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Zur )Iethodik und klinischen Anwendung der triigerfreien priiparativen DurchfluSelektrophorese Von

K . WINK, H . - ~ . v . OLDNR.SItAUSEN u n d F . KLASCHKA

Aus der II. Medizinischen (I~ffektions-)Abteilung (Chefarzt: Prof. Dr. F. O. t t 6 n ~ ) un4 der tIautklinik tier Freien Universit~ (nirek~or: Prof. Dr. H. W. SH~:~) im Rudolf-Virchow-Krankentm.as, ]3ertin

Ffir die preparative elektrophoretisehe Auftren- nm~g yon Stoffgemisehen auf Tr~gern (wie Papier oder Agar) ist die kontinuierliche Methode (G.aASS:gA_<N und HAiNNIG 1949, 1950; SVJSh'SSOS und B3~ATTSTEN 1949) der diskontinuierliehen gegenfiber im Vorteil, da bei der ]etzteren jeweils nm" eine begrenzte Menge in einem Versueh aufgetrennt werden kann, trod die Fraktionen naeh erfolgter Trennung miihsam aus dam Trgger zurfiekgewonnen werden miissen. Die trgger- freie diskontinuier]iehe Methode hat f/Jr prgparative Zweeke nnr eine geringe Bedeutung, da ]edigtich die beiden begrenzenden Fraktionen gewonnen werden kSnnen. Der Trggerelektrophorese haften jedoeh einige M/ingel an, die sieh gerade bei der Gewinnung biotogischer Substanzen (z. B. Enzyme, bindungs- aktive Gruppen, Zellen u.a.) bemerkbar machen. Diese Mgngel ergeben sich einmaI ans der Natur des Trfigers, der meist aus Papier besteht. Es kommt zu einer Adsorption der Substanzen an das Papier, die erst naeh einer Absgttigung nieht mehr stattfindet und dann die Trennung nieht mehr stSrt (WNBEn). Das ist besonders zu beaehten, wenn nnr eine geringe Menge der Trennsubstanz zur Verffigung steht. Ffir Stoffe, die veto Trfiger sehr leieht absorbiert werden, ist eine Trennnng im heterogenen System fiberhaupt nieht mSglieh.

Zum anderen ist eine St6rquelle im Prinzip der Trager-DurehfluBelektrophorese zu suehen: ~ber einen, in einer feuehten Kammer h~ngenden Bogen aus Filtrierpapier fliet3t in der Vertikalen der Trennpuffer mit der darin enthaltenen Trennsubstanz. Diese hat dadureh einen innigen Kontakt mit dem umgebenden Luftsauerstoff, wodureh es zu Oxydationen und damit zu Ver~nderungen der biologisehen Aktivitgt aufge- trennter Fraktionen kommen kann.

Demgegentiber versprieht die kontinuierliehe tr/~- gerfreie Elektrophorese wesentlJehe Vorteile, denn hierbei befindet sieh die Trennsubstanz lediglieh in einem Pnffermitieu ohne Kontakt zu einem Tr~ger oder znm Luftsauerstoff.

Die kontinuierliehe Tr/~gerelektrophorese gestattet sieh jedoeh methodiseh einfaeher, da dureh den Tr/~ger der Pufferstrom stabitisiert wird. Die Sehwierigkeit, eine kontinuierliehe Elektrophorese ohne Trgger dnrehzuf/ihren, liegt in dem Problem, die Pufferstr6- mung zu beherrsehen, wobei einige allgemeingiiltige Forderungen zu erf/illen sind. So muB es m6glieh sein, mit nieht zu grol3em Arbeitsaufwand ein Vielkompo- nentengemiseh in die einzetnen Fraktionen zu zer- legen, und dabei sowohl grote Mengen der Trennsub- stanz aufarbeiten zu kSnnen, als aueh zu eindeu-

tigen und gut reproduzierbaren Trennergebnissen zu k o m m e n .

Je grSBer die Gesehwindigkeit des strSmenden Puffers ist, um so mehr Trennsubstanz kann ibm bei- gegeben werden. Bei einem sehnellen Pufferstrom mul3 abet die angelegte Spannung hoeh genug sein, um eine ausreiehende Trennung zu erzieten. Dabei wird jedoeh eine entspreehend grol3e Joulesehe W/~rme erzeugt, die sofort und votlstandig abgeMtet werden mug, da sieh bei jeder Temperatursehwankung dureh die W/~rmekonvektion eine ~nderung der Versuehsbedin- gungen ergibt. Das Problem der W~rmekonvektion besteht f/it die Tr~gerelektrophorese nieht. Deft ist die Verdunstung ein stSrendes Moment, die jedoeh naeh HA~Nm (1958) bei entspreehender Teehnik yon Vorteil sein kann, um die Fraktionen sehon w~hrend der Trennung zu konzentrieren.

