החדרת גנים )דנ"א( לתאים של בע"ח ואדם

למטרות :

הנדסה גנטית של תאי בע"ח )חלופי •למיקרואורגניזמים(

ייצור תוצרים מסחריים• ריפוי גני של מחלות גנטיות באדם• יצירת בע"ח טרנסגנים• חיסון בדנ"א• מחקר גנטי • מחקר על וויסות גנים וביטויים•ריפוי גני שיבוט בע"ח •

תרכיבי חיסון להמונים ייצור בע"ח טרנסגני

ייצור בע"ח ביו -ריאקטור

5נושא 92 - 51שקופיות

51

שיטות החדרה של גנים )דנ"א( לתאי בע"ח

transfectionטרנספקציה =

החדרת דנ"א זר ישירות או באמצעות פלסמיד לתאי בע"ח , כאשר :הדנ"א ערום1.הדנ"א נמצא בתצמיד עם חלבון 2.הדנ"א- מחובר לנשא פלסמידי ) וקטור חיידקי (3.

ספיחה של הדנ"א ע"י קרום תא המטרה1.

פגוציטוזה של הדנ"א והחדרתו לציטופלסמה2.

חדירת הדנ"א לגרעין – ללא השתלבות בגנום התא : אפשרות לביטוי זמני למספר ימים3. )הגן המוחדר לא עובר שיכפול בזמן חלוקת התאים ולכן נעלם לאחר מספר ימים(

חדירת הדנ"א לגנום התא - והשתלבות בכרומוזום התא: אפשרות לביטוי יציב , לטווח 4.זמן ארוך. מתקבל תא רקומביננטי .

)הגן מוכפל יחד עם הגנום בזמן חלוקת התא. ויש ריבוי של הגן המוחדר (.

חשוב לדעת : תאים רקומביננטיים (10%ההשתלבות בגנום בד"כ ב % קטן מהתאים ) עד •אתר ההשתלבות בכרומוזום בד"כ אקראי •בידוד התא הרקומביננטי נעשה במצע בררני מתאים•

שלבי חדירה שונים בטרנספקציה :

1

52

אמצעים לשיפור הטרנספקציה

– מסייע בריכוז דנ"א על סידן זרחתיהשקעת הדנ"א במלח 1.קרום התא - משפר ספיחה ומסייע לפגוציטוזה )שיטה כימית(

- מסייע בחדירתו ) מסיסותו ( דרך לפידים ערבוב הדנ"א עם 2.הקרום השומני של התא ) שיטה כימית (.

– החדרת הדנ"א בשדה חשמלי באלקטרופורציהשימוש 3.היוצר פתחים עדינים )תעלות( בקרום.)שיטה פיסיקלית(.

אין צורך בהשקעה במלח ואין שלב ספיחה ) יתרון (. אך יש סכנת פגיעה בתאים ) חסרון (.

– החדרה ישירה של דנ"א לגרעין במיקרו הזרקהשימוש 4.התא,בפיפטת זכוכית זעירה ובסיוע מיקרוסקופ.

ההחדרה מתבצעת לכל תא בנפרד )חסרון (. אך היעילות ( והביטוי כרומוזומלי יציב ) יתרונות (. 30%-10%גבוהה )

בחירת השיטה נעשית בהתאם לסוג התא וליכולתו לקלוט דנ"א

53

מיקרוהזרקה ישירה לגרעין

אמצעים לשיפור טרנספקציה http://www.bmb.psu.edu/courses/biotc489/notes/transform.htm

http://www.tritechresearch.com/ScientistCG/P001211.htmhttp://www.jyi.org/volumes/volume5/issue5/features/lovejoy.html

קרום התא

גרעין התאציטופלסמה

גן

גנום

ביטוי זמני

ביטוי יציב

תורשתי

אופן ביטוי הגן תלוי בשלב של חדירת הדנ"א ובהעברתו לגרעין התא

54

1

2 34

הדנ"א נספח לקרום התא1.

הדנ"א חדר לציטופלסמה2.

הדנ"א חדר לגרעין התא אך לא משתלב בגנום התאי3.

הדנ"א חדר לגנום התא והשתלב בו4.

השלבים בחדירת גן לתא בע"ח :

55

העשרה

סוג תרביות תאים שניתן לרכוש מחברה מסחרית למטרות יישומיותhttp://www.hansei.com/products/products02.htm

כלים לגידול תאים בתרבית הניתנים לרכישה בחברה מסחרית http://www.hansei.com/products/products02_02.htm

גידול תרביות עור לשיווק מסחרי למטרות חקר השפעת חומרים קוסמטיים על העורhttp://www.invitrobiotec.de/3d_gewebe_e.htm

http://www.bodysculptor.biz/en/visage/preuves.htmhttp://www.biocytex.fr/biblio/com/toposkin/toposkin.htm

גידול תאים על מיקרונשאים לייצור אינטרפרון בקנה מידה גדולhttp://www.cellon.lu/microcarriers/immobasil

אינטרפרון – פעילות רפואית אנטי וירלית, פועל באופן בלתי ספציפי נגד כל נגיף .http://www.cat.cc.md.us/courses/bio141/lecguide/unit1/prostruct/cytokines/u3fg42a.html

http://gsbs.utmb.edu/microbook/ch049.htmhttp://www.kcom.edu/faculty/chamberlain/Website/Lects/Interfer.htm

