yann fardini
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UNIVERSITÉ FRANÇOIS - RABELAIS
DE TOURS
ÉCOLE DOCTORALE Santé, Sciences et Technologies
Unité INRA IASP 311 : « Signalisation, Portage et Virulence bactérienne »
THÈSE présentée par :
Yann FARDINI
soutenue le : 1 Février 2008
pour obtenir le grade de : Docteur de l’université François - Rabelais Discipline/ Spécialité : Sciences de la Vie et de la Santé
Étude du contrôle de l’expression des systèmes de sécrétion de type III, généré par
l’inactivation du gène yfgL codant une lipoprotéine de la membrane externe, chez
Salmonella Enteritidis
THÈSE dirigée par : M. VELGE Philippe Directeur de Recherches, INRA, Tours
Co-directeur :
Mme VIRLOGEUX-PAYANT Isabelle
JURY : M. BOSSI Lionello Directeur de Recherches, CNRS, Gif-sur-Yvette M. GUILLOT Jean-François Professeur, Université François Rabelais, Tours Mme JACOB-DUBUISSON Françoise Directrice de Recherches, INSERM U629, Institut Pasteur, Lille Mme NOREL-BOZOUKLIAN Françoise Chargée de Recherches, Institut Pasteur, Paris M. PUGSLEY Anthony Professeur, Institut Pasteur, Paris M. VELGE Philippe Directeur de Recherches, INRA, Tours
1
2
Les travaux de cette thèse ont été réalisés à l’INRA de Tours, dans l’Unité IASP 311
dirigée par M. Jean De Rycke. Ces travaux ont été co-financés par la Région Centre et
l’INRA.
Je tiens à remercier M. Philippe Velge de m’avoir permis de réaliser cette thèse au
sein de l’équipe « Signalisation, Portage et Virulence bactérienne » qu’il anime et surtout
d’avoir bien voulu revêtir la casquette officielle de Directeur de ma thèse. J’espère que tu ne
seras jamais amené à le regretter… Plus sérieusement, je tiens à te remercier d’avoir
toujours gardé un œil même lointain sur l’évolution du travail malgré tes très nombreuses
(qui a dit trop ?) occupations, ainsi que pour tes commentaires et suggestions pas toujours
réalisables mais souvent pertinents. Enfin, merci d’avoir contribué à l’amélioration de ce
manuscrit.
Naturellement, je tiens à exprimer toute ma gratitude envers ma vraie « patronne »,
Mme Isabelle Virlogeux-Payant. Merci, d’avoir encadré ma thèse dans une ambiance si
amicale. Merci, pour ta disponibilité sur le plan technique (je suis ravi de t’avoir donné des
prétextes pour mettre ta blouse) ainsi que sur le plan scientifique. Je ne peux que reconnaître
que tu y es pour beaucoup dans l’amélioration de ce manuscrit et de mes compétences en
rédaction, plus généralement. Bon, j’admets qu’au bout de quinze versions, il est temps de
dire « stop », mais le résultat est bien réel : ma rigueur et mon écriture ne sont plus les
mêmes. A la vue de ce manuscrit qui n’est pas parfait, je vous laisse donc imaginer ce que
c’était avant. Enfin, je dois également avouer que l’on a bien rigolé tout en sachant être
sérieux, tout au long de cette thèse et pour ça je t’en remercie.
Je ne pourrais partir le cœur léger sans remercier Jérôme Trotereau (avec un « t »,
oui je fais attention…). Au-delà d’un collègue de travail, c’est un vrai « pote » qui en est
ressorti. Merci pour la formation technique que tu m’as délivrée ainsi que pour ta rigueur (je
ne parlerai pas de « maniaquerie »). J’ai beaucoup appris. Encore une fois, si j’ai eu le
sourire aussi souvent au labo et pendant ces « petits moments de détente », c’est aussi par
« ta faute » !
Un petit coucou à un ancien membre de l’équipe qui s’en est allé dans d’autres
contrées, M. Sébastien Holbert. Merci, pour toutes nos franches rigolades, pour nos
discussions scientifiques, techniques et plus légères aussi. Je te suis reconnaissant de m’avoir
ôté quelques illusions sur le monde dans lequel on vit, ce qui me permettra de tomber de
moins haut ou encore de mieux esquiver. Tu m’as également montré que l’on pouvait faire
plein de choses, le tout étant de s’en donner les moyens. Pour ça, je t’exprime ma sincère
amitié et mon respect.
REMERCIEMENTS
3
D’une manière générale, je tiens à exprimer mes sincères remerciements à l’ensemble
de l’équipe, dans le désordre : Elisabeth, Agnès, Etienne, Sylvie, Olivier, Vincent, Pierrette.
Merci pour votre accueil ainsi que pour les bons moments passés. Je tiens à remercier tout
particulièrement Elisabeth, pour sa gentillesse sans limites et sa disponibilité pour réaliser
ces tests cellulaires, encore et encore, et…encore….
Une « spéciale cacedi » à tous les membres de l’équipe des « bras cassés » de l’unité
encore présents ou déjà partis : Stéphanie, Marianne, Galliano, Benoît, François, Julien, et
bien d’autres. Nous nous sommes bien amusés, ce qui m’a permis de m’oxygéner l’esprit
pour mieux replonger dans cet océan sans fond que l’on appelle le quotidien de la thèse.
Je remercie tout spécialement les « pauvres malheureux » qui ont dû me subir comme
encadrant : Audrey, Charlène et Emmanuelle. J’espère vous avoir apporté autant que vous
m’avez apporté. J’ai beaucoup appris en tant qu’encadrant.
Je tiens à remercier chaleureusement les rapporteurs, Mme Françoise Jacob-
Dubuisson et Mme Françoise Norel-Bozouklian et les examinateurs, M. Lionello Bossi, M.
Jean-François Guillot et M. Anthony Pugsley, constituant mon jury de thèse, pour avoir
accepter d’analyser mon travail et d’y avoir, pour cela, donné de leur temps. Je tiens à vous
faire part de ma fierté de vous compter parmi ce jury.
Je te remercie également, Toi qui se reconnaîtra à la lecture de ces quelques lignes
qui ne sauraient exprimer tout ce que je ressens. Merci d’avoir été là dans ces moments (que
j’espère pas trop nombreux) où j’accusais une baisse de régime et de moral. Ton sourire et
tes rires m’ont donné la force de m’accrocher. Cette stabilité dans ma vie, je te la dois et si
aujourd’hui j’en arrive là, c’est aussi grâce à toi.
Pour terminer, je remercie et dédicace, l’ensemble de cette thèse à mes parents et à
mes deux frères, sans qui je ne serais pas la personne que je suis aujourd’hui. Merci pour
votre amour et votre contribution à faire de moi une personne meilleure. Même si cela
s’avère enfantin, je tiens à faire un clin d’œil tout particulier à ma Maman : les hauts et les
bas que l’on a connus sont la source de ma force et à l’origine même de la réussite ce travail.
Tout cela je te le dois.
Enfin, je remercie toutes les personnes qui de près ou de loin, ont contribué à faire de
cette thèse ce qu’elle est : un moment de ma vie, gravé dans la roche.
4
REVUE BIBLIOGRAPHIQUE............................................................................................. 8
1. Salmonella............................................................................................................... 12
1.1. Classification................................................................................................... 12
1.2. Caractéristiques de Salmonella ....................................................................... 12
1.2.1. L’antigène O............................................................................................ 13
1.2.2. L’antigène H............................................................................................ 13
1.2.3. L’antigène Vi........................................................................................... 14
2. Les salmonelloses.................................................................................................... 14
2.1. Les infections systémiques à Salmonella ........................................................ 15
2.1.1. Pathologie................................................................................................ 15
2.1.2. Traitement et prévention ......................................................................... 16
2.2. Les gastro-entérites à Salmonella.................................................................... 16
2.2.1. Pathologie................................................................................................ 17
2.2.2. Traitement et prévention ......................................................................... 17
3. Pathogénie et facteurs de virulence de Salmonella ................................................ 18
3.1. Modèles animaux d’étude ............................................................................... 18
3.2. Pathogénie ....................................................................................................... 20
3.3. Facteurs de virulence impliqués dans les interactions bactéries-cellules........ 22
3.3.1. Les facteurs communs aux bactéries pathogènes et non-pathogènes...... 24
3.3.1.1. Les fimbriae ou pili ............................................................................. 24
3.3.1.2. Le lipopolysaccharide ......................................................................... 26
3.3.2. Les îlots de pathogénicité ........................................................................ 28
3.3.2.1. L’îlot SPI-1.......................................................................................... 29
3.3.2.2. L’îlot SPI-2.......................................................................................... 29
3.3.2.3. L’îlot SPI-3.......................................................................................... 30
3.3.2.4. L’îlot SPI-4.......................................................................................... 31
3.3.2.5. L’îlot SPI-5.......................................................................................... 31
3.3.2.6. L’îlot SPI-6.......................................................................................... 32
3.3.2.7. L’îlot SPI-7.......................................................................................... 32
3.3.2.8. Les îlots SPI-8 à SPI-14 ...................................................................... 33
3.3.2.9. L’îlot SGI-1 ......................................................................................... 35
3.3.2.10. L’îlot CS54........................................................................................ 36
SOMMAIRE
5
3.3.3. Autres facteurs de virulence.................................................................... 36
3.3.3.1. Facteurs de virulence issus de bactériophage...................................... 36
3.3.3.2. Le plasmide de virulence..................................................................... 37
4. Les systèmes de sécrétion de type III chez Salmonella ........................................... 38
4.1. Le flagelle........................................................................................................ 40
4.1.1. Structure et assemblage........................................................................... 40
4.1.2. Contrôle de l’expression et de l’assemblage du flagelle ......................... 42
4.1.3. Le flagelle et la virulence ........................................................................ 43
4.2. Le TTSS-1 ....................................................................................................... 46
4.2.1. Structure et assemblage de l’appareil du TTSS-1 ................................... 46
4.2.2. Sécrétion et translocation des protéines via le TTSS-1........................... 48
4.2.3. Détournement de la machinerie cellulaire par les effecteurs du TTSS-1 52
4.2.3.1. Manipulation de l’actine par voie directe............................................ 54
4.2.3.2. Manipulation de l’actine par voie indirecte......................................... 56
4.2.3.3. Après l’entrée ...................................................................................... 59
4.2.3.4. Les autres effecteurs du TTSS-1 ......................................................... 60
4.2.4. Régulation génétique de SPI-1................................................................ 62
4.2.4.1. Les régulateurs locaux......................................................................... 62
4.2.4.2. Les régulateurs extérieurs à SPI-1....................................................... 63
4.2.5. Régulation environnementale.................................................................. 65
4.3. Le TTSS-2 ....................................................................................................... 68
4.3.1. Structure, assemblage et translocation des effecteurs ............................. 68
4.3.2. Détournement de la machinerie cellulaire par les effecteurs du TTSS-2 70
4.3.2.1. Détournement du trafic intracellulaire ................................................ 70
4.3.2.2. SCV et filaments induits par Salmonella ............................................ 72
4.3.2.3. Modulation du cytosquelette d’actine ................................................. 74
4.3.2.4. Interférence avec les défenses anti-bactériennes................................. 74
4.3.3. Régulation génétique et environnementale de SPI-2 .............................. 76
4.4. Régulation génétique globale des TTSS chez Salmonella .............................. 78
4.5. Régulation croisée de l’expression des TTSS ................................................. 79
5. Biogenèse de la membrane externe, réponse au stress membranaire et virulence. 80
5.1. Biogenèse de la membrane externe................................................................. 80
5.1.1. Assemblage du Lipopolysaccharide (LPS) ............................................. 82
6
5.1.2. Assemblage des lipoprotéines ................................................................. 84
5.1.3. Assemblage des protéines de la membrane externe (PME) .................... 86
5.1.3.1. Passage de la MI vers la ME ............................................................... 86
5.1.3.2. Assemblage des PME à la membrane externe : rôle du complexe
« YaeT » 87
5.2. Les systèmes de réponse au stress membranaire............................................. 90
5.2.1. Le facteur E............................................................................................ 90
5.2.2. Le système CpxA/CpxR.......................................................................... 92
5.2.3. Les autres systèmes de réponse au stress membranaire .......................... 93
5.3. Systèmes de réponse au stress membranaire et virulence ............................... 93
RESULTATS ......................................................................................................................... 96
PROLOGUE : PROBLEMATIQUE, OBJECTIFS ET DEMARCHE DE LA DE THESE ........................ 98
1. Problématique et objectifs de la thèse..................................................................... 99
2. Démarche ................................................................................................................ 99
PARTIE I : L’INACTIVATION D’YFGL CONDUIT A LA SOUS-EXPRESSION DES TROIS SYSTEMES
DE SECRETION DE TYPE III CHEZ SALMONELLA ENTERITIDIS ............................................... 102
PARTIE II : SEULE L’INACTIVATION D’YFIO ET D’YFGL, PROTEINES DU COMPLEXE
« YAET », CONDUIT A UNE SOUS-EXPRESSION DU FLAGELLE ET DU SYSTEME DE SECRETION
DE TYPE III N°I CHEZ SALMONELLA ENTERITIDIS .............................................................. 122
PARTIE III : RECHERCHE DE FACTEURS PARTICIPANT A LA CASCADE DE CONTROLE DE
L’EXPRESSION DES TTSS GENERE PAR L’INACTIVATION D’YFGL CHEZ S. ENTERITIDIS ...... 140
1. Introduction........................................................................................................... 141
2. Matériels et méthodes................................................................................................ 142
2.1. Matériels........................................................................................................ 142
2.2. Mutagenèse, clonage et construction des souches ........................................ 142
2.2.1. Mutagenèse............................................................................................ 142
2.2.2. Clonage dans E. coli.............................................................................. 142
2.2.2.1. Construction de la fusion transcriptionnelle rpoEP3::lacZ............... 142
2.2.2.2. Construction du plasmide recombinant pACrpoE ............................ 144
2.2.2.3. Transformation d’E. coli et vérification des inserts .......................... 144
2.2.2.4. Electroporation de Salmonella et vérification................................... 146
2.3. Test d’activité -galactosidase ...................................................................... 146
2.4. Analyse de l’expression du TTSS-1 et du flagelle........................................ 148
7
3. Résultats ................................................................................................................ 148
3.1. Rôle de Lon dans le contrôle de la transcription des gènes codant le TTSS-1
chez un mutant yfgL ................................................................................................ 148
3.2. Rôle de E dans le contrôle de l’expression du TTSS-1 et du flagelle ......... 150
4. Discussion et perspectives..................................................................................... 153
DISCUSSION GENERALE............................................................................................... 156
REFERENCES BIBLIOGRAPHIQUES.......................................................................... 170
8
Revue bibliographique
9
10
11
Tableau 1 : Nombre de sérotypes dans chaque espèce et sous-espèce de Salmonella en
2004 (Popoff et al., 2004)
S. enterica
Sous-espèce enterica 1504
Sous-espèce salamae 502
Sous-espèce arizonae 95
Sous-espèce diarizonae 333
Sous-espèce houtenae 72
Sous-espèce indica 13
S. bongori 22
Total 2541
12
1. Salmonella
Les salmonelles sont des bactéries communément retrouvées dans le monde animal.
Ces bactéries sont à l’origine des salmonelloses qui se manifestent principalement sous forme
de fièvres typhoïdes et de gastro-entérites ou encore sous forme asymptomatique.
La caractérisation de la fièvre typhoïde datant du 19ème siècle, Louis nomma cette
maladie contagieuse ainsi en 1829 et Pettenkoffer mit en évidence le rôle de l’eau de boisson
dans sa dissémination en 1868. Cependant, ce fut en 1880 que le premier bacille fut observé
par Eberth dans des coupes de rate et de ganglions lymphatiques. La culture in vitro de cette
bactérie fut mise au point par Gaffky en 1884 (Le Minor & Véron, 1989).
1.1. Classification
La classification du genre Salmonella est complexe. Elle repose notamment sur le
schéma de Kauffmann-White qui tient compte des caractères antigéniques O (paroi), H
(flagelle), Vi (capsule) auxquels les données biochimiques et moléculaires (hybridation
ADN-ADN) ont été compilées. En 2004, deux espèces étaient distinguées : (i) Salmonella
enterica divisée en 6 sous-espèces (enterica, salamae, arizonae, diarizonae, houtenae,
indica), elles-mêmes comprenant plusieurs sérotypes, et (ii) Salmonella bongori (Popoff et al.,
2004; Reeves et al., 1989). Le genre Salmonella comptait alors 2541 sérotypes (Popoff et al., 2004)
(Tableau 1). Depuis, un troisième nom d’espèce, Salmonella subterranea a été proposé pour
une souche isolée de sédiments contaminés aux nitrates et à l’uranium (Shelobolina et al., 2004).
Le nom de cette espèce a été validé en 2005 (Euzeby, 2005).
Afin de faciliter la lecture, les sérotypes cités au cours de ce manuscrit seront écrits
sous forme contractée (ex : S. Typhi pour Salmonella enterica sous espèce enterica sérotype
Typhi).
1.2. Caractéristiques de Salmonella
Les bactéries du genre Salmonella appartiennent à la famille des Enterobacteriaceae.
Ce sont des bacilles à Gram négatif en général mobile (à ciliature péritriche). Elles peuvent se
cultiver sur milieu ordinaire contenant des extraits de viande (Le Minor & Richard, 1993).
13
Caractéristiques des Entérobactéries, les salmonelles possèdent une nitrate réductase
et leur culture ne donne pas de réaction d’oxydase. Elles sont capables de fermenter le
glucose avec ou sans production de gaz et sont aéro-anaérobies facultatives.
Comme les Entérobactéries, les salmonelles possèdent plusieurs types d’antigènes
utilisés pour la classification et en diagnostique : l’antigène O, l’antigène H et l’antigène Vi.
Selon la nomenclature, un antigène qui peut être absent ou présent sans que le diagnostique
de sérotype soit changé, est écrit entre crochet (ex : O:[5]).
1.2.1. L’antigène O
L’antigène O correspond à la partie externe du lipopolysaccharide. Dans le schéma de
Kauffman-White, 67 antigènes O sont considérés. On en distingue deux types :
- les antigènes O majeurs qui permettent de classer les sérotypes en groupe O. Par
exemple dans le groupe D, sont retrouvés les sérotypes qui présentent l’antigène O:9
tels que Typhi et Enteritidis.
- Les antigènes O accessoires qui sont toujours liés à un antigène majeur. Ils peuvent
n’avoir aucun intérêt pour le diagnostic. Ils peuvent également être liés à la présence
d’un phage dans le cadre d’une conversion lysogénique qui consiste en la
modification de l’antigène O.
Un antigène O accessoire pour le diagnostic est souligné quand il est lié à la
conversion phagique (ex : O:14).
1.2.2. L’antigène H
Les flagelles sont les structures permettant à la bactérie de se mouvoir. Ces polymères
de flagelline permettent l’agglutination rapide et l’immobilisation des bactéries via
l’utilisation d’anticorps anti-H. Chez Salmonella, l’antigène H peut se présenter sous deux
états :
- un état unique où la bactérie ne produit qu’un type de flagelle. Ce cas, le moins
fréquent chez Salmonella, est retrouvé chez S. Typhi ou encore chez S. Enteritidis.
- un état diphasique où la bactérie peut exprimer alternativement deux types de flagelle,
présentant des spécificités antigéniques différentes. Ainsi, S. Typhimurium peut
présenter un antigène H soit de type i soit de type 1,2.
14
La phase 1 de l’antigène H correspond à l’expression de la flagelline FliC. Les souches
monophasiques comme S. Enteritidis expriment ce type de flagelle. La phase 2 correspond à
la flagelline FljB. Le passage de la phase 1 à la phase 2 s’opère via l’inversion d’une région
chromosomique, nommée région H. Cette région comporte le promoteur de l’opéron codant
la flagelline FljB et une protéine FljA. L’inversion de cette région conduit à l’absence de
transcription de cet opéron (position « off ») ce qui provoque la synthèse de la flagelline FliC
(phase1). Lorsque cette région est en position « on » (le promoteur dans le sens de
transcription de l’opéron), les gènes fljB et fljA sont transcrits. La flagelline FljB (phase 2) est
produite (Silverman et al., 1979) et la protéine FljA va contrôler négativement la synthèse de
FliC via un mécanisme post-transcriptionnel. FljA va se lier à l’ARNm de fliC et diminuer sa
demi-vie, empêchant ainsi sa traduction (Yamamoto & Kutsukake, 2006).
1.2.3. L’antigène Vi
Le seul antigène capsulaire connu chez Salmonella est l’antigène Vi. Il a été
découvert par Felix et Pitt chez S. Typhi. Cet antigène, d’intérêt diagnostique, masque
l’antigène O, rendant les bactéries « O-inagglutinables ». L’antigène Vi n’est rencontré que
chez un nombre limité de sérotypes : S. Typhi, S. Paratyphi C et S. Dublin. Par chauffage de
la suspension bactérienne à 100°C pendant 10 min, l’antigène Vi est solubilisé et l’antigène O
devient accessible aux agglutinines. L’antigène Vi qui peut être perdu au cours d’une culture
(passage uniquement Vi+ vers Vi-) présente un intérêt épidémiologique, puisqu’il est le
récepteur du bactériophage Vi II.
2. Les salmonelloses
La fièvre typhoïde touche chaque année 16 millions de personnes dans le monde
conduisant à 600 000 décès, alors que les gastro-entérites en affectent 1,3 milliards dont 3
millions périssent (Pang et al., 1995). L’Organisation Mondiale de la Santé a estimé que parmi
les cas de salmonelloses déclarées en 1995, dont la cause étiologique a été établie, trois
sérotypes seulement se partagent 76 % des infections humaines : S. Enteritidis,
S. Typhimurium et S. Typhi. S. Enteritidis est d’ailleurs le sérotype le plus retrouvé dans 35
15
pays, faisant de lui la principale cause mondiale de salmonelloses en 1995 (Herikstad et al.,
2002).
En France, Salmonella était à l’origine de 60 % des Toxi-Infections Alimentaires
Collectives (TIAC) entre 2001 et 2003. Le sérotype incriminé dans 51 % de ces TIAC à
salmonelles est S. Enteritidis, ce qui le place en première position des agents bactériens
responsables des TIAC en France (Delmas G., 2005). Toutefois dans certains pays où
Campylobacter est à déclaration obligatoire, le nombre de cas connus impliquant cette
bactérie est comparable à celui des salmonelles.
Une troisième forme d’infection à Salmonella qui ne sera pas développée ici, est
l’infection asymptomatique. Cette infection pose problème notamment dans le cadre du
portage humain, entretenant ainsi le réservoir de Salmonella. Un autre exemple du portage
concerne la volaille infectée par des salmonelles ubiquistes telles que S. Enteritidis et
S. Typhimurium. Ces sérotypes sont responsables de lourdes pertes économiques en filière
avicole puisque toute détection de salmonelles dans les parquets de volailles conduit à leur
destruction, selon les arrêtés ministériels du 26 octobre 1998 (révisé en 2001).
2.1. Les infections systémiques à Salmonella
2.1.1. Pathologie
Les infections systémiques touchant l’Homme sont plus connues sous le nom de
fièvre typhoïde ou paratyphoïde. Elles sont causées respectivement par S. Typhi et
S. Paratyphi, qui sont des sérotypes strictement adaptés à l’Homme. Il s’agit de la forme la
plus grave des salmonelloses puisqu’en absence de traitement, elle évolue sous forme de
septicémie généralement mortelle. Le réservoir strictement humain est entretenu par des
personnes contaminées (malades, convalescents ou porteurs asymptomatiques) qui excrètent
la bactérie via leurs selles ou leurs urines. Les bactéries ainsi éliminées peuvent contaminer
l’eau et les denrées alimentaires (surtout non cuits, comme les produits laitiers). Après une
dizaine de jours d’incubation, la maladie se manifeste par des troubles digestifs (constipations
ou diarrhées) et des céphalées importantes accompagnées de fatigue. La fièvre atteint 39 à
40°C à la fin de la première semaine. Les jours suivants, les troubles digestifs augmentent en
intensité : forte soif, anorexie et diarrhées. En cas d’absence de traitement ou de traitement
16
tardif, des complications surviennent généralement (troubles neurologiques, diarrhées
cholériformes, hémorragies et perforations intestinales,…) pouvant aboutir à la mort du
malade. Les animaux peuvent aussi développer des infections systémiques à salmonelles : les
bovins infectés par S. Dublin, les porcins par S. Choleraesuis, les souris par la plupart des
sérotypes ubiquistes ainsi que les volailles par S. Pullorum et S. Gallinarum.
2.1.2. Traitement et prévention
Chez l’Homme, le diagnostic s’effectue à travers la recherche du micro-organisme à
partir d’hémocultures et de coprocultures voire par la mise en évidence des anticorps
circulants. L’antibiothérapie repose sur l’utilisation de molécules à bonne diffusion dans le
système lymphatique et à bonne pénétration tissulaire : triméthoprime-sulfaméthoxazole,
chloramphénicol, ampicilline, céphalosporines de troisième génération (ceftriazone,
céfopérazone), ciprofloxacine. Cependant, dans certains pays notamment ceux en voie de
développement, il existe des souches multirésistantes à certains antibiotiques comme
l’ampicilline, le chloramphénicol et le trimethoprime : 60-65 % des souches de S. Typhi
isolées en Inde et 89-93 % de celles isolées au Vietnam (Pang et al., 1998).
La prévention repose sur l’hygiène alimentaire et le contrôle de la qualité
bactériologique de l’eau. La vaccination concerne les populations des régions endémiques.
Deux types de vaccins sont utilisés actuellement : un vaccin vivant atténué, la souche de
S. Typhi Ty21a (Suisse) et un vaccin d’antigène capsulaire Vi (France). L’efficacité de ces
vaccins n’étant pas de 100%, ils ne sont pas une alternative aux mesures classiques de
prévention et représentent un coût non négligeable pour les pays en voie de développement.
2.2. Les gastro-entérites à Salmonella
Ces infections touchant à la fois l’Homme et les animaux (bovins, porcins) sont
causées généralement par des sérotypes de salmonelles ubiquistes tels que S. Enteritidis et
S. Typhimurium. Les bactéries restent principalement localisées au niveau de l’intestin. En
France et dans les pays industrialisés, elles sont responsables des Toxi-Infections
Alimentaires Collectives ou non. Les TIAC se définissent par la survenue d'au moins deux
17
cas groupés d'une symptomatologie similaire, en général digestive, dont on peut rapporter la
cause à une même origine alimentaire. Les TIAC sont soumises à la déclaration obligatoire à
la Direction Départementale des Affaires Sanitaires et Sociales (DDASS) et à la Direction
Départementale des Services Vétérinaires (DDSV). Il existe de nombreuses sources de
contamination humaine dues à la diversité des réservoirs animaux (sauvages ou domestiques)
et humains. La contamination survient par l’ingestion de produits alimentaires contaminés
d’origine animale principalement la viande de volaille mal cuite, les œufs et produits dérivés
(Delmas G., 2005).
2.2.1. Pathologie
Après une incubation d’une durée comprise souvent entre 10 et 24 h, les symptômes
apparaissent : fièvre, douleurs abdominales, diarrhées, vomissements. Ils résultent d’une
inflammation de la paroi intestinale conduisant à une déshydratation importante. La maladie
dure entre 2 et 6 jours. La dissémination sanguine de la bactérie, phénomène rare, peut
survenir chez des personnes âgées, jeunes enfants ou sujets immunodéprimés.
2.2.2. Traitement et prévention
Le diagnostic repose sur l’isolement de la bactérie par coproculture. En général,
l’antibiothérapie n’est pas mise en place, le traitement reposant principalement sur la
réhydratation du sujet. En cas d’aggravation, surtout lorsqu’il y a risque de dissémination
sanguine, l’ampicilline ou l’amoxycilline peut être administrée. Cependant, de nombreuses
souches multirésistantes de Salmonella posent problème pour le traitement.
La prévention passe par des mesures strictes d’hygiène et de contrôle de la chaîne
alimentaire (Delmas G., 2005). Plusieurs précautions sont recommandées en restauration
collective :
- respect des bonnes pratiques de transport, stockage et préparation des aliments
- respect strict des chaînes du chaud et du froid
- utilisation de mayonnaises industrielles, de préparations à base d’œufs pasteurisés et
de poudre d’œufs
En milieu familial, des précautions simples sont également à prendre :
18
- placer rapidement après les achats, les œufs à +4°C pour une durée n’excédant pas 2
semaines
- pour les personnes les plus sensibles, ne pas consommer d’œufs crus ou peu cuits
- les préparations à base d’œufs sans cuisson doivent être réalisées le plus près possible
du moment de la consommation et maintenues au froid
- Les viandes hachées et les viandes de volaille doivent être consommées après une
« cuisson à cœur »
3. Pathogénie et facteurs de virulence de Salmonella
3.1. Modèles animaux d’étude
Plusieurs modèles in vivo ont été développés, en fonction du type de pathologie à
étudier (Hapfelmeier & Hardt, 2005).
Le modèle murin d’infection systémique létale utilisant des souris génétiquement
sensibles à Salmonella, est certainement l’un des plus ancien modèle mis au point. Il a été
largement utilisé pour étudier la réponse immune à S. Typhimurium ainsi que les facteurs de
virulence impliqués dans l’infection systémique.
La persistance systémique, quant à elle, est étudiée chez la souris à l’aide de lignées
génétiquement résistantes à Salmonella. La bactérie chez cet hôte conduit à une infection
chronique des organes profonds (foie, rate).
L’infection de type entérocolite a été étudiée grâce au modèle bovin, chez l’animal
entier où S. Typhimurium infectant naturellement cet hôte produit des manifestations
cliniques et histologiques proches de celles observées chez l’Homme. Cependant, ce modèle
s’avère coûteux et les outils adaptés y sont limités par rapport au modèle murin. Un modèle
d’anses iléales ligaturées bovines offre une alternative au modèle entier mais reste assez
délicat à mettre en place. Plus récemment, un modèle murin d’entérocolite a été mis au point
en pré-traitant les souris avec de la streptomycine. Ces souris pré-traitées développent alors
une inflammation intestinale aiguë. Les outils disponibles chez la souris (anticorps, lignée de
souris « Knock out » ou transgénique, réactifs,…) offrent de nouvelles approches pour
19
igure 1 : Coupes histologiques d’intestin grêle de veaux (A et B) ou de souris (C et D) Favant et après infection par S. Typhimurium (Zhang et al., 2003)(A) Section histologique d’une plaque de Peyer de bovin non infectée (barre=100 m). L’agrandissement en haut à droite représente le sommet d’une villosité intestinale absorbante (barre = 20 m). (B) Section histologique d’une plaque de Peyer de bovin d’une anse iléale ligaturée après 8h d’infection par S. Typhimurium (barre=100 m). Les villosités montrent une agrégation entre elles et de l’exudat fibrino-purulent dans le lumen intestinal est présent. L’agrandissement en haut à droite représente le sommet d’une villosité intestinale absorbante (barre = 20 m). L’intégrité de l’épithélium intestinal est rompue. (C) Section histologique de plaque de Peyer murin non infectée (barre=100 m). L’agrandissement en haut à droite représente le sommet d’une villosité intestinale absorbante (barre = 20 m). (D) Section histologique d’une plaque de Peyer issue d’une souris moribonde, 5 jours après infection par S. Typhimurium (barre=100 m). L’agrandissement en haut à droite représente le sommet d’une villosité intestinale absorbante (barre = 20 m). L’intégrité de l’épithélium intestinal est intacte.
20
étudier cette infection intestinale aiguë provoquée par Salmonella (Hapfelmeier & Hardt, 2005).
Au-delà de ces principaux modèles, d’autres animaux sont utilisés comme la volaille,
animaux chez lesquels les salmonelles ubiquistes (S. Enteritidis, S. Typhimurium,…)
développent une infection asymptomatique (sauf chez le poussin d’un jour infecté avec une
forte dose) ou encore le porc.
Aux différents modèles animaux s’ajoutent la voie et le type d’administration. La voie
orale et la voie intra-péritonéale sont les principales voies utilisées. Dans certains cas, des
études en co-infection sont réalisées, avec un mélange en proportion égale de différentes
souches (ex. souche sauvage et mutant). Ce type d’infection permet notamment de mettre en
évidence des différences de virulence plus minimes, qui ne seraient pas mises en évidence en
modèle de mono-infection.
3.2. Pathogénie
Une fois ingérées, les salmonelles vont gagner l’intestin qu’elles vont pouvoir
coloniser. Après avoir survécu au pH acide de l’estomac, les salmonelles entrent en contact
avec l’épithélium intestinal et montrent un tropisme pour les tissus lymphoïdes comme les
plaques de Peyer chez les mammifères et les tonsils cæcaux chez les oiseaux. Salmonella
pénètre et réside dans les cellules épithéliales intestinales et les cellules M localisées au
niveau de l’épithélium associé aux follicules. Par la suite, Salmonella est prise en charge par
les macrophages de la lamina propria, qui constituent une niche privilégiée pour sa
persistance. En parallèle, la bactérie peut également franchir la barrière intestinale par une
autre voie d’entrée, les cellules phagocytaires exprimant le CD-18 comme les cellules
dendritiques. Celles-ci sont capables de projeter des dendrites à travers l’épithélium
intestinal, d’internaliser la bactérie présente dans la lumière de l’intestin et de la transporter
vers le côté basolatéral de l’épithélium (Santos & Baumler, 2004).
Dans le cas d’entérocolite, S. Typhimurium déclenche une réponse inflammatoire qui
conduit à l’afflux massif de neutrophiles et d’exsudat au niveau de la muqueuse intestinale
qui participerait activement à la destruction de l’épithélium intestinal, conduisant au
syndrome diarrhéique (Figure 1) (Zhang et al., 2003). In vitro, il a été montré que l’attachement
de S. Typhimurium au pôle apical des cellules épithéliales humaines conduit à une migration
des neutrophiles du pôle basal vers le pôle apical (McCormick et al., 1993).
21
Figure 2 : Représentation schématique de la croissance et de la diffusion in vivo deSalmonella à l’échelle de la cellule infectée et du tissus infecté, d’après (Mastroeni & Sheppard, 2004)(A) Distribution de Salmonella au niveau d’une cellule individuelle chez la souris infectée. L’augmentation de la charge bactérienne dans les tissus se traduit plutôt par une augmentation de cellules infectées dans lesquelles un faible nombre de bactéries résident plutôt qu’un très grand nombre de bactéries pour un faible nombre de cellules infectées. (B) Distribution de Salmonella à l’échelle d’un foyer infecté (lésion pathologique) chez la souris infectée. La croissance bactérienne résulte plutôt d’une augmentation du nombre de lésions pathologiques et du nombre de phagocytes infectés par foyer plutôt que de la croissance d’un seul foyer, restreignant la bactérie à son foyer initial.
A B
22
Des études in vivo suggèrent que l’infection par S. Typhimurium induit la production
d’interleukines IL-8, d’IL-17 et de GRO , un chémoattractant pour les neutrophiles (Zhang et
al., 2002; Zhang et al., 2003).
Dans le cas des infections de type systémique, l’infection de la souris par
S. Typhimurium conduit à une infiltration de monocytes et non de neutrophiles, n’affectant
pas dramatiquement l’intégrité de l’épithélium (Figure 1) (Zhang et al., 2003). Chez S. Typhi,
cette différence de type cellulaire recruté pourrait s’expliquer par la présence de la capsule,
l’antigène Vi. En effet, des travaux récents montrent que l’infection de l’épithélium intestinal
bovin par S. Typhi ne synthétisant plus cet antigène, conduit à une plus grande sécrétion de
fluide, corrélée à une augmentation de l’expression de l’IL-17 et de GRO , responsables du
recrutement des neutrophiles. La capsule participerait ainsi à l’échappement de S. Typhi au
système immunitaire (Raffatellu et al., 2007). A la suite du franchissement de la barrière
épithéliale intestinale, les salmonelles prises en charge par les macrophages, développent une
niche intracellulaire, dans laquelle elles survivent. Véhiculées par les macrophages, elles
gagnent les ganglions mésentériques puis la circulation sanguine. Sous forme libre, elles
provoquent une bactériémie, disséminent dans l’organisme hôte et colonisent rapidement le
foie et la rate et notamment les macrophages de ces organes profonds (Salcedo et al., 2001).
En modèle murin, le nombre de salmonelles par cellule est faible (1 à 2).
L’augmentation de la charge bactérienne est liée à une augmentation du nombre de cellules
infectées plutôt qu’à une multiplication intracellulaire massive. Les différentes lésions
observées sur les organes sont donc issues de multiplication de foci de cellules infectées
provenant d’une expansion clonale (Figure 2) (Mastroeni & Sheppard, 2004).
3.3. Facteurs de virulence impliqués dans les interactions
bactéries-cellules
Salmonella dispose d’un arsenal de facteurs de virulence jouant un rôle à différentes
étapes du processus infectieux. Pour interagir avec la cellule-hôte, les salmonelles vont
mettre en jeu des facteurs d’attachement, de pénétration et de survie intracellulaire,... Ce
chapitre n’a pas pour intention de dresser une liste exhaustive des facteurs impliqués dans les
interactions bactéries-cellules tant leur nombre est important. Il est intéressant de distinguer
23
Figure 3 : Image par microscopie électronique à transmission d’une souche d’E. coli
exprimant les pili codés par l’opéron pef cloné sur un plasmide (Baumler et al., 1996a)
1 m
24
les facteurs de virulence qui ne sont pas forcément spécifiques de souches pathogènes de
ceux qui le sont. Ainsi, les fimbriae, le lipopolysaccharide (LPS) mais aussi le flagelle
(détaillé dans le chapitre 4) sont présents chez des souches non pathogènes mais contribuent
plus ou moins clairement au caractère pathogène d’une bactérie. Les facteurs de virulence
spécifiques jouent quant à eux, un rôle plus clair et sont notamment codés sur des îlots de
pathogénicité, marqueurs de la plasticité génomique et de l’évolution. Un point sur ces îlots
est présenté dans ce chapitre.
