western blot1

KHOA KHOA HỌC NÔNG NGHIỆP TRƯỜNG ĐẠI HỌC CỬU LONG LỚP: CÔNG NGHỆ SINH HỌC

GVHD : Ts. Bùi Chí Bảo

NHÓM 5

HỌ VÀ TÊN MSSV

NGUYỄN THỊ HẰNG 10.033.014

HUỲNH TRÚC LINH 10.033.025

NGUYỄN THỊ NHUNG 10.033036

LA PHƯƠNG THÙY 10.033.043

DƯƠNG THỦY TIÊN 10.033.044

DƯƠNG MINH TRIỀU 10.033.048

KHÁI NIỆM KHÁI NIỆM I

KẾT LUẬNKẾT LUẬNV

QUI TRÌNHQUI TRÌNHII

Nội dungNội dungNội dungNội dung

1 Chuẩn bị mẫu

2 Chạy điện di 1 chiều với SDS page

3 Chuyển protein từ gel đến màng

5 Phát hiện và phân tích hình ảnh

4 Lai với antibody

HỆ THỐNG V3 WESTERN WORKFLOWTM HỆ THỐNG V3 WESTERN WORKFLOWTM III

ỨNG DỤNG ỨNG DỤNG IV

• Western blot là kĩ thuật xét nghiệm protein trên polyacrylamide gel chuyển đến môi trường bền vững hơn và cố định

• Là kỹ thuật lai giữa protein với protein(giữa kháng nguyên với kháng thể) protein kháng nguyên được phát hiện qua phản ứng tạo màu hoặc phát huỳnh quang

Western blot bằng cách sử dụng một kháng thể nhận ra các protein được sửa đổi với lipoic acid.

Mẫu có thể được lấy từ mô thực vậtđộng vật, bằng cách cắt ra thành nhiều mảnh nhỏ. Chúng ta cho thêm cát và dung dich đệm để ly trích ( thể tích tùy vào số lượng mẫu).

1. Chuẩn bị mẫu

* Lysis buffer chứa:Sodium hydroxide (NaOH): giúp phá vỡ các thành tế bàoSodium Dodecyl Sulfate (SDS): hòa tan màng tế bào Tris, pH 7.5 → nó sẽ phá vỡ các liên kết hydro giữa các base DNA, SDS cũng làm biến tính phần lớn các protein trong các tế bào, giúp tách các protein từ các plasmid sau trong tiến trình.

Thêm các loại chất tẩy rửa, muối và các dung dịch đệm có thể được sử dụng để ly giải tế bào và hòa tan protein.

II. Qui trình

Thêm các loại chất tẩy rửa, muối và các dung dịch đệm có thể được sử dụng để ly giải tế bào và hòa tan protein.Chất ức chế Protease và phosphatase được thêm vào để ngăn chặn sự tiêu hóa của mẫu bởi các enzyme của riêng mình. Chuẩn bị mô thường được thực hiện ở nhiệt độ lạnh để tránh làm biến tính protein và suy thoái. Và một sự kết hợp của kỹ thuật sinh hóa và cơ khí - bao gồm các loại lọc và ly tâm.


a. lysis bộ đệmĐể chuẩn bị mẫu để chạy trên gel, các tế bào và mô cần phải được ly giải để giải phóng protein quan tâm.

b. Chất ức chế protease và phosphataseNgay sau khi ly giải xảy ra, dephosphorylation phân giải protein, và biến tính bắt đầu. Những biến cố này có thể bị chậm lại rất nhiều nếu mẫu được lưu giữ trên băng hoặc ở 4°C ở tất cả các thời gian và chất ức chế thích hợp được thêm tươi để lysis đệm.


Phổ biến nhất của điện di gel sử dụng gel polyacrylamide và bộ đệm được nạp với SDS.