אבחון של נגיפים בתרבית תאים http://www.herpesdiagnosis.com/diagnose.html

http://www.vet.uga.edu/IVCVM/1998/steffens/steffens.htm

אנימציה של הדבקת תרבית תאים בנגיף ) גידול נגיפים(http://www.hhmi.org/biointeractive/animations/infection/inf_middle_frames.htm

איחוי תאים להחדרת מאקרומולקולות – איחוי פרוטופלסטים

2

מצע איזוטוניPEG+

תא-כלאיים

פרוטופלסטיםאו

ספרופלסטים

56

מכינים ספרופלסטים של חיידקים רקומביננטיים ) הנושאים את גן המטרה ( ע"י הסרת הדופן 1.בעזרת ליזוזים במצע איזוטוני .

מבצעים איחוי של תאי בע"ח יונק עם הספרופלסטים של החיידק הרקומביננטי במצע 2.איזוטוני , בתוספת פוליאתילן גליקול .

מתקבלים תאי כלאיים ) תאי היברידומה ( השונים בתכולתם הגנטית.3.

ברירה של ההיברידומה הרצויה על מצע בררני ) תאי הכלאיים המכילים את גן המטרה + גן 4.ברירה (

איחוי

http://www.biologie.uni-hamburg.de/b-online/e29/29c.htm

פרוטופלסטים הם תאי צמח ללא דופן, בעלי קרום בלבד.ספרופלסטים הם תאי חיידק ללא דופן. הפרוטופלסטים

והספרופלסטים דורשים תמיסה איזוטונית כדי לשרוד בתרבית

החדרת דנ"א לתא בע"ח בעזרת וירוס

טרנסדוקציה 3

זהו תהליך טבעי שבו הנגיף מדביק את התא ומחדיר את הגנום שלו לגרעין התא • להחדרת וקטורהמודבק. גנום הנגיף משתלב בגנום תא המטרה וע"י כך משמש

הגן . נגיפים המשמשים וקטור הם : • נגיפי רטרו ווירוס• נגיפי אדנו ווירוס • SV40 נגיף • נגיף ה הרפס•

גנום נגיפי מהונדס

רקומביננטיגרעין התא

57 תרבית קווי תאים עילאיים ) אדם, בע"ח, צמח (נגיף

נוספות בנשא לצורך ברירת התאים חיוניותשילוב תכונות הרקומביננטיים וקבלת התוצר החלבוני

תאים של בע"ח שקלטו נשא -דנ"א בגנום התאי והגן מתבטא באופן יציב

מאותרים ועוברים ברירה מתוך האוכלוסייה הכללית של התאים:

על הנשא ) מאפשר את הסלקציה (גן ברירה בעזרת • על הנשא ) מאפשר איתור התאים(גן מדווח ובעזרת •

על הנשא : רצפי בקרהבדיקת רמת הביטוי של הגן ,המוחדר לתאים המהונדסים, תלויה בנוכחות פרומוטור יעיל לפני אתר השיבוט• רצף מגביר שעתוק• רצף בקרה המגיב לחלבון ספציפי המפעיל בקרה חיובית או בקרה שלילית•

בדיקת פעילות ביולוגית של תוצר הגן המשובט תלויה ב : שליח לאחר השעתוק של עיבוד הרנ"א קיום תהליכים משלימים •

בתא היצרן ונכון של החלבון בתא היצרן תרגום יעיל • בתא היצרן קיום תהליכי עיבוד סופי של החלבון •

58

http://www.genlantis.com/catalog/product_line.cfm?product_family_key=1&product_line_key=24

שילוב "גן מדווח" בנשא שידווח על על הצלחת הטרנספקציה בתאים

העשרה

חברה מסחרית פיתחה ריאגנט מיוחד לטרנספקציה של תאי עצב ,הנקרא :

NeuroPORTER Transfection Reagentזהו ליפיד קטיוני המתאים במיוחד להגברת יעילות

החדרת גנים לתרבית ראשונית של תאי עצב.במטרה להוכיח ללקוח את יעילות הריאגנט בהחדרת גן

המקודד עבור תוצר גן מדווחע"י הנשא , הם שילבו ( . תאים שקלטו את הנשא עם GEPפלואורסצנטי ) גן

גן המטרה יקלטו גם את הגן המדווח ויאירו בירוק זוהר.

GEP : green fluorescent protein ( מקודד Jelly Fishגן שמקורו ביצורי ים )

כאשר מאירים לחלבון פלואורסצנטי ירוק . משמש בביוכימיה )חקר UVאותו בקרני

חלבונים( ובביולוגיה מולקולארית - בהנדסה ( ובחקר reporter geneגנטית כגן מדווח )

הביולוגיה.

