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BIOspektrum | 02.12 | 18. Jahrgang

JENNIFER NEUMANN, NOREEN KLEIN, DIRK SCHNEIDER

INSTITUT FÜR PHARMAZIE UND BIOCHEMIE, UNIVERSITÄT MAINZ

Membrane proteins have complex structures containing multiple structur-al elements. Using the aquaglyceroporin GlpF of the bacterium Escherichiacoli as an example, we highlight individual steps and intermediates in theassembly pathway of a complex membrane protein. Folding of GlpFinvolves specific transmembrane helix-helix interactions, folding of individual domains and formation of re-entry loops, as well as assemblyof a GlpF tetramer, the physiological and functional protein state.

DOI: 10.1007/s12268-012-0154-3© Springer-Verlag 2012

ó Ein Viertel bis ein Drittel aller in einemOrganismus codierten Proteine ist mem-branständig. Etwa 60 Prozent aller aktuelleingesetzten Medikamente wirken an Mem-branproteinen [1], und Fehlfaltung von Mem-branproteinen kann zu schweren Erkran-kungen führen [2]. Doch trotz der funda-mentalen Bedeutung sind grundlegendeAspekte der Biosynthese, der Membraninte-gration, der Faltung, Dynamik und Funktion

von Membranproteinen bislang weitestge-hend unverstanden. Im Gegensatz zu lös-lichen Proteinen haben sich bisher nur weni-ge Studien mit der Faltung und thermodyna-mischen Stabilität von Membranproteinenbeschäftigt. Obwohl der Anteil aufgeklärterMembranproteinstrukturen weit hinter derZahl löslicher Proteine liegt, wurden dochgerade in den letzten zehn Jahren viele Struk-turen von Membranproteinen gelöst. Diese

wachsende Zahl an Informationen hat unserVerständnis zu den strukturellen Grundlagender Funktion von Membranproteinen signifi-kant erweitert und oft auch entscheidend ver-ändert. Vor zehn Jahren wurde z. B. noch all-gemein angenommen, dass α-helikale Mem-branproteine im Grunde Bündel mehr oderweniger idealer transmembranärer α-Helicessind [3]. Tatsächlich hat die wachsende Zahlan Membranproteinstrukturen aber klargezeigt, dass es auch innerhalb des Mem-branmilieus eine (zunächst unerwartete) aus-geprägte Vielfalt an Strukturelementen gibt.So zeigen viele transmembranäre α-Heliceskeine ideale Geometrie, α-Helices könnenMembranen nur halb durchspannen (re-entryloops), und es wurden sogar Helices gefun-den, die annähernd waagerecht in die Mem-bran eingebettet sind.

Lässt sich die Faltung von Membran-proteinen in Stufen beschreiben?Bereits vor über 20 Jahren wurde ein verein-fachendes Modell zur Faltung α-helikalerMembranproteine vorgeschlagen [4]. Nachdiesem Modell erfolgt die Proteinfaltung inzwei unabhängigen Stufen. In der ersten Stu-fe kommt es zunächst zur Insertion einzelner(idealer) α-Helices in eine Membran. In einemzweiten Schritt führt die Ausbildung spezifi-scher Interaktionen zwischen einzelnen Heli-ces zur Assemblierung eines vollständigen,funktionstüchtigen Proteins. Gemäß diesemZwei-Stufen-Modell stellen Interaktionen zwi-schen α-Helices einen Schlüsselaspekt beider Faltung α-helikaler Membranproteine dar.Bei der komplementären Packung zweier Heli-ces füllen durch Aminosäureseitenkettenbedingte „Ausbuchtungen“ auf einer Helix„Furchen“ auf der Oberfläche der anderenHelix, wodurch die Kontakte zwischen denHelices maximiert werden. Auf interagieren-den Helices können Interaktionsmotive vorkommen, die eine definierte Zusammen-lagerung ermöglichen, welche durch Was -serstoffbrückenbindungen, elektrostatischeWechselwirkungen, Van-der-Waals-Kräfte undDipol-Dipol-Wechselwirkungen stabilisiert

Membranproteinfaltung

Wie falten Membranproteine? –Schritt für Schritt!?

