมเนยมและไนเตรตแตจะทาใหการตรงไนโตรเจนหยดชะงกลง สรางรงควตถสนาตาลอมเหลอง

สวาง ไมละลายนา บางสายพนธไฮโดรไลสแปงโดย เอนไซมเบตาอะไมเลส (β- amylase)

4) Azotobacter nigricans เปนแบคทเรยทไมเคลอนท โคโลนเรยบแตความเปลยนแปลง

เกดขนไดเมอเซลลผลตโพลแซคคาไรดออกมามาก (homopolysaccharide) จากซโครส (sucrose)

หรอ แรฟฟโนส (raffinose) ใชแอมโมเนยมและไนเทรตเปนแหลงของไนโตรเจนได

สวพ.

มทร.ส

วรรณภ

ม

11

5) Azotobacter armeniacus เซลลเคลอนทไดโดยแสรอบเซลล (peritrichous flagella)

โคโลนเรยบนนมากเปนมนแวววาว และเหนยวตดแนนกบอาหารเลยงเชอบางสายพนธสรางโฮโมโพล

แซคคาไรด เมอเลยงเชอบนซโครสแตจะไมสรางเมอใชแรพฟโนส ไฮโดรไลสแปง โดยเอนไซมอลฟาอะ

ไมเลส (α-amylase) หรอเบตาอะไมเลส (β-amylase) ขนอยกบสายพนธ ไมสามรถใชแอมโมเนยม

ไนเตรตและกลตาเมตเปน แหลงของไนโตรเจนได

6) Azotobacter paspali เซลลเคลอนทไดโดยแสรอบเซลล (peritrichous flagella)

โคโลนขน ขอบเรยบ หรอไมสมาเสมอ โคโลนจะยกตวขนมาจากอาหาร แตปกตแลวไมโคง ไมสรางโฮ

โมโพลแซคคาไรดจากซโครส และแรฟฟโนส ไมไฮโดรไลสแปง สรางรงควตถสเขยวเหลอบแสง และ

ละลายนาได สามารถใชแอมโมเนยม และไนเทรตเปนแหลงของไนโตรเจนในการเตบโตได แตใชกลตา

เมตไมได

ในดนจะมเชออะโซโตแบคเตอรแตกตางกนทงชนดและปรมาณขนอยกบความแตกตาง

ของดนและสงแวดลอม แตจะพบมากทสดในบรเวณรากพช ปจจยหลกทมอทธพลตอจานวนเชอ

อะโซโตแบคเตอร ในดนมอย 2 ประการ คอ

1) การเกอกลและการปฏปกษตอกนของจลนทรย

2) ปรมาณอนทรยวตถในดน จลนทรยหลายชนดเรงเจรญการเตบโตของ Azotobacter และ

การตรงไนโตรเจน ในทางตรงกนขามกมจลนทรยบางพวกทยบยงการเจรญเตบโตและการตรง

ไนโตรเจน เชน Cephalosporium spp.

ปกตแลวเชอในกลมอะโซโตแบคเตอรจะไมอาศยอยทผวรากของพชแตจะมมากมาย ในเขต

รากพช (rhizosphere) ในพชบางชนดสารทรากพชขบออกมา (root exudate) ซงมทงกรดอะมโน

นาตาล วตามน และกรดอนทรยรวมทงสวนของรากพช ทกาลงสลาย ตวอยนนจะเปนแหลงของ

พลงงานทสาคญททาใหเชออะโซโตแบคเตอรเจรญเตบโตและเพมจานวนอยางมากมายได

ปจจยทมผลกระทบตอการตรงไนโตรเจนของเชออะโซโตแบคเตอร

1) ออกซเจน

อะโซโตแบคเตอรตองการออกซเจนในการดารงชพ แตระดบออกซเจนจะมผลตอการตรง

ไนโตรเจน ประสทธภาพในการตรงไนโตรเจนจะเพมขนเมอออกซเจนลดลง และจะหยดชะงก เมอม

ออกซเจนสง ทงนเพราะกาซออกซเจนจะไปยบยงการตรงไนโตรเจน

สวพ.