59

http://www.bms.ed.ac.uk/services/staff/jmason/Research.html

GEPשימושים בגן מדווח

http://userpages.umbc.edu/~jili/ench772/greenmice.html

http://crossings.tcd.ie/gallery/Kac/Eighth_Day/

העשרה

עכברי טרנסגניים בע"ח פלואורסצנטיםהמתפתחים לעכברים ירוקים

60

הגן המוחדר בשלב הביצית המופריתיתבטא בכל התאים של כל הרקמות

http://www.uccs.edu/~rmelamed/MicroFall2002/Chapter%208/ch%208.htm

GEPחיידקי קולי שעברו טרנספורמציה עם פלסמיד נושא גן מדווח העשרה

61

תחומי השימוש בהחדרת גנים לתאי בע"ח ואדם

מחקר ) אפיון גנים (

ייצור- יתר מסחרישל תוצרים

ריפוי גני שלמחלות תורשתיות

יצור בע"חטרנסגנים

123

62

4

63

יצור תוצר פעיל ויעיל יותר בתרבית של בע"ח דורש : קיום תהליכי עיבוד משלימים לאחר התרגום בריבוזומים.1.קיפול נכון של החלבון בתא הודות לסביבה ציטופלסמית מתאימה .2.יצירת קשרי גופרית נכונים ויצירת מבנה תלת-ממדי פעיל ביולוגית 3. האפשרות לייצור מוגבר בתאי בע"ח ,עפ"י יכולת הפלסמיד להרבות את עצמו , 4.

בתא בע"ח ) ללא הצורך בהשתלבותו בגנום וללא תלות בשכפול התא(. ) לכן, ע"י הצמדה לפלסמיד חיידקי המרבה את עצמו בקצב מוגבר או ע"י

החדרה של רצף מגביר שעתוק או רצף בקרה חיובית בוקטור או בדנ"א עצמו, ניתן לקבל תא מהונדס שהוא יצרן-יתר( .

) שלב הייצור חופף לשלב הגידול(חד-שלבית נעשה במערכת ייצור ראשוני ייצור מטבוליט • לפני הגן ) לא דורש אינדוקציה, פועל קבוע ( .רצף מגביר שעתוק ורצוי לצרף לוקטור

) שלב הייצור מופרד משלב דו-שלבית )משני( נעשה במערכת ייצור שניוני ייצור מטבוליט •הגידול (

לפני הגן ) מופעל ע"י אינדוקציה רק בתום שלב הגידול (.רצף בקרה חיובי ורצוי לצרף לוקטור

ייצור-יתר בקנה מידה מסחרי של תוצרים בתרבית תאים

2

רוב התוצרים המיוצרים בתרבית תאי בע"ח הם חלבונים בעלי תוספות )דורשים עיבוד משלים( :

אינטרפרון - גליקופרוטאין , חלבון הנושא תוספת שייר סוכרי • גורם הקרישה - חלבון הנושא תוספת של קבוצה קרבוקסילית וקבוצה הידרוקסילית •

* התוספות מתווספות לאחר התרגום ויצירת שרשרת החלבון בריבוזומים. האנזימים המבצעים עיבוד משלים מצויים גם בתאי בע"ח הגדלים בתרבית.

http://www.nettally.com/prusty/gene.htm

ייצור חלבונים מרפאים בתאים של בע"ח מהונדסים ע"י וקטור נגיפי נושא גן

64

ריפוי גני של מחלות תורשתיות

מחלות גנטיות תורשתיות4000קיימות למעלה מ הרעיון להחדיר גן תקין לתאי רקמה פגומה ) תוך התעלמות מהגן הפגום ( 1.החדרת הגן התקין תעשה לתאי הגוף )תאים סומאטיים( . 2.החדרת גן תקין לתאי המין או לתאים עובריים בעייתית )כי תיקון זה עובר בתורשה 3.

לצאצאים( לגבי מחלות של גן יחיד ) הפגם נקודתי בגן בודד(רקהתיקון אפשרי ויישומי 4.התיקון אפשרי במקרים של חוסר מוחלט בחלבון או בייצור כמותי מופחת .5.התיקון לא אפשרי כשיש מחלה של קבוצת גנים או כשיש מחסור בכרומוזום שלם6.התיקון לא אפשרי כשיש ייצור-יתר או ייצור חלבון הרסני של תוצר הגן 7.

שיטות ההחדרה של "הגן המרפא" חייבות : להבטיח שילוב של הגן בכרומוזום תא המטרה • להבטיח ביטוי יציב ובקרת שעתוק ותרגום של הגן המושתל• להבטיח העתקת הגן במהלך חלוקת התא יחד עם כרומוזום התא• לבחור בתא המתאים ליצירת חלבון מעובד סופי ופעיל • לבחור בנשא או בוקטור המתאים להחדרה לרקמה הספציפית•

3

65http://peer.tamu.edu/curriculum_modules/Cell_Biology/module_4/whyitmatters.htm

גן תקין

הזרקה לתאי הגוף )סומאטיים(

הזרקה לביצית מופרית

ריפוי גניסומאטי

הגן נמצא אצלי רק בתאים אליהם הוחדר ולא בכל גופי

ולכן לא יעבור לצאצאי בתורשה.

הגן נמצא אצלי בכל התאים של כל הרקמות וגם בתאי המין שלי ולכן

יעבור גם לצאצאי בתורשה

כל התאים שלי טרנסגנים

הגן הפגום עדיין אצלי אך לא פועל. הגן התקין נמצא אצלי

רק בתאי הרקמה אליה הוחדר לצורך תיקון ולא

יעבור לצאצאי בתורשה.