Es zeigt sieh damit, dab die tr/~gerfreie Durehflug- elektrophorese im wesentliehen yon zwei Punkten bestimmt wird:

a) Die Str6mung des Puffers mug gleiehm~gig laminar sein und so beliebig lange aufreeht erhalten werden k6nnen.

b) Der strSmende Puffer mug stets eine konstante Temperatur haben.

Es ist das Verdienst yon BAt~I~OJ~LINI~, ~rATZX~ und GIBIASr (1958), als erste ein Ger/~t entwickelt zu h~ben, fiir das die bew/ih~en Prinzipien der kontinu- ierlichen Trggerelektrophorese /ibernommen wurden, der Tr~ger jedoch fortfM.

Dieses Ger~t 1 besteht im wesentlichen aus zwei Gl~s- platten mit den Abmessungen 59× 50 era, die aufeinander- gelegt und dureh an beiden Seiten eingelegte t~iltrierpapier- streifen in einem Abst.and yon etwa 0,5 mm gehMten werden. Diese Filtrierpapierstreifen stellen gleiehzeitig die Verbindung zu den an den Seiten befindlichen Elektrodenf, rSgen her. Der Trennpuffer wird auf Zellstoffbrfieken getropft, gelangt yon deft in die Trennkammer und wird fiber Filtrierpapierstreif- chert abgenommen und zu Sammelglgsern geleitet. Durch Bohrungen in der oberen Glasplatte erfolgt die kontinuierliche Zugabe der Trennsubstanz. Die Glasplatten sind in ihrem Inneren gekammert und werden yon einer Kfihlfliissigkeit (Glyeerin-Wassergemiseh im Verhgttnis 1 : 4) durehflossen.

Diesem System batten jedoeh einige Naehteile an, die in der Art des Puffertransports begr/indet waren und eine Modifikation notwendig machten (WINK I962, 1964). Verantwortlieh f/ir das Fliegen des Puf- fers waren die Filtrierpapierstreifen, die dureh Sog oder als Heber den aus der Kammer angebotenen Puffer ableiteten. Abgesehen davon, dab unter diesen Bedingungen die Gesehwindigkeit der PufferstrSmung

1 Hersteller: K. Marggraf oHG, I Berlin 12, Grolman- straBe 44/45.

358 K. W~K et M.: Klinisehe Anwendung der tr~gerfreien pr~parativen Durehflugelektrophorese Klinische Wochenschrift

nur in sehr engen Grenzen variierbar war, gen/igten bereits geringf~gige St6rungen wie Ersehfi~terungen, ~nderungen der Luftfeuehtigkeit and ghnliehes, um die Pufferableitung zu ver~ndern und damit die Gleieh- m/iBigkeit aufzuheben.

Zum anderen erbraehte die Verwendung yon Glas- ptagten einen Naeh~eil. Eh~e Glasplatte yon der Ab- messung 50 × 50 em biegt sieh nach einigem Gebrauch dutch, wodureh sich eine Ver~nderung der HShe des Trennspaltes ergibt, die dann zu inkonstanten Str5- mnngsverhgltnissen fiihrt. Das Durehbiegen der Glas- platten liegt in der Natur des Materials begrtindet and nicht in der }Vasserkiihlung, wle es t taN~m (1961) annimmt. Dureh Einlegen kleiner Kunsts~offseheib-

Abb. 1, Aufsicht auf die Trennk~mmer w~hrend des Trennvorganges. Getrenn~ werden die Farbstoffe Bromphenolblau, Neu-Cocein und Indigotetrasutfonat

ehen in den TrennspMt (H6~z:~, NOACK und %V~EK 1960), die sautenartig die obere Glasplatte abstii~zen, konnte das Durchbiegen verhindert werden. Die Seheibehen (aus Teflon) finden aueh in der modifi- zierten Apparatur Verwendung, sie stSren die Tren- nung nieht.

Die Modifikation der tr/igerfreien DurehflnBelek- trophorese ging yon der i~berlegung aus, die Pnffer- strSmnng meehaniseh zu kontrollieren und damit yon /~uBeren Zufglligkeiten unabh/~ngig zu maehen.