3.3.1. Les facteurs communs aux bactéries pathogènes et
non-pathogènes
3.3.1.1. Les fimbriae ou pili
Pour s’attacher aux cellules, les salmonelles disposent de structures de surface
filamenteuses nommées fimbriae ou encore pili. Ces structures longues de 0,5 à 10 µm et
larges de 2 à 8 nm sont des polymères de fimbrines (Figure 3). Les protéines intervenant
dans la biosynthèse de ces fimbriae sont codées par plusieurs gènes organisés en opéron. En
général, un opéron code un fimbriae. Les salmonelles disposent ainsi d’une dizaine d’opérons
différents. Le nombre exact varie suivant les sérotypes (van Asten & van Dijk, 2005). Les
fimbriae les plus décrits chez Salmonella sont les pili de type I (SEF21 chez S. Enteritidis)
codés par l’opéron fim dont les propriétés d’agglutination des levures ou des globules rouges
sont inhibées par le mannose. Il existe d’autres pili comme ceux codés par les opérons lpf
(pour « long polar fimbriae »), pef (pour « plasmid-encoded fimbriae ») ou agf (pour
« aggregative fimbriae » codant les fimbriae fins agrégatifs nommés aussi curli ou encore
SEF17 chez S. Enteritidis) (van Asten & van Dijk, 2005). Leurs propriétés d’agglutination sont
insensibles du mannose. Les Salmonelles disposent donc d’un répertoire étendu de fimbriae
et peuvent en exprimer plusieurs simultanément. L’expression des différents pili n’a pas
toujours été montrée in vitro en milieu de culture. L’expression de certains de ces pili,
comme ceux codés par les opérons bcf, stb, stc ou std n’a été montrée qu’en anses iléales
ligaturées bovines (Humphries et al., 2003)
In vitro, les pili, dont l’expression est très faible en culture, ont été associés à
l’attachement aux cellules. Il a été montré que les fimbriae codés par lpf jouent un rôle dans
l’attachement aux cellules HEp-2, au contraire des pili codés par pef. L’attachement aux
cellules HeLa semble, lui, plutôt lié aux fimbriae de type I (Baumler et al., 1996c). Chez
25
Figure 4 : Représentation schématique de la structure du LPS de S. Typhimurium et de ses mutants LPS rugueuxAbréviations : Man, D-mannose ; Rha, L-rhamnose ; Gal, D-galactose ; Oac, A-acétyl, GlcNAc, N-acétyl-D-glucosamine; Hap, L-glycéro-D-manno-heptose ; KDO, acide 2-kéto-3-désoxy-octonique (ou acide 3-désoxy-D-manno-octulosonique ; EtN, éthanolamine ; GlcN,D-glucosamine ; Ara NH3
+, 4-amino-arabinose. Tous les hexoses et les heptoses dans la région « core » sont liés en sauf indication contraire. Les lignes en pointillées représentent une substitution incomplète. Les lignes en vague représentent les résidus d’acides gras. LPS lisse représente le LPS sauvage au contraire des LPS Rd1, Rd2 et Re qui correspondent aux mutants LPS rugueux.
Lipide A « Core » oligosaccharidique Polysaccharide O
LPS Re
LPS Rd2
LPS Rd1
LPS lisse
26
S. Typhimurium, sur culture d’organes, les pili codés par pef et lpf ont été impliqués dans
l’attachement à l’intestin murin respectivement au niveau des entérocytes et des plaques de
Peyer (Baumler et al., 1996a; Baumler et al., 1996b).
In vivo, le rôle des pili dans la virulence est sujet à controverse. La délétion des quatre
opérons pef, lpf, fim et agf (aussi connu sous le nom de csg) chez S. Typhimurium, conduit à
l’augmentation de la dose létale 50 orale chez la souris (van der Velden et al., 1998). D’autres
opérons comme bcf, stb, stc ou std jouent également un rôle dans la persistance intestinale de
S. Typhimurium chez la souris (Lawley et al., 2006; Weening et al., 2005). L’adhésine de SEF14,
fimbriae codé par sefABCD, est nécessaire pour une bonne internalisation par les
macrophages dans la cavité péritonéale (Edwards et al., 2000). Chez le poulet, certains opérons
(stb, pef, sth, agf) ont également été décrits comme importants pour la colonisation intestinale
(Morgan et al., 2004). SEF14 favorise la colonisation splénique du poulet par S. Gallinarum
(Shah et al., 2005). D’autres travaux ne vont cependant pas dans ce sens et montrent que S.
Enteritidis délétée d’un ou plusieurs fimbriae peut coloniser normalement les organes
profonds des poulets (Allen-Vercoe et al., 1999; Rajashekara et al., 2000). Cette controverse du rôle
des fimbriae dans la pathogénie des salmonelles doit trouver son origine dans le caractère
redondant des fimbriae mais aussi dans la diversité des mutations réalisées (délétions totales
des opérons codant des fimbriae ou seulement d’un gène de l’opéron), des sérotypes de
salmonelles et des modèles in vitro et in vivo utilisés pour les étudier. De plus, les
mécanismes exacts impliquant ces structures ne sont pas encore élucidés.
3.3.1.2. Le lipopolysaccharide
Le LPS est un constituant majeur de la membrane externe des bactéries à Gram
négatif. Il est constitué de trois parties : (i) le lipide A, région proximale hydrophobe
constituée d’un squelette de glucosaminyl- -(1 6)-glucosamine substitué avec six ou sept
résidus d’acides gras saturés, (ii) le core oligosaccharidique et (iii) l’antigène O en région
distale, partie hydrophile. Ce glycolipide immunogène est présent à la surface de la bactérie
et peut se présenter sous différents aspects : lisse (« LPS-smooth ») ou rugueux (« LPS-
rough »). Ces LPS se caractérisent par la présence ou l’absence d’antigène O respectivement.
De plus, il existe des mutants dits « deep rough » (de type Rd1, Rd2 et Re ; Figure 4)
caractérisés par une perte au niveau proximal du core du LPS (Nikaido, 1996). Ces bactéries
sont alors plus sensibles aux composés hydrophobiques comme des colorants, des
antibiotiques, des sels biliaires ou des détergents.
Tableau 2 : Les îlots de pathogénicité chez Salmonella (SPI pour « Salmonella pathogenicity island ») adapté de (Hensel, 2004)
Nom Tailleen kba
PourcentageG+C moyena
Point d’insertion Distribution connue Fonctions/Facteurs de virulence
SPI-1 40 47 flhA-mutS Salmonella spp. TTSS-1, captation du manganèse
SPI-2 40 44,6 ARNt valV
S. enterica
TTSS-2
SPI-3 17 47,3 ARNt selC Salmonella spp. Survie intracellulaire et en milieu carencé en Mg2+
SPI-4 27 44,8 ARNt-like Salmonella spp. Système de sécrétion de type I
SPI-5 8 43,6 ARNt serT Salmonella spp. Effecteurs du TTSS-1 et TTSS-2
SPI-6 (SCI) 59 51,5 ARNt aspV Sous espèce enterica principalement Fimbriae
SPI-7 (MPI) 134 49,7 ARNt pheU S. Typhi, en partie chez S. Dublin et Paratyphi C
Antigène Vi, prophage SopE (effecteur du TTSS-1), pili de type IV
SPI-8 6,8 38,1 ARNt pheV S. Typhi Inconnu
SPI-9 16,3 56,7 Prophage Sous espèce enterica Système de sécrétion de type I putatif
SPI-10 33 46,6 ARNt leuX S. Dublin, S. Enteritidis, S. Typhi Fimbriae Sef
SPI-11b 14 41,3 Prophage Gifsy-1 S. Typhi, S. Typhimurium, S.Choleraesuis
pagC, pagD, msgA impliqués dans virulence en modèle murin
SPI-12c ? ? ARNt S. Typhi, S. Typhimurium, S.
CholeraesuisInconnu
SPI-13 19,3 48,1 ARNt pheV S. Gallinarum, S. Typhimurium Virulence en modèle aviaire
SPI-14 6,7 41 STM0854-STM859 S. Gallinarum, S. Typhimurium Virulence en modèle aviaire
SPI-15 6,5 49 ARNt gly S. Typhi Inconnu
SPI-16 4,5 42 ARNt arg Sous espèce enterica principalement Inconnu
SPI-17 5,1 38,5 ARNt arg Sous espèce enterica principalement Inconnu
SGI-1 43 48,4 thdF-yidY Plusieurs sérotypes de la sous espèce enterica
Multiple antibiorésistance
a Les tailles et pourcentages moyens en G+C ont été calculés à partir du génome de S. Typhi CT18 pour les îlots SPI-1 à 9 et SPI-15 à 17, et à partir du génome de S.
Typhimurium LT2 pour les îlots SPI-13, SPI-14 et SGI-1. b Les caractéristiques de SPI-11 sont celles décrites chez S. Choleraesuis SC-B67 (cf texte 3.3.2.8.)c La taille et le pourcentage moyen en G+C de SPI-12 ne sont pas mentionnés à la suite d’un possible problème d’annotation de l’îlot (cf texte 3.3.2.)
28
Le rôle du LPS dans la virulence de Salmonella est étudié depuis de nombreuses années. Le
choc septique, causé par le lipide A relargué à la suite de lyse bactérienne dans le sang, est
largement connu. Cependant, le LPS intervient également au niveau des interactions
bactéries-cellules épithéliales. Une souche de S. Typhimurium présentant un LPS rugueux va
mieux s’attacher aux cellules qu’une souche présentant un LPS lisse. Cela peut s’expliquer
par une augmentation du caractère hydrophobe d’un LPS rugueux par rapport à un LPS
normal, ce qui renforce le contact avec la membrane de la cellule épithéliale, conduisant
d’ailleurs à une certaine agrégation des bactéries entre elles (Nevola et al., 1987). Cependant, ce
rôle ne peut être généralisé à tous les sérotypes. Ainsi, un mutant « deep rough » de S. Typhi
ne peut plus s’attacher et pénétrer dans les cellules. La partie externe du core du LPS est
impliquée dans l’invasion des cellules Hep-2 (Hoare et al., 2006).
In vivo, un LPS complet de S. Typhimurium favorise la colonisation intestinale chez
la souris et l’établissement d’une persistance systémique (Lawley et al., 2006; Nevola et al., 1987).
Il a même été identifié comme un facteur de colonisation de l’intestin bovin et aviaire
(Morgan et al., 2004; Turner et al., 1998). Plus précisément, il joue un rôle dans le franchissement
du mucus permettant à la bactérie d’interagir avec l’épithélium (Licht et al., 1996; Nevola et al.,
1987). Comme pour les fimbriae, les mécanismes moléculaires expliquant le rôle du LPS dans
la virulence de Salmonella restent encore mal connus.
3.3.2. Les îlots de pathogénicité
Les îlots de pathogénicité (PAI) appartiennent plus largement à la famille des îlots
génomiques. Les îlots génomiques acquis par transfert horizontal sont distingués du
chromosome propre à la bactérie réceptrice, qui est le « cœur » du génome. Ces îlots
présentent souvent une taille allant de 10 à plus de 100 kb et un pourcentage G+C différent
du « cœur » du génome bactérien qui est d’environ 52 % chez Salmonella enterica. Ils sont
généralement proches d’un gène codant un ARNt et flanqués par des séquences répétées
directes. Ils peuvent également porter des gènes codant des facteurs de mobilité génétique
comme des transposases ou des intégrases. Le groupe de gènes présents dans ces îlots va
conférer un avantage sélectif à la bactérie, au niveau du métabolisme, de l’adaptation ou de la
résistance à l’environnement ou encore de la virulence (Dobrindt et al., 2004). Dans ce dernier
cas, les îlot génomiques sont alors désignés PAI car ils présentent un à plusieurs gènes
associés à la virulence, en plus des propriétés des îlots génomiques. A l’heure actuelle, plus
29
d’une quinzaine d’îlots, nommés en général SPI pour « Salmonella Pathogenicity Island » ont
été identifiés chez Salmonella (Tableau 2). Cependant, tous les sérotypes de salmonelles ne
présentent pas l’ensemble de ce répertoire de PAI. Ces îlots codent des facteurs de virulence
comme les systèmes de sécrétion de type III (TTSS), des effecteurs sécrétés par les TTSS,
des fimbriae, un système de captation du fer,… (Hensel, 2004). La caractérisation fonctionnelle
de ces îlots n’est pas toujours aboutie. Les derniers îlots annotés grâce à un programme
informatique, SPI-15, SPI-16 et SPI-17, ne bénéficient par exemple d’aucune étude
fonctionnelle à ce jour (Vernikos & Parkhill, 2006). Dans ce chapitre, les différents îlots de
Salmonella sont présentés. Toutefois, ce qui a trait aux TTSS et à leur fonction, sera détaillé
dans le chapitre 4.
3.3.2.1. L’îlot SPI-1
L’îlot SPI-1 constitue une insertion de 40 kb environ dans le chromosome de
Salmonella (Mills et al., 1995). Il présente un pourcentage en G+C d’environ 47 % et n’est pas
localisé près d’un gène codant un ARNt. Cet îlot code notamment le système de sécrétion de
type III n°1 (TTSS-1) qui joue un rôle central dans la pénétration de Salmonella dans les
cellules non phagocytaires (cf. Chapitre 4). Cet îlot est présent chez S. bongori et dans toutes
les sous-espèces de S. enterica (Hensel, 2004). SPI-1 ne code pas que des protéines associées
aux TTSS-1. L’opéron sitABCD présent sur l’îlot a été identifié initialement comme codant
un système putatif de captation du fer. Cet opéron, homologue à un système de transport du
fer de Yersinia pestis, complémente le défaut de croissance d’une souche d’E. coli incapable
de pousser sur un milieu déficient en fer (Zhou et al., 1999a). Par la suite, SitABCD s’est révélé
être un système de transport du manganèse, à pH basique (Kehres et al., 2002). Au niveau de la
virulence, le système Sit, induit in vivo, est requis pour la colonisation intestinale, splénique
et hépatique de S. Typhimurium en modèle murin (Janakiraman & Slauch, 2000).
3.3.2.2. L’îlot SPI-2
Cet îlot constitue un fragment de 40 kb environ présentant un pourcentage en G+C de
45 % environ. SPI-2 a été localisé près d’un gène codant l’ARNt valV (Shea et al., 1996). Sur ce
fragment, une région d’environ 25 kb comprenant une trentaine de gènes est cruciale pour la
phase systémique de la pathogénie de Salmonella. Elle code des protéines impliquées dans la
biosynthèse d’un deuxième TTSS, le TTSS-2, qui est essentiel pour la survie et la
multiplication intracellulaire de Salmonella (Hensel, 2004). Cette région est retrouvée chez
30
l’espèce S. enterica mais pas chez l’espèce S. bongori (Ochman & Groisman, 1996). La région
de 15 kb qui ne code pas ce TTSS-2, code un système de réduction du tétrathionate
permettant une respiration anaérobie des salmonelles (Hensel et al., 1999). Aucun rôle dans la
virulence n’a été attribué à cette région, à ce jour.
3.3.2.3. L’îlot SPI-3
SPI-3 est un îlot de 17 kb environ avec un pourcentage en G+C de 47 % environ,
présent en aval de l’ARNt selC chez S. Typhimurium. Il est conservé au sein du genre
Salmonella mais selon les sous-espèces et les sérotypes, il présente des variations en terme de
composition de gènes avec des insertions et des délétions au niveau de la partie centrale
(Hensel, 2004).
La partie la plus conservée porte l’opéron mgtCB codant MgtC impliquée dans la
croissance bactérienne en milieu carencé en ions Mg2+ (Blanc-Potard & Groisman, 1997) ainsi
que MgtB, transporteur de Mg2+ (Moncrief & Maguire, 1999). A l’inverse de MgtB qui ne
semble pas jouer de rôle dans la virulence de Salmonella, MgtC est importante pour la survie
intracellulaire de la bactérie dans les macrophages et dans la persistance systémique chez la
souris (Blanc-Potard & Groisman, 1997; Lawley et al., 2006). Initialement, le rôle de MgtC dans les
macrophages semblait lié à la concentration en Mg2+ limitée dans le phagosome, suggérant
que MgtC était impliquée dans le transport de cet ion. Or il a été démontré que cette protéine
n’est pas capable de transporter les ions Mg2+ (Gunzel et al., 2006). Une étude fonctionnelle
récente de MgtC a montré que son rôle dans la croissance bactérienne en milieu carencé en
ions Mg2+ et celui dans la survie intracellulaire sont dissociables et imputés à différents
domaines de MgtC (Rang et al., 2007). D’autres études sont nécessaires pour comprendre les
mécanismes d’action de MgtC.
L’îlot SPI-3 porte également d’autres gènes présentant des homologies avec des gènes
de virulence d’autres bactéries. Le gène misL code un autotransporteur dont la partie C-
terminale est homologue aux protéines impliquées dans l’attachement, VirG de Shigella
flexneri et l’adhésine AIDA-1 des E. coli entéropathogènes. Le gène marT, quant à lui, code
une protéine dont la partie N-terminale présente des homologies avec la protéine ToxR de
Vibrio cholerae requise pour la biosynthèse de la toxine cholérique. Initialement, des études
en modèle murin d’infection systémique létale avaient suggéré que ces deux gènes, misL et
marT, ne jouaient pas de rôle dans la virulence de S. Typhimurium (Blanc-Potard et al., 1999).
Or, l’inactivation de misL diminue les capacités de persistance intestinale de la bactérie dans
31
un modèle d’infection en compétition chez la souris (Dorsey et al., 2005). De plus, chez le
poulet, la protéine MisL est requise pour la colonisation intestinale (Morgan et al., 2004). En
fait, MisL est une protéine dont le domaine passager est exposé à la surface de la bactérie.
Elle est capable de lier la fibronectine favorisant l’attachement aux cellules épithéliales
expliquant ainsi son rôle dans la colonisation intestinale (Dorsey et al., 2005). De plus, en
modèle murin, marT ainsi que d’autres gènes de SPI-3 ont été impliqués dans la persistance
de S. Typhimurium (Lawley et al., 2006). Récemment, des travaux ont montré que la protéine
MarT active directement la transcription de misL (Tukel et al., 2007).
3.3.2.4. L’îlot SPI-4
L’îlot SPI-4 est un fragment de 27 kb avec un pourcentage en G+C de 45 % environ.
Il est localisé près d’une structure de type ARNt. Il est conservé chez les principaux
sérotypes. Il présente les gènes siiC, siiD, siiF codant les composants d’un système de
sécrétion de type I et le gène siiE codant une protéine sécrétée de 600 kDa. SPI-4 intervient
dans la capacité de S. Typhimurium à coloniser l’intestin bovin mais pas celui du poulet. De
plus, chez la souris, un mutant SPI-4 ne parvient pas à franchir correctement la barrière
intestinale après inoculation par voie orale. Cependant, après injection intra-péritonéale, sa
virulence est identique à celle de la souche sauvage, confirmant un rôle dans la colonisation
intestinale (Morgan et al., 2004). Dans un modèle murin, les gènes de SPI-4 codant le système
de sécrétion de type I, ont montré une importance pour la persistance de Salmonella (Lawley et
al., 2006). In vitro, la caractérisation de ce système de sécrétion de type I a mis en évidence la
sécrétion de SiiE dans le milieu de culture (Morgan et al., 2007). Les travaux de Gerlach et al.
ont aussi montré qu’elle est présente à la surface des bactéries en contact avec les cellules. De
manière intéressante, SiiE est impliquée dans l’attachement de Salmonella aux cellules
épithéliales MDCK (Gerlach et al., 2007b). L’expression de ce système de sécrétion codé par
SPI-4 est contrôlée par HilA et SirA, deux régulateurs transcriptionnels positifs des gènes
codant les protéines impliquées dans la biosynthèse du TTSS-1 (Gerlach et al., 2007a).
3.3.2.5. L’îlot SPI-5
Ce fragment de 8 kb environ avec un pourcentage en G+C d’environ 44 %, est
localisé près du gène codant l’ARNt serT. Cet îlot est conservé chez Salmonella mais
présente une structure en mosaïque. Il porte notamment les gènes sopB (connu également
sous le nom de sigD chez S. Typhimurium), pipA, pipB, pipC (sigE) et pipD. La région
32
portant sopB est conservée au sein du genre Salmonella avec parfois une insertion de cadres
ouverts de lecture (ORF) chez certains sérotypes comme S. Derby. Cependant, la région
portant pipB et pipA n’est pas retrouvée chez l’espèce S. bongori (Hensel, 2004). SPI-5 a la
particularité de coder des protéines qui sont sécrétées par différents TTSS : SopB sécrétée par
le TTSS-1 et PipB, par le TTSS-2 (Galyov et al., 1997; Knodler et al., 2002). En modèle bovin
d’anses iléales ligaturées, les gènes pipA, pipB, pipD et sopB sont impliqués dans
l’inflammation intestinale et notamment la sécrétion de fluide et le recrutement des
neutrophiles (Galyov et al., 1997; Wood et al., 1998). In vivo, le gène pipD favorise la persistance
systémique chez la souris (Lawley et al., 2006).
3.3.2.6. L’îlot SPI-6
Cet îlot, décrit à la suite du séquençage du génome de S. Typhi CT18 représente un
fragment de 59 kb avec un pourcentage de G+C de 51 % environ. Il est situé près du gène
codant l’ARNt aspV. Chez S. Typhimurium, cet îlot a aussi été appelé SCI (pour
« Salmonella chromosomal island »). SPI-6 est retrouvé chez les principaux sérotypes de
Salmonella mais des variations sont observées témoignant de la structure en mosaïque de
l’îlot (Hensel, 2004). La délétion complète de l’îlot conduit a une diminution des capacités
d’entrée de S. Typhimurium dans les cellules épithéliales intestinales. En modèle murin
d’infection systémique létale, SPI-6 n’a pas été impliqué dans la colonisation de la rate
(Folkesson et al., 2002). Pourtant, une autre étude suggère qu’une mutation polaire dans l’opéron
saf codant des fimbriae, diminue la capacité de survie intracellulaire dans les macrophages
(Klumpp & Fuchs, 2007). De manière cohérente, cet opéron saf contribue à la colonisation
splénique en modèle murin de persistance systémique (Lawley et al., 2006). Chez le porc, il
faciliterait plutôt la colonisation intestinale (Carnell et al., 2007). D’autres gènes de SPI-6,
comme stm0298 et stm0290 présentent un rôle au niveau de la persistance de S.Typhimurium
chez la souris mais leur fonction est inconnue (Lawley et al., 2006).
3.3.2.7. L’îlot SPI-7
Le locus SPI-7 est un fragment de 134 kb avec un pourcentage de G+C de 50 %
environ, également connu sous le nom de MPI (« Major Pathogenicity Island »). SPI-7 est
localisé au niveau de l’ARNt pheU et porte les gènes impliqués dans la biosynthèse de
l’antigène Vi, le prophage SopE et l’opéron codant le pilus de type IVB (Hensel, 2004). Cet
îlot est spécifique de S. Typhi. Il est toutefois présent chez S. Dublin et S. Paratyphi C mais
33
de manière incomplète puisque le prophage SopE manque chez ces deux sérotypes.
L’opéron codant le pilus de type IVB est également absent chez S. Paratyphi C. Les autres
principaux sérotypes ne présentent en général pas d’insertion au niveau du gène de l’ARNt
pheU (Hensel, 2004). Toutefois, des régions chromosomiques présentant certaines homologies
avec le prophage SopE sont identifiées chez S. Typhimurium, S. Enteritidis ou S. Dublin
(Hardt et al., 1998b).
L’antigène Vi de S. Typhi confère diverses propriétés de résistance à la bactérie :
résistance au stress oxydatif, à l’opsonisation et à l’effet bactéricide du complément. Il a été
montré récemment que l’antigène Vi inhibe la réponse inflammatoire précoce en diminuant la
sécrétion d’IL-8 par les cellules épithéliales intestinales (Sharma & Qadri, 2004). Il participerait
ainsi à l’échappement de la bactérie au système immunitaire mucosal de l’hôte (Raffatellu et
al., 2007). Le pilus de type IV, observé à la surface de S. Typhi, participe aux phénomènes
d’attachement et d’entrée dans les cellules épithéliales intestinales INT407 (Zhang et al., 2000).
La protéine SopE est sécrétée par le TTSS-1 et intervient dans l’entrée de Salmonella (Hardt
et al., 1998b).
3.3.2.8. Les îlots SPI-8 à SPI-14
Les îlots SPI-8 à SPI-14 ont été décrits plus récemment, à la suite notamment du
séquençage du génome de différents sérotypes de salmonelles. Leurs rôles dans la virulence
restent en général moins caractérisés.
SPI-8 est un îlot de 6,8 kb avec un pourcentage en G+C de 38 % environ, déterminé à
la suite du séquençage du génome de S. Typhi CT18. Il est localisé près du gène codant
l’ARNt pheV. La distribution de cet îlot au sein du genre Salmonella n’est pas connue (Hardt
et al., 1998b). Il présente deux pseudogènes codant des bactériocines putatives dont l’un est
transcrit par S. Typhi dans le phagosome du macrophage (Faucher et al., 2005).
SPI-9 est un fragment de 16 kb avec un pourcentage moyen en G+C de 57 % environ
qui code potentiellement un système de sécrétion de type I et une protéine de haut poids
moléculaire potentiellement sécrétée, comme SPI-4. Cet îlot est retrouvé chez la sous-espèce
enterica et en partie chez S. bongori (Hensel, 2004). Cependant, aucune étude fonctionnelle n’a
déterminé, à ce jour, si SPI-8 et SPI-9 sont requis pour la virulence de la bactérie.
SPI-10 est un îlot de 33 kb localisé près du gène de l’ARNt leuX, présentant un
pourcentage en G+C de 47 % environ. Il porte la séquence d’un bactériophage ainsi que
l’opéron sef qui code le fimbriae SEF14 chez S. Enteritidis, ainsi que chez S. Dublin et chez
34
S. Typhi CT18 (Hardt et al., 1998b). Cependant, chez S. Typhi, un codon stop est inséré au
niveau de sefA et sefD, respectivement premier et quatrième gène de l’opéron suggérant que
ce fimbriae n’est pas exprimé (Townsend et al., 2001). L’implication de SEF14 dans la virulence
de S. Enteritidis reste controversée (cf. 3.2.1).
Les îlots SPI-11 et SPI-12 ont été décrits à la suite du séquençage du génome de
S. Choleraesuis SC-B67 (Chiu et al., 2005). Selon les auteurs, ces deux îlots sont conservés chez
S. Typhimurium LT2 et S. Typhi CT18. Effectivement, l’îlot SPI-11 tel qu’il est présenté par
Chiu et al. (locus SC1242 à SC1258) est en partie retrouvé chez S. Typhi CT18 : la portion
SC1248 à SC1258 (environ 9 kb) est homologue à la région STY1874b à STY1893 (environ
11kb) de S. Typhi CT18 dont la différence de taille s’explique par la présence d’une portion
spécifique à chacun des deux génomes. Toutefois la première portion, SC1242 à SC1247,
n’est pas retrouvée chez S. Typhi CT18. Les auteurs ont décrit la présence d’un ORF sopB
dans cet îlot SPI-11. Cependant, après analyse de ce génome de S. Choleraesuis SC-B67
(NC_006905), on s’aperçoit que le locus de cet ORF est SC1241, excluant celui-ci de l’îlot
SPI-11 tel que les auteurs l’ont présenté. Enfin, cet ORF n’a aucune homologie avec le gène
sopB de SPI-5, qui code une protéine effectrice du TTSS-1 (cf.3.3.2.5.). Concernant l’îlot
SPI-12, là aussi des précautions doivent être prises bien que toute la zone correspondante du
génome soit totalement conservée entre S. Choleraesuis SC-B67, S. Typhimurium LT2 et
S. Typhi CT18. Les auteurs ont présenté que cet îlot, chez Choleraesuis SC-B67, se compose
de la région SC2251-SC2255 avec un pourcentage en G+C de 49,9 %. Or, en analysant le
génome, il s’avère que ce pourcentage s’élève à plus de 60 %. De plus, cette région ne
contient pas le gène msgA (locus SC2249) comme cela est présenté dans l’article. Il est
intéressant de noter qu’en amont de cette région SC2251-SC2255 se trouve le gène sspH2
(locus SCPS156) codant une protéine effectrice sécrétée par le TTSS-1 et le TTSS-2 (Miao et
al., 1999) et situé juste en aval d’une séquence d’ARNt. Cette région englobant sspH2 et msgA
possède un pourcentage en G+C d’environ 49,7 %. Il se pose donc la question d’une erreur
dans la description ou l’annotation de ces îlots SPI-11 et SPI-12 par Chi et al. Il faut toutefois
reconnaître que la région au niveau de SPI-12 présente plusieurs caractéristiques des îlots de
pathogénicité (présence d’une séquence d’ARNt, G+C% différent du reste du chromosome,
gènes de virulence). Au niveau fonctionnel, peu de données sont disponibles sur le rôle de
ces deux îlots dans la virulence de Salmonella sauf sur le gène pagC de SPI-11. La
transcription de ce gène est régulée positivement par le système à deux composants PhoP-
PhoQ, régulateur majeur de la virulence chez Salmonella (Miller et al., 1989). Ce gène code la
35
protéine PagC, protéine de la membrane externe conférant des capacités d’attachement à la
laminine de la matrice extracellulaire (Crago & Koronakis, 1999). L’inactivation de pagC
conduit à une baisse importante de la survie de Salmonella dans les macrophages. En modèle
murin d’infection systémique létale, elle conduit à une perte de virulence de Salmonella
(Miller et al., 1989). De plus, il a été montré que PagC est requise pour la persistance
systémique chez la souris (Lawley et al., 2006). Enfin, les gènes msgA et pagD, localisés près de
pagC, sont également importants pour la survie de Salmonella dans le phagosome (Gunn et al.,
1995).
Les îlots SPI-13 et SPI-14 ont été identifiés à la suite d’un criblage de mutants de S.
Gallinarum sur leur capacité à coloniser la rate du poulet. Plusieurs mutants présentant des
insertions dans SPI-13 et SPI-14 montrent un défaut de colonisation splénique ainsi qu’une
augmentation importante de la dose létale 50 dans ce modèle (Shah et al., 2005). S.
Typhimurium ainsi que S. Enteritidis portent ces îlots, ou du moins une partie mais la
distribution de ces îlots au sein du genre Salmonella n’est pas connue. Les gènes composant
ces deux îlots sont peu documentés, seul l’ORF cat-2 est connu pour favoriser l’infection de
macrophages aviaires (Zhao et al., 2002). La caractérisation fonctionnelle reste à faire.
3.3.2.9. L’îlot SGI-1
SGI-1 est un îlot de 43 kb identifié chez la souche DT104 de S. Typhimurium. Il a la
particularité de porter des gènes conférant la résistance aux béta-lactamines, à la tétracycline,
aux aminoglycosides et sulfonamides. Cet îlot contient 44 ORF et présente un pourcentage en
G+C de 49 % environ. Il est retrouvé chez d’autres sérotypes comme S. Agona ou encore
S. Infantis et peut se présenter sous différentes formes, appelées variants SGI-1 (Mulvey et al.,
2006). Il a été suggéré qu’au-delà de la multirésistance aux antibiotiques, SGI-1 joue un rôle
dans la virulence de Salmonella. Dans les faits, des expériences de pénétration cellulaire ont
montré qu’une souche de DT104 arborant l’îlot SGI-1 ne pénétrait pas mieux dans les
cellules épithéliales Hep-2 qu’une souche ne le possédant pas (Carlson et al., 2000). Cependant,
des études récentes ont montré qu’une pré-incubation de S. Typhimurium DT104 possédant
SGI-1 avec des protozoaires issus du rumen bovin, lui permet de mieux pénétrer ces cellules
épithéliales que des souches ne possédant pas cet îlot (Rasmussen et al., 2005). Il a été montré
d’ailleurs que l’ORF so13 de SGI-1 joue un rôle dans ce phénotype (Carlson et al., 2007). La
compréhension moléculaire de l’implication de SGI-1 dans la virulence de Salmonella n’en
est qu’à ses débuts, d’autant que la présence de SGI-1 ne semble pas modifier la transcription
36
des gènes de S. Typhimurium impliqués dans l’entrée ou la survie intracellulaire (Golding et
al., 2007).
3.3.2.10. L’îlot CS54
L’îlot CS54 doit son nom à sa position au centisome 54. Il s’agit d’un fragment de 25
kb qui n’est pas localisé en aval d’un ARNt. Sa distribution au sein de Salmonella suggère
une structure en mosaïque puisque shdA et ratB ont été détectés uniquement chez la sous-
espèce enterica alors que ratA, sivI et sivH ont été détectés également chez d’autres sous-
espèces ainsi que chez S. bongori. L’îlot CS54 code ainsi plusieurs protéines dont ShdA une
adhésine liant la fibronectine, qui présente des homologies avec l’autotransporteur MisL.
L’inactivation de shdA ou de ratB conduit à une diminution de la colonisation du caecum
chez la souris sensible Balb/C. De plus, en modèle murin de persistance, l’expression de ces
deux gènes est requise pour une excrétion fécale prolongée suggérant un rôle dans le portage
intestinal de S. Typhimurium (Kingsley et al., 2003).
3.3.3. Autres facteurs de virulence
Salmonella dispose d’autres facteurs de virulence qui ne sont pas localisés dans des
PAI. Ils peuvent cependant être observés sur des régions du chromosome liées à un transfert
horizontal de gènes, comme les bactériophages, ou encore sur des supports génétiques
mobiles comme des plasmides.
3.3.3.1. Facteurs de virulence issus de bactériophage
Le génome de Salmonella porte des séquences ADN de bactériophages pour certaines
fonctionnelles, c’est-à-dire capable de s’exciser du génome bactérien. Les travaux de
Figueroa-Bossi et al., ont mis en évidence la présence de deux régions excisables de 50 kb
environ, nommés Gifsy-1 et Gifsy-2 chez S. Typhimurium (Figueroa-Bossi et al., 1997). La perte
de ces bactériophages conduit à une diminution de la virulence en modèle murin d’infection
systémique létale. L’implication de Gifsy-1 dans la virulence de S. Typhimurium est plus
modeste comparée à Gifsy-2 (Figueroa-Bossi & Bossi, 1999). Gifsy-1 porte notamment le gène
gogB qui code une protéine transloquée par le TTSS-2 dans les cellules épithéliales (Coombes
et al., 2005). Son rôle dans la virulence de S. Typhimurium reste à élucider. Gifsy-2 porte
plusieurs gènes parmi lesquels ceux codant la superoxide dismutase SodCI et la protéine
GtgE qui sont des protéines importantes pour la colonisation splénique chez la souris après
37
infection intra-péritonéale (Ho et al., 2002). Le gène sseI dont la protéine est transloquée par le
TTSS-2 est également porté par Gifsy-2 (Miao & Miller, 2000). Un troisième bactériophage,
Gifsy-3 présent chez S. Typhimurium, porte notamment le gène sspH1 dont la protéine est
transloquée par le TTSS-1 (Figueroa-Bossi et al., 2001)
3.3.3.2. Le plasmide de virulence
Certaines salmonelles sont connues pour porter un voire plusieurs plasmides parmi
lesquels le plasmide de virulence. Sa taille varie de 50 à 100 kb selon les sérotypes. Au moins
sept sérotypes sont connus pour porter un plasmide de virulence : S. Typhimurium, S. Dublin,
S. Enteritidis, S. Choleraesuis, S. Gallinarum, S. Pullorum et S. Abortusovis (van Asten & van
Dijk, 2005). La nécessité du plasmide de virulence dans l’infection systémique létale chez la
souris par Salmonella est connue depuis longtemps (Gulig & Curtiss, 1987). Le plasmide de
virulence conduit à une cytotoxicité de Salmonella pour les macrophages (Guilloteau et al.,
1996).
Parmi les gènes présents sur le plasmide, l’opéron spvRABCD participe notablement
aux phénotypes associés au plasmide. Ainsi, une souche de Salmonella n’exprimant plus cet
opéron ne provoque plus de cytopathologie chez les macrophages (Libby et al., 2000). De plus,
l’absence de spvRABCD conduit à une absence de virulence en modèle murin d’infection
systémique létale ainsi qu’en modèle bovin d’entérocolite (Libby et al., 1997; Matsui et al., 2001).
La protéine SpvB modifie l’actine par ADP-ribosylation déstructurant ainsi les
microfilaments d’actine des cellules (Lesnick et al., 2001). SpvB conduit à la mort par apoptose
des cellules eucaryotes (Kurita et al., 2003). Des travaux récents ont montré qu’in vivo, SpvB
est bien transloquée dans la cellule eucaryote et qu’in vitro cette sécrétion dans le milieu
extracellulaire, se fait de manière indépendante du TTSS-1 et TTSS-2 (Gotoh et al., 2003).
Le plasmide de virulence de S. Enteritidis et S. Typhimurium porte également le gène
rck codant une protéine de la membrane externe homologue à la protéine Ail de Yersinia
enterocolitica et de la même famille que PagC. Cette protéine a été associée à la résistance de
Salmonella au complément du sérum. A l’inverse de PagC, Rck, lorsqu’elle est exprimée
chez une souche non-invasive d’E. coli, favorise l’attachement et l’entrée de la bactérie dans
les cellules eucaryotes (Heffernan et al., 1994). Les mécanismes sous-jacents de cette entrée
médiée par Rck restent à déterminer, tout comme l’importance relative de cette voie d’entrée
par rapport à celle dépendante du TTSS-1. Le plasmide de virulence porte d’autres gènes
comme l’opéron pef qui code un fimbriae (cf. 3.2.1.).
38
4. Les systèmes de sécrétion de type III chez Salmonella
La sécrétion est une fonction cellulaire basique retrouvée chez tous les organismes
vivants. La notion de sécrétion peut toutefois porter à confusion suivant le système considéré
ou encore le mouvement que l’on souhaite décrire. Les mots sécrétion, exportation et
translocation peuvent être différemment utilisés. Dans ce manuscrit, ces termes n’auront pas
exactement le même sens. Le phénomène « d’exportation » décrira le passage d’une protéine
du cytoplasme vers le périplasme. La notion de « sécrétion » décrira quant à elle, le passage
d’une protéine du périplasme vers le milieu extérieur de la bactérie (face extérieure de la
membrane externe ou milieu extracellulaire). Ce terme s’appliquera également au passage
d’une protéine du cytoplasme directement vers le milieu extérieur. Enfin, la « translocation »
désignera spécifiquement la sécrétion d’une protéine bactérienne directement dans le
cytoplasme de la cellule eucaryote. Une exception a été faite lorsqu’il est précisé « appareil
d’exportation » qui constitue une structure précise des systèmes de sécrétion de type III
(TTSS), selon la nomenclature reconnue dans la littérature. Cette structure localisée au
niveau de la membrane interne, côté cytoplasmique, adresse les protéines à travers l’aiguille
du TTSS ou le crochet dans le cas du flagelle.
