Efficacy of alcoholic hand disinfectants againstmethicillin-resistant Staphylococcus aureus (MRSA)

Summary. In order to determine the efficacy of handdisinfectants based on alcohol against three MRSAstrains and 3 methicillin-susceptible S. aureus strains(MSSA), 1-propanol (60%) as well as Sterillium andSpitaderm were investigated in the quantitative suspen-sion test at various dilutions and reactions times (15, 30and 60 s). All undiluted disinfectants revealed reduc-tion factors > 6 against MRSA and MSSA after 30 s. Di-luted disinfectants (50%) were significantly less effec-tive against MRSA at short reaction times (15 s)(p < 0.05). Sterillium in a dilution of 50 % did not reach5 reduction factors against either MRSA or MSSA after30 s. The impact of an appropriate use of hand disinfec-tants in order to break chains of infections with MRSAis obvious.

Key words: MRSA – Hand disinfection – Propanol.

Zusammenfassung. Zur Bestimmung der Wirksamkeitalkoholischer Handedesinfektionsmittel gegenuber3 MRSA-Stammen im Vergleich zu 3 Methicillin-emp-findlichen Staphylococcus aureus -Stammen (MSSA)wurden 1-Propanol (60%) sowie Sterillium und Spita-derm in verschiedenen Verdunnungen und bei ver-schiedenen Einwirkzeiten (15 s, 30 s und 60 s) im quan-titativen Suspensionsversuch untersucht. In der An-wendungskonzentration war nach 30 s fur alle Praparateeine Keimreduktion von mehr als 6 log10-Stufen ge-genuber MRSA und MSSA nachweisbar. In Verdunn-ung (50 %) und bei kurzerer Einwirkzeit (15 s) wiesenalle Praparate signifikant niedrigere Reduktionsfakto-ren gegenuber MRSA auf (p < 0,05). Verdunntes Steril-lium (50 %) erreichte weder gegenuber MRSA nochgegenuber MSSA nach 30 s eine Keimreduktion vonmehr als 5 log10-Stufen. Die Bedeutung einer sach-gerechten Durchfuhrung der Handedesinfektion zurUnterbrechung von Infektketten mit MRSA wird deut-lich.

Schlusselworter: MRSA – Handedesinfektion – Propa-nol.

Methicillin-resistente Staphylococcus aureus -Isolate(MRSA) stellen insbesondere auf chirurgischen Statio-nen sowie operativen Intensivpflegestationen wegen ih-rer Tendenz zur Ausbreitung eine Gefahrdung, vor al-lem fur schwerkranke Patienten dar [3, 14, 23, 32, 34].Der Hauptubertragungsweg innerhalb des Kranken-hauses ist die transient besiedelte Hand des Personals[2, 14, 20]. Andere Ubertragungswege werden jedochauch fur moglich gehalten, z. B. uber die Schutzkleidungdes Personals [28], uber die unbelebte Umgebung [25]oder selten auch auf aerogenem Weg [9]. Die Isolierungdes infizierten oder kolonisierten Patienten gilt als diewichtigste Maßnahme zur Unterbrechung von Infekt-ketten [27]. Als ebenso bedeutsam ist die Desinfektionder Hande des Personals nach Tatigkeiten am Patientenzu bewerten [11, 14, 32]. In Deutschland werden zu die-sem Zweck vorwiegend Praparate auf alkoholischer Ba-sis verwendet [17]. Von manchen Bakterien ist beschrie-ben worden, daß Isolate mit phanotypischer Multiresi-stenz gegenuber Antibiotica eine reduzierte Empfind-lichkeit gegenuber Desinfektionsmitteln aufweisenkonnen [24, 30]. Im Vordergrund stehen hier vor allemUntersuchungen an gram-negativen Mikroorganismenwie Providencia stuartii [31], Proteus mirabilis [29] oderPseudomonas aeruginosa [22]. Auch bei MRSA ist dieMoglichkeit einer unwirksamen Handedesinfektion alsUrsache fur seine Verbreitung im Krankenhaus bei ei-nem Ausbruch diskutiert worden [10], obwohl die Be-deutung der reduzierten Empfindlichkeit von Desinfek-tionsmitteln gegenuber multiresistenten S. aureus furdie klinische Praxis der Infektionspravention sehr un-terschiedlich eingeschatzt wird [6, 8, 13, 21]. Ziel dervorliegenden Untersuchung war es deshalb, die Emp-findlichkeit von Methicillin-resistenten und Methicil-lin-empfindlichen Staphylococcus aureus -Isolaten ge-genuber alkoholischen Handedesinfektionsmitteln mit-einander zu vergleichen.

