Western blotting, Western blotting, inmunoblotting o SDS-PAGEinmunoblotting o SDS-PAGE

Tecnica para detectar proteinas especificas separadas por electroforesis utilizando anticuerpos marcados.

Secuencia del Western blotSecuencia del Western blotElectroforesis de la muestra con las proteinasElectroforesis de la muestra con las proteinas

Transferir las proteinas desde el gel a membrana de nitrocelulosaTransferir las proteinas desde el gel a membrana de nitrocelulosa

Coloracion de las proteinas para confirmar transferenciaColoracion de las proteinas para confirmar transferencia

Bloqueo de los sitios de union inespecificos remanentes en la Bloqueo de los sitios de union inespecificos remanentes en la membrana de nitrocelulosamembrana de nitrocelulosa

Incubacion con el anticuerpo especifico primarioIncubacion con el anticuerpo especifico primario

Lavados del anticuerpo no unido Lavados del anticuerpo no unido

Deteccion del anticuerpo unido utilizando anticuerpos conjugados Deteccion del anticuerpo unido utilizando anticuerpos conjugados a perroxidasa de rabano picante (HRP)a perroxidasa de rabano picante (HRP)

Revelado con sustrato quimioluminiscente y deteccion con placas Revelado con sustrato quimioluminiscente y deteccion con placas radiograficas radiograficas

Secuencia del Western blot – Paso 1Secuencia del Western blot – Paso 1Paso 1Electroforesis de las muestras de proteínas:

-Las proteínas se desnaturalizan con calor, SDS y sustancias como beta mercaptoetanol o ditiotreitol que rompen puentes -S-S--El SDS aporta cargas negativas-Las proteínas corren hacia el ánodo (+) y se distribuyen en el gel de acuerdo a su peso molecular

Proteínas ya corriendo en el gel

Fuente de poder

Muestra de proteínas para cargar en el gel

Secuencia del Western blot – Paso 2Secuencia del Western blot – Paso 2Paso 2 - Transferencia a la membrana de nitrocelulosa:-Las proteínas separadas por tamaño se transfieren desde el gel a una membrana de nitrocelulosa-Otra vez se aprovecha la carga negativa de las proteínas

Cassette listo para iniciar transferenciaArmado del cassette de transferencia

El gel con las proteínas se coloca en el cassette de transferencia

Se quitan las burbujas para asegurarla correcta transferencia

Se detiene la corrida electroforeticaSe desarma con cuidado la cuba electroforetica para liberar

el gel con las proteinas separadas por masa

Paso 3Incubación con anticuerpos específicos y revelado:

Proteína sobre la membrana

Bloqueo de los sitios no ocupados en la membrana con proteína inerte (ej. Albúmina)

Incubar con anticuerpo primario

Incubar con anticuerpo secundario marcado con HRP

Incubar con sustrato especifico

Proteína de interes se ve como una banda oscura

Revelado quimioluminiscente

Paso 4Revelado y análisis:

Fundamento de la tecnica de revelado quimioluminiscenteFundamento de la tecnica de revelado quimioluminiscente

-El anticuerpo secundario estamarcado con HRP (peroxidasa)que en presencia de agua oxigenada degrada el luminol con emisión de luz

-La emisión de luz (fotones)se revela en oscuridadsobre una placa radiográfica sensible a la luz

-Las bandas se obtienen en el filmen la misma posición dondese encontraba la proteína

-Alta sensibilidad

Existen otras tecnicas de revelado de WBExisten otras tecnicas de revelado de WB

sustratosustrato enzimaenzima H2O2H2O2 productoproducto

coloreadocoloreado

quimioLumquimioLum ObsObs

luminolluminol HRPHRP sisi nono sisi muy sensiblemuy sensible

3,3´diaminobencidina3,3´diaminobencidina HRPHRP sisi marrónmarrón nono toxicotoxico

DAB+niquelDAB+niquel HRPHRP sisi negronegro nono toxico, mas toxico, mas sensible que sensible que

DABDAB

3,3´,5, 5´ 3,3´,5, 5´ tetrametilbencidinatetrametilbencidina

HRPHRP sisi azulazul nono producto producto semisolublesemisoluble

4 cloro naftol4 cloro naftol HRPHRP sisi azul-negroazul-negro nono poco poco sensiblesensible

Bromocloroindolil Bromocloroindolil fostato +NBTfostato +NBT

FALFAL nono azulazul nono reaccion reaccion lenta y lenta y

progresivaprogresiva

Naftol-AS-MX fosfato Naftol-AS-MX fosfato + Fast red+ Fast red

FALFAL nono rojorojo nono poco poco sensiblesensible

AP/misty purpleAP/misty purple FALFAL nono purpurapurpura nono muy establemuy estable

HRP = peroxidasa / FAL = fosfatasa alcalina

Utilizacion de WB en la clinica: Utilizacion de WB en la clinica: Confirmacion de diagnostico de HIVConfirmacion de diagnostico de HIV

Commercial Methods in Clinical Microbiology. 2000. ASM Press.

env gp160gp120gp 41

gag p55p18p24

pol p65p51p31

-Se corren proteínas de HIV

-Se transfieren a nitrocelulosa

-Se incuba la membrana con suerodel paciente

-Se revela con anticuerpos secundarios

Utilizacion de WB en la clinica: Utilizacion de WB en la clinica: Confirmacion de diagnostico de HIVConfirmacion de diagnostico de HIV

env gp160gp120gp 41

gag p55p18p24

pol p65p51p31

Criterio de la OMS:

-Negativo: Ninguna banda presente-Positivo: Dos bandas ENV presentes-Indeterminado: Cualquier banda que no alcance criteriode positividad

Utilizacion de WB en la clinica: Utilizacion de WB en la clinica: Confirmacion de diagnostico de HIVConfirmacion de diagnostico de HIV

Seroconversion de un pacienteSeroconversion de un paciente

gp160/120

p66p55/51gp41

p32

p24

p17