Les TTSS sont des systèmes permettant à la bactérie d’injecter dans les cellules
eucaryotes hôtes des protéines de virulence, afin de détourner la machinerie cellulaire à son
profit. L’appareil de sécrétion du TTSS est constitué d’une vingtaine de protéines et les
protéines effectrices sont directement transloquées du cytoplasme de la bactérie vers le
cytoplasme de la cellule hôte. Ces effecteurs ne transitent donc pas au niveau du périplasme.
Les salmonelles disposent de deux TTSS, impliqués historiquement dans deux étapes
distinctes du processus infectieux. Le TTSS-1 confère à la bactérie la capacité de pénétrer
dans les cellules non phagocytaires et joue un rôle dans les interactions avec la barrière
épithéliale intestinale et la réponse inflammatoire de l’hôte. Le deuxième TTSS, le TTSS-2
permet à Salmonella de développer une infection systémique et de coloniser les organes
profonds tels que la rate et le foie. Au niveau cellulaire, le TTSS-2 permet aux salmonelles de
survivre dans le phagosome des macrophages et dans la vacuole des cellules non
phagocytaires (Hansen-Wester & Hensel, 2001). En supplément du TTSS-1 et du TTSS-2, on
distingue également le flagelle, apparenté aux TTSS. Le flagelle n’a pourtant pas de fonction
de sécrétion de protéines effectrices dans le cytoplasme de la cellule hôte. Il présente
39
Figure 5 : Schéma structural du flagelle d’après (Aldridge & Hughes, 2002)Abréviations : ME, membrane externe ; PG, peptidoglycane ; MI, membrane interne
Figure 6 : Assemblage du flagelle chez Salmonella d’après (Macnab, 2004)L’anneau MS, l’appareil d’exportation ainsi que le moteur et le complexe d’inversion sont assemblés en premier, probablement via la voie Sec. La formation de la tige est ensuite effectuée via la sécrétion de type III alors que la mise en place des anneaux P et L est dépendante de la voie Sec. La formation du crochet se fait ensuite grâce à l’appareil d’exportation de type III puis est suivie par la sécrétion de la flagelline à travers le crochet pour former le filament du flagelle final.
Protéines
associées au
h t
Coiffe du filament
Anneau L
Anneau P
Filament
Crochet
Moteur
Appareil d’exportation
Anneau MS Anneau C
Complexe
ME
PG
MI
TigeCorps basal
Voie Sec Sécrétion de type III
Exportation par la voie Sec Sécrétion de type III
Anneau MS Appareil
d’exportation
Moteur et
Complexe
« switch »
Tige proximale Tige distale
Anneau P Anneau L Crochet Filament de
flagelline naissant
Flagelle complet
40
toutefois une capacité de sécrétion, celle de la flagelline constituant le filament du flagelle.
Cette sécrétion présente les caractéristiques de sécrétion de type III (Macnab, 2004). Ce
chapitre présentera l’assemblage, les fonctions ainsi que la régulation des trois TTSS de
Salmonella. La régulation positive et négative de l’expression des TTSS sera abordée sous un
aspect génétique et environnemental, en insistant sur les facteurs qui semblent jouer un rôle
primordial, en particulier pour le TTSS-1 et le TTSS-2. Enfin, les facteurs contrôlant
l’expression des trois TTSS seront évoqués.
4.1. Le flagelle
4.1.1. Structure et assemblage
Le flagelle est la structure permettant à la bactérie de se mouvoir dans son
environnement. Il s’agit d’un long filament de 20 nm de diamètre par environ 10 µm de
longueur. Le flagelle est codé par une cinquantaine de gènes répartis sur le chromosome
bactérien en plus d’une quinzaine d’opérons. D’un point de vue structural, le flagelle se
décompose en plusieurs parties (Macnab, 2004) (Figure 5):
- le corps basal, composé de l’anneau MS (localisée à la membrane interne), la tige qui
traverse l’espace périplasmique ainsi que l’anneau périplasmique P et celui de la
membrane externe L.
- le moteur flagellaire, localisé autour du corps basal et responsable de la rotation du
flagelle.
- le complexe « Switch », composé de la protéine FliG et de l’anneau C, est responsable
de l’inversion du sens de rotation du moteur.
- l’appareil d’exportation, localisé au niveau du pore formé par l’anneau MS. Il est
responsable de la sécrétion des composants du flagelle comme les protéines du
crochet ainsi que la flagelline.
- le crochet, structure cylindrique, sur laquelle la flagelline sera ancrée, est relié au
corps basal.
- le filament flagellaire, constitué de plusieurs filaments de flagelline formant une
structure hélicoïdale.
- des protéines de jonction entre le crochet et le filament ainsi que des protéines de
coiffe terminant le filament.
41
Figure 7 : Représentation de la hiérchie de la transcription des gènes flagellaires couplée à l’assemblage d’après (Chilcott & Hughes, 2000)Une cinquantaine de gènes codent le flagelle. Ils sont transcrits en opéron, selon trois temps différents. On distingue ainsi les gènes précoces, intermédiaires et tardifs, caractérisés par la présence de promoteurs de classe I, II et III respectivement. Le régulateur maître de la transcription des gènes flagellaires, le complexe hétéromultimérique composé de FlhC et FlhD, active la transcription des gènes intermédiaires codant notamment les protéines du corps basal et du crochet, ainsi que les deux protéines FlgM et FliA ( 28). L’activateur transcriptionnel des gènes tardifs, 28 est séquestré par FlgM jusqu’à la formation complète du corps basal et du crochet. Une fois ces derniers fonctionnels, FlgM est sécrétée à travers le crochet, libérant 28 qui active alors la transcription des gènes tardifs codant notamment la flagelline. Certains gènes sont transcrits à la fois de manière intermédiaire et tardive (fliDST,
flgKL, flgMN).
Gènes
précocesGènes
intermédiairesGènes tardifs
Signaux de
régulation
Complexe
d’activation
Formation du corps basalet du crochet
Formation dufilament flagellaire
28
FlgM
FlgM
28
Sécrétion de FlgM
Facteur actif
Complexe inactif
28
42
L’assemblage du flagelle se fait de manière séquentielle, des structures proximales
aux structures distales (Figure 6). Le schéma retenu à l’heure actuelle veut que l’anneau MS
s’intègre à la membrane interne en étroite association avec l’appareil d’exportation. Par
contre, le moment de la mise en place du moteur flagellaire et du complexe « Switch » n’est
pas tout à fait élucidé. Ces composants sont adressés à leur localisation finale via la voie Sec.
Par la suite, les autres structures seront formées. La tige est mise en place au moyen du
système de sécrétion de type III particulier au flagelle, son appareil d’exportation. Les
anneaux P et L sont formés après exportation médiée par la voie Sec. La dernière étape fait
appel, à nouveau, au système de sécrétion de type III, où le crochet qui est constitué, permet
la sécrétion de la flagelline formant le filament flagellaire (Macnab, 2004).
4.1.2. Contrôle de l’expression et de l’assemblage du flagelle
L’assemblage du flagelle est très contrôlé que ce soit au niveau transcriptionnel,
traductionnel ou post-traductionnel. Des étapes critiques comme la fonctionnalité du crochet,
déterminent si oui ou non, le flagelle sera mis en place complètement (Chilcott & Hughes, 2000).
Parmi les gènes flagellaires, on distingue des gènes précoces, intermédiaires et tardifs et des
promoteurs de classe I, II et III. En général, les gènes précoces présentent un promoteur de
classe I, les intermédiaires, un promoteur de classe II et les tardifs, un promoteur de classe III
(Figure 7). En premier lieu, l’unique promoteur de classe I permet la transcription de
l’opéron flhDC codant le régulateur transcriptionnel central des gènes flagellaires.
L’oligoprotéine FlhD2C2 active la transcription des gènes intermédiaires possédant un
promoteur de classe II, codant les protéines nécessaires à l’assemblage du corps basal et du
crochet ainsi que les régulateurs FlgM et 28. Les gènes tardifs comme ceux codant la
flagelline présentent un promoteur de classe III dépendant du facteur 28 et sont alors
exprimés. Cependant, certains gènes présentent plusieurs promoteurs obéissant ainsi aux
régulateurs FlhD2C2 ainsi qu’à 28.
Le premier niveau de régulation de l’expression du flagelle est le contrôle de
l’expression de FlhD2C2, régulateur maître du flagelle. Son expression est modulée par
différents facteurs, notamment des protéines de stress thermique dont DnaK (Shi et al., 1992) ou
encore la division cellulaire (Mizushima et al., 1994). La transcription de flhDC est inhibée par
l’expression de FimZ, régulateur positif de l’expression des fimbriae de type I (Clegg &
Hughes, 2002). Plus récemment, il a été montré que la protéine RtsB réprime directement la
43
transcription de flhDC (Ellermeier & Slauch, 2003). Au niveau post-traductionnel, la quantité du
complexe FlhD2C2 est contrôlée par la protéase ClpXP (Tomoyasu et al., 2003).
Un autre niveau de contrôle jouant sur la synthèse du flagelle, fait intervenir la
protéine Flk. Des mutants n’assemblant pas les anneaux P et L ne synthétisent pas de
flagelline en raison de la présence de Flk (Karlinsey et al., 1997). Les travaux de Aldridge et al.
suggèrent que la protéine Flk, ancrée à la membrane interne, serait un frein à la sécrétion
prématurée de FlgM dans le périplasme, évitant ainsi une libération du facteur 28 et la
synthèse de la flagelline lorsque le corps basal n’est pas achevé (Aldridge et al., 2006).
En parallèle, le facteur 28 interagit avec le facteur anti-Sigma FlgM, ne pouvant pas
activer la transcription de son régulon (Kutsukake & Iino, 1994). Lorsque le crochet est
fonctionnel, la protéine FlgM est alors sécrétée à travers cette structure. La concentration
intracellulaire de FlgM diminuant, le facteur 28 est libéré et peut activer la transcription des
gènes présentant un promoteur de classe III (Karlinsey et al., 2000). Un senseur doit
nécessairement intervenir pour activer la sécrétion de FlgM par l’appareil d’exportation, une
fois le crochet fonctionnel. La protéine FliK qui contrôle la longueur du crochet et qui est
sécrétée à travers le crochet (Minamino et al., 1999) va jouer un rôle dans ce phénomène en
association avec FlhB, protéine de l’appareil d’exportation (Minamino et al., 2004).
4.1.3. Le flagelle et la virulence
La notion de flagelle comme facteur de virulence est très ancienne mais reste
controversée. La cause en est certainement multifactorielle. Le rôle du flagelle dans la
virulence a été étudié de différentes manières : mutant dépourvu de la majeure partie de la
structure flagellaire (mutant app), dépourvu de filament (mutant fla), présentant un filament
mais pas de rotation flagellaire (mutant mot) ou encore possédant un flagelle complet mais
pas de mobilité en réponse au chimiotactisme (mutant che). De plus, si la majeure partie des
études a été faite sur S. Typhimurium, les modèles in vitro et in vivo qui ont été utilisés, sont
multiples.
Certains travaux décrivent un rôle du flagelle dans l’attachement aux cellules mais
aussi dans la pénétration de S. Enteritidis dans les cellules épithéliales (Dibb-Fuller et al., 1999).
Chez le poulet, le flagelle confère à S. Enteritidis une meilleure capacité de colonisation des
organes profonds après infection orale de poussins d’un jour (Allen-Vercoe et al., 1999).
44
Dans d’autres études, l’implication du flagelle dans la virulence in vivo n’est pas
observée. Ainsi, la dose létale 50 orale de mutants fla ou mot de S. Typhimurium n’est pas
augmentée en modèle murin d’infection systémique létale (Lockman & Curtiss, 1990; Schmitt et
al., 2001). Chez le rat, la mutation fla chez S. Enteritidis n’entraîne qu’une modeste et
transitoire diminution de la colonisation des organes profonds par la bactérie (Robertson et al.,
2003).
Plusieurs études vont dans le sens où le flagelle favorise les contacts bactéries-
cellules. Il a été montré chez S. Enteritidis que le flagelle augmente les interactions avec les
cellules épithéliales intestinales, en particulier lorsqu’il est nécessaire de franchir le mucus
pour entrer en contact avec les cellules de l’iléon chez le rat (Robertson et al., 2000). Ainsi, in
vivo, des mutants app et che de S. Typhimurium ne parviennent pas à franchir rapidement le
mucus intestinal, expliquant pourquoi, le mutant est moins associé aux cellules durant les
premières heures de l’infection (Stecher et al., 2004). Le flagelle ne ferait qu’accélérer l’entrée
de S. Enteritidis dans les cellules. Les travaux de van Asten et al. ont montré que la
différence d’entrée dans les cellules observée in vitro entre un mutant fla ou mot, au bout
d’une heure de contact n’existe plus après 3h de contact (van Asten et al., 2004). Il s’agit bien de
la fonctionnalité du flagelle qui va favoriser le contact bactéries-cellules, puisqu’il a été
montré qu’après centrifugation, un mutant de S. Typhimurium dépourvu de flagelle pénètre
les cellules Hep-2 de manière comparable à la souche sauvage (Jones et al., 1992).
Le flagelle joue également un rôle dans la réponse immunitaire de la cellule hôte. En
modèle murin d’entérocolite, cela se traduit par une réponse inflammatoire et des dommages
épithéliaux réduits à la suite d’une infection par un mutant fla ou che (Stecher et al., 2004). La
flagelline est ainsi un facteur pro-inflammatoire majeur déclenchant une réponse
entérocytaire médiée notamment par le TLR-5, récepteur à la surface basolatérale des cellules
ainsi que par Ipaf, protéine cytoplasmique des macrophages (Miao et al., 2007). Récemment, il a
été montré que la flagelline est transloquée dans la cellules hôte par le TTSS-1. Cette
découverte a permis de comprendre comment la flagelline pouvait interagir avec la protéine
Ipaf (Sun et al., 2007).
45
Figure 8 : Organisation des gènes impliqués dans la biosynthèse du TTSS-1 présents sur SPI-1 d’après (Lostroh & Lee, 2001)Le nom des gènes est indiqué par les lettres capitales avec le nom du locus dans lequel ils se trouvent (ex : G représente invG). L’opéron sitABCD localisé en aval de avrA, appartenant à SPI-1 n’est pas représenté.
Figure 9 : Le complexe d’aiguille du TTSS-1 de Salmonella Typhimurium d’après (Galan & Wolf-Watz, 2006; Marlovits et al., 2004)(A) Image par microscopie électronique de complexes d’aiguille purifiés et colorés négativement. (B) Représentation schématique et composition du complexe d’aiguille. (C) Image par rendu de surface de la structure du complexe d’aiguille, vue sous plusieurs angles.
4.2.
Composants de l’appareil de sécrétion de type IIIRégulateurs transcriptionnels Protéines du translocon ou chaperones
Effecteurs sécrétés
A C
Aiguille
Anneauxexternes
Tige interne
Anneaux
internes
B
46
Le TTSS-1
Les protéines impliquées dans la biosynthèse du TTSS-1 sont codées sur l’îlot de
pathogénicité SP1-1 (cf. 3.2.3.1.). Historiquement, les premiers gènes de cet îlot mis en
évidence ont été désignés « inv », pour « invasion gene ». Ainsi, en criblant une banque
d’ADN de Salmonella, les gènes invA, invB, invC ont été identifiés comme facteurs de
pénétration dans les cellules épithéliales (Galan & Curtiss, 1989). D’autres études ont montré
plus tard qu’ils font partie d’un plus grand ensemble de gènes codant un système de sécrétion
de type III impliqué dans l’entrée active de Salmonella dans les cellules. SPI-1 porte ainsi les
gènes inv-spa ainsi que l’opéron prgHIJK qui codent les protéines de structure du TTSS-1.
L’îlot présente également les gènes qui codent des protéines sécrétées par le TTSS-1 (gènes
sip ou ssp), des protéines chaperones ou encore des régulateurs transcriptionnels des gènes de
SPI-1 (Lostroh & Lee, 2001) (Figure 8).
4.2.1. Structure et assemblage de l’appareil du TTSS-1
La structure d’un TTSS se décompose en deux parties majeures : l’appareil
d’exportation et la partie centrale. L’appareil d’exportation permet l’adressage et la sécrétion
de protéines à travers la partie centrale, structure permettant le passage de molécules à travers
la membrane interne, le périplasme et la membrane externe. La partie centrale, appelée
« complexe de l’aiguille », est formée d’une base et d’une aiguille filamenteuse. La base est
constituée de deux anneaux à la membrane interne et de deux autres à la membrane externe.
Ces deux séries d’anneaux sont traversées par une tige interne reliée à l’aiguille en partie
distale (Marlovits et al., 2004) (Figure 9). Plusieurs protéines constituent donc ce complexe de
l’aiguille. PrgH et PrgK forment les anneaux de la membrane interne alors que InvG
constitue les anneaux externes (Kubori et al., 2000). La protéine InvG est une sécrétine dont le
bon ancrage à la membrane externe est conditionné par la lipoprotéine InvH (Crago &
Koronakis, 1998). Ces protéines sont mises en place via le système Sec.
L’assemblage de la base est suivi par la mise en place des protéines de l’appareil
d’exportation (InvA, InvC, SpaO, SpaP, SpaQ, SpaR, SpaS, OrgA et OrgB). La protéine
InvC joue un rôle clé puisqu’elle va fournir l’énergie au système grâce à son activité
ATPasique (Eichelberg et al., 1994). Des analyses génétiques de l’assemblage du TTSS-1 ont
Fin de la mise en place de
la tige interne et signal de
changement de spécificité
de substrat
de l’encoche de la base
Stabilisation
(ATPase et protéines associées à la membrane)
Appareil d’exportation
Figure 10 : Modèle d’assemblage du complexe d’aiguille du TTSS-1 de Salmonella d’après (Galan & Wolf-Watz, 2006)L’assemblage du TTSS-1 commence par la mise en place de l’anneau interne composé de PrgH et PrgK. L’anneau externe composé de InvG se met en place, aidé par InvH (ne faisant pas partie de la structure finale). L’appareil d’exportation regroupant notamment l’ATPase InvC ainsi que InvA, SpaQ, SpaP, SpaR et SpaS, est assemblé. La liaison entre l’anneau externe et l’anneau interne pourrait être médiée par IagB qui peut dégrader le peptidoglycane (aucune étude ne l’a encore montré à ce jour). L’assemblage de la base permet l’exportation de la tige interne (PrgI) et la sécrétion de l’aiguille (PrgI) et de protéines régulatrices (InvJ). InvJ va stabiliser la conformation de la base permettant le bon ancrage de la tige et de l’aiguille. Cela conduit à un changement de spécificité de substrat permettant la sécrétion des protéines effectrices par le TTSS.
48
montré que la délétion des gènes codant les protéines de l’appareil d’exportation n’empêche
pas l’assemblage de la base (anneaux PrgH-PrgK et InvG) mais prévient la mise en place de
l’aiguille du TTSS (Sukhan et al., 2001). L’aiguille est constituée de la protéine PrgI, composant
majoritaire du filament, et de PrgJ, protéine potentielle de la tige interne, toutes deux
sécrétées grâce à l’appareil d’exportation (Marlovits et al., 2004) (Figure 9). Une fois l’aiguille
mise en place, le TTSS alors fonctionnel va changer de spécificité de substrat afin de pouvoir
sécréter les protéines effectrices. Ce changement de spécificité de substrat est conditionné par
la protéine sécrétée InvJ (Collazo & Galan, 1996) qui contrôle la longueur de l’aiguille. Un
mutant invJ présente une aiguille anormalement longue et ne sécrète pas de protéines
effectrices de l’entrée (Collazo & Galan, 1996; Kubori et al., 2000). Le mécanisme de contrôle de
la longueur de l’aiguille et du changement de spécificité de substrat n’est pas encore
totalement élucidé. Des travaux récents suggèrent qu’InvJ stabiliserait une conformation
spécifique de la base permettant l’ancrage de la tige interne. Celle-ci correctement assemblée,
conduirait à l’attachement ferme de l’aiguille à la base, modifiant à nouveau la conformation
de celle-ci, de manière compatible à une sécrétion de protéines effectrices (Marlovits et al.,
2006) (Figure 10). Cette fonction d’InvJ rappelle la fonction de la protéine flagellaire FliK qui
contrôle la longueur du crochet ainsi que la fonctionnalité du flagelle (Macnab, 2004). A
l’heure actuelle, aucune étude ne s’est portée sur une interaction possible entre les protéines
de l’appareil d’exportation et InvJ dans le processus de changement de spécificité de substrat
de l’appareil du TTSS-1 comme c’est le cas entre FliK et FlhB en ce qui concerne le flagelle.
4.2.2. Sécrétion et translocation des protéines via le TTSS-1
Une dizaine d’effecteurs sécrétés par le TTSS-1 ont été identifiés. Certains sont codés
par des gènes présents sur SPI-1 (sipABCD, avrA, sptP) et d’autres codés par des gènes
localisés ailleurs sur le chromosome (sopA, sopB, sopD, sopE, sopE2, slrP, sspH1, sspH2).
D’un point de vue dynamique la translocation des protéines effectrices dans la cellule est un
évènement rapide. Une visualisation par microscopie en temps réel a montré que Salmonella
délivre son stock de protéines SipA et SopE dans la cellule eucaryote en 80 à 200 sec
(Schlumberger et al., 2005).
L’appareil du TTSS ne sécrète pas n’importe quelles protéines, obéissant ainsi à une
spécificité de substrat. Cette sécrétion se déroule en plusieurs étapes (Figure 11). Les
49
Figure 11 : Modèle de translocation de protéines effectrices par le TTSS-1 d’après (Galan & Wolf-Watz, 2006)L’effecteur est initialement associé à sa chaperone, formant un complexe qui va interagir avec l’ATPase de l’appareil d’exportation du TTSS. L’ATPase va dissocier l’effecteur de sa chaperone qui reste dans le cytosol de la bactérie. L’effecteur est ensuite adressé sous forme dépliée à travers le pore du complexe d’aiguille. Le translocon, composé de protéines sécrétées via le TTSS, forme un pore dans la membrane de la cellule eucaryote hôte. Il permet le passage de la protéine effectrice dans le cytoplasme de la cellule cible.
Membrane de la
cellule hôte
Enveloppe
bactérienne
Complexe
ATPase
ChaperoneEffecteur
TransloconPlate-forme
d’assemblage
du translocon
50
protéines effectrices des TTSS présentent souvent un signal de sécrétion en N-terminal, dans
les 20 à 30 premiers acides aminés (a.a.). Au contraire des protéines sécrétées via le système
Sec, cette séquence n’est pas clivée. Chez Yersinia, des études ont suggéré que le signal de
sécrétion réside dans la partie 5’ de la séquence non-transcrite de l’ARNm codant l’effecteur
(Anderson & Schneewind, 1997). Chez Salmonella, plusieurs travaux ont montré que pour
plusieurs effecteurs, cela n’est pas le cas. Des motifs conservés en N-terminal de la séquence
protéique modulant la sécrétion ont été mis en évidence chez certains effecteurs de S.
Typhimurium (Miao & Miller, 2000). Les 35 premiers acides aminés N-terminaux de SptP sont
ainsi suffisants pour la sécrétion de la protéine dans le milieu extérieur. Cette sécrétion se fait
en partie via le flagelle suggérant qu’un autre facteur doit conférer la spécificité pour le
TTSS-1 (Lee & Galan, 2004).
Le contrôle de la sécrétion des protéines effectrices est également conféré par les
protéines chaperones qui se lient de manière spécifique aux effecteurs. Les chaperones sont
des petites molécules qui se lient à des domaines protéiques de 50 à 100 acides aminés en
aval de la séquence signal en N-terminal des effecteurs. Ces chaperones peuvent lier
plusieurs cibles, c’est le cas de InvB qui interagit avec les protéines effectrices SipA, SopA et
SopE (Bronstein et al., 2000; Higashide & Zhou, 2006; Lee & Galan, 2003). Dans le cas de SopE, la
présence d’un domaine de liaison à la chaperone va conditionner sa translocation dans la
cellule eucaryote via le TTSS-1. Lorsque ce domaine est délété, la protéine SopE résultante
qui possède toujours son signal de sécrétion, est alors sécrétée via le flagelle seulement dans
le milieu de culture et non plus dans la cellule. Il a ainsi été suggéré que le signal de sécrétion
pourrait être un signal ancestral du flagelle et que le domaine de liaison à la chaperone
confèrerait la spécificité de la voie de sécrétion (Lee & Galan, 2004).
Lors de la sécrétion, des protéines de l’appareil du TTSS reconnaissent le substrat
pour engager sa sécrétion. Dans le cadre du TTSS-1, l’ATPase InvC joue un rôle dans ce
phénomène. Cette protéine présente non seulement un domaine lui conférant l’activité
ATPasique mais également un domaine lui permettant de s’ancrer à la membrane interne, et
un autre, d’interagir avec d’autres protéines comme celles de l’appareil d’exportation (Akeda
& Galan, 2004). In vitro, InvC va dissocier la chaperone de son effecteur où ce dernier se
trouvant sous forme non-repliée, pourra être sécrété (Akeda & Galan, 2005).
La translocation des protéines effectrices dans le cytoplasme des cellules eucaryotes
est un processus qui se distingue de la simple sécrétion in vitro dans le surnageant et
nécessite un translocon. Les protéines SipB, SipC et SipD, forment cette structure et sont
indispensables à la délivrance des effecteurs dans la cellule hôte (Collazo & Galan, 1997).
51
Figure 12 : Formation de renflements membranaires par réarrangement du cytosquelette d’actine de la cellule eucaryote en contact avec Salmonella
(A) Images par microscopie électronique à balayage de cellules MDCK infectées par S. Typhimurium pendant 30 min, présentant la formation de renflements membranaires tout autour des bactéries en contact (Galan et al., 1992)(B) Image par microscopie électronique à balayage de S. Typhimurium (pseudo-colorée en vert) infectant une cellule MDCK (pseudo-colorée en rouge). Au niveau du point de contact entre la bactérie et la cellule, les microvili de la cellule ont disparu pour laisser la place à de larges renflements membranaires qui conduiront à la pénétration de Salmonella (Patel & Galan, 2006)(C) Image de microscopie par immunofluorescence montrant le réarrangement du réseau d’actine (flèche) de la cellule hôte au niveau de S. Typhimurium. L’actine est marquée par la rhodamine phalloidine (rouge), S. Typhimurium par un anticorps conjugué au FITC (vert) et l’ADN par DAPI (bleu) (Patel & Galan, 2006)
5 µm 5 µm
A
B C
52
Les protéines SipB et SipC, homologues à IpaB et IpaC de Shigella flexneri, présentes
à la surface bactérienne, sont associées à la membrane plasmique des cellules eucaryotes
infectées par Salmonella, où elles sont supposées former un pore (Hayward et al., 2000; Scherer
et al., 2000) (Figure 11). De manière intéressante, il a été montré que SipB interagit avec le
cholestérol, composé retrouvé dans les membranes eucaryotes et absent chez les bactéries, et
que cette interaction est importante pour la translocation des effecteurs (Hayward et al., 2005).
La protéine SipB et sa chaperone restaurent les capacités de pénétration dans les cellules et de
lyse de la vacuole d’un mutant ipaB de Shigella flexneri (Hermant et al., 1995). Il est ainsi
intéressant de noter la conservation fonctionnelle entre SipB et son homologue IpaB alors que
chez Salmonella, aucune lyse de la vacuole intracellulaire n’est observée. La protéine SipD
est quant à elle moins bien caractérisée. Chez Yersinia, il a été montré que LcrV (homologue
de SipD) qui contrôle la translocation des effecteurs, forme une structure particulière à la
pointe de l’aiguille (Mueller et al., 2005). Cette structure pourrait servir de plate-forme
d’assemblage permettant la formation du pore du translocon. Chez Salmonella, le rôle de
SipD dans un tel processus reste à démontrer. Comme pour les autres effecteurs du TTSS-1,
la sécrétion des protéines du translocon SipB et SipC est aussi dépendante d’une interaction
avec une protéine chaperone, SicA (Tucker & Galan, 2000). La sécrétion des protéines du
translocon est également contrôlée par InvE, une protéine qui interagit avec le complexe
chaperone-effecteur, SicA-SipB ou SicA-SipC (Kubori & Galan, 2002). Le rôle exact de InvE
n’est pas encore connu.
4.2.3. Détournement de la machinerie cellulaire par les
effecteurs du TTSS-1
Les effecteurs du TTSS-1 vont permettre l’entrée de Salmonella dans les cellules, en
particulier, les cellules non phagocytaires en provoquant la formation de renflements
membranaires (Figure 12). La bactérie se retrouve et reste dans une vacuole dont le trafic
intracellulaire est modifié évitant ainsi la fusion phagosome-lysosome.
Parmi toutes les protéines effectrices mises en évidence à l’heure actuelle, au moins
six jouent un rôle démontré dans la pénétration et dans le remaniement du cytosquelette de la
cellule hôte. Ces protéines peuvent soit interagir directement avec l’actine soit moduler sa
dynamique de manière indirecte (Figure 13). Le rôle des autres protéines effectrices
transloquées par le TTSS-1 est moins connu.
53
Figure 13 : Mécanismes d’action des principaux effecteurs du TTSS-1 pour promouvoir l’entrée de Salmonella dans les cellules, d’après (Patel & Galan, 2005)(A) Après contact avec la cellule, Salmonella délivre ses effecteurs dans le cytoplasme de la cellule eucaryote hôte. Les protéines SipC et SipA interagissent directement avec l’actine afin de remodeler le cytosquelette et générer des renflements membranaires au niveau du site de contact bactérie-cellule. De plus, SipA va empêcher la dépolymérisation de l’actine en inhibant la gelsoline et l’ADF/cofiline. Les protéines SopE et SopE2 activent directement les RhoGTPases Rac et Cdc42, participant aux réarrangements du réseaux d’actine, via la voie du complexe Arp2/3 (B) Après l’entrée, la bactérie se retrouve dans sa vacuole, la SCV (« Salmonella containing vacuole »). SopB module le métabolisme des phosphoinositides au niveau de la membrane du SCV, permettant la maturation du phagosome. La protéine SptP, ayant une demi-vie plus longue que SopE (rapidement dégradée par le protéasome) va désactiver les RhoGTPases permettant le retour à l’origine du réseau d’actine et ainsi de la surface de la cellule hôte.
Rac, Cdc42, RhoG
Arp2/3
SGEF
Actine
Protéasome
PI3P
SopE/E2
SopB
SipA
SipC
SptP
ADF/Gelsoline
Facteurs de l’hôte Facteurs de Salmonella
A B
54
4.2.3.1. Manipulation de l’actine par voie directe
Les protéines SipA et SipC sont des interactants directs de l’actine et vont agir en
coopération pour modifier sa polymérisation (Figure 14), à l’origine de la formation de
renflements membranaires (McGhie et al., 2001).
La protéine SipC de 41 kDa est homologue à IpaC chez Shigella (Kaniga et al., 1995b).
Comme vu précédemment (cf. 4.2.2.), SipC joue un premier rôle dans la translocation des
protéines effectrices du TTSS-1 puisqu’elle appartient au translocon, structure du TTSS-1 en
contact avec la membrane de la cellule hôte (Collazo & Galan, 1997). Transloquée dans la
cellule eucaryote, elle est localisée au niveau de la membrane plasmique (Scherer et al., 2000).
SipC interagit directement avec l’actine de la cellule eucaryote et provoque son remaniement
(Hayward & Koronakis, 1999; McGhie et al., 2001). Une étude structurale récente a montré que ces
deux fonctions peuvent être dissociées. La partie centrale de la protéine SipC (a.a. 201-220)
est critique pour la nucléation de l’actine alors que la partie C-terminale (a.a. 321-409) est
responsable de la translocation des protéines effectrices dans la cellule hôte (Chang et al., 2005).
Les 120 a.a. de la partie N-terminale de SipC interagissent également avec l’actine
provoquant sa condensation qui, associée à la nucléation, conduit au remaniement du
cytosquelette dans la cellule eucaryote (Hayward & Koronakis, 1999).
SipA est une protéine de poids moléculaire apparent de 80 kDa environ, homologue à
IpaA de Shigella (Kaniga et al., 1995a). Dans la cellule eucaryote, la protéine SipA va interagir
directement avec l’actine, en inhibant notamment sa dépolymérisation, dans le but de faciliter
l’entrée de Salmonella (Zhou et al., 1999b). Elle catalyse l’activité de SipC dans la nucléation et
la formation de réseaux d’actine (McGhie et al., 2001). L’action de SipA porte sur la phase
précoce du processus de pénétration puisqu’au bout de quelques minutes, un mutant sipA
pénètre moins dans les cellules que la souche sauvage. Cependant, lors de temps de contact
plus long (15 à 30 min), la différence d’entrée n’existe plus (Jepson et al., 2001; Zhou et al.,
1999b). Les premières études de virulence d’un mutant sipA ont suggéré que SipA n’était pas
impliquée dans la virulence en modèle murin d’infection systémique létale (Kaniga et al.,
1995a). Par contre, chez le veau, SipA qui n’est pas essentielle pour la colonisation intestinale,
se révèle importante pour la létalité de Salmonella (Tsolis et al., 2000). In vitro, des travaux plus
récents ont montré que SipA joue bien un rôle plus marqué que celui initialement observé
dans la virulence de Salmonella. Chez un mutant délété des
55
Figure 14 : Coopération de SipA et SipC pour la nucléation et la formation de réseaux d’actine (McGhie et al., 2001)Des cellules Swiss 3T3 ont été fixées 5 min en présence de tampon de perméabilisation seul (Control), de SipA, de SpiC ou d’un mélange des deux protéines aux concentrations indiquées. Les cellules ont été colorées au Rouge-Texas conjugué à la phalloïdine afin de visualiser les filaments d’actine par microscopie à fluorescence. Les flèches indiquent la condensation de l’actine (c), les structures en filopode (f), ou en lamellipode (l). La barre représente 0,5 m. Une concentration de 500 nM de SipA ne provoque pas de réarrangements de l’actine. Cependant, associée à SipC même en faible concentration (0,5 nM), elle conduit à un réarrangement important de l’actine dans la cellule.
56
principaux effecteurs de l’entrée, SipA, à elle seule, confère une plus grande capacité
d’entrée dans les cellules épithéliales HT-29 (Raffatellu et al., 2005).
La protéine SipA joue également un autre rôle qui n’a pas de lien avec la
réorganisation de l’actine : l’attraction des neutrophiles dans l’intestin. En effet, dans un
modèle murin d’entérocolite, SipA favorise l’inflammation et l’afflux de neutrophiles dans
l’intestin (Hapfelmeier et al., 2004), phénotype qui peut être partiellement reproduit in vitro
puisque SipA seule, mise en contact avec des cellules épithéliales intestinales polarisées,
provoque la transmigration des neutrophiles (Lee et al., 2000b). Cette interaction conduit à la
production d’un chémoattractant, l’hépoxilline A3, au niveau apical des cellules épithéliales
intestinales (Mrsny et al., 2004).
L’ensemble de ces études suggère deux rôles distincts de SipA, un rôle extracellulaire
afin de déclencher une réponse inflammatoire et un rôle intracellulaire afin de promouvoir
l’entrée de Salmonella. Des études structurales et fonctionnelles indiquent que la partie C-
terminale de la protéine (a.a. 459 à 684) est suffisante pour lier l’actine et stabiliser les
filaments d’actine (Higashide et al., 2002). Au niveau N-terminal, les travaux de Schlumberger
et al. suggèrent que la présence de deux domaines (F1 et F2) conditionnerait la focalisation
de SipA au niveau des zones de contacts bactéries-cellules (Schlumberger et al., 2007). Il a été
montré d’autre part, que le domaine de SipA de l’acide aminé 294 à 424 (superposant la
majeure partie du domaine F2) est responsable du recrutement de neutrophiles à travers la
barrière épithéliale intestinale (Wall et al., 2007). Un même domaine de la protéine SipA semble
donc jouer deux rôles distincts suivant sa localisation (intracellulaire ou extracellulaire)
venant compliquer la compréhension du rôle de SipA dans la virulence de Salmonella.
4.2.3.2. Manipulation de l’actine par voie indirecte
Dans le but de provoquer la formation de renflements membranaires, Salmonella
dispose également de facteurs qui ne vont pas agir directement sur l’actine mais sur des
régulateurs de l’actine : les petites GTPases appartenant à la famille des Rho, régulateurs clés
de l’architecture de la cellule eucaryote (Etienne-Manneville & Hall, 2002). Ces RhoGTPases se
présentent sous deux états, une forme inactive liée au GDP et une forme active liée au GTP.
Ce passage de la forme inactive à active se fait grâce à l’intervention d’un facteur d’échange
de guanine (Figure 15).
Les protéines SopE et SopE2 de Salmonella, d’un poids moléculaire d’environ
25 kDa, sont transloquées dans le cytoplasme de la cellule eucaryote et jouent le rôle de
57
Figure 15 : Schéma simplifié de l’activation des RhoGTPases Ancrées à la membrane plasmique, les RhoGTPases inactives sont liées au GDP. Les facteurs d’échanges de guanine (GEF) catalysent l’échange de nucléotides permettant l’activation des RhoGTPases liées au GTP. Une fois activées, ces enzymes vont pouvoir transduire le signal en activant leurs substrats. L’inactivation des RhoGTPases est conditionnée par des protéines activant la réaction GTPase (GAP) des Rho conduisant à l’hydrolyse du GTP en GDP avec libération d’un phosphate inorganique (Pi).
58
facteur d’échange de guanine auprès des GTPases Rac-1 et Cdc42 (Hardt et al., 1998a; Stender
et al., 2000). SopE interagit avec Rac-1 et Cdc42 alors que SopE2 n’interagit qu’avec Cdc42
(Friebel et al., 2001). L’inhibition de l’expression de Rac-1 ou de Cdc42 par la technique
d’ARN interférence a montré que seule Rac-1 est nécessaire pour la formation de renflements
membranaires et la pénétration de Salmonella. L’activation de Cdc42 par SopE, SopE2 et
SopB, est requise pour la réponse pro-inflammatoire (expression d’IL-8) par les cellules
intestinales (Patel & Galan, 2006).
Une troisième protéine, connue sous le nom de SopB/SigD, intervient dans le
remaniement du cytosquelette d’actine. Cette protéine est une phosphatidyl-inositol
phosphatase (Galyov et al., 1997; Norris et al., 1998). Son activité phosphatase semble importante
pour le réarrangement de l’actine. (Zhou et al., 2001). Récemment, cette réorganisation de
l’actine via SopB a été attribuée à l’activation de RhoG via le facteur d’échange de guanine
endogène SGEF (Patel & Galan, 2006). In vitro, la délétion de sopB ne conduit qu’à une légère
diminution de l’entrée de Salmonella dans les cellules. Cependant, lorsque cette délétion est
couplée à l’inactivation de sopE et sopE2, une baisse importante de la pénétration de la
bactérie dans les cellules est observée (Zhou et al., 2001).