Chirurg (1997) 68: 264–270

Wirksamkeit alkoholischer Handedesinfektionsmittel gegenuberMethicillin-resistenten Staphylococcus aureus (MRSA)G.Kampf, R.Jarosch und H. Ruden

Institut fur Hygiene (Leiter: Prof. Dr. H. Ruden), Universitatsklinikum Benjamin Franklin, Freie Universitat Berlin

Springer-Verlag 1997

Material und Methodik

Testkeime

Es wurden 6 verschiedene Staphylococcus aureus -Stamme ver-wendet. Alle wurden anhand der Plasmakoagulasereaktion (Ka-ninchenplasma, bioMerieux Deutschland GmbH, Nurtingen) so-wie anhand des Clumping-Faktor-Nachweises (Staphaurex Plus,Murex Diagnostica GmbH, Burgwedel) als S. aureus identifiziert.Von diesen waren 3 gegenuber Oxacillin empfindlich (ATCC6538 sowie 2 klinische Isolate: Trachealsekret und Wundabstrich;alle mecA-Gen negativ), die 3 anderen Stamme waren gegenuberOxacillin resistent (ATCC 43300 sowie 2 klinische Isolate: Wund-abstriche; alle mecA-Gen positiv). Als MRSA-Stamme aus Patien-tenmaterial kamen nur solche in Betracht, die sowohl anhand derminimalen Hemmkonzentration (MHKL 256 mg/l) als auch an-hand der Populationsanalyse als homogen hochresistent gegen-uber Oxacillin einzustufen waren, d.h. die gesamte Keimpopula-tion war in der Lage, Oxacillin bis zu einer Konzentration von biszu 1000 mg/l zu uberleben. Die MHK der 2 ATCC Referenzstam-me waren wie folgt: MSSA (ATCC 6538): 0,094 mg/l; MRSA(ATCC 43300): 96 mg/l.

Desinfektionsmittel

Die Hauptversuche wurden mit 1-Propanol durchgefuhrt, da dieseSubstanz in vielen Anwendungspraparaten zur Handedesinfektionvorkommt und da sie in der Konzentration von 60 % (v/v) als Refe-renzsubstanz fur die Testung von Anwendungspraparaten gilt [4].1-Propanol wurde in reinster Form von Merck, Darmstadt, ver-wendet (Art. Nr.996). Zusatzlich wurden 2 Anwendungspraparategetestet: eine Kombination aus 2-Propanol (45%), 1-Propanol(30%) und Mecetroniumetilsulfat (0,2%) (Sterillium , Bode Che-mie, Hamburg) und eine Kombination aus 2-Propanol (70%),Chlorhexidindigluconat (0,5%) sowie Wasserstoffperoxid(0,45%) (Spitaderm , Henkel Hygiene GmbH, Dusseldorf). Ver-dunnungen der Reinsubstanzen und der Anwendungspraparatewurden mit Wasser standardisierter Harte (WSH; Harte des Was-sers: 17 ° dH; pH: 7,0) durchgefuhrt.

Inaktivierung

Zur Inaktivierung von 1-Propanol (maximale Konzentration:60%) wurde angenommen, daß eine 1 :10 Verdunnung in NaCl-Trypton-Losung ausreichend die baktericide Wirkung des Alko-hols beendet. Fur 6%igen 1-Propanol konnte im Vergleich mitWasser standardisierter Harte gezeigt werden, daß es selbst nacheiner Stunde Einwirkzeit zu keiner signifikanten Reduktion derAusgangskeimzahl kommt (n = 12; p = 0,875; T-Test fur unverbun-dene Stichproben, zweiseitig). Die Anwendungspraparate hinge-gen bestehen aus einem Gemisch von Wirkstoffen. Deswegen wur-de fur Sterillium und Spitaderm entsprechend den Richtliniender DGHM eine Prufung von Inaktivierungssubstanzen vorge-nommen. In 6 fachem Versuchsansatz erwies sich die Kombinationaus Tween 80 (3%), Cystein (0,1%), Histidin (0,1%) und Saponin(3%) als die wirksamste und wurde deswegen im ersten Rohrchender Verdunnungsreihen als auch bei den Filtrationsversuchen be-nutzt.

