Εισαγωγή

Ο ιός του κίτρινου καρουλιάσματος των φύλλων της τομάτας (Tomato

yellow leaf curl virus, TYLCV) (Γένος Begomovirus, Οικογένεια

Geminiviridae), αποτελεί την πιο διαδεδομένη ιολογική ασθένεια της

τομάτας στην Κύπρο. Στη φύση μεταδίδεται αποκλειστικά με τον αλευρώδη

του καπνού Bemisia tabaci Gennadius (Εικόνα 1Α) κατά έμμονο τρόπο.

Προκαλεί χαρακτηριστικά συμπτώματα στην τομάτα που αφορούν νανισμό

των φυτών, κίτρινο καρούλιασμα, μεσονεύρια χλώρωση και παραμόρφωση

των φύλλων (Εικόνες 1Β και 1Γ). Εκτός από την τομάτα που θεωρείται ο

κύριος ξενιστής του ιού, προσβάλλει αρκετά άλλα καλλιεργούμενα και

αυτοφυή φυτικά είδη. Στο πλαίσιο μιας εκτεταμένης μελέτης που έγινε στην

Κύπρο στα μέσα της δεκαετίας του 1980, ο ιός αναφέρθηκε σε 8 είδη

ζιζανίων από τέσσερεις βοτανικές οικογένειες (1).

Αντικείμενο της εργασίας ήταν η ανάπτυξη σύγχρονων τεχνικών για

τη διάγνωση του TYLCV και η χρησιμοποίηση τους για την ανίχνευση του

σε ζιζάνια που αποτελούν εναλλακτικούς ξενιστές στην Κύπρο. Παράλληλα,

έγινε σύγκριση της ευαισθησίας ανίχνευσης με άλλες εργαστηριακές

μεθόδους.

Βιβλιογραφία

(1). Ioannou, N., Kyriakou, A. & Hadjinicolis A. 1987. Host range and natural

reservoirs of TYLCV. Agricultural Research Institute, Technical Bulletin 85.

(2). Papayiannis, L.C., Iacovides, T.A., Katis, N.I. & Brown, J.K. 2010.

Differentation of TYLCV and TYLCSV using real-time TaqMan PCR. Journal of

Virological Methods, 165: 238-245.

(3). Papayiannis, L.C., Harkou, I.S., Markou, Y.M., Demetriou, C.N & Katis, N.I.

2011. Rapid discrimination of ToCV and TICV and co-amplification of plant

internal control using TaqMan PCR. Journal of Virological Methods, 176: 53-59.

(4). Papayiannis, L.C., Katis, N.I., Idris A.M. & Brown, J.K. 2011. Weed hosts of

Tomato yellow leaf curl virus in Cyprus. Plant Disease, 95: 120-125.

Ζιζάνια ξενιστές του ιού του κίτρινου καρουλιάσματος των

φύλλων της τομάτας στην Κύπρο

Λ. Χ. Παπαγιάννης

Ινστιτούτο Γεωργικών Ερευνών, Τ.Θ. 22016, Λευκωσία 1516, Κύπρος E mail: lambros@ari.gov.cy

Αποτελέσματα - Συμπεράσματα

Τα αποτελέσματα έδειξαν ότι η TaqMan PCR που αναπτύχθηκε ήταν

1000 φορές πιο ευαίσθητη από τη συμβατική PCR, με δυνατότητα

ανίχνευσης της τάξης του 10-8 ng/μl. Αντίστοιχα, το εύρος ανίχνευσης της

συμβατικής PCR ήταν 10-5 ng/μl, ενώ της TAS-ELISA μόλις 1/10 (σε

αραιώσεις φυτικού χυμού μολυσμένης τομάτας με TYLCV) (Εικόνα 3) (4).

Η TaqMan PCR έδωσε τη δυνατότητα για ανίχνευση του TYLCV σε

49 είδη ζιζανίων (11,6%) από 15 βοτανικές οικογένειες. Αντίθετα, με τη

συμβατική PCR και την ELISA, ο ιός ανιχνεύτηκε σε λιγότερα είδη (43 και

14 αντίστοιχα), προφανώς λόγω μικρότερης ευαισθησίας ανίχνευσης

(Πίνακας 2) (4).