משמעות התהליכים: החדרת הגן לתאי הגוף , החדרת גן לתאי המין , וריפוי גני

66

שימוש ב רטרו וירוס – עיקרון החדרת גן מרפא לתא מטרה

מהם נגיפי רטרו ? ,חד-גדילי, RNAנגיפי רטרו, הם נגיפי סרטן , המכילים גנום שהוא חומצת גרעין

(. אנזים זה, הוא RTבתוך ליבה חלבונית המכילה גם אנזים המתעתק לאחור ) דנ"א פולימרז, המשתמש בתבנית רנ"א חד- גדילי כדי לבנות דנ"א . נוצר סליל

של היבריד רנ"א-דנ"א . הליבה , שהיא נוקליאופרוטאין , ארוזה ועטופה מסביב במעטפת חיצונית,

חלבונית.מהמעטפת החיצונית יוצאים זיזים חלבוניים המשמשים לספיחת הנגיף לתאים חיים.

השלבים בחדירת הנגיף לתא המטרה : הנגיף הוא פרזיט תוך-תאי. גדל ומתרבה רק בתוך תא חי.

. המעטפת החיצונית, מצוידת בזיזים ,נקשרת באמצעותם לאתרים מיוחדים 1)קולטנים(, שעל קרום תא המטרה המודבק.זהו שלב הספיחה.

. לאחר הספיחה לקרום התא, המעטפה נשארת מחוץ לתא , והליבה , שהיא 2נוקליאופרוטאין מוזרקת פנימה לציטופלסמה של התא המודבק.

ע"י האנזים הנגיפי DNA ( של הנגיף מועתקת ל RNA. חומצת הגרעין ) 3המתעתק לאחור.

. אנזים אחר תאי, דנ"א פולימרז , הופך את סליל הדנ"א לדנ"א דו-גדילי . 4. הדנ"א הנגיפי , במצב דו-סלילי, חודר לגרעין ומשתלב בדנ"א התאי. גנום 5

הנגיף מוכפל במהלך התחלקות התא ועובר תעתוק ותרגום ליצירת חלבוני הנגיף.

. מולקולות של גנום הנגיף נארזות ונעטפות בחלבוני מעטפת הנגיף ליצירת 6נגיפים בשלים בעלי יכולת יציאה מהתא ויכולת הדבקת תאים שכנים.

. יציאת הנגיפים הבשלים מהתא נעשית ע"י הנצה דרך קרום התא המודבק. 7

67

RTאנזים נגיפי בתוך הליבה

רנ"א גנומי נגיפיבתוך הליבה

מעטפת חלבוניתפנימית מסביב לליבה

)קפסיד(זיזים חלבוניים של המעטפתהחיצונית יותר

מבנה נגיף רטרו

איור : מחזור חייו של נגיף רטרו בתא בע"ח

הסבר לאיור : הנגיף מדביק תא חי של בע"ח . בעזרת זיזים חיצוניים הוא נספח לרצפטורים על קרום התא.1.הוא מחדיר את הליבה לציטופלסמה של התא המודבק ויוצר עותק דנ"א של ה רנ"א הגנומי שלו ע"י האנזים 2.

RT. הדנ"א הופך לדו-גדילי , ע"י אנזים תאי , חודר לגרעין התא, ועובר אינטגרציה לגנום התאי. 3.הגנים הנגיפיים עוברים תעתוק )טרנסקריפציה( בגרעין . 4.בציטופלסמה מתקיים תרגום ) טרנסלציה( לחלבוני הנגיף. 5.מתקיימת התארגנות עצמית )אסמבלי (. חלבוני הנגיף עוטפים את חומצת הגרעין הנגיפית ויוצרים מעטפת. 6.68הנגיף הבשל מניץ מתוך קרום התא החוצה. 7.

נגיף רטרו בשלhttp://www.bham.ac.uk/ChemEng/actg/actgres.htm

http://ghr.nlm.nih.gov/ghr/picture/gene_therapy

נגיף וקטור-מרפא מדביק תא מטרה ע"י התקשרות לקולטנים ספציפיים על התא

העשרה

69

הנדסת נגיף רטרו לשימוש בריפוי גני של בני אדם

בניית פרו ווירוס מרפא :1.הוצאת גנים רעים מהנגיף ) גנים האחרים על יצירת חלבוני מעטפת הנגיף (•

) סיגנל פסי + ( אך שומרים על סיגנל יכולת ההתעטפות של הנגיף ) נושא גן מרפא (מתקבל פרו ווירוס מרפא והכנסת הגן המרפא במקומם בתוספת רצף מגביר תעתוק לפני הגן =

אריזת חלקיקי הנגיף והבשלתם לוקטור מרפא בטוח :. 2 החדרת הפרו ווירוס מרפא לתא אריזה ,שהוא תא ביניים שבו הווירוס יבשיל . הנגיף•

יתעטף בחלבוני מעטפת לא שלו ) של ווירוס אחר מסייע( ויהיה בשל להדביק תאים . הפרו ווירוס המרפא מוחדר ביחד עם פרו ווירוס אחר, פרו ווירוס מסייע )לא מרפא (. הווירוס המסייע עבר קודם •