Die beiden yon der Kiihlfliissigkeit durehstrSmten Glas- platten liegen horizontal aufeinander. Sie werden dureh Teflon-Seheibchen in einem definierten Abstand gehalten (0,5 ram). An allen vier Seiten sind sie dnrch einen Silikone- Kleber (Waeker-Chemie, Mtinehen) fesg versehlossen. Somit entsteht zwisehen den Glasplatten ein Hohlraum, die Trenn- kammer. Der Trennpuffer gelangt yon einem GefgB am hinteren Teil der Apparagur in die Trennkammer, wobei ein Filter zu passieren ist, um grobe Verunreinigungen der Kam- mer zu vermeiden. In diesem Gef~13 wird fiir ein st~ndig gleichbleibendes Niveau gesorgt (NiveaugeNB). Am vorderen Tell der Kammer befinden sieh in der unteren Glasplatte 49 Bohrungen. Von diesen Bohrungen Nhren Seh]~uehe zu einer Abnahmevorriehtung. Diese besteht aus kteinen Be- chern gleiehen FassungsvermSgens, in die in zeitlieh wghI- baren Abst.gnden tdeine Stifte genormter Gr6ge eintauchen. Dadureh wird der Puffer verdr~.ngt (Verdr~nger) and fliel?t fiber. Der iiberfliel~ende Puffer wird in 49 Sammelgefgl3e ge- leitet, die wa.hrend eines Versuehes mfihelos geweehselt werden kSnnen. Sie befinden sieh in einer Xfihlkammer, um fiir emp- findliche Substanzen eine Temperatnrkonst~anz zn gew~r- leisten. Dutch kleine frei bewegliche Stifte am Boden der

Becher wird im Sinne eines Riickschlagventfls ein RtickstoG zur Kammer hin vermieden.

Niveaugefi~B-Trennkammer-Verdr~ngerbecher bilden eia System kommunizierender tl,Shren (HA~'m 1961), womit durch eine konstante FiillhShe im Niveaugefg~13 eine ebensolche in den Beehern resultiert. Wird am Verdr/~nger Puffer ent- nommen, flieGt eine bestimmte Menge st~ndig nach, bis der alte Gleichgewichtszustand wieder erreicht ist. Dadurch kommt ein kontinuierlieher Pufferstrom zustande. Seine Gesehwindigkeit ist durch die FiillhShe des NiveaugefiiGes and den zeitlichen Abstand der Pufferentnabme meehaniseh exakt regel- und reproduzierbar.

An der oberen GIasplatte befinden sich zu beiden Seiten die Etektrodentr5ge, die durch Bohrungen in ihrem Boden mit der Trennkaramer verbunden sind. Die :Bohrungen sind mit Asbest- und Glaswolle gel/flit, um ein hydrostatisches Gef~lle zwisohen Trot und Kammer zu vermeiden. Die Sub-

stanzzugabe effolgt fiber eine stufenlos regelbare Walzenpumpe, wobei die Trenn- substanz kontinuierlieh wahlweise tiber eine von ftinf Bohrungen in der oberen Glasplatte in die Trennkammer gegeben werden kann. Die Klemmenspannung kann zwisohen 500 und 3000 Volt gewa.hlt werden.

Die GesamZanlage besteht aus der beschriebenen Trennkammer sowie einem Spannungskonstanthalter und einem K~ihlaggregat mit Umtaufpumpe. Abb. 1 zeigt eine Aufsieht auf die Trennkammer w~hrend einer Trennung der Farbstoffe Bromphenolblau, Neu- Coeein (Agfa-Werke) und Indigotetra- sulfonat.

Es wurde das schon yon BAlaROL- L~E~ U. Mitarb. durchgeffihrte Prinzip der Wasserkiihlung beibehalten, da da- mit das eingangs bereits besproehene Problem der exakten Temperatur- regelung naeh unseren jahrelangen Erfahrungen gut 15sbar ist. KAN~-m (1961) benutzt ffir das yon ihm an- gegebene Ger~t zur tr~gerfreien Dureh-

flngelektrophorese gekfihlte Luft, mit der die Gtas- platten bestrichen werden, wodureh eine ausreiehende Warmeabfuhr erzielt ~4rd. Wir ziehen die Wasser- kfihlung jedoeh aus einem anderen Grand vor. I)ber ein in sehr engen Grenzen einstellbares Kon~akt- thermometer kann die Temperatur der Kiihlflfissig- keit am Ort der Wirkung, also an der Trennkammer, genau bestimmt und konstant gehalten werden. Da- mit lafit Meh der Vorsehlag yon Tis~sI~s (1937) ver- wirkliehen, bei oder etwas unterhMb der Temperatur des Diehtemaximums der LSsung zu arbeiten, um dureh einen mSglichst geringen Diehteuntersehied der LSsung die W~rmekonvektion, die ja als Folge der Dichte- anderung zwisehen Mitre des Trennpuffers nnd Gl~s- plat~enrand zustande kommt, wei~er herabzusetzen.