Quantitativer Suspensionsversuch

Zur Bestimmung der baktericiden Wirkung wurde der Quantita-tive Suspensionsversuch nach den Richtlinien der Deutschen Ge-sellschaft fur Hygiene und Mikrobiologie durchgefuhrt [4]. Dazuwurde aus einer 24-Std-Keimsuspension 0,1 ml in den Desinfekti-

onsmittelansatz (9,9 ml) pipettiert. Nach der Einwirkzeit (15 s,30 s bzw. 60 s) wurde 1 ml aus dem Reaktionsgefaß entnommenund einer Inaktivierungs- und Verdunnungsreihe zugefuhrt. Ausjeder der 4 Stufen dieser Verdunnungsreihe wurden zweimal0,1 ml auf TS-Agarplatten pipettiert und mit einem Glasspatelgleichmaßig verstrichen (Doppelkeimzahlbestimmung). Die Plat-ten wurden 48 Std bei 37 °C bebrutet, anschließend die Kolonie-zahl bestimmt und der Durchschnittswert berechnet. Paralleldazu wurde der gleiche Versuch mit Wasser standardisierter Harte(WSH) an Stelle des Desinfektionsmittels unter ansonsten glei-chen Bedingungen durchgefuhrt (Wasserkontrolle).

Bei manchen Konzentrationen und Einwirkzeiten wurde zurErweiterung der Nachweisgrenze zusatzlich eine Membranfiltra-tion durchgefuhrt. Dazu wurde das erste Rohrchen der Verdun-nungsreihe bzw. das gesamte Volumen des Desinfektionsmittel-Keim-Gemisches (nach Inaktivierung im 9fachen Volumen desAnsatzes) filtriert (Zellulose-Nitrat-Filter; Porengroße: 0,45 mm;Sartorius AG, Gottingen). Die Filter wurden mit einer sterilen Pin-zette auf eine TS-Agarplatte gelegt. Diese wurde 48 Std bei 37 °Cbebrutet und anschließend die Koloniezahl bestimmt. Bei einerKoloniezahl von „null“ in der letzten Filtrationsstufe war dieNachweisgrenze uberschritten. Zur Berechnung der baktericidenWirkung wurde deswegen eine Kolonie auf dem Filter angenom-men. Fur jeden Keim wurden fur jede Konzentration und Einwirk-zeit 6 Versuche durchgefuhrt.

Berechnung des Desinfektionserfolges

Fur den Desinfektionsmittelansatz eines jeden Versuches sowie furdie Wasserkontrolle wurde rechnerisch die verbliebene Keimkon-zentration nach der Einwirkzeit ermittelt. Von dieser wurde derlog10 berechnet. Zur Bestimmung der Reduktionsfaktoren (RF)wurde folgende Formel verwendet [4]:

RF = log10KBE(Ko) − log10KBE(D).

Hierbei stellt „KBE(Ko)“ die Keimkonzentration im Ansatz ohneDesinfektionsmittel dar (Wasserkontrolle), „KBE(D)“ beschreibtdie Keimkonzentration im Ansatz mit Desinfektionsmittel. Furdie Auswertung standen somit fur jeden der 6 Keime pro Desin-fektionsmittelkonzentration und Einwirkzeit 6 Reduktionsfakto-ren zur Verfugung.

Statistische Verfahren

Zur vergleichenden statistischen Auswertung wurde der T-Test furunabhangige Stichproben (zweiseitig) verwendet [1]. Ein p -Wert< 0,05 wurde als signifikant erachtet.