มทร.ส

วรรณภ

ม

12

2) ความเปนกรดเปนดาง

ดนทเปนกรดจะมผลตอปรมาณและการกระจายของเชออะโซโตแบคเตอร pH ทเหมาะสม

อยในชวงสงกวา 6 เลกนอยหรอชวงเปนกลางถงดาง

3) อนทรยวตถ

การเจรญเตบโตและการตรงไนโตรเจนของเชออะโซโตแบคเตอร นอกจากจะใชสารทราก

พชขบออกมาแลว ยงตองการสารอนทรยเพอใชเปนแหลงของพลงงานอก ดงนนการเตม อนทรยวตถ

ตาง ๆ ลงดนจะชวยสงเสรมใหมการตรงไนโตรเจนสงขนดวย

4) แรธาตอาหาร

อะโซโตแบคเตอรตองการธาตอาหารตาง ๆ เพอการเจรญเตบโต ธาตอาหารทมบทบาท

สาคญนอกเหนอจาก Ca และ P แลว Mo, Co และ Fe นอกจากนแลวการมไนโตรเจนอนนทรย ใน

ดนปรมาณมาก จะยบยงการสรางเอนไซมไนโตรจเนสและลดการตรงไนโตรเจนดวย

5) อณหภม

ปกตการเพมจานวนจะเพมจานวนมากในอณหภมระหวาง 20 ถง 45 องศาเซลเซยส และจะ

ลดลงถาอณหภมสงกวา 45 องศาเซลเซยส อณหภมตาสด สาหรบการเจรญเตบโตของ เชอสวนใหญ

อยท 14 องศาเซลเซยส อณหภมทเหมาะสมตอการเจรญเตบโตของเชออะโซโตแบคเตอรทวไปจะ

ประมาณ 32 องศาเซลเซยส เชอนทกชนดทนอณหภม 50 องศาเซลเซยส ไดนาน 10 นาท จะตาย

เมออณหภมสง 60 องศาเซลเซยส นาน 10 นาท

6) ความชน

เมอดนมความชนประมาณ 70 เปอรเซนต การตรงไนโตรเจนจะเกดไดสงมาก แตถาม

ความชนมากเกนไป เชน ท 100 เปอรเซนต การตรงไนโตรเจนจะลดลงถง 1 ใน 3

7) จลนทรยชนดตาง ๆ ทอาศยอยในดน

จลนทรยบางชนดสามารถยบยงการเจรญเตบโตของเชออะโซโตแบคเตอร เชน แอคตโนไม

ซตบางชนด ซงสามารถสรางสารพษแลวขบออกมามผลยบยงการเจรญของ A. chroococcum sp.

แตจลนทรยบางชนดกสงเสรมการเจรญเตบโตของเชออะโซโตแบคเตอรในดน เชน Cellulomonas

สวพ.

มทร.ส

วรรณภ

ม

13

sp. การใชเชอผสมระหวาง Pseudomonas sp. และ อะโซโตแบคเตอรจะทาใหประสทธภาพในการ

ตรงไนโตรเจนสงขน จากการใชเชอบรสทธถง 3 เทา

Ridvan (2008) พบวา A. chroococcum มผลสงเสรมผลผลต และความเขมขนไนโตรเจน

ของขาวสาล ไดดกวาการไมใสเชอ เหมอนกบผลการศกษาของ Pandey et al. (1998) พบวาการใส

เชออะโซโตแบคเตอร สามารถเพมเมลด สของเมลด และความเขมขนของไนโตรเจนไดเชนเดยวกน

ซงเชออะโซโตแบคเตอรจดเปนปยชวภาพอกชนดหนงสาหรบการเกษตรปจจบน

3. การสรางฮอรโมนสงเสรมการเจรญเตบโตของพช

Plant Growth Promoting Rhizobacteria (PGPR) เปนแบคทเรยทอาศยบรเวณดนรอบ

รากพช มประโยชนในการสงเสรมการเจรญเตบโตและเพมความตานทานตอโรคตางๆของพช ซงจะ

สามารถเพมจานวนปมรากพช Kloepper and Schroth (1978) ,Glick et al .(1999) ซงสามารถ

นามาประยกตใชเปนอยางดในดานการเกษตร PGPR เปนกลมของแบคทเรยหลากหลายสกล และ

หลากหลายสายพนธ ซงกลมของ PGPR สวนใหญอยในสกล Azospirillum, Azotobacter,

Bacillus, Burkholoeria Pseudomonas, และ Serratia เปนตน Kloepper et al.(1989), Glick