Die Elektroendosmose ist bei der Verwendung yon Glas betr/~ehtlich. Ihre Gr6Be ist megbar dureh die Bestimmung der Ablenkung einer im elektrisehen Feld neutrMen Substanz (z. B. Dextran). Man kann dann naeh Kenntnis der elektroendosmotisehen Ablenkung dureh Wahl der geeigneten Einffihrungsbohrung die Wanderwege der Frak~ionen optimal gesgalten.

Wit haben die ArbeitsmSgliehkeiten mit der modi- fizierten Apparatur dureh die Auftrennung yon bio- logisehen Substanzen welter gepriift. Es sollen im folgenden einige Trennbeispiele yon mensehliehen Serumeiweil3fraktionen, eines Pleuraexsudats und yon Hautextrakten angefiihrt werden.

J:g. 42, Heft 7 K. W~nK et al.: Klinische Anwendung der ~rageffreien pr~iparativen DurchfluBelek~rophorese 359 1. April 196~

Die Trennungen warden s/~mtlich in VeronM-Vero- nM-Natrium-Pnffer (pH 8,6, Ionenstgrke /z = 0,025) durehgeffihrt. Die angelegte Klemmenspannung be- grug 1800 Volt, entsprechend 36 Vottlcm, dabei floB ein Strom yon 130 mA. Die Tempergtur der Kfihi- flfissigkeit lag ira EinlauI bei 00 C, im Auslauf bei @ 20 C. Die Geschwindigkeit des Puffers~roms betrug 0,22 cmlmin. Die Anode befindet sieh in allen Abbil. dungen immer reehgs.

1. Prgparative Trennungeu yon Proteinen aus menschlichem Serum und Pleuraexsudat. In 60 rain warden jeweils 0,9 ml der unverdiinnten, nieht dialy- sie~en Trennsubstanz kontinuiertich in die Trenn-

f

/0 20 JO 40 50

~..I6"~ohen - I1/'R

Jbb, 2, Eiweii]verteilungsku~ve eines Serums mAt caner Hypo-7-globulin/imie bei intik6rpermangelsyndrom. ~- Globulin 2,9 1%eL- %,

Gesam~eiweii]gehalt; 5,5 g- %

n.:

. . . . . . rl r,: /0 ~0 30 oo 50

Abb. 3. Pleuraexsudat einer Patientin mat Polyserosltis bei viseeralem Ery~her~atodes. :EiweiBgehal~ 3,6 g-%

kammer gegeben. Die Eiweit~best.immungen erfolgten mat der Biuret-Reaktion, gemessen wuarde im Photo- meter Eppendoff bei einer Wellenl~nge yon 546 m/~ unter Verwendung yon Makroe~vetten.

Bei der Betraehtung der Eiwei6verteilungskurven der aufgetrennten Proteine ergeben sieh einige Ge- meinsamkeiten, die sehon bei ff/iheren Untersuehungen (WI~K 1962) anffielen. Der sehaffe Abfall der Kurven, besonders siehtbar an den begrenzenden Fraktionen, wie am Albumin, zeigt, wie gut die einzelnen Frak- tionen in sieh homogen and nieht dutch Diffusion in ihrem Wanderweg gestSrt dutch die Trennkammer laufen. Dieses wArd aueh bei der Darstellung bestimm- ter Eiweil3komponenten, wie z.B. der alkalisehen Phosphatase des Serums in Abb. 5 deutlieh, bei der sieh vier Fraktionen mat seharfer Begrenzung and guter l~Tbereinstimmung mat der zngeh6rigen Eiweil3- verteilungskurve nachweisen lassen.