Ergebnisse

Reinsubstanz (1-Propanol)

Die MRSA-Stamme (n = 3) und die MSSA-Stamme(n = 3) wurden zusammengefaßt und als jeweils eineGruppe betrachtet. Die Mittelwerte der Reduktionsfak-toren sind fur jede der 3 Konzentrationen des 1-Propa-nol in Abb.1–3 dargestellt. 1-Propanol (60%) erwiessich schon nach 15 s Einwirkzeit mit mehr als 5 log-Stu-fen Keimreduktion als stark baktericid sowohl gegen-uber MRSA als auch gegenuber MSSA (Abb.1). Nach60 s Einwirkzeit war sowohl bei MRSA als auch beiMSSA die Nachweisgrenze erreicht (RFL 7,17). Einsignifikanter Unterschied zwischen MRSA und MSSA

G. Kampf et al.: Alkoholische Desinfektionsmittel gegenuber Methicillin-resistenten Staphylococcus aureus 265

wurde nach 15 s beobachtet (p = 0,032); nach 30 s(p = 0,054) und nach 60 s (p = 0,735) war kein signifi-kanter Unterschied feststellbar.

5 log-Stufen Keimreduktion durch 1-Propanol(40%) waren nach 15 s Einwirkzeit nur gegenuberMSSA nachweisbar (Abb.2) und nur 4 log-Stufen ge-genuber MRSA. Nach 30 und 60 s jedoch war sowohlgegenuber MRSA als auch MSSA eine Keimreduktionvon mehr als 5 log-Stufen zu beobachten. SignifikanteUnterschiede zwischen MRSA und MSSA wurdennach 15 s (p = 0,021) und 60 s (p = 0,018), jedoch nichtnach 30 s Einwirkzeit beobachtet (p = 0,524).

In der Konzentration von 30% erwies sich 1–Propa-nol gegenuber MRSA erst nach 60 s als ausreichendwirksam (> 5 log-Stufen Keimreduktion) (Abb.3). Ge-genuber MSSA wurden 5,2 log-Stufen Keimreduktion

schon nach 15 s nachgewiesen. Signifikante Unter-schiede zwischen MRSA und MSSA wurden nach 15 s(p = 0,005) und 30 s (p < 0,001) festgestellt, jedoch nichtnach 60 s (p = 0,267).

Betrachtet man die RF getrennt fur die einzelnenStamme, so ist eine gewisse Variabilitat zu beobachten.Exemplarisch wird dieses Phanomen fur 1-Propanol(60%) bei einer Einwirkzeit von 15 s dargestellt(Abb.4). Hier zeigten die 4 klinischen Isolate eine ahn-lich gute Empfindlichkeit gegenuber MRSA undMSSA, die Referenzstamme hingegen, insbesondereder MRSA-Referenzstamm (ATCC 43300), wieseneine deutlich reduzierte Empfindlichkeit gegenuber 1-Propanol auf.

Anwendungspraparate

In der klinischen Routine stehen in Deutschland Han-dedesinfektionsmittel auf alkoholischer Basis im Vor-dergrund [16, 17]. Deswegen wurden erganzend 2 An-wendungspraparate getestet, die haufig im Kranken-haus verwendet werden (Sterillium und Spitaderm ).Sie wurden sowohl in der Anwendungs- (100 %) alsauch in einer Verdunnungskonzentration (50%) gete-stet. Die Mittelwerte der Reduktionsfaktoren sind inden Tabellen 1 und 2 dargestellt.

In der Anwendungskonzentration (100 %) warenbeide Praparate schon nach 15 s Einwirkzeit (EWZ) so-wohl gegenuber MRSA als auch gegenuber MSSA starkbaktericid mit Reduktionsfaktoren > 6. Sterillium wargegenuber MRSA nach nur 15 s EWZ signifikantschlechter wirksam als gegenuber MSSA (p = 0,018).

Die auf 50% verdunnten Praparate waren deutlichschlechter wirksam. Sterillium beispielsweise erzieltegegenuber MRSA in der Verdunnung (50%) nach 15 seine Keimreduktion um 2,71 log10-Stufen, in der An-wendungskonzentration hingegen (100 %) waren6,57 log-Stufen erreicht worden. In der 50 %-Verdun-nung traten außerdem bei allen Konzentrationen undEinwirkzeiten signifikante Unterschiede zwischenMRSA und MSSA auf (pK 0,001), mit jeweils geringe-ren Reduktionsfaktoren fur MRSA.

Vergleich der Praparate Sterillium und Spitaderm

gegenuber MRSA

Nach 15 und 30 s EWZ waren hohe Reduktionsfaktorenbei beiden Praparaten gegenuber MRSA zu erzielen.Jedoch zeigte sich gegenuber MRSA ein signifikanterUnterschied zu Gunsten von Spitaderm (p < 0,001), so-wohl nach 15 als auch nach 30 s EWZ.