SDS (sodium dodecylsulfate): là một chất khử amionic gây biến tính protein bằng cách bao quanh bộ khung polypeptide khiến các phân tử duỗi thẳng ra

Hỗn hợp protein được hòa tan trong dung dịch sodium dodecyl sulfate (SDS), một chất tẩy mang điện tích âm sẽ phá tất cả các nối không cộng hóa trị của protein ban đầu

2.Chạy điện di 1 chiều

Điện tích âm có được do gắn với SDS lớn hơn rất nhiều điện tích của bản thân protein ban đầu; vì thế điện tích ban đầu của protein không ảnh hưởng đáng kể đến điện tích của phức hợp. Phức hợp SDS-protein sau đó sẽ là mẫu để chạy điện di. Sau đó các mẫu được nạp vào các giếng trong gel.


Khi điện di kết thúc, những protein trên gel sẽ được nhìn thấy là một dãy các băng bằng cách nhuộm với bạc hay một chất nhuộm màu như Coomassie blue.

Độ phân giài của SDS- Page là rất rất lớn, các phức hợp được tách thành hàng trăm vết băng trên gel.

3. Chuyển protein từ gel đến màngĐể các protein có thể vào để phát hiện kháng thể, các protein được chuyển từ trong gel lên một màng nitrocellulose hoặc polyvinylidene difluoride (PVDF ).

Phương pháp chính để chuyển các protein và sử dụng một dòng điện để kéo protein gel vào PVDF hoặc màng nitrocellulose

Các protein di chuyển từ bên trong gel lên màng. Một phương pháp chuyển bao gồm việc đặt một màng trên gel, và một chồng giấy lọc. Ngăn toàn bộ được đặt trong một dung dịch đệm nó di chuyển lên giấy bằng cách mao dẫn, đưa các protein với nó

protein trên màng nitrocellulose hoặc PVDF

Trong thực tế phương pháp này không được sử dụng vì nó mất quá nhiều thời gian; electroblotting được ưa thích.kết quả của hai quá trình "thấm", các protein được tiếp xúc trên bề mặt một lớp mỏng để phát hiện. Cả hai màng tế bào được lựa chọn cho các thuộc tính cụ thể không protein ràng buộc(tức là liên kết tất cả các protein tốt như nhau).

Protein ràng buộc dựa trên tương tác kỵ nước, cũng như tính tương tác giữa các màng tế bào và protein. Màng nitrocellulose rẻ hơn so với PVDF, nhưng mỏng manh hơn và không đứng lên cũng probings lặp đi lặp lại.

3. Chuyển protein từ gel đến màng

Tính đồng nhất và hiệu quả tổng thể của chuyển protein từ gel màng có thể được kiểm tra bằng cách nhuộm màng với coomassise Brilliant Blue hoặc S thuốc nhuộm ponceau. Ponceau S là phổ biến hơn của hai, do độ nhạy cao hơn và độ hòa tan nước, sau này làm cho nó dễ dàng hơn để sau đó destain và thăm dò màng

3. Chuyển protein từ gel đến màng

1. Các protein được chuyển sang màng lai nitrocellulose, giữ nguyên vị trí như đã phân tách trên gel.Rửa màng lai từ 5-10 phút trong dung dịch TBS.

2. Ủ trong dung dịch khóa.3. Sau rửa màng lai 2 lần TBS, 5-10 min cho mỗi lần rửa.4. Ủ màng lai đã cố định protein trong 1-2 giờ với một kháng thể sơ

cấp (primary antibody) với sự kích động nhẹ. Kháng thể sơ cấp là một kháng thể đặc hiệu, sẽ bám vào protein và tạo thành một phức hợp protein-kháng thể đối với protein quan tâm.

5. Sau rửa màng lai 2-6 lần với TTBS, 5-10 min cho mỗi lần rửa.6. Tiếp theo ủ màng lai với một kháng thể thứ cấp (secondary antibody)

có enzyme (alkalin phosphatase hoặc horseradish peroxidase) đi kèm trong 1 tiếng có sự kích động nhẹ..

4 Lai với antibody

7.Sau rửa màng lai 3-6 lần với TTBS, 5-10 min cho mỗi lần rửa.

8.Sau rửa màng lai lần cuối với TBS.