Bei der Auf~rennung hoehprozentiger LSsungen er- gibt sieh ein guter Uberblick fiber die quantitative Verteilung der EiweiBfraktionen. Rein erhalten wer- den jedoeh nut die begrenzenden Fraktionen, diese allerdings in betr~ehtlicher Menge. So k6nnen in einer hochprozentigen EiweigI6sung, z. B. in einem P]asmo- cytomsernm mat einem GesamteiweiBgehalt yon

10,7 g-% (Abb. 4), Albumin and Paraprotein in groBer Nenge getrennt werden. Bei einem Albumingehatt yon 40 gel.-% und der Eingabe yon 0,9 ml Serum in 60 man wiirde sich eine Ausbeute yon etwa 1 g Albu- min in 24 Std ergeben.

' ~Lrt l~F~ 1o 30 30 00 £0

Gldsohen - Nn.

Abb. 4. Diffuse 3~yelomatose mi~ elnem ParaproDein yore Tgp des ~7~ A" Plasmoeytoms. Eiweil]gehalt 10,7 g-%, y-Globulin 56 Ret.-%

+v\ /

L / ' , , ~ < I ~ ~ -,~.', , I , . ~ , , i ~ ~ , ' { I r", J

/0 zo 30 40 50

CIL/mchen -Nn

i b b . 5. Serum eines Patienten rnit Prostutaeareinom und mul~iplen Knochenmetastasen. ]~iweiggehal~ 6,45g-%. iIkalisehe Phospha~ase 87 m~ol E. Bestimmt warden die Eiwell3verteilung (aasgezogene Kurve) and die elkalisehe Phosphatase (striehpunktierte Kurve) naeh tier Auf- trennung. Dabei zeigt sieh eine dent]Ache Anreicherung der a.tkalisehen

Phosphatase vor allem im ~-Globultnbereich

!,r I~tlrlrJ 0 70 20 . 80 40 5"0

g'/g[mchen - III~

Abb. 6. Auftrennung des Serums eines Patienten mat fortgesehrittener Lebereirrhose. Die ausgezogene Xurve zeig~ die Eiweigverteilung in den Sammelgl~tsern. EiweiBgehalt 6,35 g-%, y-Globulin 39,2 Rel.-%. Sodann wurden die Pro~eine aus dem Albumin-a-Globulinbereieh (durch Pfeite angezeigt) einer zwei~en Trennung unterworfen. Die strichpunk~ierte Kurve zeigt die Eiweigverteilung der zweiten Trennung, wobN sieh - - ebenso wie bei der papierelektrophore~isehen Kontxolle - - Albumin and

c~-Globulin cleutlieh voneinander abheben

Andererseits verlangt die Gewinnung einzelner Fraktionen, die ffir die weitere Verwendung mSgliehst rein sein sollen, z. B. als Antigene ffir die Erzeugung yon Antik6rpern, eine subtilere Teehnik mAt st/~rker verdtinnten LSsungen. Dabei empfiehlt sieh folgendes Vorgehen:

Zur Anreicherung der gewiinsehten Fraktion ward zuerst das native Serum getrennt. Dabei finder sieh die gesuehte Fraktion noeh betr~ehtlieh verunreinigt

360 K. W~EK et al. : Klinisehe Anwendung der trggerfreien pr£parativen Durchflugelektrophorese KUnische Wochenschrift

mit den Naehbarfraktionen. Es ~Srd nun noeh einmal getrennt, wobei lediglieh etwa drei Fraktionen in ge- ringer Konzentrat ion in die Trennkammer gegeben werden. ])iese Verh/£1tnisse sind in Abb. 6 dargestellt. Naeh der Trennung des Serums eines Kranken mit Lebereirrhose mit einem GesamteiweiBgehalt yon 6,35 g- % wurde der Albumin-~-Globulin-Bereieh (in Abb. 6 durch Pfefle bezeiehnet) naeh B~CHE~ u. Mit- arb. (1952) auf einen Eiweiggehalt yon 1,05 g-% ein- geengt und naehgetrennt. Deutlieh ist die gate Tren- nung in Albumin und ~e-Globulin zu erkennen, was auch die papierelektrophoretische Kontrolle erweist.

"M

o 1o 20 30 ~0 5"0 #IEechen - Nn

Abb. 7. ~EiweiBYerteilungskurve der Au~trennung eines Extrak~es aus der menschlichen Cuffs

0 10 2.0 YO 40 5-0 5"IE~ch~n -/Vn

Abb. 8. :Eiweigver~eJlungskurve der ku%rennung eines Sammelepidermisex~raktes

e~-Globulin zeigt bei der Aceton-Einengung einen be- tr/~ehtliehen Verlust (B0c~E~ u. Mitarb.); bei der geringen Eiweigkonzentration war es in unserem Fall nieht naehweisbar.