et al.(1999) การเจรญของรากไดรบผลอยางมากจากการอาศยรวมกนระหวางรากและPGPR

Karadeniz et al .(2006) โดย PGPR จะสามารถแบงไดเปน 2 ประเภทตามการอาศยกบพชคอ

พวกทมความสมพนธแบบพงพาอาศยกนกบพช (symbiosis) คอแบคทเรยจาพวกทสามารถ

เขาสรากพชแลวเกดกระบวนการตางๆทจะชวยกระตนการเจรญเตบโตของพชได

พวกทอาศยแบบอสระในดน (free-living form) และจะพบอยใกลๆบรเวณรากพช

โดยแบคทเรยจาพวก PGPR จะชวยกระตนการเจรญเตบโตของพช ชวยใหผลผลตของพชสงขน

กระบวนการในการกระตนการเจรญเตบโตของพชมได 2 ทางคอ โดยทางตรงและทางออม

ดงน

1) กระบวนการในการกระตนการเจรญเตบโตของพชโดยทางตรง ไดแก

1.1 ตรงไนโตรเจนใหกบพช

สวพ.

มทร.ส

วรรณภ

ม

14

1.2 ยอยสลายธาตฟอสฟอรสในดนใหอยในรปทเปนประโยชนทาใหพชสามารถนาไปใช

ได

1.3 ผลตฮอรโมนพชเชน auxin, cytokinin, gibberelin เปนตน

1.4 สามารถผลตซเดอรโรฟอร (Siderophores) ชวยนาธาตเหลกไปใหพชใชประโยชน

ไดงายขน

2) กระบวนการในการกระตนการเจรญเตบโตของพชโดยทางออม คอชวยในการควบคมโรค

พช ทงโรคพชทเกดจากเชอราสาเหตโรคพช และเชอแบคทเรยสาเหตโรคพช โดยจากดปรมาณธาต

เหลกทเปนประโยชนของเชอโรคพช ทาใหสามารถปองกนการเพมจานวน และการขยายจานวนของ

เชอโรคพชได

3.1 ฮอรโมนพช ( phytohormones)

การผลตฮอรโมนพชนนเปนกลไกทสาคญในการชวยเพมประสทธภาพ ในการ

เจรญเตบโตของพช โดยรายงานเกยวกบการผลตฮอรโมนพชสวนใหญจะมงเนนไปทบทบาทของ

ฮอรโมนพช กลมทเรยกวา ออกซน ซง ฮอรโมนพชในกลมของ ออกซน กไดแก indole-3-acetic

acid (IAA) ซงจะชวยกระตนการยดตวของเซลล (cell elongation), การแบงเซลล (cell division)

และการเปลยนสภาพของเซลล (cell differentiation)

ออกซน (auxin) เปนฮอรโมนชนดแรกทคนพบในพช ทาใหสวนยอดตนกลาโคงงอเบน

เขาหาแสงและเปนกลมสารทเกยวของกบการขยายขนาดของเซลล ทาใหพชมการเตบโตยดยาวขน

เฉพาะทจนพชเบนเขาหาแสงและตอบสนองตอแรงดงดดของโลก ออกซนทพชสรางขนสวนใหญอยใน

รปสารเคมทเรยกวา กรดอนโดล-3-แอซตก (indole-3-acetic acid, IAA) โดยพชสงเคราะหจาก

กรดอะมโนทรปโทแฟน (tryptophan) ยงมสารสงเคราะหทสรางขนมา ซงมคณสมบตคลายออกซน

เพอนามาใชประโยชนทางการเกษตร ไดแก NAA (1-naphthylacetic acid), IBA (4-(Indole-3-

yl)Butyricacid), 2,4-D (2, 4-dichlorophenoxyacetic acid), IPA (indolepropionic acid) และ

2,3,6-T (2,3,6-trichlorobenzoic acid)

อะโซโตแบคเตอรสามารถผลตสารควบคมการเจรญเตบโตของพชได เชน A. beijernickii

ผลตสารคลาย ไซโตไคนน สารคลายออกซน และสารคลายจบเบอเรลลน A. chroococcum ผลต

สารคลายจบเบอเรลลน กรดจบเบอเรลลก และกรดอนโดล-3-อะซตก A. paspali ผลตสารคลาย

สวพ.