פסי - (שינוי גני ע"י הוצאת סיגנל ההתעטפות ממנו ) הסיגנל נעדר ולכן הוא אך שמרו על יכולתו לייצר חלבוני המעטפת לצורך אריזה ) אם כי הוא עצמו מנוע מלהשתמש בהם (

הגנום של שני הפרו ווירוסים עובר אינטגרציה בכרומוזום תא האריזה. • הגנום מועתק בתא האריזה . גנום הפרו ווירוס המסייע מייצר חלבוני אריזה אך לא יכול לעטוף את עצמו בהם. •

הפרו ווירוס המרפא, שאין ביכולתו לייצר חלבוני אריזה, משתמש בחלבונים של הפרו ווירוס האחר כדי לארוז את מתקבל וירוס בשל שהוא " וקטור בטוח "עצמו ולהבשיל לווירוס אינפיקטיבי וליציאה מהתא =

הדבקת תא המטרה להחדרת הגן המרפא:. 3 חלקיקי הנגיף הבשל יוצאים בהנצה מתא האריזה ועוברים להדביק את תאי המטרה המיועדים •

לריפוי בעזרת המעטפת החלבונית הם נספחים לקרום תאי המטרה ומזריקים את הליבה לציטופלסמה• ואח"כ לדנ"א דו-גדילי ע"י דנ"א פולימרז RT רנ"א הנגיף הופך לעותק דנ"א ע"י האנזים הנגיפי •

תאי גנום הנגיף עובר אינטגרציה בכרומוזום התא . הנגיף אינו יכול להתרבות מחוסר חלבוני מעטפת• הגן המרפא בעזרת רצף מגביר שעתוק המחובר אליו לפני הגן עובר תעתוק ןתרגום לחלבון •

מרפא 70

יתרונות וחסרונות השימוש בנגיפי רטרו בריפוי גני

מגבלות וקשיים : האינטגרציה בכרומוזום תא המטרה מתקיימת רק בתאים מתחלקים •

)מתרבים( מקום השתלבות גנום הנגיף בכרומוזום אקראי ועלול להיות באמצע גן חיוני •

ולבטל בכך את ביטויו . יש סכנה להתמרה סרטנית אם הנגיף ישתלב באתר הקרוב לאתר •

פרו-אונקוגני )בעל פוטנציאל ליצירת סרטן(

יתרונות השימוש בנגיפי רטרו : מדביקים טבעית תאי מאחסן ומצוידים במנגנון טבעי להחדרת הגנום לתוך •

התאRT מבטיחים השתלבות הגן המרפא בכרומוזום התאי, הודות לאנזים • קל להוציא מהם גנים מזיקים ) הגן ליצירת חלבון המעטפת ( ולהבטיח בכך, •

יצירת וקטור )נשא( בטוח לריפוי גני. קל לבטל את יכולת הריבוי שלו בתא המטרה המיועד לריפוי הגני .•

71

http://www.york.ac.uk/depts/biol/units/cru/gendeliv.htm

סיכום של סוגי וקטורים המשמשים בריפוי גני

72

העשרה

http://www.hosppract.com/genetics/9910mmc.htm

דרכי החדרת הגן לתא בע"ח ע"י נשאים שונים העשרה

73

(ex-vivoשיטת הריפוי הגני בתרבית תאים )

שיטת טיפול מקובלת היום : מוציאים תאים ספציפיים של רקמה חולה, מהחולה1.מגדלים ומרבים אותם מחוץ לגוף. יוצרים תרבית תאים .2.מחדירים בעזרת נגיף רטרו – נשא את הגן המרפא לתאים 3.

-exבתרבית )הריפוי מתבצע בתאי החולה עצמו מחוץ לגוף – vivo)

התאים המתוקנים, מוחזרים לגוף החולה ומבטאים חלבון שחסר 4.או חלבון תקין ) במקום החלבון הפגום (.

התנאים להצלחת השיטה : תאים חזקים יציבים,שניתן לגדלם מחוץ לגוף , בתרבית.• תאים נגישים , קל להוציאם מהגוף וקל להחזירם .• תאים בעלי טווח חיים ארוך בגוף כדי שהטיפול יהיה יעיל •

לזמן רב. תאים חדירים לנגיף- נשא של הגן המרפא•

התאים המתאימים לדרישות הנ"ל הם : תאי עור – דרמיס )פיברובלסטים(• תאי מח העצם ) תאי גזע (• לימפוציטים ) תאי דם (• תאי כבד•

74

(ex vivoעיקרון שיטת הריפוי הגני באדם )

. מוציאים מהגוף 1תאים שהגן בהם פגום

. בעזרת נגיף רטרו 2מחדירים גן תקין לתאים

הופך את ה רנ"א RT. האנזים 3הנגיפי

לדנ"א המשתלב בדנ"א של התא ומתקבל תא רקומביננטי

. מחזירים 4לגוף את התאים

המתוקנים

http://www.themronline.com/200412m2.html

http://www.themronline.com/dec04-19.jpg

75

דוגמה לתאים המתאימים לשימוש בריפוי : תרבית משתלי עורגני

הסיבה לשימוש בתאי העור לריפוי גני : הם חיצוניים ונגישיםא- קל להוציאם וקל להחזירם לגוף ב- הם תאים חזקים ועמידים בתרבית מחוץ לגוף ג- הם חדירים לנגיף-נשא הגן המרפאד- מתרבים במהירות ובכמויות בתרבית מחוץ לגוףה- יש להם יכולת להפריש חומרים מחוץ לתא למחזור ו-