Die im y-Globulin nachweisbaren Gipfel beruhen mit groBer Wahrseheinliehkeit auf einer echten Frak- tionierung. In Abb. 4 z .B. handelt es sieh nm ein fie A-Plasmocytom (Ifir die Durehffihrung der Immun- elektrophorese danken wir Herrn Priv.-Doz. Dr. K. E. G~LLE~T, Robert-Koch-Inst i tut , Berlin), wobei in der Eiweigverteilungskurve kathodiseh ein geringer An- stieg des y-Globulins siehtbar ist, der als y~-Globuliu angesehen wird, dem dann erst der dureh die hohe Konzentrat ion yon 56 gel . -% besonders breite Gipfel des Paraproteins mit der Wanderungsgesehwindigkeit eines fisA-Globulins folgt.

In Abb. 3 ist die Eiweigverteilungskurve eines Pleuraexsudats einer Patientin mit einer Polysero- sitis bei visceralem Erythematodes dargestellt. Es lagt sich die ffir diese Krankhei t typisehe Vermeh- rung des y-Globulins aueh im Pleuraexsudat naeh- weisen.

2. Pr@arat ive Trennung yon Hauteiwei[3-Extralcten. Von SF£s~, R6cxL und PASCH]~ wurde 1945 erstmalig

mittels Papierelektrophorese in Epidermisextrakten eine yon Cutisextrakten in der Regel erheblieh ab- weiehende Eiweigzusammensetzung ermittelt. W/~h- rend das Puffer-extrahierbare CoriumeiweiB des Men- sehen (durehsehnittlieh weniger als 2% des Feucht- gewiehts) einen Albuminanteil yon ~8--56% enthglt, linden sieh 92--95 % des epidermalen Extrakteiweiges (3--6% Trichloressigs/~ure-f/illbares GesamteiweiB)in Form yon 3- -4 wenig differierenden Fraktionen inner- halb des Globulinbereiehs.

BADE~¢ und F~EEDSEnG konnten in EiweiBextrak- tea aus Mensehen- sowie Meerschweinehen- und Ka- ninchen-Epidermis mit der Agargel-Elektrophorese drei yon dem jeweiligen Serum unabh/~ngige Proteine, mit der Immunelektrophorese vier versehiedene Ei- weiBfraktionen naehweisen, deren eine gegen proteo- lytisehe Fermente resistent erscheint. I m Rahmen dieser Studie wurde mit der geschilderten Trerm- methode eine weitere orientierende Fraktionierung des 15sliehen tIauteiweiBes versucht.

Material und Arbeitsgang Die 2--6 Std nach der Amputation yon Unterschenkeln

abgelSste, yon Desinfektionsmittelresten und Fettgewebe be- freite Haut wurde so~ol~ oder naeh 4--12stiindiger L~gerung bei --200 C mechanisch (Methode nach vA~ SCOTT) in Epi- dermis- und Cutis~nteil getrennt. Separierte Sammelepider- mis (yon vier Patienten beiderlei Geschlechts im Alter yon fiber 50 Jahren) wurde mit der ifinffachen Gewichtsmenge kalter (40 C), in Ideinen Portionen zugesetzter 5%iger KC1-LS- sung zerm5rsert, der aus dem breiigen Homogenut ausgepregte and zentrifugierte, leicht opalescierende Extrakt unter serum- anatogen Bedingungen (s. oben) fraktioniert. In gleieher Weise untersucht wurde die ~us Cutisgewebe naeh Zerkleinerung mit der Sehere und Homogenisierung (Ultra-Torrex) durch Zen- trifugieren im ~berstand erhaltene milchigtrfibe Eiweig- 16sung. Die EiweiBbestimmung in den Extrakten erfolgte nach IPLL:~, HElmsmAn-SIgN und PETE~S]~N (Eichkurve mit gum~nserum).

In den jeweiligen S~mmelfraktionen wurden a) die Extink- tion bei 280 my (Zeiss- Spektrophotometer) und b) der u-Amino- N-Wert (naeh Moo~E und STEI¢~) bestimmt.