Πίνακας 2. Ζιζάνια που εντοπίστηκαν να είναι προσβεβλημένα με TYLCV σε φυσικές συνθήκες και

αποτελέσματα σύγκρισης της διάγνωσης τους με ELISA, συμβατική PCR και TaqMan PCR

Υλικά και Μέθοδοι

Κατά τα έτη 2007-2010, στις Επαρχίες Λεμεσού, Λάρνακας και

Πάφου πραγματοποιήθηκαν τυχαίες δειγματοληψίες 3976 ζιζανίων που

φύονταν εντός και δίπλα από υπαίθριες φυτείες τομάτας, οι οποίες

παρουσίαζαν συμπτώματα προσβολής του TYLCV σε υψηλά ποσοστά (80-

100%). Έγινε αναγνώριση των φυτικών ειδών και εξαγωγή DNA από τους

φυτικούς ιστούς. Για την ανίχνευση του ιού όλα τα δείγματα ελέχθησαν με

την ορολογική δοκιμή TAS-ELISA, τη συμβατική PCR, καθώς και τη PCR

πραγματικού χρόνου (TaqMan PCR) που αναπτύχθηκε στην παρούσα

εργασία (Εικόνα 2) (2). H TaqMan PCR χρησιμοποιεί ειδικούς ανιχνευτές

έναντι του TYLCV, καθώς και γενικούς ανιχνευτές εσωτερικού ελέγχου, για

τη διάγνωση του γονιδίου mtCOX από όλα τα φυτικά είδη (3). Από όλα τα

θετικά δείγματα έγινε προσδιορισμός της νουκλεοτιδικής αλληλουχίας για

επιβεβαίωση της παρουσίας του ιού. Τέλος, έγινε σύγκριση της αναλυτικής

ευαισθησίας μεταξύ ορολογικών και μοριακών δοκιμών ανίχνευσης του

TYLCV.