Diskussion

Ausbruche von MRSA-Infektionen in Krankenhausernwerden immer wieder beschrieben [35]. ChirurgischeStationen sowie operative Intensivstationen sind beson-ders betroffen [26]. Neben der Isolierung des infizierten

G.Kampf et al.: Alkoholische Desinfektionsmittel gegenuber Methicillin-resistenten Staphylococcus aureus266

Abb.1. Baktericide Wirkung von 1-Propanol (60 %) gegenuberMRSA und MSSA; Mittelwerte der RF (n = 18) mit 95% Cl

Abb.2. Baktericide Wirkung von 1-Propanol (40 %) gegenuberMRSA und MSSA; Mittelwerte der RF (n = 18) mit 95% Cl

Abb.3. Baktericide Wirkung von 1-Propanol (30 %) gegenuberMRSA und MSSA; Mittelwerte der RF (n = 18) mit 95% Cl

bzw. kolonisierten Patienten steht die hygienische Han-dedesinfektion nach Tatigkeiten am Patienten im Vor-dergrund, um Infektketten zu unterbrechen [15]. Vonmanchen multiresistenten nosokomialen Infektionser-regern ist eine verminderte Empfindlichkeit gegenuberDesinfektionsmitteln beschrieben worden [24]. Deswe-gen wurden die in Deutschland zur Handedesinfektionublichen alkoholischen Praparate hinsichtlich ihrerWirksamkeit gegenuber MRSA im Vergleich zu MSSAuntersucht.

1-Propanol (60%) sowie die AnwendungspraparateSterillium und Spitaderm zeigten in der vorliegendenIn-vitro-Untersuchung gegenuber MRSA schon nach15 s EWZ mit durchschnittlich mehr als 4 log-StufenKeimreduktion eine ausgezeichnete baktericide Wir-

kung. Zur hygienischen Handedesinfektion soll ein Pra-parat 30 s einwirken. Nach dieser EWZ war mit durch-schnittlich mehr als 6 log-Stufen eine noch starkereKeimdreduktion zu erzielen. Dabei wurden klinischeMRSA-Isolate ausgewahlt, die sich durch besondershohe Resistenz gegenuber Oxacillin auszeichneten(MHK > 256 mg/l). Diese homogen hochresistentenStamme zeichnen sich oft durch phanotypische Multire-sistenz gegenuber zahlreichen anderen Antibiotica ausund sind aus diesem Grund auf operativen Intensivsta-tionen besonders problematisch hinsichtlich der thera-peutischen Optionen. Eine sichere Unterbrechung derInfektkette ist hier besonders wichtig.

Im Vergleich zwischen MRSA und MSSA ließen sichvor allem bei Verdunnungen der Wirkstoffe sowie beikurzen EWZ hochsignifikante Unterschiede feststellen.Sterillium (50%) zeigte nach 30 s gegenuber MRSA3,8 log-Stufen Keimreduktion, gegenuber MSSA hinge-gen 5,0 (p < 0,001). Die Applikation des Handedesin-fektionsmittels auf die feuchte oder nasse Hand wird ge-genuber MRSA wahrscheinlich nur zu einer einge-schrankten Keimreduktion fuhren. Auch ist auf eineausreichende EWZ auf der Hand zu achten. Ist dieEWZ zu kurz, muß von einer Wirkungsminderung aus-gegangen werden, die bei MRSA im Vergleich zuMSSA wesentlich deutlicher ausfallt.

Als Ursache fur den signifikanten Wirkungsunter-schied kommt moglicherweise die vermehrte Bildungvon Penicillin-bindendem Protein 2a (pbp 2a) in Frage.Der Hauptmechanismus zur Resistenzauspragung beiMRSA ist die starke intracellulare Bildung eines alte-rierten Proteins (pbp 2a), welches sich durch eine deut-lich niedrigere Affinitat zu Penicillin- und Cephalospo-rinderivaten auszeichnet [33]. Dadurch werden hohereSattigungskonzentrationen fur die Antibiotica notwen-dig, die sich in der phanotypischen Resistenz außern[19]. Proteinelektrophoresen bei MRSA legen nahe,daß es bei manchen Isolaten zu einer sehr starken Bil-dung von pbp 2a kommen kann [5]. Das Wirkprinzipder Alkohole ist die Proteindenaturierung [18]. Die ein-geschrankte Wirkung alkoholischer Handedesinfekti-onsmittel auf der mit Eiweiß belasteten Hand (z. B.durch Blut) wird als Eiweißfehler bezeichnet. Mogli-cherweise ist die gegenuber MRSA nachgewiesene re-duzierte Wirkung von Alkoholen auf das pbp 2a zuruck-zufuhren.