Die in den Fr&ktJonen der Epidermis- und Cutis- Extrakte festgestellten Extinktionswerte lassen deut- liche Untersehiede hinsichtiieh der aus Epidermis und Cutis mit 5%iger KC1-L6sung extrahierbaren Eiweil3- anteile erkennen. I m Coriumextrakt (EiweiBgehatt etwa 1,5 g-%) finder sieh ein relativ groBer Albumin- anteil, tier - - ungeaehtet der methodisehen Unter- schiede - - kurvenmi~Big mit dan yon SPIE~ u. Mitarb. papiere]ektrophoretisch ermittelten Werten gut iiber- einstimmt. Die yon den Autoren beobaehtete ,,hohe mittlere Globu]inzacke" ist in der vorliegenden Ex- t inktionskurve ebenfa]Is ausgebildet und zeigt ein ver- gleiehsweise erhShtes Profil. Ihre Wanderungsgesehwin- digkeit entsprieht offenbar der g~- bzw. der/~-Globu- linfraktion (Abb. 7).

Die Extinktionskurve der aus Epidermisextrakt (Eiweil3gehalt etwa 1,8 g-%) erhaltenen Fraktionen ist mit dem Elektrophorese-Diagramm der fr/iheren Untersucher vergleiehbar. Es linden sich vier his ffinf voneinander abgrenzbare Maxima, die eine - - methodiseh bedingte - - deutliehe Differenzierung ins- besondere tier im ]Ssliehen Epidermiseiweit3-Extrakt iiberwiegenden G]obuline (fiber 90 %) erkennen ]assen (Abb. 8).

Die Endkonzentrationen in den Fraktionen 10---18 (Abb. 8) liegen auf Grund der c~-Amino-N-'Werte, be- zogen auf c~-Alanin, um 80--120 rag-%, in Fraktion 28 bei 40 mg-%. In den korialen Trermextrakten linden

Jg. 42, tIefg 7 Kurze wissenschaftliche Mitt~itungen 361 1. April 1964

sieh allgemein niederere Endkonzen t r a t i onen (20 bis 40 mg-%).

Zusammen]assun 9. Es wird fiber die methodisehen Seh~derigkeiten bei der Durehf i ihrung der tr/~gerfreien pr / iparat iven Durehflugelektrophorese berichtet . Diese bestehen vor al lem in der Notwendigkei t , die Puffer- s t rSmung zu beherrsehen, ohne dab ein Elektropho- resetr/iger, der gteiehzeitig die F u n k t i o n eines Stabili- sators der S t rSmung i ibern immt, zur Verffigung steht. Ferner ist die Tempera tu rkons tanz zur Vermeidung einer W~rmekonvek t ion unerl/~131ieh. Es werden die mi t e inem modifizierten Ger/~ zur trggerfreien Dureh- flugelektrophorese gewonnenen Ergebnisse der Auf- t r e n n u n g yon mensehl iehen Pro te inen aus Serum, Pleuraexsudat u n d H a u t e x t r a k t e n mitgetei l t .

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K U R Z E W I S S E N S C H A F T L I C H E M I T T E I L U N G E N

Vergleiehende Untersuehungen fiber den Einbau yon C 14-Glu- cose und C14-Fructose in die gepaarten Glueuronsiiuren beim Kaninehen. Zur Frage der Wirkung der Fructose auI die Glu-

euronidsynthese*, **, ***

Von X. B~cK, H. D. S6LI~G und E. RICHTER

Aus der Medizinischen Universitatsklinik Freiburg i. Br. (Direktor: Prof. Dr. Dr. h . c .L , tteilraeyer)

(Eingegangen am 15. Oktober 1963)

Die Fragestellung fiir die vorliegenden Untersuehungen ergab sich ~us einer friiheren Arbeit, wobei gezeigt werden konnte, dub Glucose und Fructose die Bildung yon gepaarten Glucuronsauren beim gesunden Menschen zu beschleunigen vermSgen, und dab unter den gegebenen Bedingungen die Fructose einen st~rkeren Effekt auf die Glucuronidsynthese aus- iibte als die GlucoseL Dies war insofern bemerkenswert, als die Fructose nieht wie die Glucose auf direktem Wege fiber Glueose-6-phosphat--> Glueose-l-phosphat --> Uridin-diphos- phat-g]ucose --> Uridin-diphosphat-glucurons~ure als intakte 6-Kohlenstoffkette in die Glucuronide eingebaut werden kann, sondern auf Grund ihres andersartigen Sgoffweehsels in der Leber a mehrere Stufen - - einschlieBlieh Spaltung und Rekondensation der entstandenen 3-Kobienstoffbruchstficke z - bis zum GIucose-6~phosphat durchlaufen muff, we~m sic fiir die gepaarten Glucurons~uren Substrat zur Verffigung stellen soll. Die M5glichkeit wurde diskutiert, da/3 die Fructose weni- ger als Substrattieferant, sondern infolge JiLter sctmetleren Oxydation in der Leber mehr durch den damit verbundenen h5heren Energieumsatz die Bildung yon gepaarten Glucuron- r~uren stimuliere. Eine Kl~rung war yon vergleichenden Untersuchungen fiber die jewei]ige Einbaurate markier~r Glucose und markierter Fructose in die gepaarten Glucuron- s~uren zu erwarten. Beziiglich weiterer Einzelheiten und Litera~ur ~4rd auf die lriihere Ax'beit ~ verwiesen.