Ces trois protéines agissent donc en synergie afin d’activer les RhoGTPases en
mimant pour certaines (SopE et SopE2), les facteurs d’échange de guanine. La finalité de
cette activation, la manipulation des réseaux d’actine, implique différents facteurs en aval des
RhoGTPases, tel que le complexe Arp2/3, facteur eucaryote recruté à la membrane contrôlant
les réseaux d’actine (Criss & Casanova, 2003).
Après pénétration de Salmonella dans les cellules, le cytosquelette de la cellule hôte
retourne à son état d’origine, rendant à la cellule sa forme physiologique (Fu & Galan, 1999).
La protéine SptP de Salmonella est responsable de cette restauration en réorganisant le
cytosquelette d’actine. Elle active les propriétés GTPasiques de Rac-1 et Cdc42 activées à la
suite de l’entrée de Salmonella, afin que ces dernières passent à un état inactif. SptP est
homologue à YopE de Yersinia et ExoS de Pseudomonas aerugina, protéines transloquées
déstabilisant les filaments d’actine (Fu & Galan, 1998; Fu & Galan, 1999). Des études ont montré
que SptP mime la structure des protéines activant la réaction GTPasique des RhoGTPases
(Stebbins & Galan, 2000). A l’heure actuelle, il n’a pas été montré si SptP active la réaction
GTPasique de RhoG conduisant à son inactivation. Il serait pourtant intéressant d’établir si
SptP peut inhiber l’effet de SopB sur RhoG comme elle le fait pour l’effet de SopE et SopE2
sur Rac-1 et Cdc42.
59
Chez Salmonella, les travaux de Kubori et Galán ont montré que SopE et SptP sont
délivrées dans la cellule en quantité équivalente très tôt au cours de l’infection plutôt que
l’une après l’autre. Cependant, elles ne présentent pas la même demi-vie dans la cellule
eucaryote (Kubori & Galan, 2003). SopE est ainsi rapidement dégradée par le protéasome et ne
peut plus activer les RhoGTPases. Par la suite, SptP qui devient majoritaire, fait pencher la
balance vers l’inactivation des RhoGTPases et ainsi la restauration du réseau d’actine
(Figure 13 et 15). Cette stabilité est conditionnée par le domaine de sécrétion et de
translocation de l’effecteur (Kubori & Galan, 2003). D’autres études doivent être réalisées avant
de pouvoir généraliser ce système à d’autres effecteurs. De plus, les causes moléculaires
expliquant la reconnaissance préférentielle du protéasome pour une protéine donnée restent à
élucider.
4.2.3.3. Après l’entrée
Historiquement, le rôle du TTSS-1 a été cloisonné à la pénétration de Salmonella dans
les cellules. Toutefois, l’implication du TTSS-1 dans le trafic et la prolifération intracellulaire
de Salmonella est une notion qui émerge. Des études montrent ainsi que des effecteurs du
TTSS-1 jouent non seulement un rôle dans la fermeture du phagosome mais aussi dans sa
stabilité dans la cellule hôte. Ainsi, SopB et son activité inositol phosphatase va permettre en
partie la bonne fermeture du phagosome contenant Salmonella. L’élimination de
phosphatidyl-inositol-(4,5)-biphosphate accumulé au niveau des renflements membranaires
semble requise pour la formation rapide des vacuoles contenant les salmonelles (SCV pour
« Salmonella-containing vacuole ») (Terebiznik et al., 2002). La modulation du métabolisme des
phosphoinositides par SopB contribue à la maturation du phagosome (Hernandez et al., 2004).
De plus, cette activité phosphoinositide phosphatase de SopB protège les cellules épithéliales
infectées d’une apoptose prématurée, permettant ainsi le maintien de Salmonella dans sa
niche intracellulaire (Knodler et al., 2005). La protéine SipA présente également un rôle dans la
biogenèse de ces SCV et leur localisation dans la cellule, en coopérant avec SifA un effecteur
transloqué par le TTSS-2 (Brawn et al., 2007). In vivo, il a d’ailleurs été montré que des
effecteurs du TTSS-1 comme SipA et SopB sont exprimés tardivement au cours de
l’infection en modèle murin d’infection systémique létale, au niveau des organes profonds
(Giacomodonato et al., 2007). En parallèle, Lawley et al. ont identifié des effecteurs du TTSS-1
(SopE2) et des protéines du translocon (SipB et SipD) comme étant requis pour la persistance
systémique murine (Lawley et al., 2006).
60
L’infection des cellules par Salmonella peut conduire à la mort des cellules, illustrant
le caractère cytotoxique de la bactérie. Plusieurs travaux ont montré qu’une mutation de sipB
conduit à une diminution de la cytotoxicité de S. Typhimurium infectant les macrophages ou
les cellules dendritiques (Santos et al., 2001; van der Velden et al., 2003). La protéine SipB, faisant
partie du translocon comme SipC, semble également transloquée dans les cellules puisque
Collazo et al. l’ont observée au niveau du cytosol (Collazo & Galan, 1997). Des études indiquent
que SipB, injectée dans le macrophage, va induire l’apoptose via la voie de la Caspase-1 avec
qui elle interagit (Hersh et al., 1999). Les travaux du laboratoire de Galán montrent également
que l’apoptose des cellules déficientes en Caspase-1 infectées par Salmonella est due à SipB.
Ils suggèrent que cette mort résulterait d’une déstructuration des mitochondries induisant
l’autophagie puis la mort cellulaire (Hernandez et al., 2003). Ces études vont ainsi dans le sens
d’un rôle du TTSS-1 qui ne peut se limiter à la simple entrée de Salmonella dans les cellules
et le franchissement de la barrière épithéliale intestinale. L’idée d’une coopération entre les
effecteurs du TTSS-1 et du TTSS-2 ouvre des perspectives d’études intéressantes.
4.2.3.4. Les autres effecteurs du TTSS-1
Hormis SipA, SipC, SopB, SopE, SopE2 et SptP, d’autres protéines sont transloquées
par le TTSS-1. Leur caractérisation n’est pas autant avancée.
La protéine SopD a été identifiée initialement chez S. Dublin (Jones et al., 1998). In
vitro, elle est impliquée dans l’entrée dans les cellules épithéliales polarisées et in vivo, elle
joue un rôle dans l’entéropathogénicité chez le veau (Raffatellu et al., 2005; Zhang et al., 2002).
Au niveau moléculaire, SopD, dans la cellule eucaryote est recrutée au site d’entrée et
contribue, en coopération avec SopB, à la fermeture de la vacuole conduisant à la formation
du SCV (Bakowski et al., 2007). Au-delà d’un simple rôle dans l’entrée, SopD semble également
impliquée dans l’infection systémique chez la souris et la réplication dans les macrophages
(Giacomodonato et al., 2007; Lawley et al., 2006).
La protéine SlrP possède des domaines riches en leucine et présente des homologies
avec IpaH de Shigella et YopM de Yersinia. Identifiée initialement comme un facteur de
colonisation intestinal murin, SlrP est transoquée par le TTSS-1 et le TTSS-2 (Miao & Miller,
2000; Tsolis et al., 1999). Son rôle exact dans la pathogénie de Salmonella reste peu décrit.
La protéine SspH1 a été mise en évidence par l’identification d’un motif conservé
dans la séquence de protéines effectrices des TTSS. SspH1 est peu conservée chez les
souches de Salmonella Typhimurium (Miao et al., 1999; Zhang et al., 2002).
61
Figure 16 : Modèle simplifié de la régulation génétique de SPI-1 Le régulateur transcriptionnel central des gènes de SPI-1, HilA, active la transcription des gènes codant le TTSS-1. Son expression est elle-même très contrôlée, notamment par HilD qui déréprime la transcription de hilA. D’autres régulateurs positifs et négatifs vont moduler la transcription de hilA, principalement via l’expression de HilD. Les flèches en rouge pleines et en tirets représentent une activation transcriptionnelle et post-transcriptionnelle respectivement. Les flêches bleues en pointillés représentent une inhibition post-traductionnelle.
62
La protéine connue sous le nom d’AvrA, homologue à YopJ de Yersinia et à une
protéine d’une bactérie pathogène de plante, a été identifiée comme effecteur (Hardt & Galan,
1997). Cette protéine ne favorise pas la virulence de Salmonella en anses iléales ligaturées
bovines (Zhang et al., 2002) mais semble moduler la voie NF- B, impliquée dans la réponse
inflammatoire de la cellule (Collier-Hyams et al., 2002).
Récemment, un nouvel effecteur a été identifié, SteA, qui joue un rôle dans la
virulence de Salmonella chez la souris (Geddes et al., 2005; Lawley et al., 2006). Cette protéine,
transloquée dans la cellule par le TTSS-1 et le TTSS-2, se localise au niveau de l’appareil de
Golgi (Geddes et al., 2005). Les mécanismes d’action de cette protéine restent à déterminer.
4.2.4. Régulation génétique de SPI-1
4.2.4.1. Les régulateurs locaux
L’îlot SPI-1 code plusieurs régulateurs transcriptionnels dont le rôle principal est de
moduler l’expression de ses propres gènes (Figure 16). Le régulateur transcriptionnel central
des gènes de SPI-1 est le facteur HilA, membre de la famille OmpR/ToxR. Ce régulateur se
lie à un motif conservé présent au niveau des promoteurs de prgH et invF conduisant à la
transcription des gènes prgHIJKorgAB et invFGEABCspaMNOPQRS. Ainsi, HilA active la
synthèse des protéines structurales du TTSS-1 et de la protéine InvF, second régulateur
transcriptionnel de la famille AraC/XylS. Ce dernier est requis pour la transcription des gènes
sicAsipBCDA codant notamment les protéines du translocon ainsi que des gènes sopB/sigD et
sopE, présents ailleurs sur le chromosome (Lostroh & Lee, 2001). Pour activer la transcription
des gènes de son régulon, InvF requiert la présence de la protéine chaperone SicA avec
laquelle elle interagit directement (Darwin & Miller, 2000; Darwin & Miller, 2001). Tout
récemment, une coopération entre HilA et InvF pour la transcription des gènes extérieurs à
SPI-1 codant les effecteurs SopE, SopB et SopA a été suggérée. La transcription de ces gènes
est activée directement par HilA qui peut se lier à leur régions promotrices, en plus de InvF
(Thijs et al., 2007). Il a été montré que HilA peut également s’autoréguler négativement, lorsque
Salmonella est cultivée en conditions non favorables à l’expression des gènes de SPI-1 (De
Keersmaecker et al., 2005).
L’expression du TTSS-1 résulte d’une cascade d’activation transcriptionnelle dans
laquelle des régulateurs vont contrôler l’expression de HilA. Deux de ces régulateurs, HilC
(aussi connu sous le nom de SprA et SirC) et HilD appartenant à la famille AraC/XylS sont
63
codés sur l’îlot SPI-1 (Eichelberg et al., 1999; Schechter et al., 1999). Tous les deux vont interagir
avec une région en amont de hilA et déréprimer sa transcription (Lucas & Lee, 2001; Schechter &
Lee, 2001). L’inactivation de hilD, au contraire de hilC, conduit à une diminution importante
de la transcription de hilA et, en conséquence, de l’entrée de Salmonella dans les cellules
(Rakeman et al., 1999; Schechter et al., 1999). HilC et HilD peuvent également activer directement
la transcription de invF indépendamment de HilA (Akbar et al., 2003; Rakeman et al., 1999). De
plus, HilC et HilD semblent pouvoir activer directement leur propre transcription (Ellermeier
et al., 2005). Ce rétrocontrôle positif doit certainement jouer le rôle d’amplificateur de la
réponse.
4.2.4.2. Les régulateurs extérieurs à SPI-1
Plusieurs régulateurs de l’entrée, positifs mais aussi négatifs, codés par des gènes
répartis sur tout le chromosome, ont été identifiés, dessinant un réseau de régulation
complexe mais souvent centralisé sur l’expression de HilA et HilD, le nœud de régulation de
l’expression des gènes associés au TTSS-1 (Figure 16).
Les régulateurs positifs
Le système à deux composants BarA/SirA contrôle la transcription de hilA (Altier et al.,
2000b). La protéine SirA phosphorylée se lie aux zones promotrices de hilA et hilC suggérant
un contrôle direct de leur transcription (Teplitski et al., 2003). Les auteurs n’ont cependant pas
montré que cette liaison in vitro conduisait réellement à une activation de la transcription de
ces gènes. Les travaux de Ellermeier et al. indiquent que l’activation de la transcription de
hilA via SirA est abolie en absence de HilD. Cela suggère un contrôle indirect de la
transcription de hilA, dépendant de HilD (Ellermeier et al., 2005). En parallèle, SirA contrôle
négativement la transcription des gènes flagellaires via flhDC (Teplitski et al., 2003).
Le contrôle de l’entrée, médié par BarA/SirA semble en partie lié à l’activation du
système de régulation post-transcriptionnel csr. SirA se lie au promoteur du gène csrB codant
un ARN non traduit et active sa transcription (Teplitski et al., 2003). L’ARN csrB est connu
chez E. coli pour inhiber l’activité de la protéine CsrA (Liu et al., 1997). Or la protéine CsrA
contrôle l’expression des gènes associés au TTSS-1 potentiellement via HilD ainsi que des
gènes flagellaires, en se liant à l’ARNm cible pour modifier sa stabilité (Altier et al., 2000a;
Lawhon et al., 2003). Lorsqu’elle est absente ou surexprimée, la transcription de hilA est
64
diminuée suggérant un contrôle très fin du niveau de CsrA pour réguler la pénétration (Altier
et al., 2000a).
La protéine RtsA, identifiée comme régulateur positif de la transcription des gènes de
SPI-1 constitue un autre point de régulation (Ellermeier & Slauch, 2003). RtsA, régulateur de la
famille AraC/XylS, va augmenter la transcription de hilA, en partie de manière indépendante
de HilC et HilD, conduisant ainsi à l’activation transcriptionnelle de invF. La transcription de
invF via RtsA peut également se faire en partie de manière indépendante de HilA (Ellermeier
& Slauch, 2003). Récemment, il a été montré qu’une protéine de fusion RtsA possède la
capacité de se lier aux promoteurs de hilC et hilD ainsi qu’à celui de son propre gène,
suggérant une autorégulation (Olekhnovich & Kadner, 2007). De plus, la transcription de rtsA est
également activée par le régulateur SirA (Ellermeier et al., 2005) mais également par HilC et
HilD en milieu à forte osmolarité (Olekhnovich & Kadner, 2007).
Les régulateurs négatifs
La modulation fine de l’expression de hilA et des gènes de SPI-1 doit se faire
nécessairement par l’intervention de régulateurs négatifs qui modifient la balance
activation/inhibition (Figure 16).
Dans cette optique, la recherche de mutants présentant une activation de la
transcription de hilA a mis en évidence le rôle de HilE (Fahlen et al., 2000). Le facteur HilE
interagit avec HilD, l’empêchant certainement de se lier au promoteur de hilA pour
augmenter sa transcription (Baxter et al., 2003). Aucune étude n’a cependant confirmé ce
mécanisme. La transcription de hilE est contrôlée par les protéines FimY-FimZ. Ces
protéines, impliquées dans la biosynthèse des pili de type I et dans l’inhibition de
l’expression du flagelle, activent la transcription de hilE, conduisant ainsi à l’inhibition de la
transcription de hilA (Baxter & Jones, 2005).
La protéase Lon réprime la transcription de hilA en milieu de culture et dans la
vacuole de la cellule (Boddicker & Jones, 2004; Takaya et al., 2002). Il a été montré que Lon
dégrade les protéines HilC et HilD conduisant ainsi à la baisse de transcription de hilA
(Takaya et al., 2005).
Le système RcsC/YojN/RcsB, impliqué dans la biosynthèse de la capsule, contrôle
négativement l’expression du TTSS-1 et du flagelle, en diminuant la transcription de hilA
ainsi que celle de flhDC. Ce système semble répondre à l’osmolarité (Arricau et al., 1998;
65
Mouslim et al., 2004). Une protéine contrôlant ce système a été identifiée. Le facteur IgaA
prévient une activité excessive de RcsB/YojN/RcsC par un contrôle post-traductionnel dont
les mécanismes exacts ne sont pas encore connus (Dominguez-Bernal et al., 2004). De plus, le
régulon de RcsB/YojN/RcsC présente des points communs avec celui de PhoP/PhoQ,
régulateur de l’expression du TTSS-2 (cf. 4.3.3.), notamment au niveau des gènes de
virulence comme prgH codant une protéine de structure du TTSS-1. Il semble cependant que
ce système ne régule pas l’expression des gènes de SPI-2 (Garcia-Calderon et al., 2007).
4.2.5. Régulation environnementale
Salmonella doit s’adapter à son environnement pour survivre et se développer. In
vitro, un milieu à pH neutre, faiblement oxygéné et à forte osmolarité (conditions supposées
reproduire celles de l’iléon distal) conduit à l’activation de hilA (Bajaj et al., 1996). Dans le
duodénum (partie proximale de l’intestin grêle), la bile sécrétée inhibe l’entrée de Salmonella
(Prouty & Gunn, 2000). Par la suite, les acides gras à chaîne courte (acétate, propionate et
butyrate) présents en proportion variable tout au long du tractus intestinal, vont moduler
l’entrée. Une proportion majeure d’acétate retrouvée dans l’iléon (partie distale de l’intestin
grêle) conduit à l’augmentation de la transcription de hilA via le système BarA/SirA (Lawhon
et al., 2002). Le métabolisme des acides gras joue effectivement un rôle dans la régulation de
hilA. La mutation du gène fadD codant une protéine impliquée dans la captation des acides
gras, conduit à l’augmentation de la transcription de hilA. Les mécanismes exacts du contrôle
de l’expression de hilA par la dégradation des acides gras restent à élucider.
Le métabolisme du phosphate contrôle la transcription des gènes de SPI-1. La
mutation de pstS (aussi connu sous le nom de phoS), dont la protéine est impliquée dans le
système de captation du phosphate inorganique (Pi), conduit à la baisse de la transcription de
hilA (Lucas et al., 2000). La mutation de pstS provoque l’activation du système à deux
composants PhoB-PhoR qui est à l’origine de la diminution de la transcription de hilA. En
effet, la mutation de phoB chez un mutant pstS restaure la transcription de hilA (Lucas et al.,
2000). Des travaux de Baxter et Jones (non publiés à l’heure actuelle mais présentés dans une
revue) suggèrent que la régulation de l’expression de HilA via le système PhoB passerait par
l’activation de FimZY et HilE (Jones, 2005).
L’exposition de Salmonella aux peptides antimicrobiens rencontrés chez l’hôte, dans
l’intestin mais aussi dans la vacuole des macrophages, conduit également à inhibition de la
transcription de hilA (Bader et al., 2003).
66
Figure 17 : Modèle de structure du TTSS-2 et organisation génétique de SPI-2 d’après (Kuhle & Hensel, 2004)(A) Schéma hypothétique du TTSS-2 et de la localisation cellulaire de ses composants. (B) Organisation génétique de SPI-2 qui présente notamment les gènes ssaU à ssrB codant des protéines du TTSS-2 et les gènes ttr, non impliqués dans la virulence, qui codent des protéines impliquées dans le système de réduction du tétrathionate pour la respiration anaérobie.
Appareil
Translocon
Effecteur
Chaperone
Fonction inconnue
Système de réducti
ARN
on du tétrathionate
t
Gène de phage
Système à deux composantsMembrane endosomale
Membrane externe
Périplasme
Membrane interne
Signaux
environnementaux
Gènes associés au TTSS-2
Effecteurs
67
4.3.
Figure 18 : Formation d’une structure dépendante de SPI-2 à la surface de Salmonella(Chakravortty et al., 2005)(A) Image en microscopie électronique d’une souche sauvage et d’un mutant ssaV de S. Typhimurium (gène codant une protéine de structure du TTSS-2) cultivés en conditions favorables à l’expression de SPI-2. La barre représente 2 m. (B) Image en microscopie électronique d’une section ultrafine de Salmonella dans une vacuole de macrophages RAW264.7, 7 h post infection. La barre à gauche représente 500 nm et celle de droite 25 nm.
Souche sauvage Mutant ssaV
A
B
68
Le TTSS-2
Le TTSS-2 est le deuxième système de sécrétion de type III identifié chez Salmonella.
Il est codé par des gènes regroupés au niveau de l’îlot SPI-2, organisés en opérons codant les
protéines de l’appareil de sécrétion, des effecteurs, des chaperones et un système à deux
composants (Shea et al., 1996). Le TTSS-2 confère à Salmonella la capacité à survivre dans la
vacuole de phagocytose des macrophages (Ochman et al., 1996). La virulence des souches de
Salmonella n’exprimant pas le TTSS-2 est ainsi fortement atténuée (dose létale 50 augmentée
d’un facteur 105) en modèle murin d’infection systémique létale (Shea et al., 1996). Ce TTSS
joue donc un rôle essentiel dans la phase systémique de la pathogénie de Salmonella.
4.3.1. Structure, assemblage et translocation des effecteurs
La structure et l’assemblage du TTSS-2 ont été beaucoup moins étudiés que ceux du
TTSS-1 qui servent de modèle. Les fonctions des différents gènes présents sur SPI-2 ont été
essentiellement attribuées par recherche d’homologies avec les gènes associés à d’autres
TTSS. Le modèle retenu montre que le TTSS-2 se compose d’un appareil avec une base
ancrée à la membrane bactérienne composée d’une structure à la membrane interne et d’une à
la membrane externe (Figure 17). Les gènes ssaDRSTUV codent potentiellement des
protéines localisées à la membrane interne. Une étude par fractionnement cellulaire suggère
effectivement que SsaV est présente à ce niveau alors que SsaC, capable de s’oligomériser à
pH acide, est localisée au niveau de la membrane externe (Rappl et al., 2003). L’aiguille serait
constituée de SsaG, SsaH et SsaI (Kuhle & Hensel, 2004)
La partie du TTSS-2 exposée à la surface bactérienne, notamment le translocon, est
beaucoup mieux caractérisée. Les gènes sseBCD codant les protéines du translocon sont ainsi
requis pour la translocation des effecteurs du TTSS-2 dans la cellule hôte mais pas pour la
sécrétion dans le surnageant de culture (Beuzon et al., 1999; Nikolaus et al., 2001). Récemment, un
appendice dépendant de SPI-2 a pu être visualisé à la surface de Salmonella par microscopie
électronique (Figure 18). Des anticorps dirigés contre les protéines du translocon SseB et
SseC reconnaissent cet appendice. La mutation du gène ssaV codant une protéine de
structure, abolit la formation de cet appendice et la reconnaissance via les anticorps anti-SseB
et –SseC, suggérant ainsi qu’il s’agit bien du TTSS-2 (Chakravortty et al., 2005). Une souche
69
Figure 19 : Modèle présentant les phénotypes associés à la vie intracellulaire de Salmonella (Abrahams & Hensel, 2006)(A) La souche sauvage de Salmonella, après pénétration dans la cellule se retrouve dans une vacuole appelée SCV (vacuole contenant Salmonella) qui va se localiser près du noyau de la cellule eucaryote hôte. (B) Plusieurs protéines effectrices sécrétées par le TTSS-2 de Salmonella recrutent les moteurs moléculaires et génèrent des interactions avec les microtubules. La balance d’activité entre la kinésine et la dynéine permet le maintien de la SCV au niveau du noyau. Les interactions avec les microtubules génèrent l’extension de filaments induits par Salmonella à partir de la SCV. (C) Les protéines SseF et SseG sont requises pour le maintien des SCV à proximité du noyau. La mutation de sseF conduit chez Salmonella à une baisse du recrutement de la dynéine, favorisant l’activité de la kinésine (mouvement du pôle – vers le pôle + des microtubules) qui distribue les SCV en périphérie de la cellule hôte. (D) La protéine SifA est requise pour le recrutement de dynéine et l’intégrité de la SCV. Un mutant sifA se retrouve ainsi dans le cytoplasme de la cellule hôte. (E) Le cycle intracellulaire de Salmonella consiste également à éviter les défenses de l’hôte : espèces réactives oxygénées générées par la NADPH-oxydase et le monoxyde d’azote (NO) produit par la NO synthase inductible.(F) Dans la cellule, la SCV interagit avec le réseau d’actine et s’y associe intimement.
Glycoprotéines lysosomales
Actine
Dynéine
Kinésine
Microtubules
Transporteur intracellulaire
A BC
D
mutant
sifA
noyau
NADPH-
oxydase
NOSi
Souche
sauvage
Souche
sauvage
E
mutant
sseF sseG
GF
70
de Salmonella mutée dans l’un des gènes codant les protéines du translocon est logiquement
atténuée dans sa survie à l’intérieur du macrophage (Hensel et al., 1998).
La translocation des effecteurs du TTSS-2 est dépendante de la protéine SseA. En son
absence, Salmonella est totalement avirulente en modèle murin d’infection systémique létale
(Coombes et al., 2003). La protéine SseA est requise pour la mise en place du translocon et joue
en fait le rôle de chaperone au moins pour les protéines SseB et SseD (Ruiz-Albert et al., 2003).
Le TTSS-2 sécrète plus d’une dizaine d’effecteurs. La translocation de certains
d’entre eux (SspH1, SspH2, SifA, SifB, SseJ, SlrP et SopD2) est reliée à la présence d’un
motif conservé en N-terminal (Brumell et al., 2003; Miao et al., 1999; Miao & Miller, 2000).
4.3.2. Détournement de la machinerie cellulaire par les
effecteurs du TTSS-2
Le rôle et les fonctions liés au TTSS-2 se concentrent principalement sur la vie
intracellulaire de Salmonella. Il participe donc à la réplication in vivo dans les organes
profonds ce qui aboutit à une infection systémique (Cirillo et al., 1998; Hensel et al., 1998; Ochman
et al., 1996; Salcedo et al., 2001). La majorité des études ont été réalisées en cultures cellulaires et
principalement sur des macrophages. La survie dans les macrophages et le détournement du
trafic cellulaire est en effet un point critique pour la virulence de Salmonella. Après l’entrée
dans les cellules, Salmonella se retrouve dans une vacuole qui en évoluant devient spécifique
de Salmonella. Cette vacuole contenant Salmonella est nommée SCV (« Salmonella-
containing vacuole »). Ces vacuoles présentent des marqueurs des endosomes tardifs comme
Rab7, des glycoprotéines lysosomales LAMP-1, LAMP-2 et LAMP-3/LAMP-1, ainsi que
l’ATPase vacuolaire responsable de l’acidification du phagosome. Cependant, ces SCV ne
présentent que tardivement voire pas du tout certaines caractéristiques des endosomes tardifs
(comme les récepteurs mono-6-phosphate) suggérant l’absence de fusion phagosome-
lysosome (Knodler & Steele-Mortimer, 2003).
4.3.2.1. Détournement du trafic intracellulaire
Une des premières fonctions attribuées au TTSS-2, est la modification du trafic
intracellulaire afin d’inhiber la fusion du phagosome contenant Salmonella et du lysosome de
la cellule hôte. La protéine SpiC a été la première décrite comme étant impliquée dans ce
71
Figure 20 : Formation de filaments induits par Salmonella au niveau de la vacuole endosomale (Abrahams & Hensel, 2006)Ces filaments sont des prolongements tubulaires de la membrane de la vacuole contenant Salmonella (SCV) présentant des marqueurs des endosomes tardifs comme LAMP-1. Comme d’autres effecteurs transloqués par le TTSS-2, SseF se localise au niveau des filaments et de la SCV.
72
processus (Uchiya et al., 1999). Sécrétée dans le macrophage, SpiC interagit avec les protéines
eucaryotes TassC et Hook3, impliquées dans le trafic vésiculaire, permettant d’inhiber la
fusion phagosome-lysosome (Lee et al., 2002; Shotland et al., 2003). Cependant, d’autres travaux
n’ont pas réussi à montrer la translocation de SpiC dans les cellules. Freeman et al. ont mis
en évidence une fonction de SpiC plutôt dans la sécrétion et la translocation des effecteurs du
TTSS-2 (Freeman et al., 2002). SpiC, interagissant avec SsaM, semble requise pour la bonne
mise en place du translocon composé de SseB, SseC et SseD (Yu et al., 2004). Un double rôle
de SpiC ne peut être exclu. Il est tout à fait possible que SpiC puisse être nécessaire à la
bonne fonctionnalité du TTSS-2 et soit également transloquée dans la cellule hôte pour
détourner la machinerie cellulaire. Cela a déjà été observé avec SipC dans le cadre du TTSS-
1 (cf. 4.2.3.1.).
Dans la cellule infectée, les SCV ont été observées à proximité du réseau de Golgi,
proche du noyau (Figure 19). Cette localisation est déterminante pour la réplication de
Salmonella dans les cellules épithéliales (Salcedo & Holden, 2003). Récemment, il a été montré
que cette localisation est conditionnée par une restriction de la mobilité des SCV via les
microtubules, grâce aux protéines SseG et SseF. En effet, des vacuoles contenant des mutants
sseG et sseF montrent un mouvement intracellulaire important défavorisant leur association
au réseau de Golgi (Ramsden et al., 2007). Les protéines SseF et SseG semblent intimement
liées aux microtubules et à leur agrégation au niveau des SCV suggérant un lien entre le
cytosquelette de microtubules et la vie intracellulaire de Salmonella (Kuhle et al., 2004). L’idée
de coopération entre SseG et SseF est confortée par des études montrant une interaction
directe entre ces deux protéines (Deiwick et al., 2006). De plus, le domaine transmembranaire C-
terminal de SseF est crucial pour le bon positionnement de la SCV dans la cellule et le
recrutement de la dynéine, moteur moléculaire des microtubules (Abrahams et al., 2006).
4.3.2.2. SCV et filaments induits par Salmonella
Un autre effecteur crucial du TTSS-2 impliqué dans cette interaction avec les
microtubules est la protéine SifA. Cette protéine est essentielle à la formation des filaments
induits par Salmonella (Sif) au niveau de sa vacuole (Figure 20). Ces structures
filamenteuses présentent des marqueurs de l’endosome tardif comme Rab7 et des
glycoprotéines du lysosome (Stein et al., 1996). Le rôle de ces filaments dans la virulence de
Salmonella n’est pas encore compris. Une hypothèse est que l’extension de filaments à partir
de la SCV permettrait d’augmenter le volume de la vacuole et de favoriser la multiplication
73
intracellulaire. La formation de ces filaments par l’intermédiaire de SifA se fait le long des
microtubules, servant d’échafaudage (Brumell et al., 2002). Cette protéine est importante pour la
réplication dans les macrophages et la virulence chez la souris (Brumell et al., 2001; Stein et al.,
1996).
SifA joue également un rôle dans le maintien de l’intégrité membranaire des SCV.
L’inactivation de sifA conduit à une destruction de la membrane de la SCV relarguant
Salmonella dans le cytoplasme de la cellule hôte. La protéine SseJ semble impliquée dans
cette destruction prématurée de la vacuole contenant un mutant sifA. En inactivant sseJ chez
un mutant sifA, la bactérie n’est plus retrouvée dans le cytoplasme de la cellule hôte
suggérant que la SCV est intacte (Ruiz-Albert et al., 2002). Des études complémentaires ont
montré que SseJ co-localise avec la membrane des SCV et que son activité désacylase,
démontrée in vitro, est déterminante pour moduler l’intégrité de la membrane de la SCV
(Ohlson et al., 2005).
Une protéine homologue à SifA, SifB a été identifiée chez Salmonella (Miao & Miller,
2000). Cependant, si elle a été localisée au niveau des SCV comme SifA, aucun rôle ne lui a
été attribué dans la biogenèse des SCV et la virulence de Salmonella (Freeman et al., 2003).
La protéine SopD2, homologue à SopD, effecteur du TTSS-1, est transloquée par le
TTSS-2 et localisée au niveau des endosomes tardifs. Cette localisation est médiée par les
150 premiers acides aminés de sa séquence et suggère un rôle de cette protéine dans la
physiologie des SCV (Brumell et al., 2003). D’autres études sont nécessaires pour déterminer
l’action exacte de SopD2 dans les mécanismes de virulence de Salmonella.
Les protéines PipB et PipB2, transloquées par le TTSS-2 sont également associées
aux Sif (Knodler et al., 2002; Knodler et al., 2003). Il a été montré que ces protéines sont associées
à des microdomaines membranaires, appelés « Lipid rafts », résistants aux détergents, connus
pour intervenir dans des voies de signalisation chez les cellules eucaryotes. Cependant, le rôle
physiologique d’une telle association dans la virulence de Salmonella n’est pas encore défini.
Des travaux plus récents sur PipB2 montrent que cette protéine, non essentielle pour la
formation de Sifs et le recrutement du marqueur endosomal tardif LAMP-1, est requise pour
l’extension des Sifs (Knodler et al., 2003). Les travaux de Henry et al. ont permis d’établir que
PipB2 interagit avec la kinesine-1, moteur moléculaire à l’origine de l’extension des Sifs
(Henry et al., 2006).
74
4.3.2.3. Modulation du cytosquelette d’actine
La manipulation du réseau d’actine joue un rôle prépondérant dans la pénétration de
Salmonella dans les cellules épithéliales mais ne se limite pas qu’à cette étape du processus
infectieux. Des effecteurs du TTSS-2 manipulent le réseau d’actine de la cellule hôte alors
que la bactérie est localisée dans sa vacuole intracellulaire. Plusieurs heures après l’entrée de
Salmonella, un réseau d’actine est formé autour de la vacuole. La mise en place de ce réseau
est dépendante de la fonctionnalité du TTSS-2 et est nécessaire pour la réplication
intracellulaire de Salmonella (Meresse et al., 2001). Les effecteurs SspH2 et SseI co-localisent
avec ce réseau d’actine associé aux vacuoles contenant Salmonella et interagissent avec la
filamine, une protéine réticulant l’actine. Cependant, ces effecteurs ne semblent pas
impliqués dans la formation de ces vacuoles associées à l’actine, au contraire de SpvB (Miao
et al., 2003). Récemment, une protéine kinase sécrétée par le TTSS-2, SteC a été identifiée et
impliquée dans le réarrangement de l’actine autour de la vacuole contenant Salmonella
(Geddes et al., 2005; Poh et al., 2007).
4.3.2.4. Interférence avec les défenses anti-bactériennes
L’échappement de Salmonella aux défenses de l’hôte est crucial pour l’établissement
d’une infection systémique. Parmi les mécanismes de défense anti-microbienne, les
macrophages disposent des espèces réactives oxygénées. Or le TTSS-2 inhibe la formation
d’un complexe actif de NADPH-oxydase à la membrane du SCV, empêchant ainsi la
production d’espèces réactives oxygénées (Gallois et al., 2001; Vazquez-Torres et al., 2000). De
plus, il protège également Salmonella de la production de monoxyde d’azote (NO) synthétisé
par l’enzyme NO synthase inductible en inhibant son recrutement au niveau des SCV
(Chakravortty et al., 2002). Cependant, aucun effecteur du TTSS-2 n’a été associé à ces
phénotypes.
S. Typhimurium présente une activité cytotoxique pour les macrophages,
indépendante du TTSS-1 (cf. 4.2.3.3.), observée à partir de 12h post-infection. Cette
cytotoxicité est dépendante du TTSS-2 (van der Velden et al., 2000). Ce n’est que très
récemment qu’un effecteur du TTSS-2 a pu y être associé. La protéine SseL, portant une
activité désubiquitinase, est transloquée dans le cytoplasme du macrophage et joue un rôle
dans la cytotoxicité pour les macrophages (Rytkonen et al., 2007). La délétion de sseL réduit
légèrement la capacité de S. Typhimurium à coloniser les organes profonds de la souris à la
suite d’une infection en compétition (Coombes et al., 2007; Rytkonen et al., 2007). L’apoptose
d’une cellule infectée ne semble pas être simplement une réponse de l’hôte mais
75
Figure 21 : Modèle de régulation génétique et environnementale de SPI-2 Le pH acide de l’environnement active le système à deux composants OmpR-EnvZ où le régulateur OmpR phosphorylé se lie aux promoteurs de ssrA et ssrB codant le régulateur transcriptionnel central des gènes impliqués dans la biosynthèse du TTSS-2. Le système à deux composants PhoP-PhoQ, activé par la diminution de la concentration d’ions divalents, active directement la transcription de ssrB. D’autres régulateurs positifs (SlyA) et négatifs (YdgT) contrôlent la transcription des gènes de SPI-2 via ssrAB. Les flèches rouges indiquent une activation transcriptionnelle.
76
également un moyen pour Salmonella d’échapper aux défenses de l’hôte et de se disséminer
dans l’organisme.
4.3.3. Régulation génétique et environnementale de SPI-2
Le régulateur transcriptionnel central des gènes codant les protéines impliquées dans
la biosynthèse du TTSS-2 est le système à deux composants SsrA/SsrB (SpiR-ORF12/SsrB)
(Ochman et al., 1996; Shea et al., 1996). Il régule positivement la transcription des gènes codant
les protéines de structure du TTSS-2 ainsi que ceux codant les effecteurs présents sur ou hors
de SPI-2 (Brumell et al., 2003; Cirillo et al., 1998; Hensel et al., 1998; Knodler et al., 2002; Miao &
Miller, 2000; Worley et al., 2000). Plusieurs études ont montré que les gènes de SPI-2 sont
préférentiellement exprimés au niveau intracellulaire et que le système SsrA/SsrB est requis
pour cette activation (Cirillo et al., 1998; Valdivia & Falkow, 1997; Walthers et al., 2007). In vitro, il a
été montré initialement que la transcription de ssrAB ainsi que celle des gènes de SPI-2
étaient induites en milieu minimum à faible concentration d’ions divalents Mg2+ et Ca2+ et de
phosphate (Deiwick et al., 1999). D’autres travaux indiquent que le pH acide (entre 4,5 et 5,8)
active l’expression de protéines sécrétées par le TTSS-2 (Coombes et al., 2004) et que la faible
osmolarité est un signal favorisant la transcription de ssrA (Lee et al., 2000a). Récemment, il a
été montré que les signaux environnementaux issus du phosphate inorganique et de l’acidité
sont en fait distincts l’un de l’autre. La transcription des gènes de SPI-2, dépendante de
SsrA/SsrB, est activée soit à pH légèrement acide (inférieur à 6,2) en phase exponentielle de
croissance, soit à faible concentration en phosphate inorganique en phase stationnaire mais
indépendamment du pH (Lober et al., 2006). A l’instar de HilA et HilD pour le TTSS-1, le
système SsrA-SsrB constitue le nœud de régulation de l’expression du TTSS-2 (Figure 21).