9.Tiếp tục ủ màng lai trong một hỗn hợp phản ứng đặc hiệu với enzyme. Nếu mọi việc đều diễn ra một cách chính xác sẽ phát hiện thấy các băng ở bất kỳ nơi nào có mặt phức hợp protein-kháng thể sơ cấp-kháng thể thứ cấp-enzyme hay nói cách khác là ở bất kỳ nơi nào có mặt protein quan tâm

9. Ðặt một phim nhạy cảm với tia X lên màng lai để phát hiện các điểm sáng phát ra do enzyme

Phương pháp phát hiện đo màu phụ thuộc vào ủ màng lai với một chất nền có khả năng phản ứng với các enzyme (như peroxidase ) được ràng buộc với các kháng thể thứ cấp.đó màng.

5 Phát hiện và phân tích hình ảnh

Phát hiện bằng đo màu

phản ứng này diễn ra bằng cách chuyển đổi thuốc nhuộm hòa tan thành một dạng không hòa tan của một màu sắc khác tủa thành các vết ngay bên cạnh các enzyme và qua xuất hiện vết trên màng

Phát triển của blot sau đó dừng lại bằng cách rửa đi những thuốc nhuộm hòa tan. Hàm lượng protein được đánh giá thông qua densitometry (cường độ vết là) hoặc quang phổ.

phát hiện bằng huỳnh quang

Các đầu dò gắn huỳnh quang được kích thích bởi ánh sáng và sự phát xạ kích thích sau đó được phát hiện bởi một photosensor như CCD máy ảnh được trang bị với các bộ lọc khí thải thích hợp chụp một hình ảnh kỹ thuật số và cho phép phân tích dữ liệu xa hơn như phân tích trọng lượng phân tử số lượng phân tử. Huỳnh quang được coi là một trong những phương pháp tốt nhất để định lượng, nhưng ít nhạy cảm hơn chemiluminescence

Phương pháp phát hiện Chemiluminescent phụ thuộc vào ủ màng lai với một chất nền sẽ luminesce khi tiếp xúc với reporter trên kháng thể thứ cấp. Ánh sáng sau đó được phát hiện bởi phim ảnh, và gần đây hơn bởi máy ảnh CCD chụp một hình ảnh kỹ thuật số. Những hình ảnh được phân tích bởi densitometry, đánh giá số lượng tương đối của nhuộm protein và định lượng các kết quả về mật độ quang học. Mới hơn phần mềm cho phép phân tích dữ liệu xa hơn như phân tích trọng lượng phân tử nếu các tiêu chuẩn thích hợp được sử dụng.

Phát hiện bằng phương pháp Chemiluminescent

Hệ thống máy chạy western blot của Biorad: V3 Western Workflow™

Các quy trình làm việc V3 đầy đủ kết hợp kỹ thuật truyền thốngvới công cụ sáng tạo, chẳng hạn như TGX Stain ™ đúc sẵn gel,Trans-Blot ® Turbo hệ thống ™, và ChemiDoc ™ MP màn hình,để nhanh chóng kiểm tra kết quả điện di và chất lượng chuyển giao trước khi đến western blotting, đơn giản hóa phân tích, định lượng protein để có được kết quả nhanh hơn.

Bio-Rad's V3 Western Workflow là một phương pháp gồm năm bước để đơn giản quy trình western blotting.

- Mini-PROTEAN® TGX Stain-Free™ precast gels and Criterion™ TGX Stain-Free™ precast gels tách protein cao với thời gian chạy nhanh và sử dụng dung dịch đệm Tris_ glycine để chạy.TGX Stain-Free™ precast gels có chứa một công nghệ độc đáo được xây dựng vào hóa học gel cho phép nhanh chóng, chất lượng cao, tách biệt protein trong thời gian ít nhất là 15 phút.

1. Tách biệt Protein

2.Hình tượng hóa các protein

- Tách Protein ra có thể hình dung và xác nhận bằng cách sử dụng công nghệ miễn phí vết, covalently liên kết với protein, sau 1 phút kích hoạt trên một MP ChemiDoc màn hình. Điều này cho phép hình dung ngay được protein trên gel toàn bộ mà không cần nhuộm. Stain-công nghệ là một giải pháp thay thế tiết kiệm thời gian để nhuộm Coomassie truyền thống, cung cấp một quy trình làm việc sắp xếp hợp lý.