Versuchsanordnung Fiinf m~nnIiehe Xaninchen mit einem KSrpergewicht

zwischen 1,6 kg und 2,8 kg wurden jeweils zwei Versuchen unterworfen. 12 Std vor Versuchsbegbm N~hrungskarenz.

* Herrn Prof. Dr. F. Leuthardt zum 60. Geburtstag. ** Die Untersuchungen wurden yon der Deutschen For-

sctmngsgemeinschaf~ unterstfitzt. *** Eine ausfiihrliche MitteiIung wird in der Bioehem.

Z. erfolgen.

Einlegen eines fixierbaren Dauerkatheters in die ti[arnblase. Verabreichung yon i g/kg K6rpergewicht Menthol zusammen mit Tween in 20ml/kg KSrpergewieht warmem ~¥asser suspendiert durch die Schlundsonde.

In dem einen Versuch enthiclt die Fliissigkeit zus~tzlich 2 g Glucose/kg XSrpergewicht mit 50 #C uniform markierter C14-Glucose/kg, in dem anderen 2 g Fruetose/kg KSrperge- wicht mit 50 ~C uniform markierter C14-Fructose/kg.

Sofort nach Verabreiehung der jeweiligen L6sung Eia- bringen des Tieres in einen entsprechend konstruierten Stoff- wechselk~fig, der es gestattete, ausgeschiedene Harnmenge und abgeatmetes C02 quantatitiv zu gewinnen. Versuchs- dauer 2 Std. Abstand zwischen den zwei Versuchen beim gleichen Tier mindestens 1 Woche. Abwechslung der Ver- suchsfolge, so dub bei drei Tieren Fructose, bei zwei Tieren Glucose im ersten Versuch zur Anwendung k~mem

.Bestimmungsmethoden Quantitative Bestimmung der Glueurons~ure im Itarn

nach DIsc~E ~. KristMIisation des ausgeschiedenen Menthol glucuronids naeh Angaben von WILLiams 6 sowie E~SE~BE~G und Gu~RI~ a. Identifikation durch Schmelzpunkt und Infra- rotspektrum. QuaIitativer Naehweis der Radioaktivitiit im Glucuronsiiureanteil des Nentholglueuronids durch Spaltung einer Probe des kristMlisierten Glueuronids mit Glucuronidase und ansch]ieBende Radiopapierchrom~tographie der Gluenron- sgure.

Veraschung des kristMIisierten Mentholglucuronids und F~llung des entstehenden C02 ats BaCOs (A). Gra~dmetrisehe Bestimmung des abgeatmeten CO s als BaCOs (B). Anfertigen yon BaCO3-Pl~ttchen yon (A) und (B) und Messung der i~adioaktivit~t in uneadlich dicker Schicht im fensterlosen ~Iethandurehflugz~hIer.

Die spezifische Aktivitgt des aus dem Mentholglucuronid gewonnenen CO~ wnrde auf den Glueuronsg:ureanteil umge- rechnet, d~ das naeh Spaltung mit GIucuronidase iso]ierte Menthol erwartungsgemgg keine l~adioaktivitiit enthielt.

Ergebnisse (s. Tabelte) Vier der fii~ff Tiere schieden nach zus~tzlicher Fructose-

verabreiehung innerhalb der zweis~iindigen Versuehsdauer mehr gepaarte Glucurons~uren im I~arn aus ats nach zusEtz- lieher Verabreichung der Glucose. MittelwerC unter Glucose 221 rag, unter Fructose 326 mg (bei Elimination der Werte des Tieres Nr. 3 wegen der nnter Glucose ungewShnlieh scMechten Glueuronidausscheidung: unter Glucose 259 rag, unter Fructose 333 mg).