¯ Abb. 1: Strukturenoligomerer Membran-proteine. Gezeigtsind (von oben linksnach unten rechts)der Kaliumkanal KscA(PDB: 1BL8), dashumane Aquaporin 1(PDB: 1IH5), der niko-tinische Acetylcholin-rezeptor (PDB: 2BG9)und der Ammonium-transporter Amt-1(PDB: 2B2F). Die lei-tende Pore ist jeweilsdurch den schwarzenPunkt gekennzeich-net.

sein können. Außerdem können auch Mem-branlipide indirekt zur Interaktion von Heli-ces beitragen, indem sie Helices „zusammen-drücken“ und dadurch Protein-Lipid-Interak-tionen minimieren [5]. Das Zwei-Stufen-Modell wurde zu einer Zeit vorgeschlagen,als kaum Membranproteinstrukturen bekanntwaren, und es basiert auf der Annahme, dassα-helikale Membranproteine im Grunde Bün-del idealer α-Helices sind. Während dies füreinige Membranproteine klar gilt, hat sichjedoch herausgestellt, dass dieses Modell dieFaltung komplexer α-helikaler Membranpro-teine nur unzureichend beschreibt und einezu starke Vereinfachung der tatsächlichenGegebenheiten darstellt. Beispielsweise wur-den extramembranäre Regionen, die Mem-braninsertion peripherer Domänen, die Aus-bildung nicht-idealer membraninserierterSegmente, die Rolle von Kofaktoren und dieAusbildung oligomerer Strukturen in demModell nicht berücksichtigt. Die in den letz-ten Jahren veröffentlichten Membranpro-teinstrukturen haben gezeigt, dass vieleα-helikale Membranproteine als höher geord-nete Oligomere vorliegen (Abb. 1). In einigenFällen ist die Notwendigkeit zur Oligomeri-sierung intuitiv ersichtlich, so wird etwa imKscA-Kaliumkanal und im Acetylcholinre-zeptor die zentrale Pore im Zentrum desjeweiligen Oligomers gebildet. Im Gegensatzhierzu ist die Grundlage der Oligomerbildungbei Ammoniumstransportern und Aquapori-nen unklar.

Aquaporine bilden homotetramereStrukturenAquaporine sind hochselektive Transmem-brankanäle, welche den Fluss von Wasserüber zelluläre Membranen erleichtern [6].Aquaporine lassen sich in zwei Unterfamilieneinteilen: die echten, wasserleitenden Aqua-porine und die Aquaglyceroporine, deren Mit-glieder stereoselektiv auch die Diffusion klei-ner, ungeladener Moleküle, wie Glycerol undanderer linearer Polyalkohole, über die Mem-bran erleichtern. Das Aquaglyceroporin GlpFaus Escherichia coli, dessen Kristallstrukturbereits vor über einem Jahrzehnt geklärt wur-de [7], ist das bis heute wohl am besten unter-suchte Aquaglyceroporin.

Generell besitzen Aquaporine eine hoch-konservierte Struktur und sind aus sechsTransmembranhelices sowie zwei die Mem-bran halb durchspannende Helices aufgebaut,die zusammen ein rechtshändig angeordnetesHelixbündel bilden, in dessen Zentrum sichdie Kanalpore befindet. Alle Aquaporin-Mono-

mere weisen zwei repetitive Einheiten auf,die je drei Transmembransegmente enthal-ten und in einem Winkel von 180 Grad in derMembran orientiert sind (Abb. 2). Die N- undC-terminalen Domänen besitzen eine ver-gleichbare Tertiärstruktur, wodurch eine Pro-tein-interne „Quasi-Symmetrie“ mit zwei-zähliger Pseudo-Drehachse gegeben ist. Die-se bei allen Aquaporinen konservierte inter-ne Wiederholung ist womöglich auf die Dupli-kation eines Vorläufer-Gens zurückzuführen,welches für ein Protein mit dualer Trans-membran-Topologie codierte, das heißt, wel-ches in zweierlei Orientierung in die Mem-bran inserieren konnte (Abb. 2). Wie vieleandere α-helikale Membranproteine assozi-ieren auch Aquaporin-Monomere innerhalbbiologischer Membranen und bilden höhergeordnete Oligomere. Der Grund für dieHomotetramerisierung aller Aquaporine istjedoch bisher weitestgehend unklar, da dasMonomer die funktionale Einheit darstellenkönnte. Anhand des Aquaglyceroporins GlpFaus E. coli wurden in den letzten Jahren eini-ge Untersuchungen zur Faltung und Assem-blierung höher geordneter Membranproteinedurchgeführt [8–11].