Le système à deux composants OmpR-EnvZ constitue un régulateur transcriptionnel
positif majeur de ssrA-ssrB qui répond à l’acidification ainsi qu’à l’environnement
intracellulaire (Feng et al., 2003; Lee et al., 2000a). Concernant la réponse à l’osmolarité, le rôle
d’OmpR-EnvZ reste controversé (Feng et al., 2003; Garmendia et al., 2003; Lee et al., 2000a).
L’étude de la transcription de ssrAB par le système OmpR/EnvZ réalisée par Feng, et al a mis
en évidence que chacun des ORF présente un promoteur. Les auteurs ont montré alors que
OmpR se lie au promoteur de ssrA et à celui de ssrB (Feng et al., 2003). SsrB peut ainsi être
produite en absence de ssrA et inversement. De plus, SsrB s’autorégule positivement (Feng et
al., 2004). Les régulateurs SsrB et OmpR coopèrent ainsi pour moduler directement la
77
transcription des gènes ssrA-ssrB mais aussi des gènes codant certains effecteurs comme sseI
(srfH) (Feng et al., 2004; Worley et al., 2000). De récents travaux ont montré que SsrB peut se lier
à un plus grand nombre de promoteurs : ceux de ssrA, ssrB, ssaB, ssaG, ssaM, sseA, sifA, sifB
illustrant la capacité de ce régulateur à intervenir à tous les niveaux de la biosynthèse du
TTSS-2 : structure, effecteurs et chaperones (Walthers et al., 2007). Régulateur majeur de
l’expression du TTSS-2, le système à deux composants OmpR/EnvZ est aussi requis pour la
transcription de hilA (Lucas et al., 2000). Ce contrôle transcriptionnel nécessite le facteur HilD
(Ellermeier et al., 2005). Cependant, le sens biologique de cette régulation de l’expression du
TTSS-1 et du TTSS-2 reste mal compris.
L’environnement à l’intérieur du macrophage, dans le phagosome constitue un
changement auquel Salmonella s’adapte. Le système à deux composants PhoP/PhoQ, haut
placé dans la cascade de régulation de l’expression des TTSS, est un composant majeur dans
la survie intracellulaire (Miller et al., 1989). Le senseur PhoQ va moduler son activité en
fonction de la concentration en ions divalents Mg2+ et Ca2+ qu’il est capable de lier. Une forte
concentration de ces cations inactive le système PhoP/PhoQ alors qu’une faible concentration
l’active (Groisman, 2001). Ce système semble ainsi reconnaître la localisation de Salmonella,
soit en milieu extracellulaire soit en milieu intracellulaire. Ce système lorsqu’il est activé,
réprime ainsi la transcription des gènes de SPI-1 notamment via hilA (Bajaj et al., 1996; Pegues
et al., 1995). Son effet négatif sur la transcription des gènes associés au TTSS-1 pourrait passer
par l’activation de l’expression de HilE, régulateur négatif de l’expression de HilD (Ellermeier
& Slauch, 2007). En parallèle, PhoP/PhoQ active l’expression de SsrA/SsrB et de son régulon
via ce signal environnemental, même si des controverses existent (Deiwick et al., 1999;
Garmendia et al., 2003; Kim & Falkow, 2004). Cependant, une étude récente du système
PhoP/PhoQ montre qu’il est nécessaire pour l’expression de ssrB mais pas pour celle de ssrA.
De manière cohérente, la protéine PhoP se lie au promoteur de ssrB in vitro, de même lorsque
Salmonella réside dans le macrophage (Bijlsma & Groisman, 2005). Ces travaux peuvent peut-
être expliquer pourquoi certains auteurs avaient conclu que PhoP ne régulait pas l’expression
de SsrA/SsrB, puisqu’ils avaient analysé la transcription de ssrA en réponse à l’inactivation
de phoP (Kim & Falkow, 2004).
Le régulateur SlyA, appartenant à la famille des régulateurs MarR contrôle
positivement la transcription des gènes de SPI-2 (via ssrA-ssrB), de gènes codant des
effecteurs du TTSS-2 (sseB, sopD2, pipB2) ainsi que d’autres impliqués dans la résistance
aux peptides antimicrobiens (Linehan et al., 2005; Navarre et al., 2005). Récemment, il a été
78
montré que SlyA qui se dimérise, se lie directement au promoteur de ssrA expliquant ainsi le
contrôle de l’expression des gènes de SPI-2 (Okada et al., 2007). Le régulon SlyA se superpose
partiellement avec celui de PhoP suggérant une co-régulation par ces deux facteurs, de gènes
impliqués dans la virulence de Salmonella (Navarre et al., 2005). Cela suggère une régulation de
SlyA par PhoP, mais il s’avère que cette notion est controversée (Navarre et al., 2005; Norte et
al., 2003; Shi et al., 2004). De par son rôle dans le contrôle de la transcription des gènes associés
au TTSS-2, SlyA est importante pour la virulence systémique, la survie dans les macrophages
et la résistance aux peptides antimicrobiens de Salmonella (Libby et al., 1994; Linehan et al.,
2005; Shi et al., 2004).
Le TTSS-2 est supposé n’être exprimé qu’au niveau intracellulaire, notamment lors de
la phase systémique de la pathogénie de Salmonella. Une étude récente bouleverse cette idée
en montrant que les gènes de SPI-2 sont activement exprimés au niveau intestinal, dans le
lumen de l’iléon. Cette activation dans le lumen est fortement dépendante des régulateurs
SsrB et OmpR (Brown et al., 2005). Ces études suggèrent que Salmonella doit se préparer à
« combattre » l’environnement du phagosome avant même d’y pénétrer ou que le TTSS-2
joue un rôle encore inconnu dans la lumière intestinale.
4.4. Régulation génétique globale des TTSS chez
Salmonella
L’expression des TTSS est très contrôlée notamment par des régulateurs qui leurs sont
relativement spécifiques. Cependant, Salmonella présente un autre niveau de contrôle faisant
appel à des régulateurs ayant un champ d’action plus global modifiant l’expression de
plusieurs TTSS à la fois.
Les petites protéines de type Histone, protéine liant le nucléoïde, contrôlent la
transcription des gènes codant le TTSS-1 et le TTSS-2, voire du flagelle. La protéine H-NS
est depuis longtemps connue pour réguler positivement l’expression du flagelle via FlhD2C2
(Bertin et al., 1994). H-NS ainsi que Hha contrôlent cependant négativement la transcription de
hilA en se liant à sa zone promotrice. Les régulateurs positifs HilC et HilD, en conditions de
culture favorables à l’expression du TTSS-1, doivent induire la transcription d’hilA
probablement en supprimant la répression médiée par H-NS et Hha (Olekhnovich & Kadner,
2006). De plus, H-NS et Hha contrôlent négativement la transcription de rtsA, hilC et hilD
79
suggérant plusieurs niveaux de contrôles de l’expression des gènes de SPI-1 (Olekhnovich &
Kadner, 2007). La transcription des gènes impliqués dans la biosynthèse du TTSS-2 est
également inhibée par H-NS, Hha ainsi que YdgT, homologue de Hha (Silphaduang et al., 2007;
Walthers et al., 2007). En conditions de culture favorables à l’expression du TTSS-2, SsrB va
contrer l’effet négatif de H-NS et conduire ainsi à la transcription des gènes de SPI-2
(Walthers et al., 2007) Récemment, il a été montré que la protéine H-NS est capable de se lier
aux séquences d’ADN riches en A+T, caractéristiques des régions acquises par transfert
horizontal. Elle serait un régulateur négatif de l’expression des gènes acquis par transfert
horizontal (Navarre et al., 2006). De manière intéressante, la protéine H-NS interagit avec YdgT
et Hha (Nieto et al., 2002; Paytubi et al., 2004). L’association de Hha ou YdgT avec H-NS pourrait
conférer à cette dernière une spécificité de liaison aux promoteurs des gènes de SPI-1 et SPI-
2. Il serait intéressant d’évaluer le rôle de ces interactions dans la régulation
transcriptionnelle de ces gènes.
Il existe d’autres petites protéines liant le nucléoïde parmi lesquelles Fis. Une étude
globale du transcriptome d’un mutant fis a révélé que ce facteur contrôle positivement la
transcription des gènes impliqués dans la biosynthèse des trois TTSS de Salmonella (Kelly et
al., 2004). Ce contrôle s’opère en partie directement car Fis peut se lier notamment aux régions
promotrices de flhD et ssrA codant les régulateurs centraux des gènes flagellaires et de SPI-2
respectivement (Kelly et al., 2004).
Le facteur IHF, faisant également partie de la famille des protéines de type Histone,
est impliqué dans l’expression des TTSS de Salmonella. L’absence d’IHF, protéine
hétérodimérique composée de sous-unités codées par ihfA et ihfB, conduit à la diminution de
l’expression des gènes codant les protéines intervenant aux différentes étapes de la
biosynthèse des trois TTSS (Mangan et al., 2006).
4.5. Régulation croisée de l’expression des TTSS
Au-delà d’une régulation globale, l’expression de chaque TTSS peut être modulée par
le régulateur d’un autre TTSS. Chez S. Typhi et dans une moindre mesure chez
S. Typhimurium, le groupe de Galán a montré que l’inactivation par un transposon de fliA
(codant le second régulateur transcriptionnel des gènes flagellaires) diminue les capacités de
la bactérie à entrer dans les cellules et à transcrire des gènes impliqués dans la biosynthèse du
TTSS-1 (Eichelberg & Galan, 2000). En outre, FliZ dont le gène est situé en aval de fliA et
80
transcrit en opéron, active l’expression de hilA chez S. Typhimurium (Lucas et al., 2000). La
mutation de fliZ conduit ainsi à une diminution de l’entrée dans les cellules corrélée avec une
altération de la sécrétion des protéines effectrices du TTSS-1 (Iyoda et al., 2001). Dans les
travaux du groupe de Galán, un rôle de FliZ dans les phénotypes associés à la mutation
transpositionnelle de fliA potentiellement polaire n’a pas été reporté. Il serait donc intéressant
d’étudier le rôle précis de FliA à l’aide d’une délétion non polaire du gène.
Le régulateur HilA a récemment été impliqué dans le contrôle de la transcription de
gènes flagellaires ainsi que de gènes impliqués dans la biosynthèse du TTSS-2. La protéine
HilA est en effet capable de se lier au promoteur de flhD et de ssaH (codant une protéine de
structure du TTSS-2) afin de réprimer leur transcription, lorsque Salmonella est cultivée en
conditions favorables à l’expression du TTSS-1 (Thijs et al., 2007). Il est intéressant de noter
que ssaH est potentiellement en opéron avec d’autres gènes codant des protéines de structure
du TTSS-2 (Figure 17). Par contre, à l’heure actuelle, aucune donnée n’est disponible sur la
régulation directe de l’expression du TTSS-1 et du flagelle par SsrB, régulateur central de
SPI-2. Ces résultats sont en contradiction avec l’expression concomitante du flagelle et du
TTSS-1 habituellement reconnue et l’observation récente de l’expression des gènes de SPI-2
dans l’intestin. Il apparaît ainsi difficile de globaliser en un schéma cohérent, toutes les
données issues des très nombreuses études portant sur la régulation de l’expression des
TTSS.
5. Biogenèse de la membrane externe, réponse au stress
membranaire et virulence
La membrane externe des bactéries à Gram négatif a pour rôle principal de protéger la
bactérie de l’environnement extérieur de par sa nature imperméable à de nombreux composés
toxiques comme les antibiotiques. Elle est également le siège d’échanges où des composés
transitent du milieu intracellulaire vers le milieu extracellulaire et inversement.
5.1. Biogenèse de la membrane externe
La majeure partie des études ayant contribué à une meilleure connaissance de la
biogenèse de la membrane externe a été réalisée chez E. coli, Neisseria meningitidis et
81
Figure 22 : Modèle d’assemblage du LPS à la membrane externe d’après (Bos et al., 2007)Le LPS synthétisé au niveau de la couche interne de la MI, est transporté au niveau de la couche externe de cette membrane par le transporteur de la famille ABC, MsbA. Le LPS traverse le périplasme vers la ME selon un mécanisme non déterminé à l’heure actuelle : (A) Le LPS pourrait être transporté via des sites de contact entre la MI et la ME. Le LPS serait pris en charge par LptA, associée aux sites de contact par l’interaction avec une protéine « X ». La protéine LptB jouerait un rôle dans la formation de ces sites de contact membranaire. (B) Le LPS pourrait alternativement être transporté vers la ME selon un mécanisme de type Lol (cas des lipoprotéines). LptB serait le transporteur ABC qui présenterait le LPS à LptA, chaperone périplasmique permettant son adressage à la ME. Le passage du LPS vers la surface de la ME est conditionné par le complexe Imp-RlpB.
A B
82
S. enterica. L’enveloppe des bactéries à Gram négatif se compose de la membrane interne
(MI) et de la membrane externe (ME), séparées par le périplasme contenant le
peptidoglycane. La MI est une bicouche de phospholipides. La ME est, elle, plus complexe
puisqu’il s’agit d’une bicouche composée de phospholipides côté interne et de LPS coté
externe. Les domaines membranaires des protéines intégrales de la MI forment des hélices .
Les protéines intégrales de la ME (PME) forment quant à elles des feuillets qui prennent la
forme de tonneaux Ces deux membranes contiennent également des lipoprotéines qui y
sont enchâssées et font généralement face au périplasme.
Tous les composants de la membrane externe sont synthétisés dans le cytoplasme. Ils
doivent donc traverser la MI pour gagner le périplasme et être acheminés vers leur
destination finale, la ME. Ils doivent franchir le peptidoglycane pour atteindre la ME. Des
enzymes capables de lyser le peptidogycane existent et ont été associées à l’assemblage de
plusieurs systèmes de sécrétion. Cependant, dans le cadre de l’assemblage des composés de
la ME, peu de données sont disponibles sur leur franchissement du peptidogycane. Ce
chapitre se concentrera sur les bases de la biogenèse de la membrane externe : l’assemblage
du LPS, des lipoprotéines et des PME à la membrane externe.
5.1.1. Assemblage du Lipopolysaccharide (LPS)
Le LPS est un glycolipide complexe constitué du lipide A dans la ME et lié à un
« core » oligasaccharidique (divisé en partie proximale et distale) poursuivi par une répétition
d’oligosaccharides représentant l’antigène O. Le lipide A et le sucre du core proximal, KDO
(acide 3-deoxy-D-manno-oct-2-ulosonique) sont essentiels à la survie d’E. coli. L’abondance
du LPS à la surface bactérienne implique une grande proximité des chaînes de LPS entre
elles. Cette proximité est rendue possible grâce à l’intercalation de peptides divalents
prévenant la répulsion des charges négatives des molécules de LPS. Cette organisation du
LPS est essentielle à la perméabilité de la ME (Nikaido, 2003).
La biosynthèse des composants du LPS est réalisée dans le cytoplasme. Cependant, le
lipide associé au core (lipide A-core) et les sous-unités de l’antigène O sont transportés au de-
là de la MI de manière séparée. Sur la face périplasmique de la MI, l’antigène O est ensuite
lié au lipideA-core par des mécanismes incomplètement décryptés à l’heure actuelle (Bos et al.,
2007).
83
Figure 23 : Modèle d’assemblage des lipoprotéines à l’enveloppe bactérienne d’après(Bos et al., 2007)Les lipoprotéines passent à travers la MI grâce au système Sec et sont acylées au niveau de leur cystéine (C) en N-terminal. Elles sont prises en charge par le transporteur ABC LolCDE lorsqu’elles ne présentent pas de signal de rétention à la MI, un aspartate (D) à la suite de la cystéine N-terminale (C-D). Les lipoprotéines n’ayant pas ce signal de rétention (C-X) sont reconnues par LolCDE, puis adressées à la chaperone périplasmique LolA. En complexe avec LolA, elles reconnaissent ensuite LolB permettant le transfert à la ME. L’exposition de lipoprotéines sur la face externe de la ME (phénomène peu commun) survient selon un mécanisme inconnu.
84
Le franchissement de la MI du lipide A-core est assuré par MsbA, transporteur de la
famille ABC (pour « ATB-binding cassette »). Chez un mutant msbA thermosensible
d’E. coli, le lipide A nouvellement synthétisé n’est plus accessible aux enzymes
périplasmiques censées le modifier suggérant qu’il n’est pas transporté au niveau de la
couche périplasmique de la MI (Doerrler et al., 2004). Récemment, les lipoprotéines LptA, qui
est périplasmique, et LptB, qui est associée à la couche interne de la MI, ont été impliquées
dans le transport du LPS entre la MI et la ME (Sperandeo et al., 2007).
L’accès du LPS à la ME est ensuite médié par Imp (ou OstA), une PME essentielle
chez E. coli. La perte partielle de fonction de cette PME conduit à une augmentation de la
perméabilité de la membrane. Une mutation conditionnelle de imp provoque quant à elle, une
modification de la densité de la ME (Braun & Silhavy, 2002). Chez Neisseria, Imp n’est pas
essentielle et il a été montré que le peu de LPS synthétisé chez un mutant imp n’est pas
accessible aux enzymes modifiant le LPS à la ME suggérant que Imp est bien impliquée dans
l’exposition de ce complexe à la surface de la bactérie (Bos et al., 2004). Chez E. coli, une
protéine en complexe avec Imp vient d’être mise en évidence. Cette lipoprotéine, nommée
RlpB, est essentielle chez E. coli et favorise l’accès du LPS à la surface bactérienne en
coopération avec Imp (Wu et al., 2006).
Deux modèles de transport du LPS sont considérés à l’heure actuelle (Figure 22). Le
premier suggère que le LPS transiterait de la MI vers la ME via des sites de contacts entre les
membranes. Le LPS interagirait avec la protéine LptA associée à ces sites de contacts
membranaires grâce à l’interaction avec une protéine hypothétique qui y est ancrée. Le LPS
gagnerait alors le complexe Imp-RlpB qui permettrait son adressage à la surface bactérienne.
Le second suppose que le LPS passerait de la MI vers la ME sous une forme soluble, en
complexe avec une chaperone masquant les groupes hydrophobiques du LPS. La protéine
périplasmique LptA pourrait jouer ce rôle de transporteur par interaction directe et délivrerait
le LPS au complexe Imp-RlpB (Bos et al., 2007).
5.1.2. Assemblage des lipoprotéines
Les lipoprotéines sont des protéines présentant une chaîne d’acides gras en partie N-
terminale, au niveau d’une cystéine. Cette acylation s’opère au niveau du périplasme après
franchissement par ces protéines de la MI via le système Sec. Les lipoprotéines résidant au
niveau de la MI, présentent généralement en +2 de la protéine mature, un aspartate au
85
Figure 24 : Modèle d’assemblage des protéines de la membrane externe d’après (Bos et
al., 2007)Les protéines de la membrane externe (PME) traversent la MI via le système Sec et sont prises en charge par des chaperones périplasmiques telles que Skp et SurA. L’interaction précoce avec Skp prévient l’agrégation des PME dans le périplasme. SurA joue également un rôle dans la traversée périplasmique des PME, probablement en coopération avec Skp. Les PME sont finalement adressées au complexe « YaeT » dont la protéine centrale YaeT reconnaît un motif C-terminal des PME et permet leur ancrage à la ME. YaeT est assisté des lipoprotéines YfgL, YfiO, NlpB et SmpA. Leur rôle exact dans ce complexe est encore inconnu.
86
contraire des lipoprotéines de la ME qui ne présentent pas ce signal de rétention (Terada et al.,
2001). Le système impliqué dans la reconnaissance de ce signal de localisation et le transport
de ces lipoprotéines vers la ME est le système Lol (Figure 23). Le transporteur ABC
LolCDE va reconnaître le +2 des lipoprotéines destinées à la ME alors qu’il ne reconnaît pas
l’aspartate en +2 de celles qui restent à la MI. L’hydrolyse de l’ATP par LolD permet alors le
transfert de la lipoprotéine de LolC-E vers LolA, chaperone périplasmique (Narita & Tokuda,
2006). La lipoprotéine est ensuite transférée à LolB, récepteur situé dans la ME (Yokota et al.,
1999). Des mécanismes inconnus dirigent ensuite l’ancrage de la lipoprotéine à la ME.
5.1.3. Assemblage des protéines de la membrane externe
(PME)
Les PME sont des protéines à tonneaux insérées intégralement à la membrane. Il en
existe un grand nombre mais, parmi les majoritaires, se trouvent OmpC et OmpF qui forment
des trimères ainsi que OmpA, une porine monomérique. Chez Salmonella, la porine OmpD
est également présente en abondance (Nikaido, 2003).
5.1.3.1. Passage de la MI vers la ME
Les PME sont synthétisées dans le cytoplasme et traversent ensuite la MI grâce à leur
séquence signal en N-terminal via le système Sec généralement. Ce dernier les fait transiter
du cytoplasme vers le périplasme sous forme dépliée (de Keyzer et al., 2003). Une fois dans le
périplasme, ces PME vont interagir avec des chaperones qui sont nécessaires au bon
déroulement de leur adressage à la ME (Figure 24) (Bos et al., 2007). La protéine Skp interagit
ainsi immédiatement avec les PME tout juste exportées dans le périplasme prévenant
l’agrégation de ces protéines (Harms et al., 2001). Une seconde chaperone, SurA intervient dans
la prise en charge des PME. Au départ identifiée comme facteur de survie en phase
stationnaire, cette protéine joue un rôle dans le passage des PME de leur conformation
dépliée à repliée (Rouviere & Gross, 1996). Récemment, il a été montré que SurA se lie
préférentiellement à des motifs largement retrouvés chez les PME, des résidus aromatiques
associés à des feuillets (Hennecke et al., 2005). L’inactivation simultanée de surA et skp étant
létale chez E. coli, cela suggère que les protéines correspondantes assurent des fonctions
intimement liées (Rizzitello et al., 2001).
87
D’autres protéines vont jouer un rôle dans la phase périplasmique des PME, comme
DsbA qui forme des ponts disulfures entre deux résidus cystéines participant à la maturation
des PME. La protéine DegP (ou HtrA) présente des activités chaperone et protéase en
dégradant les PME non repliées ou mal repliées s’accumulant dans le périplasme. Son
activité protéase prévenant l’accumulation toxique de PME dans le périplasme, semble plus
importante que son activité chaperone (Mogensen & Otzen, 2005).
5.1.3.2. Assemblage des PME à la membrane externe : rôle
du complexe « YaeT »
Le composant requis pour l’insertion des PME dans la ME est la protéine YaeT chez
E. coli, aussi connue sous le nom de Omp85 chez N. meningitidis. Cette protéine essentielle
chez E. coli et N. meningitidis, est elle-même une PME et son absence, induite par mutation
conditionnelle, conduit à une réduction sévère des PME OmpC, OmpF, OmpA et TolC à la
ME (Voulhoux et al., 2003; Werner & Misra, 2005).
Chez E. coli, YaeT fait partie d’un complexe multiprotéique incluant à ce jour 4
lipoprotéines formant le complexe « YaeT » (Figure 24). Par des études de co-
immunoprécipitation, il a été montré que ce complexe est composé de YfiO, YfgL, NlpB et
SmpA (Sklar et al., 2007a; Wu et al., 2005). Le complexe s’organise autour de YaeT qui interagit
indépendamment avec YfgL et YfiO. Cette dernière interagit avec NlpB (Malinverni et al.,
2006). L’intégration de SmpA dans ce complexe n’est pas tout à fait claire. Chez un mutant
smpA, YaeT co-précipite moins avec YfiO. De plus, chez un mutant nlpB, SmpA co-précipite
moins avec YfiO. Ainsi, il a été suggéré que SmpA stabilise l’interaction YaeT-YfiO et
YfiO-NlpB (Sklar et al., 2007a). Chez N. meningitidis, une analyse en SDS-PAGE en
conditions non dénaturantes a montré que Omp85 est associée à un complexe de haut poids
moléculaire. Cependant la seule protéine identifiée dans ce complexe, RmpM, ne correspond
pas à celles des protéines du complexe « YaeT » chez E. coli (Bos et al., 2007).
Chez E. coli, YfgL, protéine non essentielle et YfiO, protéine essentielle, semblent les
plus importantes de ce complexe après YaeT, puisque leur absence conduit à d’importantes
altérations de la membrane externe (baisse des quantités de PME et perméabilité
membranaire augmentée) (Malinverni et al., 2006; Onufryk et al., 2005; Ruiz et al., 2005; Wu et al.,
2005). YfgL et YfiO présentent cependant des rôles différents. L’inactivation d’yfgL conduit à
une légère augmentation du niveau de TolC à la ME alors qu’une perte partielle de fonction
d’YfiO diminue le niveau de TolC à la ME (Charlson et al., 2006; Malinverni et al., 2006). Le rôle
88
d’YfgL semble donc restreint à l’adressage de certaines PME au contraire d’YfiO qui semble
avoir un rôle plus large, comme YaeT. De plus, YfgL joue un rôle particulier chez E. coli.
Initialement, YfgL a été mise en évidence par la recherche de mutations supprimant la
sensibilité aux dérivés lipidiques de la vancomycine d’un mutant imp4213 (perte partielle de
fonction de Imp). L’inactivation d’yfgL restaure ainsi la perméabilité d’un mutant imp4213 à
ces composés au contraire de la perte partielle de fonction d’YfiO (Eggert et al., 2001; Wu et al.,
2005). De manière intéressante, le gène yfgL, relativement bien conservé chez les bactéries à
Gram négatif, n’a pas d’homologue au sein des génomes séquencés de N. meningitidis et N.
gonorrhoeae, au contraire d’yfiO. Chez N. gonorrhoeae, comL, l’homologue de yfiO, semble
essentiel. Cependant, aucune étude de son implication dans l’assemblage des PME n’a été
réalisée à ce jour chez Neisseria (Bos et al., 2007).
L’implication de SmpA dans la mise en place des PME à la membrane est moins
marquée que YfgL et YfiO mais cependant supérieure à celle de NlpB. Un mutant smpA
présente en effet une altération modérée du niveau des PME alors que la délétion de nlpB est
pratiquement sans effet sur la ME (Onufryk et al., 2005; Sklar et al., 2007a). Cependant,
l’inactivation simultanée de smpA et nlpB est létale chez E. coli, confortant l’idée d’un rôle
direct de SmpA et NlpB dans l’assemblage des PME.
Des études in vitro en bicouches lipidiques ont suggéré que YaeT forme un pore dont
l’activité est modifiée en présence de PME non repliées. L’interaction de YaeT avec les PME
est médiée par la reconnaissance par YaeT d’un motif situé dans la partie C-terminale de la
PME (Robert et al., 2006). La séquence de YaeT présente cinq domaines POTRA
(« polypeptide transport-associated domain »), de P1 à P5. Ces domaines P3 et P4 sont
essentiels pour assurer la survie d’E. coli. Certains domaines POTRA sont importants pour
l’interaction d’YaeT avec les lipoprotéines de son complexe. Le domaine P5 est requis pour
l’interaction d’YaeT avec toutes les lipoprotéines. L’interaction d’YfgL avec YaeT requiert,
quant à elle, les domaines P2, P3, P4 et P5.
La majorité des PME nécessite YaeT pour leur assemblage à la ME. Certaines PME
ne requièrent toutefois pas YaeT. C’est le cas des sécrétines, PME formant des anneaux à la
ME, impliquées dans des systèmes de sécrétion. Ainsi, il a été récemment montré que PulD,
la sécrétine du système de sécrétion de type II de Klebsiella oxytoca, s’assemble à la ME et
se multimérise indépendamment de YaeT (Collin et al., 2007).
Chez Salmonella, le complexe « YaeT » n’a pas été étudié à ce jour.
89
5.2.
Absence de stress Stress
Figure 25 : Modèle d’activation de la voie E en réponse à un stress de la membrane externe d’après (Bos et al., 2007)Le stress de la membrane externe génère une accumulation de PME dénaturées dans le périplasme. Le domaine C-terminal de ces PME est reconnu par le domaine PDZ de la protéase DegS qui initie une cascade protéolytique en coopération avec RseP conduisant à la dégradation de RseA, protéine de la MI séquestrant E. La protéolyse de RseA libère E dans le cytoplasme qui peut s’associer à l’ARN polymérase pour activer la transcription de son régulon comprenant des gènes codant les chaperones Skp et SurA, ainsi que la protéase DegP. L’activation de la voie E conduit également à la production de petits ARN (ARNs) qui vont contrôler négativement l’expression des PME. RseB, est une protéine périplasmique liée à RseA qui empêche sa dégradation en absence de signal d’activation.
90
Les systèmes de réponse au stress membranaire
La biogenèse et l’intégrité de la ME sont étroitement contrôlées. Un problème
d’assemblage de PME ou une dénaturation des PME provoquée par un stress
environnemental conduit à une accumulation de protéines mal repliées dans le périplasme.
Cette accumulation de protéines si elle n’est pas enrayée peut devenir toxique pour la
bactérie. Les systèmes de réponse au stress membranaire sont des outils dont dispose la
bactérie pour répondre à ces problèmes et contrôler sa ME. La réponse de la bactérie consiste
notamment à diminuer la production de nouvelles PME, activer la synthèse de protéases (ex.
DegP), de chaperones (ex. SurA) ou de protéines de maturation (ex. DsbA). Les PME
dénaturées présentes dans le périplasme seront ainsi soit dégradées soit renaturées (Rowley et
al., 2006). A l’heure actuelle, les systèmes les plus décrits sont le facteur sigma alternatif E et
le système à deux composants CpxA/CpxR. Deux autres systèmes sont pressentis pour jouer
un rôle dans la réponse au stress membranaire, BaeS/BaeR et PSP. Ces derniers ne seront que
brièvement présentés dans ce chapitre.
5.2.1. Le facteur E
Le facteur E, de par sa nature, est un facteur transcriptionnel contrôlant l’expression
de nombreux gènes. Codé par le gène rpoE en opéron avec rseABC, il est essentiel chez
E. coli mais pas chez S. Typhimurium (De Las Penas et al., 1997; Humphreys et al., 1999).
L’activation de E modifie la transcription de nombreux gènes dont rpoE. Son régulon se
compose notamment des gènes codant des protéines impliquées dans la maturation, la
dégradation et l’assemblage des PME comme SurA, DegP, YaeT, YfiO, NlpB, YfgL, ou
encore des gènes impliqués dans la biosynthèse du LPS (Onufryk et al., 2005; Rhodius et al., 2006;
Skovierova et al., 2006). La plupart des mutants n’exprimant pas l’une des ces protéines ou
présentant une altération du LPS surexpriment le facteur E (Onufryk et al., 2005; Rouviere &
Gross, 1996; Tam & Missiakas, 2005). L’activation de E conduit également à la production de
petits ARN non codants, ARNs (ARN « small »), qui vont inhiber l’expression des PME au
niveau post-transcriptionnel (Vogel & Papenfort, 2006). Chez Salmonella, l’activation de E
augmente l’expression des ARNs RybB et MicA qui diminuent
91
Figure 26 : Modèle de régulation de la voie Cpx d’après (Rowley et al., 2006)Le stress de la membrane externe d’origine multiple (pH, attachement sur surface, surproduction, agrégation ou dénaturation de protéines) active la voie Cpx, certainement par le domaine périplasmique de CpxA. Dans ces conditions, le contrôle négatif via CpxP est levé, permettant la phosphorylation par CpxA de CpxR qui peut ainsi lier les séquences promotrices et activer la transcription des gènes de son régulon. Parmi le régulon Cpx, se trouvent les gènes codant la protéase DegP et l’enzyme de modification DsbA. Le système Cpx s’autorégule positivement mais active aussi la transcription de cpxP. L’activation de la voie Cpx conduit également à l’inhibition de la transcription de l’opéron rpoErseABC. La protéine CpxP ne semble pas être la seule responsable de l’inhibition de la voie Cpx, un ou plusieurs autres facteurs (?) encore inconnus, doivent intervenir.
92
respectivement l’expression de OmpC-OmpD et OmpA-LamB (Bossi & Figueroa-Bossi, 2007;
Papenfort et al., 2006).
L’activité de E est très contrôlée (Figure 25). Les mécanismes de ce contrôle ont été
bien étudiés chez E. coli. Le facteur E est séquestré au niveau de la membrane interne via
RseA qui présente une partie exposée dans le cytoplasme ainsi qu’une autre dans le
périplasme (Ades et al., 1999). La libération de E dans le cytoplasme s’opère par le clivage de
RseA via deux protéases, DegS et RseP (YaeL) activées à la suite d’une accumulation de
protéines dénaturées (Alba et al., 2002). DegS présente un domaine PDZ impliqué dans les
interactions protéines-protéines, qui va se lier aux domaines PDZ localisés au niveau C-
terminal de PME dénaturées dans le périplasme (Alba & Gross, 2004). DegS ainsi activée va
cliver RseA au niveau du résidu 148, contenant une région riche en glutamines qui, jusque là,
inhibait la protéolyse via RseP. Cette protéine RseP présente également un domaine PDZ qui
l’empêche de cliver RseA indépendamment de l’activité DegS (Alba & Gross, 2004). Les
mécanismes d’inhibition via ce domaine PDZ restent inconnus. L’activité de E est
également contrôlée par RseB, protéine périplasmique liée à RseA empêchant tout clivage de
RseA par DegS en absence de signal (Cezairliyan & Sauer, 2007). Il a également été suggéré que
RseB inhibe le clivage de RseA qui peut s’opérer indépendamment de DegS (Grigorova et al.,
2004). Cependant, le rôle exact de RseB n’est pas encore très clair.
5.2.2. Le système CpxA/CpxR
Le système à deux composants CpxA/CpxR est constitué de la protéine CpxA,
senseur localisé à la membrane interne et CpxR, régulateur transcriptionnel. Il intervient dans
le contrôle de l’intégrité de la ME en répondant aux stress comme l’exposition à l’EDTA ou à
un pH alcalin ainsi qu’une surexpression de protéines mal repliées. Le système CpxA/CpxR
est également activé via NlpE (lipoprotéine de la ME), lors de l’attachement de la bactérie sur
une surface hydrophobique (DiGiuseppe & Silhavy, 2003). Selon une étude bioinformatique, le
régulon de CpxA/CpxR serait constitué d’une centaine de gènes (De Wulf et al., 2002). Il inclut
notamment les gènes codant la protéase DegP et la protéine de maturation DsbA (Pogliano et
al., 1997). De manière intéressante, CpxA/CpxR peut inhiber la transcription de rpoE illustrant
une inter-relation entre ces systèmes (De Wulf et al., 2002; Miticka et al., 2003).
L’expression du système CpxA/CpxR est contrôlée notamment par la protéine CpxP
qui interagirait avec CpxA au niveau périplasmique en absence de signal d’activation. En
93
présence de PME dénaturées, CpxP se détacherait de CpxA lui permettant de transduire le
signal à CpxR en le phosphorylant. Ce dernier va alors activer la transcription des gènes de
son régulon (Figure 26) (DiGiuseppe & Silhavy, 2003; Raivio et al., 1999). Comme E, ce système
s’autorégule mais active également la transcription de cpxP dont le produit localisé dans le
périplasme va inhiber l’activité de CpxA/CpxR (Raivio et al., 1999).
5.2.3. Les autres systèmes de réponse au stress membranaire
Le système BaeS/BaeR est également un système à deux composants où BaeS joue le
rôle de senseur et BaeR, celui de régulateur. L’absence de ce système augmente la sensibilité
de la bactérie à l’indole (composant générant un stress), l’impliquant ainsi dans la réponse au
stress (Raffa & Raivio, 2002). Un autre rôle physiologique a été décrit, impliquant BaeS/BaeR
dans la résistance aux antibiotiques et aux sels biliaires par l’activation de pompes d’efflux
(Nishino et al., 2005).
Un quatrième système de réponse au stress membranaire peut être envisagé, le
système PSP (pour « Phage-Shock-Protein Response ») présent chez E. coli, Yersinia
enterocolitica et Salmonella. Il est composé de protéines membranaires (notamment PspC et
PspB) qui doivent certainement agir comme senseur ainsi que des protéines cytoplasmiques
(PspA et PspF). En conditions non inductrices, PspF serait inhibée par PspA. Ce système PSP
est induit par de nombreux stress environnementaux conduisant à la libération de PspF qui
pourrait agir sur la transduction des gènes de son régulon. Il est notamment impliqué dans le
maintien de la force protomotrice (Rowley et al., 2006). Récemment, il a été montré que le
système PSP compense l’absence de E chez un mutant rpoE de S. Typhimurium pendant la
phase stationnaire de croissance (Becker et al., 2005).
5.3. Systèmes de réponse au stress membranaire et
virulence
Plusieurs bactéries pathogènes à Gram négatif utilisent les systèmes de réponse au
stress décrits chez E. coli. De plus en plus d’études font état de l’implication de ces systèmes
dans la virulence bactérienne. Les bactéries pathogènes au cours de leur cycle infectieux sont
susceptibles de rencontrer des environnements « stressants » chez l’hôte qu’elles infectent.
94
Les défenses de l’hôte ont souvent pour conséquence d’altérer la ME de la bactérie, son
premier rempart. Les systèmes de réponse au stress membranaire doivent donc assurer le
maintien de cette ME favorisant la survie et le développement de la bactérie. Des études
montrent que les deux principaux systèmes de réponse au stress membranaire sont impliqués
dans la virulence.
Le système E permet à Salmonella de résister aux stress oxydatif, aux agents
antimicrobiens ainsi qu’aux espèces réactives oxygénées. De manière cohérente, un mutant
rpoE de S. Typhimurium survit mal dans les macrophages et présente une virulence
systémique diminuée chez la souris (Humphreys et al., 1999; Testerman et al., 2002).
Le système CpxA/CpxR altère l’entrée de S. Typhimurium dans les cellules en raison
principalement d’une diminution des capacités d’attachement de la bactérie. L’activation
constitutive de CpxA/CpxR via une mutation dans cpxA (cpxA*) conduisant à une
accumulation de CpxR phosphorylée (CpxR-P) est responsable de ce phénotype (Humphreys et
al., 2004). Une autre étude a montré que l’inactivation de cpxA et non celle de cpxR diminue
les capacités d’entrée dans les cellules de Salmonella cultivée à pH acide. Cela s’explique par
une diminution de la transcription de hilA, codant le régulateur positif de la transcription des
gènes impliqués dans la biosynthèse du TTSS-1 (Nakayama et al., 2003). Ces deux études
apportent une certaine confusion quant au rôle exacte de CpxA/CpxR dans la virulence de
Salmonella et plus particulièrement dans l’expression du TTSS-1. De nouvelles études
réalisées dans des conditions favorables à l’expression du TTSS-1 en comparant les trois
mutants ( cpxA, cpxA* et cpxR) permettraient certainement de clarifier le rôle de ce
système chez Salmonella.