มทร.ส

วรรณภ

ม

15

ไซโตไคนน กรดอนโดล-3-อะซตก และสารคลายจบเบอเรลลน A. brasilense ผลตสารคลายไซโตไค

นน สารคลาย จบเบอเรลลน และซเอตน (Zahir et al., 2004)

การสงเคราะห กรดอนโดล-3-แอซตก ในพชและเชอจลนทรยหลายชนดพบวามกระบวนการ

คลายคลงกน มสารเรมตนคอ กรดอะมโน L-tryptophan แบคทเรยจะเปลยน tryptophan ใหเปน

indole ethanol ซงสารชนดนสามารถแสดงคณสมบตเปนออกซนได เพราะพชจะเปลยน indole

ethanol ใหเปน indoleacetaldehyde และกรดอนโดล-3-แอซตก

การคดเลอกเชอทมความสารถในการตรงไนโตรเจนและสรางฮอรโมนออกซนมาผลตเปนปย

ชวภาพกจะชวยสงเสรมการเจรญเตบโตของพช เชน ผก พชไร และไมผล เปนตน ทาใหสามารถลด

ตนทนการใชปยลงไดอกทางหนง

สวพ.

มทร.ส

วรรณภ

ม

16

วธการดาเนนการวจย

1. การแยกเชอบรสทธของเชอในกลมอะโซโตแบคเตอร

เกบตวอยางดนจากพนทเกษตรของจงหวดพระนครศรอยธยา จานวน 16 อาเภอ แลวนาไป

แยกเชอบรสทธ โดยวธ dilution plate method โดยมขนตอนดงน

1) ผสมดน 1 กรม ลงในนากลนท Sterile 99 มลลลตร เขยาใหเขากนดวย Vertex

2) เจอจางสารละลายดนลงไปครงละ 10 เทา ใสสารละลาย ดน 0.1 มลลลตร ลงในอาหาร

Ashby’ s

3) ทาการ spread plate ใหทว

4) บมเชอไวทอณหภมหอง ประมาณ 2-5 วน

5) เมอบมทงไวประมาณ 2-5 วน จะมเชอขนบนอาหาร เลอกเกบเชอทมโคโลนใหญ ๆ โดย

การเขยในอาหาร Ashby’ s ดวยวธการ Streak plate บมเชอทงไวอก 2-5 วน แยกเชออะโซโตแบค

เตอรทเจรญเปนโคโลนเดยวแลวเขยลงใน slant agar เลยงเชอใน slant agar ประมาณ 5–7 วนเมอ

เจรญดแลวกใหทาการเกบเชอในอณหภมตาเพอรอการทดสอบประสทธภาพตอไป

2. การศกษาประสทธภาพของเชออะโซโตแบตเตอรในการตรงไนโตรเจน และการสรางออกซน

1) แผนการทดลอง

ใชแผนการทดลองแบบ completely randomized design จานวน 4 ซา ประกอบดวย

เชออะโซโตแบคเตอรจานวน 15 ไอโซเลต และมตารบทไมใสเชออะโซโตแบคเตอร (ตารบควบคม)

อกหนงตารบการทดลอง รวมทงหมด 16 ตารบการทดลอง

2) การทดสอบการตรงไนโตรเจนในอาหารเหลว

เลยงกลาเชอของอะโซโตแบคเตอร ในอาหารเหลว nutrient broth ใหอากาศโดยเครอง

เขยาทความเรวรอบ 120 รอบ/นาท เปนเวลา 24 ชวโมง นากลาเชอทไดมาทาการปนเหวยงเอา

เฉพาะเซลล ลางเซลลดวย 0.85 % NaCl นาเซลลทไดมาทาเปนสารละลายใน phosphate buffer

โดยปรบคา optical density (OD) ใหเทากบ 0.2 ทความยาวคลน 600 นาโนเมตร ดดเซลล 100

ไมโครลตร ใสในอาหารเหลวสตร Ashby’ s ปรมาตร 50 มลลลตรทบรรจอยในขวดชมพ ขนาด 150

มลลลตร ใหอากาศโดยการใชเครองเขยาทความเรวรอบ 100 รอบ/นาท ทอณหภมหอง จากนน

สวพ.