הדם

שלבי השיטה : מגדלים תאי עור ) פיברובלסטים של הדרמיס ( בתרבית1. מחדירים לתאים בתרבית גן מרפא בעזרת נגיף רטרו 2.ושותלים את השתל בדרמיס עור של החולה . קולגן משבצים אותם בתוך ג'ל של 3. השתל נקלט ומתמלא בנימי דם .4. . הפיברובלסטים המהונדסים מייצרים ומפרישים לדם את התוצר המרפא5

76

כתחליף לרקמה המטרה להשתמש במשתלי עור מהונדסים לייצור חלבונים מרפאים בגוף , האמורה לייצר באופן טבעי את החלבון. ההנחה היא, שמחזור המקורית )בעלת הגן הפגום (

הדם יעביר את החלבון המופרש משתל העור לרקמות הזקוקות לו.

בתחום יישום של ההנדסה הגנטית והריפוי הגני משתמשים בשתלי עור ) פיברובלסטים ( להחדרת גנים תקינים, כתחליף לרקמה הטבעית המייצרת את תוצר

הגן.

http://www.biologicalprocedures.com/bpo/arts/1/72/m72f1lg.htm

פיברובלסטים מהונדסים המשמשים בריפוי גני גדלים במצע ג'ל קולגן

חשיבות הקולגן בתרבית תאים ראשונית : הקולגן מספק רקמה תומכת לתאים המחברת בין התאים המתפתחים בתרבית. • הקולגן מעודד התרבות והתמיינות של התאים בתרבית• הקולגן מעודד ספיחת התאים ומאריך את משך חיי התרבית•

77

העשרה

מחלות תורשתיות המתאימות לטיפול ע"י ריפוי הגני

התנאים להצלחת השיטה של הריפוי הגני :המחלה התורשתית נובעת מפגם בגן יחיד בודד בלבד. 1.הפגם הוא היעדר מוחלט או ייצור מועט של החלבון ) מחלות 2.

חסר (אם הפגם הוא ייצור-יתר ) מחלות עודף ( או ייצור חלבון הרסני אין 3.

משתמשים בשיטה זו. יש נשא מתאים להחדרת הגן לסוג התאים הספציפי המעורב 4.

דוגמאות למחלות תורשתיות המתאימות לריפוי גניבמחלה.

היפר כולסטרמיהתלסמיהסיסטיק פיברוזיס המופיליה

חסר חלבון הפגם :האחראי למעבר יוני

הכלוריד דרך קרום תאי האפיתל של הריאות.

הצטברות ריר התוצאה:בסמפונות ובריאות

דלקות ריאות המחלה:חוזרות וקשיי נשימה.

חסר חלבון הפגם :)חלבונים( האחראי

לקרישת הדם. דימום התוצאה:

לאחר פציעה ללא אפשרות קרישה .

איבוד דם המחלה:בפציעות רב.

חסר חלבון הפגם :המשמש קולטן

לליפופרוטאין מסוים הצטברות התוצאה:

כולסטרול ושומנים בדם.

סתימת המחלה:כלי דם בגיל צעיר.

חסר חלבון הפגם :האחראי לבניית

ההמוגלובין שבדם. בעיות התוצאה:

בהובלת חמצן לרקמות הגוף .

אנמיה המחלה:חמורה ) חוסר דם (

78

(CFדוגמה לשימוש בריפוי גני של סיסטיק פיברוזיס )

סיסטיק פיברוזיס : זו מחלה תורשתית של גן אחד• יש פגם גנטי בתפקוד תאי אפיתל של הריאות• הפגם : מחסור בייצור חלבון - נשא בקרום האחראי על הכנסת יוני הכלוריד לתאים• הנזק : הצטברות ריר סמיך בסמפונות ובריאות הגורם לדלקת ולחוסר נשימה• סכנת מוות• 1:2500 תדירות המחלה : •

בעזרת נגיף ) השתמשו בנגיף אדנו (CFניסויים בריפוי גני של

79 http://www.hosppract.com/genetics/9910mmc.htm

העשרה

ע"י ריפוי גני של תאי גזע ממוח ADA-SCIDטיפול במחלת העצם

:SCIDהמחלה מחלה תורשתית של מערכת החיסון•הפגם במח העצם• , הגורר Tבדם ההיקפי, יש חסר בלימפוציטים מסוג •

.Bאי תפקוד של לימפוציטים מסוג החסר מתבטא באי יכולת הגוף לפתח תגובה •

חיסונית נגד זיהום מיקרוביאלי . המחלה נקראת "מחלת כשל חיסוני חמור מורכב" - •

כי יש פגיעה בתפקוד סוגים שונים של תאי הדם הלבנים .