Chez d’autres bactéries, CpxA/CpxR semble effectivement jouer un rôle dans
l’expression des TTSS. Ainsi, chez Shigella sonnei, la mutation cpxA conduit aussi à une
diminution de l’expression du TTSS par contrôle post-transcriptionnel de InvE (VirB),
second régulateur de l’expression de ce système de sécrétion (Mitobe et al., 2005). Récemment,
Carlsson et al. ont montré que la perte de CpxA réduit la sécrétion de type III de Yersinia
pseudotuberculosis (Carlsson et al., 2007a). Ils ont également observé que cette perte de CpxA
conduit à une baisse de l’expression d’invasine, une adhésine de Y. pseudotuberculosis
conduisant à une réduction de l’attachement de la bactérie aux cellules (Carlsson et al., 2007b).
De manière intéressante, ils ont associé leur mutation de cpxA à une accumulation de CpxR-P
qui est capable de lier le promoteur de inv codant invasine et de rovA codant un activateur
transcriptionnel des gènes codant les adhésines de Y. pseudotuberculosis. Leurs travaux
95
suggèrent donc que CpxR-P contrôle négativement l’expression des adhésines (Carlsson et al.,
2007b). Ils restent à étudier l’effet de CpxR-P sur la transcription des gènes impliqués dans la
biosynthèse du TTSS de Y. pseudotuberculosis.
D’autres études ont porté, non plus directement sur E ou sur CpxA/CpxR, mais sur
les membres de leurs régulons. Ainsi, la protéase DegP (HtrA), dont l’expression est activée
par E et CpxA/CpxR, confère à S. Typhimurium la capacité à résister aux espèces réactives
oxygénées, à survivre dans les cellules et à être virulente en modèle murin d’infection
systémique létale (Humphreys et al., 1999; Testerman et al., 2002). Dans ce sens, il a été montré
que chez la souris dont les macrophages sont dépourvus de « burst oxydatif », un mutant htrA
de S. Typhimurium est virulent (Mutunga et al., 2004).
La chaperone SurA, dont l’expression est aussi régulée par E, est impliquée dans
l’attachement et la pénétration de S. Typhimurium dans des cellules épithéliales intestinales.
Il a été montré que la dose létale 50 orale d’un mutant surA est augmentée d’un facteur 1000
chez la souris (Sydenham et al., 2000).
La protéine DsbA, dont l’expression est contrôlée par CpxA/CpxR, est également
impliquée dans la virulence de Salmonella. Il a été montré que DsbA a pour substrat la
protéine SsaC (SpiA) formant l’anneau de la ME du TTSS-2. Elle est nécessaire à la
fonctionnalité de SsaC et donc du TTSS-2. Cela pourrait expliquer l’altération de la virulence
d’un mutant dsbA de S. Typhimurium en modèle murin d’infection systémique (Miki et al.,
2004). Cette étude a montré que InvG (l’équivalent de SsaC chez le TTSS-1) n’est pas un
substrat de DsbA. Cependant, la mutation dsbA conduit à une diminution de la sécrétion des
protéines effectrices du TTSS-1 ainsi que de l’entrée dans les cellules (Miki et al., 2004) qui ne
peut s’expliquer par une diminution de la transcription des gènes de SPI-1. Le mécanisme
d’action de DsbA au niveau du TTSS-1 doit encore être élucidé. De manière intéressante,
RtsA, un régulateur de la transcription des gènes codant les protéines associées au TTSS-1,
est un activateur de la transcription de dsbA (Ellermeier & Slauch, 2004).
96
Résultats
97
98
Prologue :
Problématique, objectifs
et démarche de la de thèse
99
1. Problématique et objectifs de la thèse
L’équipe « Signalisation, Portage et Virulence bactérienne » s’attache à mieux
comprendre les mécanismes impliqués dans la virulence et le portage de S. Enteritidis. Dans
le cadre de la recherche de facteurs participant aux phénomènes d’attachement et de
pénétration, le laboratoire a criblé une banque de mutants transpositionnels, mettant en
évidence une souche dans laquelle le transposon était inséré dans l’ORF yfgL. L’annotation
du génome de S. Typhimurium LT2 décrit que le produit de l’ORF yfgL possède des
homologies avec une sérine/thréonine kinase. Il possède des domaines liant la
pyrroloquinoline-quinone (PQQ), un domaine WD-40 (impliqué dans les interactions
protéines-protéines) ainsi qu’une séquence signal de lipoprotéine de la membrane externe.
Les premières études avaient montré que l’inactivation d’yfgL affectait la pénétration de
S. Enteritidis dans les cellules épithéliales intestinales, expliqué en partie par une diminution
de la sécrétion des protéines effectrices de l’entrée du TTSS-1 et des protéines flagellaires.
Cette diminution de sécrétion n’avait d’ailleurs pas été associée à une accumulation
intracellulaire de ces différentes protéines suggérant leur moindre synthèse. Ces phénotypes
in vitro ont été mis en parallèle in vivo avec une diminution des capacités du mutant yfgL de
S. Enteritidis à coloniser les cæca et la rate du poussin (Amy et al., 2004).
Les travaux du laboratoire avaient suggéré un rôle important de l’inactivation d’yfgL
dans la virulence de S. Enteritidis. Or, peu d’informations étaient disponibles sur cet ORF et
sur les mécanismes l’impliquant dans la virulence de Salmonella au moment de sa mise en
évidence. Ainsi, l’objectif principal de la thèse a été de comprendre comment l’inactivation
d’yfgL pouvait influer sur la virulence de S. Enteritidis et notamment sur l’expression des
TTSS.
2. Démarche
L’expression des TTSS est contrôlée à différents niveaux chez Salmonella. Le
contrôle de la transcription des gènes codant les protéines impliquées dans la biosynthèse des
TTSS est un moyen largement utilisé par la bactérie pour réguler l’expression de ces facteurs
de virulence. Sachant que les données de l’équipe avaient suggéré que l’inactivation d’yfgL
100
conduisait à une diminution chez S. Enteritidis de la biosynthèse des protéines sécrétées par
le TTSS-1 et des protéines flagellaires, nous avons émis l’hypothèse que la transcription des
gènes codant ces protéines pouvait être modifiée suite à l’inactivation d’yfgL. Le
transcriptome de S. Enteritidis en réponse à l’inactivation d’yfgL dans des conditions de
culture favorables à l’expression du TTSS-1 ou du TTSS-2, a ainsi été étudié.
Au cours de cette étude du transcriptome, les groupes de Silhavy et de Kahne ont
montré qu’YfgL appartient au complexe multiprotéique « YaeT » impliqué dans
l’assemblage des protéines de la membrane externe (PME) (Ruiz et al., 2005; Wu et al., 2005). Le
rôle « réel » d’YfgL dans la virulence est alors apparu moins évident. Il était possible
notamment d’envisager que les phénotypes observés chez le mutant yfgL de S. Enteritidis
pouvaient n’être que la conséquence d’une altération de la membrane. Nous avons alors
concentré prioritairement notre travail sur la détermination : (i) du rôle des différentes
protéines du complexe « YaeT » dont YfgL dans l’assemblage des PME et (ii) de l’impact de
la délétion des gènes codant ces protéines du complexe « YaeT » ainsi que la protéine
chaperone SurA, connue pour être impliquée dans l’assemblage des PME, sur l’expression
des TTSS chez S. Enteritidis.
En parallèle, nous avons souhaité identifier des facteurs impliqués dans la voie de
contrôle de l’expression des TTSS, observée chez le mutant yfgL de S. Enteritidis. Ce
travail, mené en second plan par rapport à l’étude du complexe « YaeT », s’est porté sur deux
candidats Lon et E, identifiés à partir des données du transcriptome obtenues par microarray
chez le mutant yfgL de S. Enteritidis.
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102
Partie I :
L’inactivation d’yfgL conduit à la sous-expression
des trois systèmes de sécrétion de type III chez
Salmonella Enteritidis
Article n°1 :
Fardini, Y., K. Chettab, O. Grepinet, S. Rochereau, J. Trotereau, P. Harvey, M. Amy, E. Bottreau, N. Bumstead, P. A. Barrow, and I. Virlogeux-Payant. 2007. The YfgL lipoprotein is essential for type III secretion system expression and virulence of Salmonella
enterica Serovar Enteritidis. Infect Immun 75:358-70.
103
L’article n°1 présente l’impact de la délétion d’yfgL sur l’expression des trois TTSS
de S. Enteritidis, ainsi que sur l’assemblage des PME à la membrane. Par des analyses en
microarray, nous avons pu montrer qu’une souche n’exprimant pas yfgL, cultivée en
conditions favorables à l’expression du TTSS-1 ou du TTSS-2, présente une transcription
altérée de la plupart des gènes codant les protéines impliquées dans la biosynthèse du TTSS-
1, du TTSS-2 et du flagelle. La transcription des régulateurs transcriptionnels centraux de
l’expression des trois TTSS étant également diminuée suite à l’inactivation d’yfgL, cela a
confirmé un contrôle de la transcription de l’ensemble des gènes impliqués dans la
biosynthèses des trois TTSS. Ces analyses en microarray (réalisées par K Chettab et O.
Grépinet) ont été confirmées par RT-PCR en temps réel. Ce défaut d’expression des trois
TTSS a été observé en parallèle d’une diminution importante de la virulence in vivo en
modèle murin d’infection systémique létale.
Nous avons alors montré que chez S. Enteritidis, la délétion d’yfgL conduit à une
augmentation de la sensibilité de la bactérie à différents antibiotiques ainsi qu’à une baisse
des niveaux des PME majeures à la membrane, comme chez E. coli. Il faut noter que sur la
figure 7 de l’article n°1, la protéine OmpD, une PME spécifique de Salmonella, n’est pas
annotée. A la suite des premières études des profils de PME, nous avions microséquencé les
produits des deux bandes visibles sur le gel (à 33 kDa et 35-36 kDa). Les résultats nous
avaient permis d’identifier OmpA et OmpC/F respectivement. Les premiers acides aminés de
la séquence N-terminale de OmpC/F et OmpD étant identiques à plus de 90% les mêmes,
nous sommes passés à côté de OmpD. Plus récemment, nous avons construit et étudié le
profil de PME de souches de S. Enteritidis délétées de OmpA, OmpC, OmpF ou OmpD.
Nous avons alors pu observer que la bande protéique sur gel à 35-36 kDa est composée de
OmpD (majoritairement) à 35 kDa et OmpC/F à 36kDa. Dans nos conditions de migration,
ces protéines ne sont pas correctement séparées, ce qui est à l’origine de cette confusion
(données non présentées). Nos conclusions quant au rôle d’YfgL dans l’adressage des PME
ne sont toutefois pas remises en cause puisque le niveau global de ces PME (OmpA, OmpC/F
et OmpD) est diminué chez le mutant yfgL.
Bien qu’YfgL soit requise pour l’assemblage des PME, nous avons pu montrer que
l’appareil TTSS-1 peut s’assembler et sécréter la protéine effectrice SipA, lorsque HilA, le
régulateur transcriptionnel central des gènes associés au TTSS-1, est exprimé
constitutivement chez le mutant yfgL. D’autre part, nous avons pu montrer que chez un
mutant invA, ne pouvant assembler un TTSS-1 fonctionnel, la transcription de sipA n’est pas
104
modifiée. Il est intéressant de noter que chez S. Typhimurium, un mutant invA ne présente
pas de rétrocontrôle transcriptionnel des gènes codant l’aiguille du TTSS-1 (Sukhan et al.,
2003). L’ensemble de ces données ont ainsi suggéré que le contrôle de la transcription des
gènes impliqués dans la biosynthèse du TTSS-1, généré par la délétion d’yfgL ne devait pas
résulter d’une impossibilité d’assemblage de l’appareil à la membrane altérée du mutant.
Le contrôle de l’expression des TTSS par YfgL est nécessairement indirect. Il peut
résulter soit de la délétion d’yfgL ou soit d’une cascade de signalisation via des interactions
protéines-protéines impliquant YfgL qui ne présente pas les caractéristiques d’un facteur de
transcription. Le contrôle de l’expression dans le même sens des 3 TTSS n’est pas courant
chez Salmonella. Le peu de facteurs connus pour réguler dans le même sens l’expression des
3 TTSS chez Salmonella sont des protéines de type Histone, liant le nucléoïde (Fis, IHF)
(Kelly et al., 2004; Mangan et al., 2006). L’analyse des données obtenues en microarray ne nous a
pas permis d’identifier l’un de ces facteurs comme potentiellement impliqués dans cette
cascade de contrôle de l’expression des TTSS via la délétion d’yfgL. De plus, par RT-PCR en
temps réel, nous n’avons pas observé de diminution de la transcription de fis chez le mutant
yfgL (résultats non présentés). Ces résultats suggèrent soit l’existence d’une voie de contrôle
dans le même sens de l’expression des 3 TTSS, alternative à celles déjà connues, soit
l’implication de régulateurs différents en fonction du TTSS affecté.
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Partie II :
Seule l’inactivation d’YfiO et d’YfgL, protéines du
complexe « YaeT », conduit à une sous-expression du
flagelle et du système de sécrétion de type III n°I
chez Salmonella Enteritidis
Article n°2 :
Y. Fardini, J. Trotereau, E. Bottreau, C. Souchard, P. Velge and I. Virlogeux-Payant.Role of the member of the “YaeT” complex in outer membrane protein assembly and TTSS expression in Salmonella Enteritidis.
Article prochainement soumis à Journal of Biological Chemistry
123
Suite aux travaux montrant l’implication d’YfgL dans la biogenèse de la membrane
externe d’E. coli et de S. Enteritidis, notre objectif a été de savoir si le contrôle de
l’expression des TTSS chez le mutant yfgL de S. Enteritidis était une conséquence de
l’altération de la membrane externe. Afin d’apporter des éléments de réponse à cette
question, nous avons choisi d’étudier les conséquences de l’inactivation des gènes codant les
protéines du complexe « YaeT » sur l’assemblage des PME et l’expression du TTSS-1 et du
flagelle.
Chez E. coli, YaeT et YfiO sont essentielles et une mutation conditionnelle des gènes
les codant, conduit à un important défaut d’assemblage des PME. A l’inverse, NlpB et SmpA
ne sont pas essentielles chez E. coli. La perte de NlpB ne conduit qu’à peu voire pas de
problèmes d’assemblage des PME. La perte de SmpA provoque, quant à elle, un défaut
d’adressage des PME à la membrane plus important que celui résultant de la délétion de nlpB
(Malinverni et al., 2006; Sklar et al., 2007a; Wu et al., 2005).
Nous avons tout d’abord entrepris la construction des souches de S. Enteritidis
n’exprimant plus une des protéines du complexe « YaeT », c’est-à-dire, NlpB, SmpA, YfiO
et YaeT (Sklar et al., 2007a; Wu et al., 2005). Nos tentatives de déléter l’ORF yaeT se sont toutes
soldées par un échec, suggérant que cet ORF est essentiel chez S. Enteritidis comme ses
homologues chez E. coli et Neisseria meningitidis (Voulhoux et al., 2003; Wu et al., 2005). Nous
nous sommes alors focalisés sur les autres membres du complexe. Globalement, le rôle du
complexe « YaeT » dans l’assemblage des PME est conservé chez S. Enteritidis à l’exception
du fait qu’YfiO n’apparaît pas essentielle. L’étude de l’expression du TTSS-1 et du flagelle
chez les différents mutants n’exprimant plus les membres du complexe a montré que seule
l’absence d’YfiO, au contraire de NlpB et SmpA, conduit à la diminution de l’expression de
ces TTSS chez S. Enteritidis, comme cela a déjà été montré pour la délétion d’yfgL.
La biogenèse de la membrane externe et notamment l’assemblage des PME à la
membrane externe est un processus très contrôlé et conservé chez les bactéries à Gram
négatif (Bos et al., 2007). Un résultat intéressant de notre étude est la mise en évidence du
caractère non essentiel d’yfiO chez S. Enteritidis. La délétion de cet ORF par la technique
utilisant le système -Red Recombinase adapté à S. Enteritidis (Figueroa-Bossi et al., 2006a) n’a
posé aucun problème alors que celle d’yaeT s’est révélée impossible. Cependant, la délétion
totale d’yfiO conduit à un défaut notable de la vitesse de croissance de S. Enteritidis en milieu
de culture riche (milieu LB) ce qui suggère un rôle d’YfiO dans la croissance bactérienne.
Dans un souci de comparer les souches entre elles dans des conditions les plus proches
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possibles, nous avons donc construit deux mutants ayant une perte partielle de fonction
d’YfiO qui ne présentent plus ou peu de différence de croissance avec la souche sauvage.
Nous avons ainsi construit des mutants yfiO exprimant seulement les 227 ou les 172 premiers
acides aminés (sur les 245) de la protéine YfiO. Ces mutants ont été nommés respectivement
mutant yfiO 227 et yfiO 172. La mutation yfiO 227 est celle initialement décrite chez E. coli
(Malinverni et al., 2006; Wu et al., 2005). Dans chaque étude, nous avons alors observé que
l’amplitude des phénotypes observés chez les mutants yfiO était proportionnelle à
l’importance de la délétion. Ces données suggérèrent que la fonction d’YfiO n’est pas
conditionnée que par les 18 derniers acides aminés de sa séquence en C-terminal. La délétion
de 73 acides aminés en partie C-terminale a probablement causé une modification importante
de la conformation de la protéine conduisant à une perte de fonction plus importante.
L’ensemble des données obtenues sur les mutants yfgL et yfiO chez S. Enteritidis, a
montré qu’un défaut d’expression du TTSS-1 et du flagelle est observé en parallèle d’une
altération importante de l’adressage des PME à la membrane. Les résultats sur le mutant
smpA qui présentent une légère altération de l’assemblage des PME mais pas de
modifications de l’expression des TTSS, suggèraient cependant une possible dissociation des
deux phénomènes. Nous avons donc tenté d’établir si une altération de l’adressage des PME à
la membrane conduit systématiquement à un défaut d’expression du TTSS-1 et du flagelle.
Notre stratégie a été de construire un mutant affecté dans l’adressage des PME sans perturber
la composition ni la stabilité du complexe « YaeT ». Nous avons étudié un mutant
n’exprimant plus SurA, chaperone périplasmique impliquée dans l’adressage des PME chez
E. coli (Rouviere & Gross, 1996). Il a été récemment montré que cette chaperone délivre les
PME au complexe « YaeT » en intéragissant notamment avec YaeT. Toutefois, la délétion de
surA ne modifie pas la stabilité de ce complexe « YaeT » (Sklar et al., 2007b). Nous avons ainsi
montré que la délétion de surA chez S. Enteritidis n'entraîne pas de modifications de
l’expression du TTSS-1 et du flagelle malgré une altération de l’asdressage des PME à la
membrane. L’ensemble de nos résultats montre qu’il est possible d’observer un défaut
général d’assemblage des PME à la membrane sans modification de l’expression du TTSS-1
et du flagelle. La sous-expression des TTSS observée chez les mutants yfgL et yfiO n’est
donc probablement pas due au défaut d’assemblage des PME, observé chez ces mutants.
Cependant, nous ne pouvons pas écarter l’implication d’un autre défaut de la membrane
externe, non identifié à l’heure actuelle, dans le contrôle de l’expression des TTSS chez ces
mutants.
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ROLE OF THE MEMBERS OF THE “YAET” COMPLEX IN OUTER MEMBRANE PROTEIN ASSEMBLY AND TYPE-THREE SECRETION SYSTEM EXPRESSION IN
SALMONELLA ENTERITIDIS Yann Fardini, Jérôme Trotereau, Elisabeth Bottreau, Charlène Souchard, Philippe Velge and
Isabelle Virlogeux-Payant* Institut National de la Recherche Agronomique, Centre de Tours-Nouzilly, UR1282, Infectiologie Animale et Santé Publique, 37380 Nouzilly, France
Running Title: “YaeT” complex and TTSS-1 and flagella expressionAddress correspondance to Dr. Isabelle Virlogeux-Payant, UR1282, Infectiologie Animale et Santé Publique, Bâtiment 311, Institut National de la Recherche Agronomique, Centre de Tours-Nouzilly, 37380 Nouzilly, France, [email protected], phone : 33 (0)2 47 42 76 60, fax : 33 (0)2 47 42 77 79.
Like many gram-negative bacterial pathogens, Salmonella enterica uses type three secretion systems (TTSS) to infect its hosts. TTSS-1, TTSS-2 and flagella play an important role in the virulence ofSalmonella. YfgL is a lipoprotein known to be part of the “YaeT” complex involved in outer membrane protein (OMP) assembly in E. coli. Previous work by our laboratory showed that YfgL is essential for full expression of the three TTSS of Salmonella
enterica serovar Enteritidis. In this study, the role of the different proteins of the “YaeT” complex in OMP assembly and TTSS expression was assessed. First, the role of the “YaeT” complex in OMP was shown to be conserved in S. Enteritidis,apart from the fact that YfiO did not appear to be essential, in contrast to its E.
coli homologue. As previously demonstrated with yfgL, a transcriptional down-regulation of the genes involved in TTSS-1 and flagella biosynthesis was observed in the S. Enteritidis mutants lacking yfiO, but not in the smpA and nlpB mutants. In line with this result, the secretion of TTSS-1 effectors and flagellar proteins was reduced in the S. Enteritidis yfiO mutants, in accordance to their reduced invasion rate in HT-29 epithelial cells. As no modification of TTSS-1 and flagella expression was found in a S. Enteritidis surA mutant, which has an important defect in outer membrane protein assembly, our results suggest that the reduced expression of TTSS observed in yfiO and yfgL mutants is not due to their OMP assembly defect. Overall, these data provide evidence for an additional role of YfgL and YfiO in S. Enteritidis.
Salmonella are a worldwide health problem, affecting millions of people. The etiologic agent, Salmonella enterica isresponsible for a variety of diseases from gastroenteritis to lethal systemic infection such as typhoid fever. To infect the host, Salmonella use various virulence factors, among which Type III Secretion Systems (TTSS) play a crucial role. TTSS-1, encoded by Salmonella pathogenicity island 1 (SPI-1), is mainly responsible for bacterial invasion into eukaryotic cells (1). TTSS-2, encoded by SPI-2, plays an important role in intracellular survival and replication of Salmonella in the vacuole of the host cells. Therefore TTSS-2 is crucial for systemic dissemination of the bacteria (2). These TTSS allow the bacteria to inject effector proteins into the host cytosol, hijacking the eukaryotic cellular machinery for their own benefit. The flagella, sharing similar structural design with TTSS (3), confer motility to Salmonella, contributing to their interaction with the intestinal epithelium (4).
In Salmonella enterica subsp. enterica
serovar Enteritidis, commonly named S.
Enteritidis, YfgL has recently been shown to have a role in virulence. Loss of YfgL results in a virulence defect in vivo in a murine model of systemic infection and in a reduced colonization of ceca and spleens in one-day-old chicks. In vitro, the ability of a yfgL
mutant to invade epithelial cells and to secrete TTSS-1 effectors and flagellar proteins is impaired (5,6). These in vivo and in vitro
phenotypes are related to the transcriptional down-regulation of SPI-1, SPI-2 and flagellar genes involved in the biosynthesis of the TTSS-1, TTSS-2 and flagella. Among these genes, hilA, ssrB and fliA, which encode central transcriptional regulators for TTSS-1, TTSS-2 and flagella expression respectively,
126
are down-regulated in the mutant compared to the wild-type strain (6). Salmonella is not the only bacteria for which a role of YfgL in virulence has been demonstrated, and a virulence defect, also related to invasion, has been observed in a yfgL mutant of the adherent-invasive E. coli LF82 strain (7).
In E. coli K12, YfgL is involved in the assembly of outer membrane proteins (OMP) (8,9). Through biochemical and genetic studies, YfgL has been shown to be a lipoprotein which is part of a multiprotein complex named the “YaeT” complex. This complex is composed of the OMP YaeT and three other lipoproteins in addition to YfgL: YfiO, NlpB and SmpA. YaeT interacts directly and independently with YfgL and YfiO, whereas NlpB interacts only with YfiO (10). The most recently described member of the complex, SmpA, seems to play a role in the stability of the “YaeT” complex, particularly in the maintenance of the YaeT-YfiO and YfiO-NlpB interactions (11). The “YaeT” complex is involved in outer membrane biogenesis, as it has been shown to control the assembly of the major OMPs, OmpA and OmpC/F (8-11). In this complex, YaeT and YfiO are both essential for E. coli, anddepletion of these proteins results in a severe defect of OMP assembly (9,10). By contrast, YfgL, NlpB and SmpA are not essential in E.
coli. Loss of YfgL causes a reduction in OMP assembly and consequently an increased antibiotic susceptibility of the bacteria, whereas the loss of NlpB results only in minor OMP targeting defects (9,10,12,13). Loss of SmpA causes only a slight defect of OMP assembly, which is however greater than that observed in a nlpB mutant (11).
In S. Enteritidis, YfgL has also been shown to be involved in OMP targeting (6). Our lab previously showed that the alteration of the OM observed in a S. Enteritidis yfgL
mutant did not prevent TTSS assembly, since constitutive expression of SPI-1 genes by forcing hilA transcription was shown to restore the ability of a yfgL mutant to secrete the SipA protein, thus demonstrating the functionality of TTSS-1 in the mutant under this condition (6). However, this result did not preclude that a defect in outer membrane protein assembly could influence TTSS expression. In order to document this issue and as the “YaeT” complex has been poorly
characterized in Salmonella, the aim of this study was to analyze the role of the different proteins of the complex in OMP assembly and the impact of the deletion of the corresponding genes on the expression of TTSS-1 and flagella. Moreover, in order to assess the involvement of an OMP assembly defect in TTSS expression, irrespective of the “YaeT” complex structure, a surA mutant was also studied, since the periplasmic SurA chaperone has previously shown to be involved in OMP targeting in E. coli (14).
EXPERIMENTAL PROCEDURES Bacterial strains and culture conditions-
Bacterial strains used in this work are listed in Table 1. The S. Enteritidis LA5 strain is a field isolate from infected chicken, resistant to nalidixic acid (20 µg.ml-1; Nal 20) (15). Bacteria were routinely grown in Luria Bertani (LB) broth at 37°C overnight with shaking. When necessary, bacteria were cultured in LB broth supplemented with 0.3 M NaCl (16) and antibiotics were added to cultures when necessary, at the following concentrations: spectinomycin (Sp), 100 µg.ml-1; Nal, 20 µg.ml-1; kanamycin (Km), 50 µg.ml-1;chloramphenicol (Cm), 30 µg.ml-1; and carbenicillin (Cb), 100 µg.ml-1. For growth analysis, 100 mL of fresh LB medium were inoculated with overnight culture to a final concentration of 107 bacteria per mL, and cultured for 8h with shaking at 37°C. Growth was recorded by measurement of the optical density at 600 nm. Mutagenesis in S. Enteritidis-Mutants were obtained using the -Red mutagenesis system, modified as previously described (6). The sequence of the primers used is listed in Table 2. The nlpB, smpA, yfiO, yfiO 172 and yfiO 227 mutants were obtained using the following protocol.
The construction of the “ORF” mutant was carried out as follows. The antibiotic resistance cassette, CmR or KmR of pKD3 or pKD4 respectively, was amplified with primers ORF-P1 and ORF-P2, and the PCR product was electroporated in the S. Enteritidis LK5hsdR strain (17) harboring pKD46, using a Micropulser (Biorad) in accordance with the manufacturer’s recommendations. Cm or Km-resistant Cb-sensitive clones were selected and the insertion was controlled by PCR with primers ORF1/ORF2. The mutation was then
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transduced in the S. Enteritidis LA5 strain using the P22HT105int phage. After PCR verification of the transduction with the same primers as above, the plasmid pCP20 was introduced in the LA5 mutant by electroporation to remove the CmR or KmRr
cassette. Transformants, previously selected at 30°C on the basis of their resistance to Cb, were cultured at 42°C without antibiotics to eliminate the plasmid pCP20 and then tested for the loss of the Cb and Cm resistance. The “scar” sequence and the deletion limits of the
nlpB mutant were checked by sequencing. Unless specified, the mutants and the parent wild-type strain have a similar growth curve (data not shown). Construction of the plasmid pACyfiO-The complete coding sequence of yfiO was amplified by PCR with primers yfiO3/yfiO4 (Table 2) from the chromosomal DNA of strain LA5. After restriction with SmaI and HindIII, the 1 kb PCR product was cloned into the SmaI and HindIII sites of pACYC177, generating the pACyfiO plasmid. The sequence of the pACyfiO insert was checked by sequencing. Protein analysis-In order to study membrane proteins, bacteria were grown in LB broth containing 0.3 M NaCl until the optical density at 600 nm reached between 0.8 and 1. Total membrane proteins were extracted as described previously (6). The proteins were analyzed by electrophoresis in a 12% (wt/vol) SDS-polyacrylamide gel and either stained with Coomassie brilliant blue G-250 (18) or transferred onto a nitrocellulose membrane (Protran; Schleicher and Schuell). Immunoblotting was performed with polyclonal rabbit antisera raised against OmpA (1:2000). At least three independent experiments were carried out for each strain. Blots were revealed with horseradish peroxydase-goat anti-rabbit antibodies (1:5000; Dako) and the Amersham ECL plus western blotting detection system (GE Healthcare). Secreted proteins were obtained from bacteria cultured in LB broth containing 0.3 M NaCl until the optical density at 600 nm reached between 1.8 and 2, as described previously (5). Proteins were separated by electrophoresis in a 10% (wt/vol) SDS-PAGE and either stained with Coomassie brilliant blue G-250 or transferred onto a nitrocellulose
membrane and immunoblotted with polyclonal rabbit antisera raised against SipA (1:1000) or H:g,m flagellin (1:500) as previously described (5). At least three independent experiments were carried out for each strain. RNA Extraction and Real-Time RT-PCR-RNAwere recovered from bacteria cultured in LB broth supplemented with 0.3 M NaCl. Total bacterial RNA were obtained as described previously (19). Potential DNA contamination was eliminated by DNaseI treatment (Invitrogen) in accordance with the manufacturer’s instructions. Absence of DNA was confirmed by amplification of the tufA
gene by PCR as previously described (6). The amount, purity and quality of the RNA were evaluated by optical density measurement at 230, 260 and 280 nm and by gel electrophoresis followed by ethidium bromide staining. One microgram of RNA was then reverse transcribed by the avian myeloblastosis virus reverse transcriptase (Promega) with random hexamer primers (Promega) in accordance with the manufacturer’s protocol. Real-Time PCR (Light Cycler, Roche) was carried out to quantify the transcriptional levels of sipA, hilA
and fliD genes and the housekeeping gene tufA
(20). Primers and conditions used to perform these real-time PCR have been described elsewhere (6). The transcriptional level of each gene was quantified in duplicate from three independent RNA extractions and bacterial cultures.Invasion assay-Bacteria were grown in LB broth overnight without shaking, or for 6 hours with shaking. The human adenocarcinoma cell line HT-29 (ECACC no. 85061109) (21) was used between passages 27 and 67. Cell monolayers were grown to confluence in 24-well plates as previously described (22). Monolayers were then infected with bacteria at a multiplicity of infection of 30 for 2h at 37°C. Bacterial invasion was then quantified by the gentamicin protection assay as described elsewhere (5). The rate of invasion was expressed by dividing the number of gentamicin-resistant bacteria by the number of bacteria deposited per well, then multipled by 100. Three independent experiments were performed in duplicate. Results were then compared using a Kruskal-Wallis non-parametric test and analysed using Dunn’s
128
multiple comparison test, using Prism software (GraphPad).
RESULTSYfiO is not essential in S. Enteritidis-In order to study the role of the different proteins of the “YaeT” complex in S. Enteritidis, isogenic deletion mutants of the different genes encoding the proteins of the complex were constructed. All our attempts to construct a yaeT deletion mutant failed, suggesting that yaeT is essential in S. Enteritidis, as it is in E.
coli and Neisseiria meningitidis (9,23). We therefore decided to focus our study on the remaining member of the “YaeT” complex.
nlpB, smpA and the yfiO mutants were easily obtained. These mutants had a growth rate similar to the wild-type strain (data not shown), except for the yfiO mutant whose growth was reduced compared to the wild-type strain (Figure 1). On the basis of this result, we chose to construct strains with a YfiO with partial loss of function and with a growth rate the same as or close to that of the wild-type strain for further studies. We constructed two different mutants: one with a mutation previously described in E. coli where the last 18 codons of the YfiO protein were deleted (9), and one in which the YfiO protein was truncated after the amino acid in position 172. These mutants were called yfiO 227 and yfiO 172 respectively. In rich medium, the yfiO 227 mutant grew as well as the wild-type strain, whereas yfiO 172 showed a slight growth delay but was able to reach the same optical density as the wild-type strain in the stationary phase (Figure 1). Complementation with plasmid pACyfiO, which harbors the yfiO
gene, restored the ability of the yfiO 172 and yfiO mutants to grow like their parental strain
(data not shown). These results demonstrate that yfiO is not essential in S. Enteritidis.
YfiO and to a lesser extent SmpA are involved
in OMP assembly in S. Enteritidis-In E. coli,the NlpB, SmpA and YfiO lipoproteins are differentially involved in OMP assembly (10-12). As their role in S. Enteritidis was unknown, the involvement of these proteins was assessed by comparing the membrane protein profiles of the corresponding mutants with that of the wild-type strain or a mutant lacking YfgL already known to play a role in outer membrane protein assembly in S.
Enteritidis (6). As we knew that the OMP defect observed in the S. Enteritidis yfgL
mutant is the same when bacteria are cultured in LB or LB NaCl 0.3M (unpublished results), we used SDS-polycacrylamide gel electrophoresis (SDS-PAGE) to study the OMP profile of the different mutants after culture in LB NaCl 0.3 M, because this culture condition is used for TTSS expression analysis (see below). We observed no reduction in the porin levels, such as OmpA, OmpC/F and OmpD (a major Salmonella outer membrane porin) in the nlpB mutant (Figure 2A). In the
smpA mutant, the OMP profile showed a slight decreased level of these porins compared to the wild-type strain (Figure 2A). In contrast, like the yfgL mutant, the two yfiO
mutants showed a marked reduction in porin levels in their membrane. Furthermore, the yfiO 172 mutant was more affected than the yfiO 227 and yfgL mutants (Figure 2A). Allthese results were confirmed by Western blotting using an antiserum raised against OmpA (Figure 2B). Therefore, in addition to YfgL, YfiO and to a lesser extent SmpA play a role in OMP assembly in S. Enteritidis, while this assembly is not disturbed by the lack of nlpB.
Expression of YfiO, like YfgL, is required for
epithelial cell invasion of S. Enteritidis-TheYfgL lipoprotein is required for the optimal invasion of S. Enteritidis into eukaryotic cells. In order to ascertain whether Salmonella
invasion could also be influenced by loss of YfiO, NlpB or SmpA, we analyzed the ability of mutants lacking these proteins to penetrate HT-29 epithelial cells. The wild-type strain and the yfgL mutant were used as controls. As previously described, the yfgL mutant invaded the HT-29 cells significantly less than the wild-type strain (P < 0.05). No significant difference was observed between the smpA
or the nlpB mutants and the wild-type strain. By contrast, the capacity of both yfiO mutants to invade HT-29 cells was significantly reduced compared to that of the wild-type strain (P < 0.05 and P < 0.001 respectively). The yfiO 227 mutant showed a 10-fold decrease in its invasion rate, whereas the yfiO 172
mutant was almost unable to invade HT-29 cells (Figure 3). The introduction of pACyfiO
restored the invasion ability of the yfiO 227
mutant (about 50% of the wild-type
129
intracellular invasion rate). For unknown reasons, the introduction of this plasmid in the yfiO 172 mutant totally failed to restore the ability of the mutant to invade HT-29 cells under our standard conditions for the invasion test, i.e. when bacteria were cultured overnight without shaking (data not shown). By contrast, when bacteria were pre-cultured for 6 h with shaking, the pACyfiO plasmid conferred to the yfiO 172 mutant the ability to invade HT-29 cells to about 45% of the wild-type intracellular rate (Figure 3). Overall, these results show that, in addition to YfgL, the expression of YfiO, but not that of SmpA or NlpB, is required for efficient cell invasion by Salmonella.
yfiO mutants, but not smpA or nlpB
mutants, have defective TTSS-1 and flagella
expression-In S. Enteritidis, the invasion defect of a yfgL mutant was associated with the decrease in TTSS-1 and flagella expression (5,6). Since the expression of the YfiO lipoprotein also modified the invasion ability of S. Enteritidis, we investigated TTSS-1 and flagella expression in the yfiO mutants. When cultured under TTSS-1 expression conditions, the two yfiO mutants showed a marked defect in the secretion of proteins compared to the wild-type strain, as observed by SDS-PAGE and Coomassie blue staining. Using previous N-terminal sequencing and western-blotting results obtained on a yfgL mutant (5), we identified that the proteins whose secretion was greatly affected in the yfiO mutants were the TTSS-1 effector proteins SipA and SipC and the flagellar proteins FliC, FliD and FlgL (Figure 4A). The introduction of pACyfiO in these mutants fully restored the secretion ability of the yfiO 227 mutant, whereas only a partial complementation was observed for the yfiO 172 mutant, particularly for SipA secretion (Figure 4A). Moreover, in accordance with the results of invasion tests, the nlpB and the
smpA mutants secreted these proteins at similar levels to the wild-type strain (Figure 4A). These results were confirmed by Western blotting with sera raised against SipA or H:g,m flagellin (Figure 4B and C). Interestingly, we previously determined that the secretion defect of TTSS-1 and flagellar proteins in a yfgL mutant was related to a transcriptional down-regulation of the genes involved in the biosynthesis of these
TTSS (6). As no intracellular accumulation of SipA and FliD was observed in the yfiO
mutants by Western blotting (data not shown), we postulated that a mechanism similar to that observed for a yfgL mutant could be observed in the yfiO mutants. To address this hypothesis, transcription of the genes encoding SipA and FliD proteins was analyzed using real-time RT-PCR. As in the yfgL mutant, the yfiO 227 mutant transcribed the sipA and fliD
genes respectively 30 and 7 times less than the wild-type strain. Moreover, the alteration of the transcription of these genes was greater in the yfiO 172 mutant, since sipA and fliD were more than 100 times less transcribed in this strain than in the wild-type strain (Figure 4D). In addition, we analyzed the transcription of hilA, the central transcriptional activator of the TTSS-1 encoding genes. Both mutations in yfiO caused a marked reduction (more than 30-fold) in the transcription of hilA, suggesting a decrease in the transcription of all TTSS-1 encoding genes in the yfiO mutants. The introduction of pACyfiO largely restored the full transcription of these different genes (Figure 4D). Overall, these results suggest that the impaired secretion of TTSS-1 and flagellar proteins following yfiO mutations was due to a defect in the transcription of the genes encoding these systems. For the nlpB and
smpA mutants, no particular changes in the transcription of sipA, hilA and fliD was observed (Figure 4D), which is consistent with the efficient secretion and epithelial cell invasion observed in these mutants (Figure 4A). Therefore, in the “YaeT” complex, only the expression of a functional YfiO protein, in addition to YfgL, is required for transcription of genes encoding the TTSS-1 and the flagella in S. Enteritidis.