- Trans-Blot Turbo hệ thống là một protein bộ máy chuyển giao nhanh chóng có thể làm giảm các bước chuyển giao ít nhất là 3 phút, trong khi duy trì chuyển protein cao hiệu quả trên một loạt các khối lượng phân tử.

- ChemiDoc MP màn hinh kết hợp vớicông nghệ bẩn miễn phí cho phép xác minh ngay lập tức chuyểnprotein.

3. Chuyển protein

4.Xác minh chuyển giao protein

Bình thường hóa cho protein tổng số, tước và reprobing là không còn cần thiết. Phần mềm hình ảnh phòng thí nghiệm cho kết quả định lượng thay vì bình thường hóa tương đối.

5.Validate và quantitate

Các màn hinh ChemiDoc MP và hình ảnh phòng thí nghiệm phần mềm ™ có thể được sử dụng để xác nhận dữ liệu phương Tây thấm qua bình thường hóa protein tổng số kết hợp với protein vệ sinh.

IV. ỨNG DỤNG CỦA KỸ THUẬT WESTERN BLOT

Xác định sự hoạt động của gen thông qua sự có mặt của protein trong mô. Đánh giá mức độ hoạt động mạnh yếu của gen mục tiêu Xác định độ lớn của gen mục tiêu. Nhận dạng protein mục tiêu. Phân tích cây trồng chuyển gen. Đánh giá tính chuyên biệt của antibody. Phân tích bệnh do vi khuẩn và virus gây ra. Phân tích sự phát triển của thực vật.

ww

w.th

em

eg

alle

ry.com

Co

mp

an

y Lo

go

Các thử nghiệm khẳng định HIV sử dụng một western blot để phát hiện kháng thể chống HIV trong một mẫu huyết thanh của con người.

Một số hình thức của bệnh Lyme thử nghiệm sử dụng Western blot.

Western blot cũng có thể được sử dụng như một thử nghiệm xác minh về nhiễm viêm gan B.

Ứng dụng Western blot trong y tế:

1 3

Các protein sau đó được chuyển giao cho một màng, nơi đang thăm dò (phát hiện) bằng cách sử dụng các kháng thể đặc hiệu với protein.

Sử dụng điện di gel để tách các protein có nguồn gốc biến tính bằng chiều dài của chuỗi polypeptide hoặc bởi cấu trúc 3-D của protein.

2

V. KẾT LUẬN

Western blot là một kỹ thuật phân tích được sử dụng rộng rãi để phát hiện các protein cụ thể trong các mẫu.

4 6

Western blot còn được sử dụng trong các lĩnh vực sinh học phân tử, hóa sinh, immunogenetics và các ngành sinh học phân tử khác.

Phương pháp này cho phép sự tách biệt của tất cả các protein tế bào trên một gel lớn.lợi thế lớn của phương pháp này là nó thường phân biệt giữa các đồng dạng khác nhau của một loại protein cụ thể.

5

V. KẾT LUẬN

Western blot cho phép các nhà nghiên cứu xác định trọng lượng phân tử của protein và để đo số lượng tương đối của protein trong các mẫu khác nhau.

ww

w.th

em

eg

alle

ry.com

Co

mp

an

y Lo

go

http://www.scbt.com/protocol_western_immuno_blotting.html

http://en.wikipedia.org/wiki/SDS-PAGE

http://www.bio-rad.com/prd/en/SG/adirect/biorad?ts=1&cmd=BRCatgProductDetail&vertical=LSR&catID=M08HIB15

http://www.wattpad.com/371606-c%C3%B4ng-ngh%E1%BB%87-dna-t%C3%A1i-t%E1%BB%95-h%E1%BB%A3p-c%C3%B4ng-ngh%E1%BB%87-sinh-h%E1%BB%8Dc?p=85

western blot1

Documents