Complex Immuno Deficiency = SCID ( Severe)

:SCID-ADAהביוכימיה של המחלה מונע )ADA ) Adenosine De Aminaseהאנזים

הצטברות רעילה של אדנוזין, בתוך תאי הגזע במוח העצם, ע"י פירוקו ושחרור קבוצה אמינית

ממולקולת האדנוזין )דאמינציה( . אם האנזים פגום ,מצטבר אדנוזין בתאים בכמות רעילה

.Tהגורמת למות תאי הגזע של לימפוציטים

הפנוטיפ: תקין בתאי-הגזע )תאי מוצא( ADAמחסור באנזים •

, הגורם למותם במח העצם.Tשל לימפוציטים מסוג מחסור בתאי גזע תקינים במח העצם.• בדם ההיקפי ובעקבות זאת יש Tמחסור בלימפוציטים •

כשל חמור של מערכת החיסון העלול לגרום למוות.

) אחד מסוגי המחלה(SCID-ADAמחלת הפגם בגנוטיפ:

בתאי ADAמוטציה בגן המקודד ליצירת האנזים • .Tהגזע )תאי מוצא( , שמהם נוצרים לימפוציטים

ADAאין פעילות של אנזים •

העשרה

80

החדרת גן מרפא לתאי מח העצם - דוגמה לריפוי גני של מערכת החיסון

81

העשרה

. מוציאים תאי 1מח עצם מהתינוק

. ריבוי וגידול 2התאים בתרבית

וברירה של תאי חיסון

. מדביקים את 3התאים

בנגיף נושא גן מתקן

. בוררים את 4התאים

המכילים גן מתקן

. מחזירים את התאים 5המתוקנים לגוף התינוק

. לאחר שבועיים מערכת 6החיסון מגינה מפני זיהומים

http://www.jeansforgenes.com/2_about/2070_howitworks.php

עיקרון ייצור בע"ח טרנסגני :מחדירים את גן המטרה ישירות לגרעין תא ביצית מופרית )או בשלב עובר(

ע"י מיקרוהזרקה. הגן משתלב בגנום התאי .

מאפיינים ויתרונות השימוש בבע"ח טרנסגנים :גן המטרה מתבטא בכל התאים של כל הרקמות בבע"ח )הגן הוחדר 1.

בשלב ביצית מופרית(.הביטוי יציב לכל משך חייו .2.הגן עובר בתורשה מדור לדור לצאצאים . ) יתרון (3. ) בע"ח ביו-ריאקטוריםתוצר הגן מיוצר בנפחים גדולים בבע"ח 4.

טרנסגנים, המשמשים יצרנים של תוצר מסחרי (, בהשוואה לתרבית תאים ) יתרון ( .

בהשוואה לתרבית תאים זולה יותרעלות הייצור בבע"ח טרנסגני 5.) יתרון (

ייצור זנים טרנסגנים של בע"ח 4

82

http://www.learner.org/channel/courses/biology/archive/animations/hires/a_gmo3_h.html

סרטון של ייצור בע"ח טרנסגני המפריש חלבון אדם ) בחלב (

http://highered.mcgraw-hill.com/sites/0072919345/student_view0/chapter16/elearning.html#

השתלה בעז אם פונדקאית

ולד עז טרנסגנית

עיקרון הכנת בע"ח טרנסגני

מיקרו הזרקה של גן האדם לביצית המופרית

חלב עז מכיל חלבון אדם. מבודדים מהחלב את חלבון האדם

בידוד גן אדם בידוד ביצית מעז והפרייתה

83

תחומי שימוש בבע"ח טרנסגנים :

השבחת זנים / השבחת מוצרים מבע"ח בתחום החקלאות1. הקניית עמידות לבע"ח כנגד מחלות • קצב גידול וריבוי מהיר יותר •איכות צמר משופרת בכבשים • דגים המתרבים מהר יותר•

ייצור בע"ח טרנסגנים ביו-ריאקטורים בתחום הרפואה 2. עז המייצרת ומפרישה פלסמינוגן אקטיבטור של אדם בחלב•פרה המייצרת ומפרישה לקטופרין של אדם בחלב•

http://www.unc.edu/~unclng/cow.jpg84

אנימציה של יצירת בעל חיים טרנסגניhttp://www.learner.org/channel/courses/biology/archive/animations/hires/a_gmo3_h.html

אתיקהhttp://www.shef.ac.uk/b/bioethics-today/Lancaster/animal/transgenic.htm

אתיקה העשרה

85

אתיקה http://www.accessexcellence.com/RC/debates.html

איחוי פרוטפלסטים http://www.biologie.uni-hamburg.de/b-online/e29/29c.htm

אמצעים לשיפור טרנספקציהhttp://www.bmb.psu.edu/courses/biotc489/notes/transform.htm

ריפוי גני http://www.ornl.gov/sci/techresources/Human_Genome/medicine/genetherapy.shtml

http://ghr.nlm.nih.gov/ghr/picture/gene_therapyhttp://biology.kenyon.edu/slonc/gene-web/Lentiviral/Lentivi2.html

http://users.rcn.com/jkimball.ma.ultranet/BiologyPages/P/PackagingCell.gifhttp://stemcells.nih.gov/info/scireport/chapter11.asp

http://www.jeansforgenes.com/2_about/2070_howitworks.phphttp://www.york.ac.uk/depts/biol/units/cru/gendeliv.htm

http://faculty.uca.edu/~johnc/biotec1440.htm

מחלות תורשתיות המטופלות בריפוי גני http://users.rcn.com/jkimball.ma.ultranet/BiologyPages/G/GeneTherapy.html