A surA mutant is impaired in OMP assembly but not in TTSS-1 and flagella expression-Toascertain whether the defect of OMP assembly could be responsible for the decrease in TTSS-1 and flagella expression observed in the
yfgL and yfiO mutants, we studied a surA
mutant of S. Enteritidis,. Indeed, since SurA, which is a periplasmic chaperone, has previously been shown to be involved in OMP targeting in E. coli (14). First, we compared the outer membrane protein profile of the
surA strain to that of the wild-type strain after SDS-PAGE and Coomassie blue staining
130
or western blotting using an antiserum raised against the major outer membrane protein OmpA. As shown in Figures 5A and 5B, the
surA mutant exhibited a lower level of porins such as OmpC/F, OmpD and OmpA in its membrane than the wild-type strain when cultured in LB NaCl 0.3 M. This is in line with the role of SurA in OMP assembly in S.
Enteritidis, as previously demonstrated in E.
coli. Interestingly, the profile obtained for the surA and the yfgL mutants looked
qualitatively and quantitatively similar, suggesting that the OMP assembly defect of these two mutants is very similar. Secondly, the ability of the surA mutant to secrete TTSS-1 and flagellar proteins was assessed. When cultured in favorable conditions for TTSS-1 expression (LB NaCl 0.3M), the
surA strain secreted FilC, FliD and SipA proteins at a similar level to the wild-type strain and the smpA mutant (Figures 5C and 5D). Overall, these results demonstrate that SurA is involved in OMP targeting and that the defect of OMP assembly generated by the lack of SurA did not decrease the secretion of effectors by the TTSS-1 and flagellar proteins.
DISCUSSIONThe YaeT complex, composed of the
YaeT, YfiO, NlpB, SmpA and YfgL proteins, has previously been shown to be involved in OMP assembly in E. coli. In this study, we provide the first description in S. Enteritidis of the role of the partner proteins of the “YaeT” complex in OMP assembly. Moreover, as the YfgL lipoprotein has previously been shown to be involved not only in OMP assembly but also in the expression of the TTSS in Salmonella, we analyzed the TTSS secretion abilities of the yfiO, nlpB and smpA
mutants in order to determine whether the control of these secretion systems was specific to the yfgL deletion or not. Our results show that the role of the “YaeT” complex in the OMP assembly described in E.
coli is conserved in S. Enteritidis. NlpB played no major role in OMP assembly, whereas SmpA showed a slight involvement in this process, as described in E. coli, consistent with an increased sensitivity of the S. Enteritidis
smpA mutant to rifampin, a small toxic compound (unpublished results) (11). In contrast, YfiO was shown to be very important for correctly targeting the OMP in S.
Enteritidis. However, we found that YfiO is not essential in Salmonella, unlike its homologue in E. coli (10,12) and in Neisseiria
gonorrhoeae, where total deletion of comL
(the yfiO homologue) failed (24). This constitutes a major characteristic of the “YaeT” complex of Salmonella.
The study of the TTSS-1 and flagellar secretion by the smpA, nlpB and yfiO
mutants highlighted two groups of mutants: one composed of the smpA and nlpB
mutants, which had no particular TTSS expression defect and were fully invasive for epithelial cells; and the second composed of the two yfiO mutants which presented similar phenotypes as those found previously for a yfgL mutant, i.e reduced expression of these two TTSS correlated with a reduced invasive ability. While the smpA mutant behaved strictly like its parental strain, we observed that the nlpB mutant had a slightly greater invasion rate than the wild-type strain (Figure 3). This result is consistent with the greater motility of the mutant on semi-solid agar plate than the wild-type strain (unpublished results), as motility is known to favour the likelihood of bacteria interacting with host cells. This greater motility of the mutant is consistent with the role of NlpB in repressing the swarming motility in Serratia marcescens
(25). The results on the smpA mutant are interesting because Sklar and co-workers suggested that SmpA is involved in maintaining the complex stability, in particular the interaction between YaeT and YfiO independently of YfgL (11). This suggests that alteration of the “YaeT” complex stability by the loss of SmpA in S. Enteritidis does not lead to down-regulation of TTSS expression.
In contrast to the first group of mutants, our work on YfiO shows that this protein is important for OMP assembly and expression of flagella and TTSS-1. An interesting point is that the yfiO 172 mutant was more affected than the yfiO 227, whatever the phenotype tested. This result suggests that the function of YfiO is not related only to its last 18 C-terminal amino acids. This notion could explain why the complementation of the yfiO
mutants by pACyfiO was not complete. Indeed, the mutants complemented by pACyfiO expressed two YfiO proteins, the wild-type and a truncated YfiO protein which competed with each other. Thus, when
131
complementation in the yfiO 172 strain was less marked than that in the yfiO 227, it could have been due to the association of YfiO and YfiO 172 which is less functional than the association of YfiO and YfiO 227.
YfgL and YfiO are the only proteins of the “YaeT” complex whose expression is necessary for OMP assembly and expression of the TTSS-1 and flagella. This raises the question of the relationship between these two phenotypes. Alternatively, is the OMP targeting defect responsible for the down-regulation of TTSS expression observed in the corresponding mutants? Studying SmpA provided the first clue for a lack of relationship between these two phenotypes, as the smpA
mutant had a minor but visible role in OMP assembly and did not show any involvement in TTSS-1 and flagella expression. In addition, as SmpA is involved in maintaining the stability of the “YaeT” complex (11), this result suggests that impairment of the “YaeT” complex stability resulting from the lack of SmpA does not lead to down-regulation of the TTSS-1 and flagella expression in S.
Enteritidis. The second clue was provided by the study of a surA mutant. SurA is a periplasmic chaperone for OMP that has recently been shown to interact with YaeT, suggesting that SurA may deliver the OMP directly to the “YaeT” complex (26). Based on this role, we observed that this mutant had a marked OMP assembly defect similar to that of the yfgL mutant. In contrast, no difference was observed in the levels of TTSS-1 effectors (SipA) and flagellar proteins secreted by the
surA mutant compared to the wild-type strain, demonstrating that it is possible to obtain an outer membrane protein targeting defect without altering TTSS expression (Figure 5). Moreover, these results also provide clues about the role of the envelope stress response system E in controlling TTSS expression in the yfgL and yfiO mutants. It is well-known in E. coli that surA deletion results in a E activation which is higher than that resulting from yfgL inactivation (14). Therefore, E is also likely to be activated in
the S. Enteritidis surA mutant due to the observed OMP assembly defect. As the TTSS expression was not impaired in this mutant, it seems unlikely that the E response, previously observed by microarray analysis in the yfgL mutant (6), could be involved in the down-regulation of the TTSS expression observed in this latter mutant and very likely in the yfiO mutant also. This is also consistent with the Salmonella low-virulence phenotype that has been associated with the deletion of rpoE ( E-encoding gene) and not with its over-expression (27). Following this line, Carlsson et al. suggested that intact E is required for type III secretion in Yersinia
pseudotuberculosis (28).Finally, our work shows that alteration
of the outer membrane does not lead inevitably to decreased TTSS expression, and therefore strongly suggests that the reduced expression of TTSS observed in the yfiO and yfgL mutants is not related to their OMP assembly defect. These data provide evidence for an additional role for YfgL and YfiO, beyond their role in OMP assembly. In line with this view, Khairnar et al. (29) recently showed that YfgL is involved in DNA strand break repair and homologous recombination in E. coli.Moreover, these authors demonstrated that YfgL possesses a Ser/Thr kinase activity enhanced by pyrroloquinoline-quinone (PQQ) with which YfgL undoubtedly interacts through its PQQ binding domains. YfgL therefore seems to be involved in a signalization cascade controlling this DNA process. Overall, these different data provide strong evidence that YfgL and YfiO are involved in different processes that need to be integrated at the bacteria level.
Acknowledgements- We are grateful to V. Legrand for her technical help. We thank Dr Roland Lloubes (CNRS, Marseille) for providing the rabbit polyclonal anti-OmpA antisera. This work was supported in part by the European Union program FOOD-CT-2003-505523. Y.F. holds an INRA/Région Centre fellowship.
132
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133
FIGURE LEGENDS
Figure 1: YfiO is important but not essential for S. Enteritidis growth in vitro. The growth curves for the S. Enteritidis wild-type strain LA5 ( ), the yfio 227 mutant ( ), the yfiO 172 mutant ( ) and the yfiO ( ) are shown. Bacteria were cultured for 8 h in LB broth with shaking. Growth was recorded by measurement of the optical density at 600 nm at regular times. A representative experiment from 2 independent cultures is shown.
Figure 2: Involvement of the different lipoproteins of the “YaeT” complex in the OMP assembly in S. Enteritidis. The outer membrane protein levels were analyzed by preparation of total membrane protein extracts from the S. Enteritidis wild-type strain LA5, the yfgL mutant, the nlpB mutant, the yfio 227 mutant, the yfiO 172 and the smpA mutant. Strains were grown in LB supplemented with 0.3 M NaCl. Proteins were separated by 12% SDS-PAGE and stained by Coomassie brillant blue staining (A) or transferred onto a nitrocellulose membrane and probed with polyclonal antibodies raised against OmpA of E. coli (B). The position of OmpA and OmpD are indicated. Results shown are from a representative experiment from 3 independent cultures and protein extractions.
Figure 3: Involvement of the different lipoproteins of the “YaeT” complex in cell invasion of S.
Enteritidis. The invasion rate of the bacteria was evaluated by the gentamicin protection assay on human HT-29 epithelial cells. Cells were infected with the S. Enteritidis wild-type strain LA5, the
yfgL mutant, the nlpB mutant, the smpA mutant, the yfio 227 mutant, the yfio 227 mutant complemented with pACyfiO (yfio 227+yfiO) pre-cultured overnight without shaking (A). The cell invasion rate of the yfiO 172 mutant and its corresponding complemented strain were compared to the wild-type strain after pre-culture 6h with shaking (B). Results correspond to the median of at least three independent experiments carried out in duplicate. Values were compared using the Kruskall-Wallis test and analyzed by the Dunn’s multiple comparison test : * P<0.05 WT vs yfgL, WT vs yfiO 227; *** P<0.001 WT(6h) vs yfiO 172
Figure 4: Involvement of the different lipoproteins of the “YaeT” complex in the TTSS-1 and flagella expression in S. Enteritidis. Secreted proteins (A, B and C) by the S. Enteritidis wild-type strain LA5, the yfgL mutant, the nlpB mutant, the smpA mutant, the yfio 227 mutant, the yfiO 172
mutant, the yfio 227 or yfiO 172 mutant complemented with pACyfiO (yfio 227+yfiO and yfiO 172+yfiO)after growth in LB supplemented with 0.3 M NaCl. Proteins from culture supernatants were precipitated with trichloroacetic acid, separated by 10 % SDS-PAGE and stained with Coomassie brillant blue (A) or transferred onto a nitrocellulose membrane and probed with polyclonal antibodies raised against either SipA (B) or H:g,m flagellin (C) and revealed by chemiluminescence. Transcription of genes (D) involved in invasion and motility in the indicated S. Enteritidis strains cultured in LB supplemented with 0.3 M NaCl. The mRNA expression of sipA, hilA and fliD was assessed by real-time RT-PCR. The expression levels of the indicated genes were normalized to the expression level of the housekeeping gene tufA. The results correspond to the means ± SEM of at least three independent cultures and RNA extractions quantified in duplicate.
Figure 5: Role of the SurA protein in OMP assembly and expression of TTSS-1 and flagella in S. Enteritidis. The outer membrane protein levels (A and B) and secreted proteins (C and D) of the indicated strains were analyzed as described in Figure 2 and Figure 4 respectively. Note that membrane lines corresponding to the wild-type strain and yfgL mutant from the protein secreted analysis (C and D) were grouped with those of smpA and surA mutants to eliminate non relevant portions of the membrane. Results shown are from a representative experiment from 3 independent culutres protein extractions.
134
Table 1 : Strains and plasmids used in this study
Strain or
plasmid
Relevant characteristic(s) Source
Strains
LA5 S Enteritidis wild type strain (Nalr) (15)
LK5hsdR hsdR mutant of S. Enteritidis LK5 (Spr) (17)
yfgL LA5 isogenic mutant with the yfgL gene deleted (6)
nlpB LA5 isogenic mutant with the nlpB gene deleted This study
smpA LA5 isogenic mutant with the smpA gene deleted This study
yfiO LA5 isogenic mutant with the yfiO gene deleted This study
yfiO 172 LA5 isogenic mutant with the yfiO gene truncated after the codon 172
to 246
This study
yfiO LA5 isogenic mutant with the yfiO gene truncated after the codon 227
to 246
This study
yfiO+yfiO strain yfiO harboring the plasmid pACyfiO This study
yfiO 172+yfiO strain yfiO 172 harboring the plasmid pACyfiO This study
yfiO +yfiO strain yfiO harboring the plasmid pACyfiO This study
Plasmids
pKD3 Vector carrying an FRT-Cm-FRT cassette (Cbr Cmr) (30)
pKD4 Vector carrying an FRT-Km-FRT cassette (Cbr Kmr) (30)
pKD46 Plasmid encoding the -Red recombinase and carrying , and exo
genes under the control of ParaB; temperature sensitive-replication (Cbr)
(30)
pCP20 Plasmid encoding the FLP recombinase; temperature-sensitive
replication (Cbr)
(31)
pACYC177 Cloning vector (Cbr Kmr) (32)
pACyfiO 1-kb fragment containing the yfiO coding sequence in plasmid
pACYC177 (Cbr)
This study
135
Table 2: Primers used in this study
Primer
name
Sequence (5' to 3')a
smpA1 CGTAATACGCTGGCAAACGC
smpA2 CGGATAACGGTGTGGAAGCC
smpA-P1 AATATGAGCCACGTACTGCTCAGGCCCGAAAAGGAACCCAATCACTATGCGTGTAGGCTGGAGCTGCTTC
smpA-P2 TGATGAACGTAACCTCATCAGGCGGTATCACAAAATTACTTCGTCAACGCCATATGAATATCCTCCTTAG
nlpB1 ATGCAACTGGGTGGTCATGGCGTGATTTCC
nlpB2 CATGCCCTTGCGATCAAACTGTTCAATGCG
nlpB-P1 AAAGTCGCGCCTGGCGAAGGTTGCGGGTGTTTCGCTTGTTTTGCTGCTCGGTGTAGGCTGGAGCTGCTTC
nlpB-P2 GCCTGGAAGACGGCAACCAGCGCGTCGTTCTGGCTTTGCGTCAGAGTATGCATATGAATATCCTCCTTAG
yfiO-P1 GACGCGCATGAAATATCTGGTGGCAGCAGCCACGTTGAGCCTGTTTCTGGGTGTAGGCTGGAGCTGCTTC
yfiO-P2 CAGCCTGCGCATTCAGCTGCATCTGACGATAGGCGTTTTCCATCAGCGGCCATATGAATATCCTCCTTAG
yfiO172-P1 ATAGCCAGTACACCACCGACGCCACTAAGCGTCTGGTATTCCTGAAAGACGTGTAGGCTGGAGCTGCTTC
yfiO227-P1 CGCGCGATGCGTTGCCGCTGATGGAAAACGCCTATCGTCAGATGCAGCTGGTGTAGGCTGGAGCTGCTTC
yfiO245-P2 AAAAAAACGGCAGCCGGAAGGCTGCCGTTTTGCTTGTTTGTATTGCTTCACATATGAATATCCTCCTTAG
yfiO1 GTTATCCATTCGGACCGTATTCTCAGCAGG
yfiO2 ACTTTTTGTGAGGCATCGCAGGAAGAAGCG
yfiO3 CTATTGTAGCTGGTCTTACCCGGGAGCAGG
yfiO4 GAATGGCTGAAAGCTTGCCATATTTGACTGG
tufA1 AGAGACTCAGAAGTCTACCTGTACTGGCG
tufA2 CTTCACGGATTGCGAAACGC
a Restriction sites are underlined.
136
Figure 1
Figure 2
137
Figure 3
Figure 4
138
Figure 5
139
140
Partie III :
Recherche de facteurs participant à la cascade de
contrôle de l’expression des TTSS généré par
l’inactivation d’yfgL chez S. Enteritidis
Résultats non publiés
141
1. Introduction
Il n’est pas déterminé actuellement si le contrôle de l’expression des TTSS résulte
d’une implication des protéines YfgL et YfiO ou seulement de l’inactivation de leur gène.
Dans tous les cas, ce contrôle fait nécessairement appel à des facteurs intermédiaires et
notamment cytoplasmiques. Nous avons donc tenté d’identifier des facteurs impliqués dans le
contrôle de l’expression des gènes impliqués dans la biosynthèse des TTSS chez le mutant
yfgL. En se basant sur l’analyse de nos données trancriptomiques et sur la littérature, deux
candidats ont été étudiés : Lon et E.
L’étude à haut débit du transcriptome de bactéries cultivées en conditions favorables à
l’expression des gènes associés au TTSS-2 a montré que la transcription du gène lon est plus
importante chez le mutant yfgL que chez la souche sauvage. Lon est une protéase ATPase
dépendante dont l’absence conduit chez S. Typhimurium à l’accumulation de HilC et HilD,
régulateurs transcriptionnels positifs des gènes associés aux TTSS-1 (Takaya et al., 2005). Si la
production de Lon est augmentée chez le mutant yfgL, la dégradation de HilC et HilD doit
être plus importante ce qui doit conduire à une diminution de la transcription de hilA. Cette
hypothèse pouvait donc être une première explication à la sous-expression des gènes
impliqués dans la biosynthèse du TTSS-1 observée chez un mutant yfgL.
Une autre hypothèse pour expliquer ce contrôle a été émise. Chez le mutant yfgL
ainsi que chez un mutant yfiO, l’altération de la membrane externe est importante (cf. Article
n°1 et 2). Les données bibliographiques ainsi que nos résultats en microarray indiquent que la
délétion d’yfgL conduit à l’activation de la voie E, système de réponse au stress
membranaire (Onufryk et al., 2005). Sachant qu’un lien entre l’activation d’une réponse au
stress membranaire CpxAR et la diminution des capacités d’attachement-pénétration de
Salmonella avait déjà été décrit (Humphreys et al., 2004), nous avons émis l’hypothèse que le
système de réponse au stress E pouvait être un élément de la cascade conduisant à
l’inhibition de la transcription des gènes codant les TTSS chez un mutant yfgL ou yfiO de S.
Enteritidis.
142
2. Matériels et méthodes
2.1. Matériels
Les souches construites et utilisées au cours de cette étude ainsi que les plasmides
utilisés sont présentés dans le Tableau 3. Les amorces sont quant à elle décrites dans le
Tableau 4.
2.2. Mutagenèse, clonage et construction des souches
2.2.1. Mutagenèse
La technique de mutagenèse utilisant le système -Red recombinase (Datsenko &
Wanner, 2000) avec modifications (Figueroa-Bossi et al., 2006a) a permis la construction des
différents mutants lon, rpoE et rseA (Tableau 3) à l’aides des amorces correspondantes
(mutant orf construit à l’aide des amorce ORF-P1 et ORF-P2 et vérifié à l’aide des amorces
ORF1 et ORF2). Cette technique permettant la délétion d’un ORF sur le chromosome
bactérien sans effet polaire sur la transcription des gènes en aval a été décrite précédemment
(Article n°1).
2.2.2. Clonage dans E. coli
2.2.2.1. Construction de la fusion transcriptionnelle
rpoEP3::lacZ
La séquence promotrice de rpoE, dont l’activité est dépendante de E a été amplifiée
par PCR à l’aide des amorces rpoEP3F-rpoEPR (Tableau 4). Ces amorces portent
respectivement un site de restriction reconnu par les enzymes de restriction SphI et HindIII.
Dans un volume final de 50 L, la PCR a été faite en tampon Herculase® reaction buffer 1 X
(Stratagene™) contenant 0,05 U/ L d’ADN polymérase avec une activité correctrice, la
Herculase®Enhanced DNA polymerase (Stratagene™), 150 ng d’ADN chromosomique de la
Tableau 3 : Souches et plasmides utilisés au cours de l’étude
Soucheouplasmide
Caractéristiques Source
Souche
LA5 Souche sauvage S. Enteritidis LA5 (NalR) (Allen-Vercoe et al., 1997)
LK5hsdR Souche S. Enteritidis LK5 hsdR::Spec (Figueroa-Bossi et al.,2006a)
yfgL LA5 délétée de l’ORF yfgL Article n°1
lon LA5 délétée de l’ORF lon Cette étude
yfgL lon LA5 délétée des ORF yfgL et lon Cette étude
rpoE LA5 délétée de l’ORF rpoE Cette étude
rseA LA5 délétée de l’ORF rseA Cette étude
Plasmides
pKD3 Vecteur portant une cassette FRT-Cm-FRT (CbR CmR) (Datsenko & Wanner, 2000)
pKD4 Vecteur portant une cassette FRT-Km-FRT (CbR KmR) (Datsenko & Wanner, 2000)
pKD46Plasmide thermosensible codant la Red-recombinase etportant les gènes , et exo, sous contrôle d’une promoteur inductible à l’arabinose, (CbR)
(Datsenko & Wanner, 2000)
pCP20Plasmide thermosensible codant la FLP-recombinase (CbR)
(Cherepanov & Wackernagel, 1995)
pACYC177 Vecteur de clonage (CbR KmR) (Chang & Cohen, 1978)
pACrpoEpACYC177 portant un fragment de 700 pb portant la séquence codante de rpoE (CbR)
Cette étude
Vecteur de clonage pour promoteur dans un multisite de clonage en aval de deux terminateurs de transcription et en amont du gène lacZ dépourvu de son promoteur (CmR)
(Robbe-Saule et al., 1997)pQF50Cm
rpoEP3::lacZ Fusion transcriptionnelle rpoEP3::lacZ dans pQF50Cm Cette étude
144
souche LA5, 1 L de chaque amorce à 10 M et 0,2 mM de dNTP. Le programme PCR a
consisté en une dénaturation de 2 min à 94°C suivie de 30 cycles de 3 étapes : 30 s
d’hybridation à 55°C, 2 min d’élongation à 72°C et 30 s de dénaturation à 94°C. Après une
dernière hybridation, une élongation finale de 7 min a été réalisée.
Après purification sur colonne du kit PCR Purification (Qiagen™) selon le protocole
du fournisseur, 1 g de produit PCR a été digéré sous 20 L par 0,5 U/ L d’enzyme SphI et
HindIII (Promega) dans le tampon B 1 X (Promega™) contenant de l’albumine sérique
bovine à 0,1 mg/mL. La réaction a été incubée 1h30 à 37°C. En parallèle, 200 ng de plasmide
pQF50Cm (Robbe-Saule et al., 1997) ont été également restreints par ces deux enzymes.
Après purification par extraction phénol/chloroforme du produit PCR et du plasmide
restreint, la ligation a été réalisée à l’aide du kit DNA Ligation (Takara™) selon un rapport
de concentration plasmide/insert de 1/3, selon les recommandations du fournisseur,
permettant d’obtenir la fusion transcriptionnelle rpoEP3::lacZ
2.2.2.2. Construction du plasmide recombinant pACrpoE
La séquence codante accompagnée de son site de fixation du ribosome du gène rpoE a
été amplifiée par PCR grâce aux amorces rpoE5 et rpoE6 possédant respectivement un site de
restriction reconnu par SmaI et HindIII. Après restriction par les enzymes correspondantes, le
produit PCR a été cloné dans le plasmide pACYC177 au niveau du gène conférant la
résistance à la kanamycine (Chang & Cohen, 1978) selon la même stratégie que précédemment,
permettant d’obtenir le plasmide pACrpoE.
2.2.2.3. Transformation d’E. coli et vérification des inserts
Une culture de 20 mL de E. coli MC1061 à D.O.600nm = 0,4 a été centrifugée. Le culot
a été repris dans 10 mL de solution de CaCl2 50 mM et incubé 30 min dans la glace. Après
centrifugation à 4°C à 7000 g pendant 5 min, le culot, repris dans 1 mL de solution de CaCl2
50 mM, a été incubé 1 h dans la glace. Un volume de 200 L de bactéries rendues
compétentes a été mis en contact avec 10 L de produit de ligation. Après incubation pendant
5 min à 42°C, le mélange a été placé dans la glace pendant 10 min puis 1 mL de TSB a été
ajouté. Après incubation à 37°C, les bactéries ayant incorporé le plasmide ont été
sélectionnées sur gélose TSA contenant l’antibiotique approprié (chloramphénicol 30 g/mL
pour rpoEP3::lacZ et carbénicilline 100 g/mL pour pACrpoE). Pour la fusion
transcriptionnelle, les boites contenaient également du 5-bromo-4-chloro-3-indolyl- -D-
galatopyranoside (X-Gal) à 80 g/mL.
145
Tableau 4 : Amorces utilisées au cours de l’étude
a Les sites de restriction sont surlignés
Nom Séquence (5’à 3’)a Utilisation
lon-P1 ATGCTGGTCGCCCAGAAGGAAGCATCGACGGATGAGCCGGGTGTAAACGAGTGTAGGCTGGAGCTGCTTC
mutant lon
lon-P2 CGATCGGCAACACCTGACCACGCAGCGTGATCTCACCGGTCATTGCCACACATATGAATATCCTCCTTAG
mutant lon
lon1 TTCCTGAGTTTATCGGTCGTCTGC contrôle mutant lon
lon2 GCCTATTGTGACAAGAAACGAGGGC contrôle mutant lon
rpoE-P1 TTGGTTTGGGGAGACATTACCTCGGATGAGCGAGCAGTTAACGGACCAGGGTGTAGGCTGGAGCTGCTTC
mutant rpoE
rpoE-P2 ATCTCTTCATAGCTCAGGCCATCCAGCTCCCGTAAGGTGATTGCCATACGCATATGAATATCCTCCTTAG
mutant rpoE
rpoE3 ACTCTAACCTGTTGCTTGCTCATAGTGCGG contrôle mutant rpoE
rpoE4 TATCGAAATGGAGAACGTCAGGCGTATCCC contrôle mutant rpoE
rpoEP3-F ATGCATGCTAAGACCTGTCTACAACATGAC fusion rpoEP3::lacZ
rpoEP-R GTAAGCTTTCCCCAAACCAAATTTCCACGCG fusion rpoEP3::lacZ
rpoE5 CCTGTTGCTTGCTCATAGCCCGGGTTATGG clonage rpoE
rpoE6 GCTTTGAGCAGCTCACTATCCAAGCTTTCG clonage rpoE
rseA-P1 ATGGCGAAACGTTGGATAGTGAGCTGCTCAAAGCGCTTACGCACGACCCGGTGTAGGCTGGAGCTGCTTC
mutant rseA
rseA-P2 TTCCTAAAGTTTGGATTCCTGGCACCTGTACCGCGGCTTGCTGGGTTTGCCATATGAATATCCTCCTTAG
mutant rseA
rseA1 TGGCAATCACCTTACGGGAG contrôle mutant rseA
rseA2 AACGCCTTGTTTCGTGATGC contrôle mutant rseA
146
Les plasmides recombinants ont été extraits à partir d’E. coli à l’aide du kit Qiaprep®
Spin miniprep (Qiagen). Après vérification des inserts par restriction enzymatique et/ou PCR,
les inserts ont été séquencés par Génome Express à l’aide de l’amorce pACYC177-1 pour la
construction pACrpoE et l’amorce -40M13 pour la fusion transcriptionnelle. Les plasmides
présentant une séquence d’insert identique aux régions correspondantes du génome séquencé
de S. Enteritidis PT4 NCTC 133349 (Institut Sanger) ont été sélectionnés pour être
électroporés dans Salmonella.
2.2.2.4. Electroporation de Salmonella et vérification
Une culture de S. Enteritidis LA5 en TSB à D.O.600nm = 0,8 a été centrifugée et le
culot bactérien a été lavé 3 fois en glycérol 10 % à 4°C. Le culot bactérien a été finalement
repris dans 160 L de glycérol. L’électroporation a consisté à mettre en présence 80 L de
bactéries avec 200 ng de plasmides recombinants puis à placer le tout dans une cuve
d’életroporation et de procéder au choc électrique via l’électroporateur Micropulser
(Biorad™) selon les recommandations du fournisseur. Après 1 h à 37°C en milieu SOC, les
bactéries ayant incorporé le plasmide d’intérêt ont été sélectionnées sur le milieu TSB
correspondant (cf. paragraphe 2.2.1.3.). La bonne incorporation des plasmides a été vérifiée
par extraction plasmidique.
2.3. Test d’activité -galactosidase
Les souches à tester ont été précultivées en TSB+antibiotiques à partir des
conservations à –80°C. L’activité du promoteur a été testée dans 2 conditions de cultures, en
milieu LB NaCl 0,3 M, favorable à l’expression du TTSS-1 (Arricau et al., 1998) et en milieu
LPM pH5,8, favorable à l’expression du TTSS-2 (Coombes et al., 2004).
Un volume de 5 mL de milieu+antibiotiques a été ensemencé avec 200 L de
préculture puis incubé à 37°C sous agitation jusqu’à une D.O.600nm comprise entre 1,8 et 2
pour la culture en milieu LB NaCl 0,3 M et une D.O.600nm = 0,4 pour la culture en milieu
LPM pH5,8. De ce bouillon, 500 L ont été mis en présence de 1,5 mL de tampon PM2 + -
mercaptoéthanol (NaH2PO4 100 mM, MgSO4 1 mM, MnSO4 2 mM, -mercaptoéthanol 10
mM ajouté extemporanément) avec 50 L de chloroforme et 50 L de SDS 0,05 %. Après
mélange vigoureux (15 s de vortex), la lyse des bactéries est obtenue après 10 min à
147
7,40
5,98
6,70
5,40
4,04,55,05,56,06,57,07,58,0
Figure 27 : Effet de la délétion de lon, associée ou non à l’inactivation d’yfgL, sur la transcription du gène hilA chez S. EnteritidisLes ARN ont été extraits des bactéries cultivées en LB NaCl 0,3 M jusqu’à D.O.600nm = 1,8- 2,0, traités à la DNase I puis reverse transcrits à l’aide de l’AMV reverse transcriptase (Promega). Le nombre d’ADNc du gène hilA est quantifié par PCR en temps réelle (Light Cycler, Roche puis normalisé par rapport au niveau de tufA, gène exprimé constitutivement. Résultats issus d’une expérience unique.
sauvage yfgL lon yfgL lon
148
température ambiante. Le dosage est réalisé ensuite à 28°C où 200 L de l’extrait de lyse
ajoutés à 1,8 mL de tampon PM2- -mercaptoéthanol, ont été mis en présence de 0,5 mL
d’une solution d’ortho-nitrophényl- -D-galatopyranoside (ONPG) 4% au temps t = 0.
Lorsque le mélange réactionnel a viré au jaune (correspondant à une D.O.420nm de 0,3-0,4), la
réaction a été arrêtée par l’ajout de 1 mL de solution de Na2CO3 1 M et le temps a été noté.
Un tube témoin ne contenant pas d’extrait de lyse a été arrêté au bout du même temps de
réaction ( t).
L’activité -galactosidase exprimée en unités Miller a été calculée en tenant compte
des D.O.600nm de la culture bactérienne initiale, D.O.420nm et D.O.550nm du mélange réactionnel
après arrêt ainsi que du temps de réaction t selon la formule suivante :
Activité = (unités Miller)
2.4. Analyse de l’expression du TTSS-1 et du flagelle
Les protocoles d’analyse des protéines sécrétées par le TTSS-1 et le flagelle et de la
transcription des gènes impliqués dans la biosynthèse du TTSS-1 (sipA, hilA) et du flagelle
(fliD) de S. Enteritidis cultivée en LB NaCl 0,3 M ont été détaillés précédemment (Article
n°1).
3. Résultats
3.1. Rôle de Lon dans le contrôle de la transcription des
gènes codant le TTSS-1 chez un mutant yfgL
Afin d’évaluer le rôle de Lon (régulateur négatif indirect de l’expression de hilA) dans
le contrôle de l’expression du TTSS-1 généré par la mutation yfgL, nous avons construit des
souches de S. Enteritidis lon ainsi que lon yfgL. En effet, si Lon dont le gène est
surexprimé chez le mutant yfgL, est impliquée dans cette voie, son inactivation devrait
(D.O.420nm – (1,75 x D.O.550nm) x 1000 x Facteur de dilution
D.O.600nm x t
149
Figure 28 : Activation de la voie E chez un mutant yfgL de S. Enteritidis cultivé en LPM pH 5,8 et LB NaCl 0,3 M. Ces conditions sont respectivement favorables à l’expression du TTSS-2 et TTSS-1. Mesure de l’activité -galactosidase (en unités Miller) de la souche sauvage S. Enteritidis LA5, du mutant yfgL, de la souche yfgL complémentée par pACyfgL ( yfgL+yfgL) et du mutant
rpoE, portant la fusion transcriptionnelle rpoEP3::lacZ, dont la transcription dépend du facteur E. Les résultats représentent les moyennes issues d’au moins 3 expériences indépendantes dans chaque condition de culture (valeurs indiquées au-dessus de chaque histogramme).
Figure 29 : Activation de la voie E chez des souches de S. Enteritidis surexprimant rpoE ou délétée du gène rseA, en milieu LB NaCl 0,3 M. Mesure de l’activité -galactosidase (en unités Miller) de la souche sauvage S. Enteritidis LA5, de la souche sauvage surexprimant rpoE (sauvage+pACrpoE) et du mutant rseA,portant la fusion transcriptionnelle rpoEP3::lacZ, dont la transcription dépend du facteur E,après culture en LB NaCl 0,3 M. Les résultats représentent la moyenne d’une expérience réalisée en duplicate sur la souche sauvage LA5 et sur deux clones indépendants de la souche LA5 surexprimant rpoE et du mutant rseA.
1 1
258
45
558
368322
47
0
100
200
300
400
500
600
700
LPM pH 5,8 LB NaCl 0,3 M
Uni
té M
iller
Sauvage
yfgL
yfgL + yfgL
rpoE
55
714
167
0
100
200
300
400
500
600
700
800
Uni
té M
iller
Sauvage Sauvage
+
pACrpoE
rseA
150
conduire à la restauration au moins partielle de la transcription des gènes impliqués dans la
biosynthèse du TTSS-1. La transcription de hilA a été étudiée chez les différentes souches
construites, cultivées en LB NaCl 0,3 M, conditions où le mutant yfgL exprime moins ce
gène que la souche sauvage (26 fois moins dans cette expérience ; Figure 27). Le gène hilA
est 4 fois moins transcrit chez le mutant lon yfgL que chez le mutant yfgL. Dans le même
sens, le mutant lon transcrit 5 fois moins hilA que la souche sauvage. De manière cohérente,
nous n’avons pas observé d’augmentation mais plutôt une légère diminution du taux de
pénétration dans les cellules épithéliales intestinales HT-29 du mutant lon yfgL par rapport
au mutant yfgL ainsi que du mutant lon par rapport à la souche sauvage (résultats non
montrés). Nos résultats suggèrent donc que Lon n’intervient pas de façon majeure chez un
mutant yfgL, dans le contrôle de la transcription des gènes codant le TTSS-1 en conditions
favorables à leur expression. De plus, nos résultats suggèrent plutôt que Lon favorise
l’expression du TTSS-1 chez S. Enteritidis cultivée dans ces conditions de culture. Les
expériences de transcription et de pénétration n’ont été réalisées qu’une et deux fois
respectivement. Bien que ces résultats ne soient que préliminaires, ils restent cohérents entre
eux. De ce fait, l’étude de Lon n’a pas été poursuivie dans le cadre de la thèse.
3.2. Rôle de E dans le contrôle de l’expression du TTSS-1
et du flagelle
Chez S. Enteritidis, l’activation du système E chez le mutant yfgL n’a été montrée
que par microarray dans des conditions de cultures favorables à l’expression du TTSS-2. Il
était nécessaire de confirmer cette activation dans différentes conditions de culture, en
particulier celles favorables à l’expression du TTSS-1. Pour cela, le promoteur P3 du gène
rpoE, dépendant du facteur E, a été cloné dans le plasmide pQF50Cm en amont du gène
lacZ dépourvu de sa région promotrice. Cette fusion nommée rpoEP3::lacZ a été électroporée
dans la souche sauvage LA5 de S. Enteritidis, le mutant yfgL, le mutant yfgL complémenté
par pACyfgL exprimant le gène sauvage yfgL ( yfgL+yfgL) ainsi que dans le mutant rpoE,
témoin négatif. Comme montré dans la Figure 28, en milieu LPM pH 5,8 et en milieu LB
NaCl 0,3 M, l’activité -galactosidase mesurée chez le mutant yfgL est respectivement 2 et
8 fois plus importante que chez la souche sauvage. L’introduction d’yfgL chez le mutant
yfgL restaure l’activité -galactosidase à un niveau égal à celle de la souche sauvage. Cela
B
C
A
Figure 30 : Effet de la surexpression du facteur E chez S. Enteritidis, sur la sécrétion des protéines en milieu LB NaCl 0,3 M. Analyse des protéines sécrétées par la souche S. Enteritidis LA5, la souche LA5 surexprimant E (Sauvage+pACrpoE) et le mutant rseA, cultivés en LB NaCl 0,3 M. Les protéines du surnageant de culture précipitées à l’acide trichloracétique, sont migrées en gel SDS-PAGE puis colorées au bleu brillant de Coomassie (A) ou transférées sur une membrane de nitrocellulose et immuno-marquées par un anticorps polyclonal dirigé contre SipA (B) ou la flagelline H :g,m puis révélées par électrochimioluminescence (C).
151
152
confirme que le phénotype observé chez la souche yfgL est bien dû à la délétion de ce gène.