มทร.ส

วรรณภ

ม

17

ทดสอบประสทธภาพการตรงไนโตรเจนดวยวธ acetylene reduction (Hardy et al., 1968;

Hardy et al., 1973) ทเวลา 7 วน โดยเปลยนจากจกสาลเปนจกยาง ใชเขมฉดยาดดอากาศออกจาก

ขวดชมพผานทางจกยาง 10 มลลลตร จากนนฉดแกสอะเซทลน 10 มลลลตร เขาไปในขวดโดยเขมฉด

ยา บมไวเปนระยะเวลา 1 ชวโมง จากนนใชเขมฉดยาขนาด 10 มลลลตร ดดแกสในขวดแกวแลว

นามาเ กบในหลอดเ กบแกส แลวนามาวดปรมาณแกส เอทธลนท เ กดขนดวยเคร อง gas

chromatography

3) การทดสอบประสทธภาพการสรางออกซน

ถายเชอแตละไอโซเลตจานวน 1 ml ใสลงในอาหารเหลวปลอดไนโตรเจน ตามสตรของ

Ashby’ s (อาหารเหลว 1 l เตม tryptophan 50 mg/ml โดยเตมเพอเปนสารตงตนในการสราง

ฮอรโมนออกซน) ปรมาตร 50 ml ทบรรจใน ขวดรปชมพ ขนาด 125 ml ใหอากาศดวยเครองเขยา

ทความเรว 100 รอบ/นาท เปนเวลา 3 วน เกบตวอยางทกวน เพอศกษาปรมาณออกซนดวยวธ

Salkowski colouring reagent (Fernando et al.(2007), Ravikumar et al.(2004)) โดยนา

ตวอยางมาปนเหวยงทความเรว 4,000 รอบ/นาท เปนเวลา 30 นาท ทอณหภม 5 ๐C เกบสวนใส 3

ml เตม reagent 2 ml (0.5M FeCl3 ละลายใน 35% HClO4) จากนนบมทอณหภมหอง เปนเวลา

30 นาท ในทมด แลววดคาการดดกลนแสงท ความยาวคลน 535 nm

4) วเคราะหขอมล

วเคราะหคาความแปรปรวนของขอมลเพอหาคา F – value พรอมทงคาสถตสาหรบ

เปรยบเทยบความแตกตางของคาเฉลยในแตละสายพนธตามวธของ DMRT (Duncan’s multiple

range test)

สวพ.

มทร.ส

วรรณภ

ม

18

ผลและวจารณ

1. การแยกเชอบรสทธของเชอในกลมอะโซโตแบคเตอรจากดน

เกบตวอยางดน จากพนทเกษตรของจงหวดพระนครศรอยธยา จาก 16 อาเภอ รวมเปน

จานวน 16 ตวอยาง สามารถแยกเชออะโซโตแบคเตอรบรสทธได 16 ไอโซเลต ลกษณะของโคโลนท

พบมากทสดมสขาว (สครม), ขอบเรยบ, สะทอนแสง, เสนผาศนยกลาง 3-8 มลลเมตร และโคโลนท

มลกษณะใส, แวววาว, สะทอนแสง ขนาดเสนผาศนยกลาง 2-5 มลลเมตร เมอศกษาลกษณะทาง

สณฐานวทยาภายใตกลองจลทรรศน พบวาเปนแบคทเรยแกรมลบรปแทงขนาดสนและใหญ

และแกรมลบรปแทงขนาดสนและเลก นอกจากนยงพบการสรางเมดสนาตาลดา สนาตาลปนเหลอง

และสเหลอง ในเชอทมอายมาก (ภาพท 1)

a) b) c)

d) e) f)

สวพ.