Im Vergleich der beiden gepruften Handelspraparatewar die baktericide Wirkung von Spitaderm gegenuberder von Sterillium signifikant besser. Jedoch war beibeiden Praparaten schon nach 15 s Einwirkzeit eine aus-reichend starke Keimreduktion festzustellen. Diesestarke Sofortwirkung ist dem hohen Anteil von Propa-nol zuzuschreiben. Zur Aufrechterhaltung einer rema-nenten Wirkung auf der Hand enthalt das Spitaderm

zusatzlich Chlorhexidindigluconat (0,5%). Inwieweitdadurch eine erneute Besiedlung der Hand mit MRSAvermieden werden kann, ist hier nicht zu beurteilen.

Auch gegenuber MRSA haben alkoholische Hande-desinfektionsmittel eine ausgezeichnete Wirkung. DerKliniker kann sich somit auf die Wirksamkeit dieserPraparate verlassen. Der Patient wird sich darauf ver-

G. Kampf et al.: Alkoholische Desinfektionsmittel gegenuber Methicillin-resistenten Staphylococcus aureus 267

Abb.4. Reduktionsfaktoren von 1-Propanol (60%) gegenuber6 S.-aureus -Stammen (Einwirkzeit: 15 s); Mittelwerte der RF(n = 6) mit Standardabweichung

Tabelle 1. Wirksamkeit von Sterillium (100 und 50%) gegenuberMRSA und MSSA; Mittelwerte der Reduktionsfaktoren (RF)(n = 18) zu verschiedenen Einwirkzeiten (15 und 30 s); T-Test furunabhangige Stichproben (zweiseitig)

Praparat EWZ [s] Mittelwert der RF± 95% Cl

p -Wert

MRSA MSSA

Sterillium 100% 15 6,57 ± 0,32 7,07 ± 0,21 0,01830 8,12 ± 0,16 8,24 ± 0,14 0,257

Sterillium 50% 15 2,70 ± 0,27 3,88 ± 0,52 0,00130 3,78 ± 0,19 4,96 ± 0,39 < 0,001

Tabelle 2. Wirksamkeit von Spitaderm (100 und 50%) gegen-uber MRSA und MSSA; Mittelwerte der Reduktionsfaktoren(RF) (n = 18) zu verschiedenen Einwirkzeiten (15 und 30 s); T-Test fur unabhangige Stichproben (zweiseitig)

Praparat EWZ [s] Mittelwert der RF± 95% Cl

p -Wert

MRSA MSSA

Spitaderm 100% 15 7,76 ± 0,14 7,78 ± 0,15 0,86530 8,78 ± 0,14 8,85 ± 0,07 0,407

Spitaderm 50% 15 5,23 ± 0,34 6,09 ± 0,26 < 0,00130 6,12 ± 0,18 7,14 ± 0,42 < 0,001

lassen mussen, daß das Personal im Krankenhaus diesewirksamen Desinfektionsmittel auch anwendet. Meh-rere Studien wiesen darauf hin, daß die Compliancebeim Krankenhauspersonal hinsichtlich der Hygieneder Hande schlecht ist [12]. Arzte fallen besonders ausdem Rahmen, obwohl sie eine Vorbildfunktion haben[7, 15]. Um MRSA-Epidemien im Krankenhaus einzu-dammen, werden sicher keine neuen Handedesinfekti-onsmittel benotigt. Eine hohere Compliance bei derHandedesinfektion, insbesondere beim arztlichen Per-sonal, wird weitaus mehr zur Eingrenzung von Infek-tionen mit MRSA im Krankenhaus beitragen konnen.

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Dr. G.KampfInstitut fur HygieneUniversitatsklinikum Benjamin FranklinFreie UniversitatHindenburgdamm 27D-12203 Berlin

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