SCID - ADAמחלת http://dragon.zoo.utoronto.ca/~jlm2001/J01T0601B2/MainText.html

ADAשימוש בנגיף רטרו לריפוי גני של מחלת http://dragon.zoo.utoronto.ca/~jlm2001/J01T0701E/retrovirus.html

ריפוי גני של סיסטיק פיברוזיסhttp://ehp.niehs.nih.gov/docs/2001/109-1/forum.html

http://www.hosppract.com/genetics/9910mmc.htm

העשרה

86

ריפוי גני http://www.amalnet.k12.il/meida/biolog/bioi0145.htm

ריפוי גנים על שולחן הניתוחיםhttp://www.snunit.k12.il/science/biology/a_gripui.html

שיבושים גנטיים ותיקונםhttp://www1.snunit.k12.il/heb_journals/kimat2000/11-40.htm

המהפכה הגנטית http://www1.snunit.k12.il/heb_journals/galileo/006012.html

העשרה

http://www.bham.ac.uk/ChemEng/actg/actgres.htm87

אנימציה של חדירת נגיף לתא בע"חhttp://www.hhmi.org/biointeractive/animations/infection/inf_middle_frames.htm

מידע על חלבונים מרפאים :

אינסולין •http://users.rcn.com/jkimball.ma.ultranet/BiologyPages/P/Pancreas.html

9 , פקטור 8 פקטורי קרישה - פקטור •http://users.rcn.com/jkimball.ma.ultranet/BiologyPages/C/Clotting.html#Bleeding_disorders

הורמון הגדילה •http://users.rcn.com/jkimball.ma.ultranet/BiologyPages/P/Pituitary.html#GH

אריתרופואטין •http://users.rcn.com/jkimball.ma.ultranet/BiologyPages/K/KidneyHormones.html#epo

מפעיל פלסמוגן •http://users.rcn.com/jkimball.ma.ultranet/BiologyPages/C/Clotting.html#tpa

הפקת חומרי רפואה•http://users.rcn.com/jkimball.ma.ultranet/BiologyPages/R/RecombinantDNA.html#Some_recombinant_DNA_products_being_used_in_human_therapy

העשרה

88

DNA Vaccineחיסון בדנ"א ע"י פלסמיד מחסן

חיסון בדנ"א התפתח בעקבות ריפוי גני • משתמשים בפלסמיד הנושא גן עבור חלבון אנטיגני , המוחדר לגוף כדי •

להשרות תגובה חיסונית ספציפית לחלבון המטרה שהגן מקודד עבורו . הוקטור : דנ"א פלסמידי הנושא גן + פרומוטור + רצף מגביר תעתוק • : תת-עורית או לתוך הדרמיס או לתוך השריר או ע"י תותח In Vivo ההזרקה •

גניםיתרונות החיסון עם דנ"א :

הפלסמיד יכול לקודד עבור יותר מאפיטופ אחד • חיסון זה מעורר תגובה תאית חזקה וגם יצירת נוגדנים • אפשר לייצר חיסון זה בצורה מסחרית • החיסון לטווח ארוך • אין סכנת זיהום בנגיפים • חיסון לא יקר•

חסרונות : אינטגרציה בכרומוזום התא לא בשליטה • סכנת יצירת נוגדנים כנגד הדנ"א • סכנה לשינוי בבקרת התאים ופגיעה בהם • סכנה להשרות סבילות חיסונית לאנטיגן • לא יעיל באנטיגן לא חלבוני •

העשרה

89

איור עיקרון החיסון בדנ"א

העשרה

90

בע"ח טרנסגניים http://highered.mcgraw-hill.com/sites/0072919345/student_view0/chapter16/elearning.html

http://www.mhhe.com/biosci/genbio/maderbiology7/student/olc/chap17-outline.mhtml

http://users.rcn.com/jkimball.ma.ultranet/BiologyPages/T/TransgenicAnimals.html

http://www.btgplc.com/about/Interferons.html

http://www.avigenics.com/services.htm

http://www.rbej.com/content/1/1/80/figure/F2

http://www.biotech.iastate.edu/biotech_info_series/bio10.html

http://www.agresearch.co.nz/scied/search/biotech/gene_gmomaking_animal.htm

מבע"ח טרנסגני 8הפקת פקטור http://www.ext.vt.edu/pubs/biotech/443-003/443-003.html#L2

הסבר של השיטה http://www.cartage.org.lb/en/themes/Sciences/Zoology/AnimalPathology/TransgenicAnimals/TransgenicAnimals.htm

העשרה

91

שימושים והתועלת בבע"ח טרנסגניים לאדם

http://users.rcn.com/jkimball.ma.ultranet/BiologyPages/T/TransgenicAnimals.html

http://www.actionbioscience.org/biotech/margawati.html

http://users.rcn.com/jkimball.ma.ultranet/BiologyPages/T/TransgenicAnimals.html

http://www.ag.uiuc.edu/~vista/html_pubs/irspsm91/transfor.html

http://users.rcn.com/jkimball.ma.ultranet/BiologyPages/T/TransgenicAnimals.html

העשרה

92