Le mutant rpoE ne présente pas d’activité -galactosidase démontrant que l’activité
observée chez les autres souches est bien dépendante du facteur E. Ces résultats confirment
les données microarray précédemment obtenues et montrent que la délétion d’yfgL conduit à
l’activation de la voie E en conditions favorables à l’expression du TTSS-1 et du TTSS-2
chez S. Enteritidis.
Pour étudier l’implication de la réponse E dans le contrôle de l’expression du TTSS-
1 et du flagelle chez le mutant yfgL, nous avons d’abord pensé déléter le gène rpoE chez ce
mutant. Selon notre raisonnement, cela devait conduire à la restauration de l’expression du
TTSS-1 et du flagelle, si E était bien impliqué dans cette voie. Cependant, nos multiples
tentatives de transduire la mutation rpoE dans le mutant yfgL se sont soldées par un échec.
Or, la mutation rpoE a pu être transduite dans la souche yfgL complémentée par pACyfgL.
Ces résultats suggèrent que la délétion de rpoE est létale lorsque yfgL est inactivé.
Par conséquent, nous avons surexprimé le facteur E chez la souche sauvage et évalué
son impact sur l’expression du TTSS-1 et du flagelle. Pour cela, la souche LA5 de S.
Enteritidis portant le plasmide pACrpoE (LA5+pACrpoE) et une souche délétée du gène
rseA ( rseA) codant la protéine séquestrant le facteur E à la membrane interne en absence de
signaux d’activation, ont été construites. Dans un premier temps, la surexpression de E chez
ces deux souches a été vérifiée par l’étude de la transcription dépendante de E du promoteur
rpoEP3. L’activité -galactosidase de la souche LA5+pACrpoE portant la fusion
transcriptionnelle rpoEP3::lacZ est 10 fois supérieure à celle de la souche sauvage en milieu
LB NaCl 0,3 M. La souche rseA montre quant elle, une activation moins marquée puisque
l’activité -galactosidase est 2 à 3 fois supérieure à celle de la souche sauvage (Figure 29).
De manière intéressante, l’activité observée précédemment chez le mutant yfgL (induction
d’un facteur 8) est intermédiaire à celle de ces deux souches surexprimant E dans les mêmes
conditions de culture. Ces résultats devront toutefois être confirmés.
La sécrétion des effecteurs du TTSS-1 et des protéines flagellaires in vitro par ces
deux souches surexprimant E, a été analysée. Par migration SDS-PAGE et coloration des
protéines au bleu de Coomassie, nous avons montré que le niveau de sécrétion d’effecteurs
du TTSS-1 (SipA, SipC) et de protéines flagellaires (FliC, FliD) dans le surnageant de
culture, par la souche LA5+pACrpoE et le mutant rseA est similaire à celui de la souche
sauvage (Figure 30-A). Ceci a été confirmé par immuno-empreinte à l’aide d’anticorps
153
polyclonaux dirigés contre la protéine SipA et les protéines flagellaires (Figure 30-B et -C).
La surexpression de E ne permet pas de reproduire le phénotype observé chez le mutant
yfgL. L’ensemble de ces résultats suggère que la surexpression de E n’a donc pas ou très
peu de rôle dans la sous-expression du TTSS-1 et du flagelle chez le mutant yfgL en
conditions de culture favorable à l’expression du TTSS-1. Ces résultats préliminaires issus
d’une expérience unique (réalisée cependant sur 2 clones indépendants pour chacune des
souches surexprimant E) nécessiteront une confirmation et une étude en conditions de
culture favorable à l’expression du TTSS-2 pourra être envisagée.
4. Discussion et perspectives
L’objectif initial de ce travail était de mettre en évidence des facteurs impliqués dans le
contrôle de l’expression des 3 TTSS, généré par la délétion d’yfgL chez S. Enteritidis. En
première approche, nous nous sommes concentrés sur Lon dont le gène est surexprimé chez
le mutant yfgL et nous avons étudié son rôle dans l’expression du TTSS-1 et du flagelle.
Nos travaux préliminaires ont montré que la délétion du gène lon chez le mutant yfgL ne
restaurait pas la transcription de hilA suggérant que Lon ne joue pas un rôle significatif dans
le phénotype lié à la délétion d’yfgL. De manière surprenante, nous n’avons pas été en mesure
de reproduire les résultats décrits par Takaya et al, concernant l’augmentation de la
transcription de hilA et le phénotype d’hyper-pénétration chez un mutant lon. Nous avons
observé plutôt une tendance inverse suggérant un rôle positif de Lon dans la transcription de
hilA. Cette différence pourrait provenir soit de la différence d’osmolarité du milieu de
culture (milieu NaCl 0,3 M dans notre étude contre le milieu L contenant du NaCl à 0,086 M
ou 0,172 M dans l’étude de Takaya et al.) ou soit du sérotype utilisé (S. Enteritidis dans notre
étude contre S. Typhimurium) (Takaya et al., 2002). Aucun autre travail n’a d’ailleurs mis en
évidence ce phénotype d’hyper-pénétration chez un mutant lon de S. Typhimurium.
Boddicker et Jones ont suggéré que Lon participe à la répression de l’expression de hilA en
conditions défavorables comme la vacuole d’endocytose (Boddicker & Jones, 2004). Nos
travaux ayant été réalisés en conditions favorables à l’expression du TTSS-1, il serait
souhaitable d’effectuer ces analyses en conditions favorables à l’expression du TTSS-2. Dans
ces conditions, la surexpression de Lon chez le mutant yfgL pourrait jouer un rôle dans le
154
contrôle de la transcription de hilA ce qui serait cohérent avec la surexpression de lon
observée en microarray.
A la suite de la description du complexe « YaeT » dans lequel YfgL a été impliquée
(Wu et al., 2005), nous avions analysé le rôle d’YfiO et de NlpB dans la sécrétion des protéines
effectrices du TTSS-1 et du flagelle ainsi que dans la perméabilité membranaire. A l’issue de
ces travaux, nous ne pouvions dissocier l’altération de la membrane externe et la diminution
de la sécrétion des protéines effectrices du TTSS-1 et du flagelle. Une perte partielle de
fonction d’YfiO, comme la perte d’YfgL et à l’inverse de la perte de NlpB, causait une
altération de la membrane et de la sécrétion des protéines effectrices du TTSS-1 et du
flagelle. Nous avions ainsi émis l’hypothèse que le contrôle de l’expression des TTSS,
observé notamment chez le mutant yfgL pouvait résulter de l’activation de systèmes de
réponses au stress membranaire, surtout en sachant que le système E est activé chez un
mutant yfgL d’E. coli (Onufryk et al., 2005) et de S. Enteritidis (Article n°1). Le facteur E
n’ayant jamais été impliqué dans le contrôle de l’expression des TTSS chez Salmonella, il
était intéressant de déterminer son rôle dans la cascade de contrôle générée chez le mutant
yfgL. Nous avons préalablement confirmé l’activation du système E chez le mutant yfgL
de S. Enteritidis en conditions favorables à l’expression du TTSS-1 et du TTSS-2. Bien que
cette activation semble essentielle à la survie du mutant yfgL de S. Enteritidis puisque nous
n’avons pas pu déléter rpoE chez ce mutant, nos travaux ne l’ont pas impliquée dans
l’expression du TTSS-1 et du flagelle. En effet, la surexpression de E chez la souche
sauvage n’a pas modifié les capacités de sécrétion des protéines effectrices du TTSS-1 et des
protéines flagellaires. Des résultats similaires ont été obtenus avec un mutant resA qui ne
séquestre plus E en absence de stress. Toutefois, nous ne pouvons pas exclure que la réponse E puisse être un élément qui doit être associé à d’autres facteurs pour déclencher le contrôle
de l’expression des TTSS. Il est ainsi possible que dans notre système de surexpression de E
chez la souche sauvage LA5, toutes les conditions n’aient pas été reproduites pour obtenir ce
phénotype. De manière intéressante, plusieurs publications relatent l’activation de la voie E
en parallèle d’une diminution de la virulence suggérant que ce phénomène n’est pas
spécifique du mutant yfgL. L’inactivation d’hfq codant une protéine chaperone liant
notamment les ARNs, active la voie E chez S. Typhimurium (Figueroa-Bossi et al., 2006b) et
conduit à une baisse importante de la virulence de cette bactérie expliquée notamment par
une baisse de la sécrétion des effecteurs du TTSS-1 et de la mobilité (Sittka et al., 2007). Chez
Vibrio cholerae, Ding et al. ont montré que la mutation hfq diminue également la virulence
155
en parallèle d’une activation de la voie E. Cependant, comme dans notre étude, ces auteurs
ont montré que l’inactivation de rseA ne permettait pas de reproduire ce phénotype (Ding et al.,
2004). Par ailleurs, l’inactivation de surA (codant une chaperone impliquée dans l’assemblage
des PME à la membrane) chez E. coli conduit à l’activation du système E (Rouviere & Gross,
1996). Il est ainsi fort probable que chez Salmonella, ce soit également le cas puisque nos
résultats suggèrent que l’assemblage des PME est altéré chez un mutant surA. Néanmoins,
le fait que les capacités de sécrétion du TTSS-1 et du flagelle du mutant surA de S.
Enteritidis ne sont pas modifiées (Article n°2) sont cohérentes avec une absence de rôle de
l’activation de E dans la diminution de l’expression du TTSS-1 et du flagelle. Enfin, dans la
littérature, les phénotypes de faible virulence liés à rpoE ont plutôt été associés à son
inactivation plutôt qu’à sa surexpression chez S. Typhimurium (Humphreys et al., 1999;
Testerman et al., 2002). De même, chez Yersinia pseudotuberculosis, la sécrétion de type III
requiert un facteur E fonctionnel (Carlsson et al., 2007a).
Une implication des autres systèmes de réponse au stress membranaire dans le
phénotype du mutant yfgL ne doit pas être exclue. Le système à deux composants CpxAR a
été impliqué dans les phénomènes d’attachement-pénétration de S. Typhimurium. Il a été
montré qu’une mutation conduisant à l’activation constitutive du régulateur CpxR diminue
l’attachement et la pénétration de S. Typhimurium (Humphreys et al., 2004). De même, chez
Yersinia pseudotuberculosis, l’attachement aux cellules eucaryotes et l’expression du TTSS
et des adhésines par la bactérie, sont diminués chez un mutant cpxA accumulant CpxR sous
forme phosphorylée, c’est-à-dire active (Carlsson et al., 2007a; Carlsson et al., 2007b). Chez S.
Enteritidis, il serait ainsi intéressant d’évaluer l’expression de ces systèmes de réponses au
stress chez le mutant yfgL même si les analyses de nos données microarray n’ont pas mis en
évidence leur activation. Cependant, sans confirmation par une autre méthode nous ne
pouvons exclure leur éventuelle activation. Si nous établissons qu’ils sont activés, leur rôle
dans le contrôle de l’expression des TTSS pourrait être analysé par l’étude de mutants de ces
systèmes chez la souche yfgL.
Cependant, plutôt que de poursuivre l’étude ciblée de Lon ou des autres systèmes de
réponse au stress membranaire, il nous semble préférable de développer une approche
aléatoire pour identifier des facteurs impliqués dans cette cascade de contrôle de l’expression
des TTSS chez le mutant yfgL.
156
Discussion générale
157
158
YfgL et ses multiples rôles
Depuis le début de la thèse, les articles sur YfgL se sont multipliés, présentant
plusieurs rôles pour cette protéine (Figure 31).
Chez E. coli, YfgL, lipoprotéine de la membrane externe (ME) a été impliquée dans la
biogenèse et la perméabilité de la membrane externe, via son association avec le complexe
« YaeT » responsable de l’assemblage des protéines de membrane externe (PME) (Charlson et
al., 2006; Ruiz et al., 2005; Wu et al., 2005). Chez S. Enteritidis, nous avons montré qu’YfgL joue
ce rôle dans l’adressage des PME à la membrane (Article n°1).
Chez les bactéries pathogènes, l’expression d’YfgL est importante pour la virulence.
Chez S. Enteritidis, elle est requise in vivo pour l’infection systémique chez la souris (Article
1), pour la colonisation précoce de l’intestin et de la rate chez le poussin d’un jour (Amy et al.,
2004) et dans le portage systémique chez le poussin d’une semaine (résultats de non publiés de
l’équipe). Nous avons montré que l’inactivation d’yfgL conduit à la réduction de la
transcription de la plupart des gènes impliqués dans la biosynthèse des 3 TTSS : le flagelle
impliqué dans la mobilité ; le TTSS-1, dans la pénétration dans les cellules non
phagocytaires ; et le TTSS-2, dans la survie intracellulaire de S. Enteritidis (Figure 31). Ce
contrôle passe notamment par la diminution de la transcription des gènes codant les
régulateurs transcriptionnels centraux de chacun de ces TTSS : HilA pour les gènes associés
au TTSS-1, FlhD2C2 et FliA pour ceux associés au flagelle et SsrB pour ceux associés au
TTSS-2 (Article n°1).
Nos travaux ne sont pas les seuls à décrire un rôle d’YfgL dans la virulence
bactérienne. Chez une souche d’E. coli adhérente-invasive, il a été également montré que la
perte d’yfgL conduit à une diminution des capacités de pénétration de la bactérie en parallèle
d’une réduction de la production de vésicules de membrane externe et de l’expression des pili
de type I. Ce défaut de pénétration n’a cependant pas été relié à la réduction de l’expression
des pili de type I. Il a plutôt été suggéré que les vésicules de la membrane externe pourraient
favoriser la pénétration de cette souche d’E. coli (Rolhion et al., 2005). Toutefois, le mécanisme
exact expliquant le défaut de pénétration chez cette souche n’a pas été totalement élucidé.
D’autre part, nous avons également trouvé des articles antérieurs à la thèse relatant le rôle
d’un ORF nommé sspJ dans la virulence de S. Typhimurium. Cet ORF est en fait yfgL. Le
nom sspJ n’ayant jamais été repris par d’autres groupes, nous sommes initialement passés à
côté de ces travaux. Les auteurs avaient ainsi déposé dans les banques de données cette
séquence à la suite d’une étude où ils ont mis en évidence l’implication de cet ORF dans la
résistance à la ménadione, composé superoxyde. Ils ont ainsi montré qu’un mutant
Figure 31 : Représentation schématique de fonctions et phénotypes associés à YfgL ou à son absence
UV, Rayons Gamma
160
sspJ::MudJ présente un défaut de réplication intracellulaire dans les macrophages. En
parallèle, ce mutant présente une baisse de la virulence chez des souris résistantes
(C3H/HeN) et sensibles (Balb/C), après infection intra-péritonéale (van der Straaten et al., 2001).
Cette baisse de virulence est en partie abolie chez des souris déficientes en production de
composés superoxydes (p47phox-/-) confirmant le rôle de sspJ dans la résistance à de tels
composés (van Diepen et al., 2002). Ces résultats sur sspJ sont totalement cohérents avec nos
travaux chez S. Enteritidis. Nos résultats montrant la baisse d’expression du TTSS-2 et
l’altération de la membrane externe observée chez le mutant yfgL peuvent expliquer les
phénotypes observés dans l’étude de van der Straaten et al. Enfin, un point intéressant de
cette étude sur sspJ/yfgL est que la protéine correspondante serait sécrétée dans le surnageant
de culture par S. Typhimurium suggérant un nouveau rôle potentiel pour YfgL.
Très récemment, il a été montré chez E. coli qu’YfgL présente une activité
serine/thréonine kinase et qu’elle peut lier le pyrroloquinoline-quinone, un composé anti-
oxidant. L’inactivation d’yfgL conduit à une augmentation de la sensibilité de la bactérie aux
irradiations UV et aux rayons gamma, suggérant un rôle d’YfgL dans la réparation de l’ADN
et la recombinaison homologue chez E. coli (Khairnar et al., 2007) (Figure 31).
Parmi tous ces rôles décrits pour YfgL, le consensus que l’on peut dégager est la
notion de sensibilité à différents composés ou radiations, de la bactérie n’exprimant plus cette
protéine et l’atténuation de sa virulence. Par contre, d’autres aspects sont moins clairs ou
restent à confirmer chez d’autres bactéries : localisation membranaire et/ou sécrétée, activité
enzymatique, association en complexe multiprotéique.
Tentatives de compréhension du contrôle de l’expression des TTSS chez les
mutants yfgL et yfiO
L’implication d’YfgL et d’YfiO dans l’intégrité de la membrane externe et
l’expression des TTSS nécessitait d’évaluer l’impact de la modification de la membrane
externe sur l’expression des TTSS chez S. Enteritidis. L’étude du complexe « YaeT » et
surtout celle de SurA, a montré qu’un défaut d’assemblage des PME à la membrane ne
conduit pas à la modification de l’expression du TTSS-1 et du flagelle. Cela a suggéré que la
sous-expression des TTSS chez les mutants yfgL et yfiO n’est pas reliée à l’altération de
l’assemblage des PME chez ces mutants. Nous ne pouvons toutefois pas écarter qu’une autre
modification de la membrane externe dans l’expression des TTSS chez le mutant yfgL.
Chez E. coli, il a été montré, par exemple, que la délétion d’yfgL conduit à une élévation du
161
niveau de LPS (Charlson et al., 2006) ce qui est probablement à relier à l’activation du système E qui contrôle positivement la transcription des gènes du LPS (Rhodius et al., 2006). A l’heure
actuelle, l’augmentation des niveaux de LPS chez le mutant yfgL de S. Enteritidis n’a pas
été vérifiée. Il semble cependant peu probable que l’augmentation des niveaux de LPS soit la
cause de la modification de l’expression du TTSS-1 et du flagelle chez le mutant yfgL. En
effet, nous avons montré que la surexpression de E chez S. Enteritidis, probablement
responsable d’une augmentation du niveau de LPS, ne diminue pas l’expression du TTSS-1
et du flagelle (résultats partie III). Ces données vont dans le sens d’un autre rôle potentiel
pour YfgL voire YfiO que celui qu’elles jouent dans la biogenèse de la membrane externe.
De manière intéressante, chez la bactérie à Gram positif Bacillus subtilis qui ne possède pas
de membrane externe, la protéine YxaL, homologue d’YfgL, a été décrite comme étant
sécrétée (MA Petit, Communication personnelle) et favorisant l’activité de l’hélicase PcrA
impliquée dans la réplication de l’ADN (Noirot-Gros et al., 2002). Le fait que l’inactivation
d’yfiO conduise également à l’expression du TTSS-1 et du flagelle peut suggérer un lien avec
YfgL. Cependant, mis à part son rôle dans la biogenèse de la ME, aucune information n’est
disponible sur YfiO, rendant difficile l’établissement d’une hypothèse l’associant avec YfgL
pour expliquer le contrôle de l’expression des TTSS chez Salmonella.
Il serait intéressant de dissocier l’altération de la membrane externe et le défaut
d’expression des TTSS. Une stratégie envisageable est de construire une banque plasmidique
d’ORF yfgL mutés ponctuellement par la technologie d’error-prone PCR. Nous pourrions
alors cribler cette banque plasmidique chez le mutant yfgL sur les deux critères
phénotypiques : perméabilité membranaire et expression du TTSS-1. Les constructions
générées pourraient également être testées sur leur activité kinase et leur capacité à interagir
avec YaeT, ce qui permettrait de caractériser fonctionnellement YfgL. Cette stratégie a déjà
été utilisée avec succès pour la cartographie fonctionnelle de l’ATPase InvC de l’appareil du
TTSS-1 (Akeda & Galan, 2004). En l’appliquant sur YfgL, nous pourrions potentiellement
mettre en évidence des domaines de la protéine, impliqués dans un ou plusieurs rôles d’YfgL.
Quelles fonctions biologiques pour YfgL ?
A l’heure actuelle, nous ne pouvons pas être sûrs que le contrôle de l’expression des
TTSS ne soit pas lié à l’altération de la membrane externe chez le mutant yfgL. Nos travaux
ont cependant montré des éléments suggérant une dissociation de ces deux phénomènes,
suggérant un nouveau rôle d’YfgL. Avec les données bibliographiques, ce sont de multiples
162
rôles n’ayant pas forcément de liens évidents entre eux, qui ont été associés à YfgL. Il se pose
donc la question de la fonction biologique assurée par YfgL dans la bactérie.
Des analyses bioinformatiques décrivent YfgL comme une lipoprotéine de la
membrane externe avec des domaines de type WD-40. Ces domaines présents chez les
protéines eucaryotes sont connus pour être impliqués dans les interactions protéine-protéine
(van der Voorn & Ploegh, 1992). Ces données sont cohérentes avec le rôle décrit pour YfgL en
association avec le complexe « YaeT », dans l’assemblage des PME (Wu et al., 2005). Chez S.
Typhimurium, YfgL a été montrée comme étant sécrétée et impliquée dans la résistance aux
composés superoxydes (van der Straaten et al., 2001). La sensibilité d’un mutant yfgL à de tels
composés peut alors s’expliquer par l’altération de la ME et l’augmentation de sa
perméabilité à différentes molécules. Nous avons effectivement observé cette perturbation
membranaire chez S. Enteritidis (Article n°1). Toutefois, la sécrétion de YfgL chez S.
Typhimurium observée par van der Straaten et al., n’avait pas été prédite par les analyses
bioinformatiques ni décrite chez E. coli. Nos travaux préliminaires chez S. Enteritidis
suggèrent qu’YfgL est retrouvée dans le surnageant de culture (résultats non présentés). Nous
ne sommes pas en mesure d’associer la sécrétion d’YfgL avec un rôle déjà connu. Cependant,
le fait qu’YfgL présente une activité ser/thr kinase démontrée chez E. coli, permet
d’envisager deux hypothèses chez Salmonella : une voie de signalisation dépendante d’YfgL
dans la bactérie ou la translocation d’YfgL dans les cellules eucaryotes.
Chez Myxococcus xanthus, des ser/thr kinases ont été impliquées dans une cascade de
phosphorylation conduisant à la régulation d’un activateur transcriptionnel impliqué dans le
développement de la bactérie (Nariya & Inouye, 2005). Chez Mycobacterium tuberculosis, il a
été récemment montré que l’activité de PknD, une ser/thr kinase, conduit à la
phosphorylation d’un anti-anti-facteur Rv0516c) en parallèle de la modification de
transcription de nombreux gènes appartenant au régulon d’un facteur alternatif (SigF)
(Greenstein et al., 2007). La protéine YfgL chez S. Enteritidis pourrait ainsi phosphoryler une
protéine conduisant à l’activation ou l’expression d’un facteur transcriptionnel. Avant de se
lancer dans la recherche de tels mécanismes, il apparaît important d’établir en premier lieu, si
l’activité kinase d’YfgL est importante pour le contrôle de l’expression des gènes impliqués
dans la biosynthèse des TTSS chez S. Enteritidis. La cartographie fonctionnelle d’YfgL
réalisée par error-prone PCR (voir plus haut) pourrait permettre d’obtenir des variants
d’YfgL n’ayant plus d’activité ser/thr kinase. Il serait alors possible d’évaluer si ces variants
peuvent complémenter le défaut d’expression des TTSS chez le mutant yfgL.
163
D’autre part, des protéines de type ser/thr kinases transloquées dans la cellule hôte,
ont déjà été impliquées dans la virulence bactérienne, notamment chez Yersinia. La protéine
YpkA, transloquée dans la cellule eucaryote, est importante pour la virulence de Yersinia
pseudotuberculosis. De plus, son activité ser/thr kinase lui est nécessaire pour conférer à Y.
pseudotuberculosis sa virulence chez la souris (Wiley et al., 2006). Un tel rôle pour YfgL
implique que son activité ser/thr kinase chez Salmonella soit confirmée. In vitro, il est
possible d’évaluer l’auto-phosphorylation de la protéine purifiée en présence d’ATP par
immuno-marquage à l’aide d’anticorps dirigés contre des épitopes ser/thr phosphorylés
comme cela a été fait chez E. coli (Khairnar et al., 2007). La translocation d’YfgL dans la
cellule eucaryote pourrait être observée par microscopie confocale à immunofluorescence à
l’aide de l’anticorps anti-YfgL développé au cours de la thèse. Une autre façon de l’observer
serait par la construction d’une fusion YfgL-Cya (portant une activité adénylate cyclase
calmoduline-dépendante) et d’évaluer si S. Enteritidis peut transloquer cette fusion dans les
cellules eucaryotes en analysant leur taux d’AMPc (augmentation du niveau d’AMPc dans
les cellules où la protéine fusion est transloquée).
Cascade de contrôle de la transcription des gènes impliqués dans la biosynthèse
des TSSS chez le mutant yfgL
Le contrôle de l’expression des TTSS fait nécessairement intervenir une cascade
d’activation ou d’inhibition transcriptionnelle couplée potentiellement à une transduction du
signal médiée par des interactions protéines. Plusieurs cas de figures peuvent être envisagés
pour décrire ce contrôle. Le premier est que la voie de contrôle médiée par YfgL ou sa perte,
conduise à l’activation ou l’inhibition d’un seul régulateur capable de moduler la
transcription des gènes impliqués dans la biosynthèse des 3 TTSS de Salmonella. Le second
est que cette voie implique la modification d’expression de plusieurs régulateurs modulant
chacun l’expression d’un ou deux TTSS. De plus, les régulateurs impliqués pourraient être
différents selon les conditions de culture utilisées.
En analysant les données transcriptomiques obtenues à partir des analyses en
microarray, nous n’avons pas été en mesure d’identifier la modification de la transcription de
gènes codant des régulateurs connus, comme Fis, qui contrôlent l’expression des 3 TTSS
dans le même sens chez le mutant yfgL. D’autre part, l’analyse du transcriptome du mutant
yfgL a mis en évidence la modification de l’expression de facteurs connus pour réguler
l’expression d’au moins un TTSS. Il s’agit de Lon qui dégrade HilC et HilD, régulateurs
164
positifs de la transcription des gènes associés au TTSS-1 (Takaya et al., 2005), dont le gène est
surexprimé chez le mutant yfgL par rapport à la souche sauvage. Toutefois, nos premiers
résultats n’ont pas impliqué Lon dans la voie de contrôle de la transcription des gènes du
TTSS-1 chez le mutant yfgL en conditions de culture favorables à l’expression du TTSS-1
(cf. Résultats, chapitre 3). Si d’autres études peuvent être réalisées de manière ciblée, suite à
nos premières expériences infructueuses, la recherche aléatoire de facteurs impliqués dans
cette voie de contrôle est probablement à privilégier. Dans cette optique, il serait intéressant
de développer une stratégie permettant d’identifier des facteurs impliqués dans l’expression
des TTSS, qu’ils soient surexprimés ou sous-exprimés chez le mutant yfgL. Cela
nécessiterait la construction de fusions transcriptionnelles hilA::lacZ, ssrB::lacZ et fliA::lacZ
et l’utilisation d’une banque de mutants générés par un transposon de type T-POP. La
mutagenèse via T-POP conduit à l’inactivation d’un ORF en absence de tétracycline ou à la
surexpression d’un ORF en présence de tétracycline si le transposon est inséré en amont de
l’ORF cible (Lee et al., 2007). Nous pourrions ainsi cribler une banque de mutants
transpositionnels T-POP en présence et en absence de tétracycline sur la capacité à restaurer
l’activité transcriptionnelle de hilA chez le mutant yfgL. Les facteurs identifiés pourront
alors être testés sur leur capacité à restaurer la transcription de ssrB et fliA afin d’établir leur
spectre d’action sur l’expression des 3 TTSS chez le mutant yfgL. Ces travaux pourraient
permettre, non seulement de comprendre la cascade de contrôle de l’expression des TTSS
chez le mutant yfgL mais également la mise en évidence de nouvelles voies de contrôle de
la transcription des gènes impliqués dans la biosynthèse des TTSS chez Salmonella.
Le complexe « YaeT » chez S. Enteritidis
Nos résultats ont suggéré que le rôle des protéines du complexe « YaeT » décrit chez
E. coli dans l’assemblage des PME est conservé chez S. Enteritidis. Cependant, nous n’avons
aucune donnée sur les interactions protéines-protéines entre les membres de ce complexe.
Jusqu’à présent nous nous sommes basés sur les données du groupe de Silhavy et de celui de
Kahne qui ont décrit le complexe « YaeT » par co-immunoprécipitation (Malinverni et al., 2006;
Sklar et al., 2007a). Ces auteurs ont notamment basé leurs travaux sur la localisation à la
membrane externe d’YfgL (Wu et al., 2005). Nos travaux ainsi que les données de la littérature
particulièrement chez Salmonella suggèrent que le rôle d’YfgL ne se limite pas
165
Figure 32 : Localisation génétique d’yfgL chez S. Enteritidis
ssiivvHHyyffggJJeennggAAyyffggLLyyffggMMhhiissSS
166
qu’à la ME. Le fait qu’YfgL assure d’autres fonctions que l’assemblage des PME,
notamment sa fonction ser/thr kinase, étaye l’hypothèse d’interactions d’YfgL avec d’autres
partenaires. La recherche de protéines interagissant avec YfgL semble incontournable chez S.
Enteritidis. Par la suite, il pourra être envisagé de déterminer les protéines phophorylées par
YfgL.
Dans un premier temps, nous pourrions réaliser une recherche ciblée d’interactions
entre les différents membres du complexe « YaeT » par la technique du double hybride chez
la levure, par la technologie de résonance plasmonique de surface ou encore par
immunoprécipitation à l’aide de l’anticorps anti-YfgL développé au laboratoire. Ces travaux
nous permettraient de confirmer ou pas l’existence du complexe « YaeT » au niveau
interactionnel qui à l’heure actuelle n’a jamais été montrée ni chez une autre bactérie ni par
une autre méthode que l’immunoprécipitation. Au niveau génétique, il serait également
possible de générer des mutants délétés de plusieurs gènes codant les membres du complexe
« YaeT » afin d’établir un lien génétique à mettre en parallèle des interactions physiques. A
l’aide d’une banque double hybride à partir de l’ADN de S. Enteritidis construite au
laboratoire, un criblage avec YfgL comme protéine appât peut être envisagé dans un second
temps. Nous pourrions ainsi mettre en évidence des interactions transitoires d’YfgL avec son
substrat de manière compatible avec une activité ser/thr kinase potentielle. L’objectif dans
notre contexte sera d’établir si les interactants d’YfgL sont impliqués dans la voie de contrôle
de l’expression des TTSS chez S. Enteritidis. Ces travaux en combinaison avec ceux
concernant l’identification de facteurs transcriptionnels pourraient ainsi participer à la
caractérisation de la ou des voies de contrôle de l’expression des TTSS.
yfgL et le locus yfg-eng : proximité génétique signifie-t-elle rôle partagé ?
En revenant aux origines de ces travaux de thèse, il faut souligner qu’yfgL est situé sur
le chromosome entre les gènes hisS et sivH. Dans cette région, sont retrouvés dans le même
sens de transcription qu’yfgL, yfgM, engA et yfgJ (Amy et al., 2004) (Figure 32). L’organisation
transcriptionnelle de cette région n’étant pas connue, elle avait été analysée par Northern blot
et RT-PCR dans le cadre d’une étude préliminaire. Des co-transcrits portant les ORF yfgM-
yfgL, yfgL-engA avaient été mis en évidence. D’autre part, l’existence d’un monotranscrit
d’yfgL avait également été observée par Northern blot (résultats non publiés). En nous basant
sur l’idée qu’une proximité génétique entre ORF sous-entend généralement un lien
phénotypique ou fonctionnel, nous souhaitions en début de thèse évaluer le rôle de ces ORF
167
dans la virulence de S. Enteritidis. Un mutant yfgM ou yfgJ présente des capacités de
sécrétion des protéines effectrices du TTSS-1 et des protéines flagellaires comparables à
celles de la souche sauvage. De plus, nous avons montré qu’un mutant yfgM est aussi
virulent que la souche sauvage en modèle murin d’infection systémique létale (résultats non
présentés). Ces résultats ont suggéré que yfgM et yfgJ ne jouent pas de rôle dans la virulence
de S. Enteritidis. Concernant engA, toutes les tentatives de construction d’un mutant ont
échoué, suggèrant que la protéine EngA est essentielle chez S. Enteritidis, comme cela avait
déjà été montré chez E. coli et S. Typhimurium (Hwang & Inouye, 2001; Knuth et al., 2004). Les
analyses bioinformatiques prédisent que le produit d’engA présente des homologies avec les
protéines liant le GTP. Chez E. coli, engA code une protéine dont les domaines GTPasiques
sont importants pour son rôle dans l’activité et la stabilité des ribosomes (Bharat et al., 2006).
Le rôle d’EngA chez E. coli n’est cependant pas totalement compris. Récemment chez S.
Typhimurium, l’interaction d’EngA avec les ribosomes a été confirmée (Lamb et al., 2007).
Aucun rôle d’EngA n’a donc encore été identifié dans la virulence de Salmonella. A part
l’existence de co-transcrits, il n’existe à l’heure actuel aucun lien fonctionnel entre les ORF
du locus yfg-eng. Il se pose toutefois la question de l’implication de ces ORF dans la
biogenèse de la membrane externe.
Application potentielle du mutant yfgL voire yfiO
Une souche de S. Enteritidis n’exprimant pas yfgL présente une virulence fortement
atténuée en modèle murin d’infection systémique létale. Il est cependant intéressant de noter
que ce mutant reste capable de coloniser le cæcum quel que soit le modèle animal utilisé
(modèle murin infection systémique létale, infection du poussin d’un jour, modèle aviaire de
portage). Dans le cas du modèle aviaire de portage, il persiste même aussi bien que la souche
sauvage dans les cæca et ce, pendant une période supérieure à 8 semaines (données non
publiées de l’équipe). Par contre, le mutant est fortement atténué au niveau systémique dans
tous ces modèles. Ces caractéristiques et le fait que le mutant soit non agglutinable a permis à
l’équipe de proposer la mutation yfgL pour une souche vaccinale chez la volaille. Les critères
nécessaires pour une telle souche vaccinale sont la faible virulence chez la volaille et la
souris, la capacité à inhiber la colonisation d’autres souches de S. Enteritidis chez la volaille,
l’établissement d’une réponse immunitaire protectrice chez l’hôte et sa non-agglutination
avec un sérum anti-flagelle permettant la distinction des animaux infectés et des animaux
vaccinés. Le mutant yfgL a montré une bonne capacité d’inhibition de colonisation d’une
168
autre souche de S. Enteritidis (U. Methner, Allemagne). Il reste cependant à savoir si ce
mutant permet l’établissement d’une réponse immunitaire protectrice chez la volaille. La
mutation d’yfiO pourrait également être intéressante, à l’instar de la mutation d’yfgL. Les
capacités de colonisation cæcale du mutant yfiO doivent être préalablement étudiées avant
d’aller plus loin. Il serait également intéressant de tester les capacités de survie de ces
mutants dans l’environnement. En effet, de par leur membrane altérée, ces mutants pourraient
présenter des capacités de survie dans l’environnement réduites ce qui constituerait un
avantage certain pour un vaccin vivant.
Conclusion
Les travaux de la thèse ont permis une première caractérisation du complexe « YaeT »
chez Salmonella et suggèrent un nouveau rôle pour YfgL. Nous avons pu apporter quelques
éléments pour améliorer notre compréhension du contrôle de l’expression des TTSS chez le
mutant yfgL et dans un second temps, le mutant yfiO. Il se pose toutefois la question de
l’intérêt biologique pour la bactérie de contrôler ses 3 TTSS dans le même sens. De
nombreux régulateurs spécifiques contrôlent finement l’expression de chaque TTSS impliqué
dans des étapes du processus infectieux plus ou moins bien compartimentés. Salmonella
induit-elle un signal de contrôle d’expression de ces 3 TTSS en modulant l’expression
d’YfgL au cours de son cycle pour promouvoir sa virulence ? De manière intéressante, une
étude récente a montré que dans l’intestin murin, compartiment favorable à l’expression du
TTSS-1 et du flagelle, le TTSS-2 est exprimé (Brown et al., 2005). Biologiquement, il est donc
envisageable de penser que l’expression des 3 TTSS peut être contrôlée dans le même sens.
A l’heure actuelle, nous n’avons pas pu déterminer de manière directe le rôle actif
d’YfgL dans le contrôle de l’expression des TTSS, donnant priorité à la caractérisation
fonctionnelle de cette protéine. L’enjeu sera donc de faire la part des choses entre les
différentes fonctions démontrées ou suggérées d’YfgL (sécrétion et/ou association au
complexe « YaeT », activité ser/thr kinase) et d’en relier éventuellement une au contrôle de
l’expression des TTSS. A plus long terme, la protéine YfgL ainsi qu’YfiO pourraient
constituer de nouvelles cibles thérapeutiques.
169
170
Références
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171
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Yann FARDINI Étude du contrôle de l’expression des systèmes de sécrétion de type III, généré par l’inactivation du
gène yfgL codant une lipoprotéine de la membrane externe, chez
Salmonella Enteritidis
Résumé Les salmonelles, responsables de fièvres typhoïdes et gastro-entérites, sont un problème majeur de santé publique. Les systèmes de sécrétion de type III (TTSS) sont des facteurs de virulence cruciaux de Salmonella. Nos travaux ont montré que délétion du cadre ouvert de lecture yfgL conduit à une faible transcription des gènes codant les 3 TTSS conduisant à une baisse importante de la virulence de Salmonella Enteritidis. Or, la délétion de ce gène, dont la protéine chez E.coli est en complexe avec les protéines YaeT, YfiO, NlpB et SmpA, conduit à une altération de la membrane externe. Chez S. Enteritidis, nous avons montré que le rôle du complexe « YaeT » dans l’assemblage des protéines de membrane externe est conservé. Or, seule l’inactivation d’yfiO, conduit une diminution de l’expression des TTSS. Nos travaux ont toutefois suggéré que le défaut d’assemblage des protéines de membrane externe n’est pas la cause de ce défaut d’expression des TTSS observés chez les mutants yfgL et yfiO.
Résumé en anglais Salmonella, responsible for typhoid fever and gastroenteritis, is a worldwide health problem. Type three secretion system (TTSS) are crucial virulence factors in Salmonella. Our work showed that deletion of the open reading frame yfgL led to a transcriptional down-regulation of the genes encoding the proteins involved in the biosynthesis of the 3 TTSS in Salmonella Enteritidis. It was shown that inactivation of yfgL whose encoded protein is in complex with YaeT, YfiO, NlpB and SmpA in E. coli, causes an outer membrane alteration. In S. Enteritidis, we observed that the role of the “YaeT” complex in outer membrane protein assembly is conserved in S. Enteritidis. In addition, only yfiO inactivation resulted in a down-expression of the TTSS. However, we presented elements suggesting that the outer membrane protein targeting defect was not responsible for the TTSS down-expression observed in the yfgL and yfiO mutants.