มทร.ส

วรรณภ

ม

19

ภาพท 1 การแยกเชอ, ลกษณะของโคโลน, ลกษณะทางสณฐานวทยาของเซลล และการสรางเมดส

ของเชออะโซโตแบคเตอรทแยกไดจากพนทเกษตร จ. พระนครศรอยธยา a) การแยกเชอ

บรสทธดวยวธการ streak plate b) โคโลนสขาว(A3) c) โคโลนใส(A4) d) การสรางเมดส

นาตาลดา (A1) สนาตาลปนเหลอง(A6) สเหลอง(A8) e) เซลลตดสแกรมลบ รปแทง ขนาด

สนและใหญ f) เซลลตดสแกรมลบ รปแทง ขนาดสนและเลก

ตารางท 1 ตวอยางเชออะโซโตแบคเตอรแบงตามพนทเกบตวอยางดน

ไอโซเลต อาเภอ

A1 มหาราช

A2 มหาราช

A3 มหาราช

A4 ภาช

A5 ภาช

A6 ภาช

A7 ภาช

A8 ภาช

A9 บางไทร

A10 เชยงรากนอย

A11 พระนครศรอยธยา

A12 บางบาล

A13 บางบาล

A14 บางปะหน

A15 ผกไห

A16 บางปะอน

สวพ.

มทร.ส

วรรณภ

ม

20

2. การทดสอบการตรงไนโตรเจนในอาหารเหลวของเชออะโซโตแบคเตอรไอโซเลตตางๆ

จากการทดสอบการตรงไนโตรเจนของเชออะโซโตแบคเตอรแตละไอโซเลต ดวยวธ

acetylene reduction ในอาหารเหลว พบวามความแตกตางอยางมนยสาคญทางสถต

โดยเชออะโซโตแบคเตอรมสามารถตรงไนโตรเจนไดอยในชวง 0.48-0.99 mg N/hr เชออะโซโตแบค

เตอรทสามารถตรงไนโตรเจนไดสงทสดจานวน 10 ไอโซเลต คอ A1, A2, A3, A4, A5, A6, A7, A8,

A9 และ A10 สามารถตรงไนโตรเจนไดหลงการเลยงเชอ 7 วน เทากบ 0.94 0.98 0.98 0.98 0.97

0.96 0.98 0.99 0.96 และ 0.99 mg N/hr ตามลาดบ ซงผลการทดลองสอดคลองกบผลการทดลอง

ของ พกล และดารารตน (2550) ทศกษาประสทธภาพการตรงไนโตรเจนของอะโซโตแบคเตอรดวยวธ

acetylene reduction ในอาหารเหลว พบวาสายพนธ อะโซโตแบคเตอรทคดเลอกมามการตรง

ไนโตรเจนทแตกตางกนและพบวาอยในชวง 0.90-3.18 mg N /hr

ตารางท 2 ปรมาณการตรงไนโตรเจนของเชออะโซโตแบคเตอรทเวลา 7 วน

Isolate mg N/hr

A1 0.94a

A2 0.98a

A3 0.98a

A4 0.98a

A5 0.97a

A6 0.96a

A7 0.98a

A8 0.99a

A9 0.96a

A10 0.99a

A11 0.50b

A12 0.57b

A13 0.48b

A14 0.48b

A15 0.53b

A16 0.55b

สวพ.

มทร.ส

วรรณภ

ม

21

F-test *

p-value 0.00

% CV 15.81

หมายเหต * หมายถง แตกตางกนทางสถตทระดบความเชอมน 95%

3. การทดสอบประสทธภาพการสรางออกซน

จากการทดลองพบวาปรมาณของออกซนทสรางขนโดยเชออะโซโตแบคเตอรแตละไอโซเลต

มความแตกตางกนอยางมนยสาคญทางสถต เชออะโซโตแบคเตอรไอโซเลต A10 สามารถสราง

ฮอรโมนออกซนไดสงทสด รองลงมาคอไอโซเลต A4 และ A8 ซงสามารถสรางฮอรโมนออกซนได

35.00 20.48 และ 19.76 mg/ml ตามลาดบ Shende et.al. (1977) รายงานวา A. chroococcum

สามารถสรางและขบสารตาง ๆ ออกมามากมาย ไดแก ไทอามน (thiamine) ไรโบฟลาวน

(riboflavin) ไพรดอกซน (pyridoxine) ไซยาโนโคบาลามน (cyanocobalamine) กรดนโคทนค

(nicotinic acid) กรดแพทโทเธนค (pantothenic acid) กรดอนโดนอาซตก (indole acetic acid)

และจบเบอเรลลน (gibberellin) หรอสารทมสมบตคลายจบเบอเรลลน นอกจากน

A. chroococcum ยงสามารถสรางสารปฏชวนะยบยงการเจรญเตบโตของเชอราในดนบางชนดได

เมอรวมสมบตตาง ๆ เขาดวยกนสามารถกลาวไดวาเชอนมประโยชนตอการงอกของเมลดดวย

ตารางท 3 ปรมาณการสรางออกซนของเชออะโซโตแบคเตอรทเวลา 3 วน

Isolate mg/ml

A1 4.64d

A2 7.62d

A3 7.98d

A4 20.48b

A5 18.81b

A6 17.62bc

A7 17.62bc

A8 19.76b

A9 6.31d

A10 35.00a

สวพ.