Faltung/Entfaltung von GlpF: Strukturbildung in Stufen?Die Übertragung des Zwei-Stufen-Modells aufGlpF bedeutet, dass sich zunächst alle Trans-membranhelices in die Membran einlagernund lediglich über Linkerregionen lose mit-einander verbunden bleiben. Danach würdees zur Interaktion der „idealen“ Helices undzur Ausbildung des GlpF-Monomers sowiezur Ausbildung des GlpF-Tetramers kommen.Die Ausbildung des Tetramers würde dannbereits eine neue Stufe beschreiben und dasZwei-Stufen- zu einem Drei-Stufen-Modellerweitern. Aber GlpF besteht eben nicht nuraus idealen α-Helices! Wann bilden sich diere-entry loops aus, die die Membran nur halbdurchspannen? Und falten die pseudosym-metrischen Domänen unabhängig?

Verschiedene spektroskopische Untersu-chungen zur Entfaltung von GlpF haben erge-ben, dass die Entfaltung nicht als einfacher,zweistufiger Mechanismus verstanden wer-den kann, sondern vielmehr als ein vielstufi-ger Prozess mit (mindestens) einem tetra-meren, einem dimeren und einem monome-ren Zustand [11]. Während dimere (Ent-)Fal-tungsintermediate bei löslichen Proteinenschon häufig beobachtet wurden, ist GlpF daserste α-helikale Membranprotein, für das bis-her ein solches stabiles Intermediat beschrie-

ben wurde. Schon in früheren Studien konn-te gezeigt werden, dass der oligomere Zustanddie GlpF-Funktion beeinflusst und das Pro-tein allein in seiner tetrameren Form voll-ständig funktionsfähig ist [10]. Dies deutetdarauf hin, dass die Bildung des Tetramersentweder die Struktur der vier Einzelkanälebeeinflusst oder die Stabilität durch die Oli-gomerisierung erhöht wird. In Entfaltungs-studien wurde tatsächlich gezeigt, dass diedimere Zwischenstufe eine reduzierte Terti-ärstruktur besitzt, während die Sekundär-struktur des Proteins nicht beeinträchtigt zusein scheint [11]. Außerdem haben Studienzur in vivo-Stabilität eine erhöhte Abbauratevon monomerem im Vergleich zu tetrameremGlpF ergeben [10].

Basierend auf den strukturellen Informa-tionen und experimentellen Ergebnissen derletzten Jahre kann für das komplexe α-heli-kale Membranprotein GlpF ein Faltungsmo-

˚ Abb. 2: Mögliche Evolution des Aquapo-rins GlpF (nach [12]). Ein glpF-Vorläufer-Gencodierte für ein Protein mit dualer Topologie,welches in zweierlei Orientierung in dieMembran inserierte (A). Nach Genduplika-tion und unabhängiger Evolution der beidenGene, welche für die zwei Aquaporin-Unter-einheiten codierten (B), kam es durch Gen-fusion zur Ausbildung eines einzelnen Gens(C), sodass statt zwei unabhängigen Protein-Untereinheiten eine kontinuierliche Polypep-tidkette mit zwei Faltungs domänen syntheti-siert wurde.