มทร.ส

วรรณภ

ม

22

A11 4.81d

A12 5.96d

A13 5.01d

A14 4.80d

A15 8.40d

A16 9.91cd

F-test *

p-value 0.00

% CV 23.11

หมายเหต * หมายถง แตกตางกนทางสถตทระดบความเชอมน 95%

สรปผลการทดลอง

1. เชออะโซโตแบคเตอรทสามารถตรงไนโตรเจนไดสงทสดจานวน 10 ไอโซเลต คอ A1,

A2, A3, A4, A5, A6, A7, A8, A9 และ A10 สามารถตรงไนโตรเจนไดหลงการเลยงเชอ 7 วน

เทากบ 0.94 0.98 0.98 0.98 0.97 0.96 0.98 0.99 0.96 และ 0.99 mg N/hr ตามลาดบ

2. เชออะโซโตแบคเตอรไอโซเลต A10 สามารถสรางฮอรโมนออกซนไดสงทสด รองลงมาคอ

ไอโซเลต A4 และ A8 ซงสามารถสรางฮอรโมนออกซนได 35.00 20.48 และ 19.76 mg/ml

ตามลาดบ

จากผลการทดลองทาใหคดเลอกเชออะโซโตแบคเตอร ได 3 ไอโซเลต ทมประสทธภาพใน

การตรงไนโตรเจนและสราฮอรโมนออกซน คอ ไอโซเลต A10 A4 และ A8 ตามลาดบ ซงสามารถ

นามาพฒนาเปนปยชวภาพไดตอไป

สวพ.

มทร.ส

วรรณภ

ม

23

เอกสารอางอง

กญญา มวงแกว. 2544. การปรบปรงคณภาพปยหมกโดยเชอจลนทรยทยอยสลายเซลลโลสและตรง

ไนโตรเจน. บณฑตวทยาลย จลาลงกรณมหาวทยาลย. กรงเทพฯ.

ยงยทธ โอสถสภา. 2546. ธาตอาหารพช. สานกพมพมหาวทยาลยเกษตรศาสตร, กรงเทพฯ.

ธงชย มาลา. 2546. ปยอนทรยและปยชวภาพ : เทคนคการผลตและการใชประโยชน. สานกพมพ

มหาวทยาลยเกษตรศาสตร, กรงเทพฯ.

สมศกด วงใน. 2541. การตรงไนโตรเจน : ไรโซเบยม – พชตระกลถว. สานกพมพ

มหาวทยาลยเกษตรศาสตร, กรงเทพฯ.

Burns, R. C., and Hardy, R. W. F. 1975. Nitrogen fixation in bacteria and higher plants.

Berlin:Springer-Verlag.

Esmaeil, Y. A.M.E. Azadgoleh, H. Pirdashti and S. Mozafari. 2008. Azotobacter and

Azospirillum inoculants as biofertilizer in canola (Brassica napus L.) cultivation.

Asian Plant Sci. 7(5): 490-494.

Fernando, L. W. R., P. D. Quadros, F. A. O. Camargo and E. W. Triplett. 2007.

Screening of diazotrophic bacteria Azopirillum spp. for nitrogen fixation and

auxin production in multiple field sites in southern Brazil. J. Microbiol.

Biotechnol 23: 1377–1383.

Gastal, F. and G. Lemaire. 2002. N uptake and distribution in crops: an agronomical

and ecophysiological perspective. J. Exp. Bot. 53: 789–799.

Giller, K. E., and Wilson, K. F. 1991. Nitrogen fixation in tropical cropping systems.

UK:CAB international.

Glick, B. R., C. L. Patten, G. Holguin and D.m. Penrose. 1999. Biochemical and

Genetic Mechanisms Used by Plant Growth Promoting Bacteria. Imperial

College Press. Waterloo, Ontario, Canada.