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dell in mehreren Stufen diskutiert werden(Abb. 3): Nach Insertion der mehr oder weni-ger idealen α-Helices in die Membran wür-den in einer nächsten Stufe nicht das voll-ständige Monomer, sondern zunächst einzel-ne Domänen unabhängig ausgebildet werden.Die nächste konzeptionelle Stufe wäre dannals eine Art intramolekulare Heterooligome-risierung anzusehen, in der die beiden anti-parallelen GlpF-Domänen miteinander inter -agieren und es zur Bildung des Monomerskommt. Die die Domänen verbindende Schlei-fenregion übernimmt nach diesem Modell dieRolle des „Linkers“, der die Proteinhälften inräumlicher Nähe hält und sie in die für dieInteraktion richtige Position bringt. DurchAusbildung lokaler Strukturen wird eineMikroumgebung geschaffen, die nicht mehr(ausschließlich) durch die Lipidkomponenteder Membran bestimmt ist, und hier könnensich bei Membranproteinen Strukturelemen-te, wie etwa halb durchspannende Helices,ausbilden, was letztendlich zur vollständigenFaltung des Proteinmonomers führt. Jedochist die GlpF-Faltung hiermit noch nicht voll-ständig beschrieben, da – wie bereits erwähnt– das Tetramer die funktionale Form des Pro-teins darzustellen scheint. In der nächstenkonzeptionellen Stufe kommt es den Entfal-tungsstudien zufolge zur Bildung eines sta-bilen dimeren Faltungsintermediats. Danachfolgt schließlich die Bildung eines Dimerszweier Dimere und damit die Ausbildung deraktiven tetrameren GlpF-Form. Es ist denk-bar, dass sich auch hier noch lokal Struktur-elemente ausbilden, die letztendlich für dieFunktion des Monomers (im Tetramer) wich-tig sind.

Dieses Modell zur Faltung von GlpF (undanderer Aquaporine) geht weit über dasursprünglich vorgeschlagene Zwei-Stufen-Modell hinaus. Für GlpF konnte ein mehr-stufiger Prozess der (Ent-)Faltung experi-

mentell nachgewiesen werden. Bisher sinddie Grundlagen der Strukturbildung jedochnur bei sehr wenigen Membranproteinendetailliert untersucht, und der Weg vom (ent-falteten) Polypeptid zur komplexen Strukturwird bei jedem Membranprotein verschiedensein. Es kann auch immer nur eine konzep-tionelle Vereinfachung sein, die Proteinfal-tung in Stufen zu betrachten, und ein dyna-mischer Faltungsprozess wird hierdurchsicherlich nur unzureichend beschrieben. Die-se (bewusste) Vereinfachung erlaubt es aber,experimentell bestimmte Faltungsstufengezielt zu betrachten und wird sicher zur Cha-rakterisierung zusätzlicher Stufen führen.Auf diese Weise wird aus einer Faltung in(wenigen) Stufen, welche (postulierte) Fal-tungsintermediate darstellen, letztendlich derdynamische und komplexe vielstufige Fal-tungsweg eines Membranproteins beschrie-ben werden können.

DanksagungUnsere Arbeiten werden durch die DFG, dieStiftung Rheinland-Pfalz für Innovation und

den Forschungsschwerpunkt COMATT derUniversität Mainz gefördert. ó

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Korrespondenzadresse:Prof. Dr. Dirk SchneiderInstitut für Pharmazie und BiochemieJohannes Gutenberg-Universität MainzJohann-Joachim-Becher-Weg 30D-55128 MainzTel.: 06131-39-25833Fax: 06131-39-25348Dirk.Schneider@uni-mainz.de

¯ Abb. 3: Potenziel-ler Faltungsweg desAquaglyceroporinsGlpF mit postuliertenFaltungsintermedia-ten. Weitere Erklärun-gen im Text.

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AUTORENJennifer Neumann2006–2011 Studium derBiomedizinischen Chemiean der Universität Mainz.Diplomarbeit am Institutfür Pharmazie und Bioche-mie. Zurzeit Doktorandinbei Prof. Dr. Schneider.

Noreen Klein2006–2010 Studium des Chemie -ingenieurwesens an der HochschuleFresenius in Idstein. 2010 Diplom -arbeit am Institut für Biochemie derUniversität Frankfurt a. M. 2010–2011 Qualifikationsstudium an derUniversität Mainz. Seit 2011 Dokto-randin bei Prof. Dr. Schneider.

Dirk SchneiderJahrgang 1973. 1992–1997 Studium der Chemie und Biologie an der Universität Münster. 1997–2000 Promotion an der Universität Bochum. 2001–2002 Postdoc imDepartment für molekulare Biophysik und Biochemie der Yale University, New Haven,CT, USA, bei Prof. Dr. Engelman. 2003–2009 Juniorprofessor für Biochemie im Insti-tut für Biochemie und Molekularbiologie der Universität Freiburg. 2007 Habilitation inBiochemie und Molekularbiologie. Seit 2010 W3-Professor für Biochemie an der Uni-versität Mainz.