Hardy, R. W. F., R. S. Holsten, E. K. Johnson and R. C. Burns. 1968. The acetylene-

ethylene assay for N2 fixation laboratory and field evaluation. Plant Physiol.

43: 1185-1270.

Hardy, R. W. F., R. C. Burns and R. S. Holsten. 1973. Application of acetylene-ethylene

assay for measurement of nitrogen fixation. Soil Biol. Biochem. 5: 47-48.

สวพ.

มทร.ส

วรรณภ

ม

24

Karadeniz S,.F. Topcuog and S. Inan, 2006, Auxin, gibberellin, cytokinin and abscisic

acid production in some bacteria. World J. Microbiol. Biotechnol 22: 1061–

1064.

Kloepper, J. W. and M. N. Schroth. 1978. Plant growth promoting rhizobacteria on

radishes. Pro. Int. Conf. Plant Pathol. Bacteria Angers France 2: 879-882.

Ravikumar S., K. Kathiresan, T. M. Ignatiammal, M. B. Selvam and S. Shanthy. 2004.

Nitrogen-fixing azotobacters from mangrove habitat and their utility as marine

biofertilizers. J. Exp. Marine Biol. Ecol. 312: 5–17.

Ridvan, K. 2008. Yield response and nitrogen concentrations of spring wheat (Triticum

aestivum) inoculated with Azotobacter chroococcum strains. Ecological

Engineering. 33: 150–156.

Sisson, V.A., T.W. Rufty and R.E. Williamson. 1991. Nitrogen-use efficiency among

fluecured tobacco genotypes. Crop Sci. 31, 1615–1620.

Stocking, C. R. and A. Ongum. 1962. The intracellular distribution of some metabolic

elements in leaves. Am. J. Bot. 49: 284-289.

Tate, R. L. 2000. Soil microbiology. 2 nd ed. 346-372. New York:John Wiley & Sons.

Wang, Z.H., L. Wang, C.Y. He, H. Wang, X.L. Kui and Z.X. Jiang. 2000. Studies on

effect of over N fertilization on nitrate accumulation in different vegetables

and its regulation. Agro. environ. 19(1): 46–49.

Zahir, Z.A., M. Arshad and W.T. Frankenberger,Jr. 2004. Plant growth promoting

rhizobacteria: applications and perspectives in agriculture. Adv. Agron. 81:

97-168

สวพ.

มทร.ส

วรรณภ

ม

25

ภาคผนวก

สวพ.

มทร.ส

วรรณภ

ม

26

1. สตรอาหาร Ashby’ s medium

Mannitol 20.0 g/l

K2HPO4 0.2 g/l

MgSO4.7H2O 0.2 g/l

NaCl 0.2 g/l

K2SO4 0.1 g/l

CaCO3 5.0 g/l

Agar 15.0 g/l

Distilled water 1000.0 ml

สวพ.

มทร.ส

วรรณภ

ม

27

2. Gram stain

• Crystal violet

สารละลาย A ประกอบดวย

Crystal violet (85% dye) 20 g

Ethyl alcohol 95% 20 ml

สารละลาย B ประกอบดวย

Ammonium oxalate 0.8 g

Distilled water 80 g

ผสมสารละลาย A กบ สารละลาย B ถามตะกอน กรองกอนนาไปใช

• Safranin O

Safranin O 2.5 g

Ethyl alcohol 95% 100 ml

ถาจะใชในการยอม ใหเจอจางเปน 1:10

• Gram’s iodine solution (Mordant)

Iodine 1.0 g

Potassium iodide 2.0 g

Distilled water 300 ml

ละลาย Iodine และ Potassium iodide ในขวดนากลนปรมาณนอย ๆ กอน แลวเตม นาให

ครบ เกบในขวดสชา

• Alcohol acetone (Decolorizer)

Ethyl alcohol 95% 250 ml

Acetone 250 ml

สวพ.

มทร.ส

วรรณภ

ม

28

ภาพผนวก

สวพ.

มทร.ส

วรรณภ

ม

29

ภาพผนวกท 1 การเตรยมแกสอะเซทธลน

ภาพผนวกท 2 การวเคราะหฮอรโมนออกซน a) standard 0 20 40 60 80 100 ug/ml

b) ตวอยาง

a) b)