Οικογένεια

Φυτικό είδοςΑ Κωδικός NCBI Β Θετικά/ΣυνολοΓ ELISAΔ PCRΕ TaqMan PCRΖ

Amaranthaceae Amaranthus retroflexus FR682583 2/63 - ++ 26

Amaranthus viridis FR682584 6/48 - ++ 27

Amaranthus graecizans FN822919 8/52 - ++ 28

Chenopodiaceae Chenopodium album FR682585 12/62 - + 29

Chenopodium murale FN822920 9/51 - + 29

Compositae Asteriscus aquaticus FR682586 10/45 1.2 ++ 19

Calendula arvensis FN822921 37/137 1.3 +++ 17

Chrysanthemum coronarium FR682587 12/66 - ++ 21

Chrysanthemum segetum FR682588 6/46 - ++ 18

Conyza bonariensis FR682589 5/35 - ++ 25

Matricaria recutita FN822922 9/56 - + 27

Onopordum cyprium FR681783 2/13 - - 31

Silybum marianum FR681784 3/18 - - 28

Sonchus asper FR682590 9/31 - ++ 23

Sonchus oleraceus FN822923 14/87 - ++ 25

Sonchus tenerrimus FR682591 2/20 - ++ 22

Urospermum picroides FR682592 8/25 1.1 ++ 20

Convolvulaceae Convolvulus arvensis FN822924 16/76 - +++ 19

Convolvulus humilis FR682593 8/45 - +++ 21

Cuscuta spp. FR682594 2/7 - + 23

Cruciferae Hirschfeldia incana FR682595 1/21 - ++ 24

Raphanus raphanistrum FR682596 18/79 - ++ 22

Raphanus sativus FR682597 6/18 - ++ 25

Sinapis alba FN822925 12/61 1.1 ++ 21

Sinapis arvensis FR682598 11/81 1.3 ++ 24

Euphorbiaceae Chrozophora tinctoria FN822926 2/17 - ++ 22

Euphorbia helioscopia FR681785 4/20 - - 30

Mercurialis annua FR681788 1/7 - - 29

Geraniaceae Erodium ciconium FR682599 2/24 - ++ 25

Erodium cicutarium FR682600 1/19 - ++ 28

Leguminoseae Lotus edulis FR682601 5/26 - + 30

Lotus halophilus FR682602 8/39 - + 29

Scorpiurus muricatus FR682603 14/81 - ++ 24

Malvaceae Lavatera cretica FR682604 3/26 0.4 ++ 26

Malva cretica FR681786 8/54 - - 28

Malva neglecta FR682605 30/178 0.6 ++ 25

Malva nicaeensis FR682606 22/151 0.6 ++ 26

Malva parviflora FN822927 19/131 0.4 ++ 29

Malva sylvestris FR682607 11/81 0.3 ++ 27

Orobanchaceae Orobanche ramosa FR682608 3/17 - + 26

Plantaginaceae Plantago lagopus FR682615 4/37 - ++ 23

Plantago major FR682609 8/45 - ++ 20

Primulaceae Anagallis arvensis FR682610 16/82 - + 27

Solanaceae Datura innoxia FR682611 5/12 1.7 +++ 18

Datura stramonium FR682612 18/41 1.6 +++ 16

Solanum nigrum FN822928 28/137 1.9 +++ 18

Solanum villosum FR682613 6/32 1.5 ++ 22

Umbelliferae Scandix pecten-veneris FR682614 6/33 - ++ 25

Urticaceae Urtica urens FR681788 9/72 - - 31

Σύνολο 461/3976

Η υιοθέτηση σύγχρονων και ευαίσθητων τεχνικών έδειξε ότι

τουλάχιστον 40 νέα είδη ζιζανίων αποτελούν εναλλακτικούς ξενιστές του

TYLCV στην Κύπρο. Η συσχέτιση της παρουσίας συμπτωμάτων στα είδη

αυτά με την προσβολή από τον ιό δεν κατέστη δυνατή. Η παρουσία του

TYLCV στα ζιζάνια, είναι πιθανό να σχετίζεται με τη διατήρηση του

μολύσματος σε περιόδους κατά τις οποίες δεν καλλιεργούνται τομάτες (4).

Εικόνα 1A. Ο φορέας του TYLCV, αλευρώδης του καπνού B. tabaci. 1B. Νανισμός φυτού τομάτας

μολυσμένου με TYLCV. 1Γ. Συμπτώματα κίτρινου καρουλιάσματος των φύλλων τομάτας,

προσβεβλημένης με TYLCV

Α Τα είδη που αναφέρονται ως νέοι ξενιστές του ιού στην Κύπρο δίνονται με έντονη γραφή, Β Κωδικός καταχώρησης νουκλεοτιδικής

αλληλουχίας του TYLCV στη βάση δεδομένων NCBI. Γ Αριθμός προσβεβλημένων φυτών/Συνολικό αριθμό φυτών που ελέγχθηκαν. Δ

Αποτελέσματα ορολογικών δοκιμών. Δίνεται η μέση οπτική πυκνότητα στα 405 nm, ενώ το σημείο – σημειώνεται για τα δείγματα στα

οποία δεν ήταν δυνατή η ανίχνευση με ELISA. Ε Αποτελέσματα συμβατικής PCR. Τα πρόσημα αναφέρονται στην ένταση της ζώνης

ηλεκτροφόρησης που λήφθηκαν: - = μη εμφανής ζώνη, + = ασθενής ζώνη, ++ = εμφανής ζώνη, +++ = έντονη ζώνη. Ζ Αποτελέσματα

TaqMan PCR. Δίνεται ο μέσος όρος των κύκλων ανίχνευσης, Ct (Ο μικρότερος κύκλος αναφέρεται σε μεγαλύτερη ικανότητα

ανίχνευσης)

Εικόνα 3. Σύγκριση αναλυτικής ευαισθησίας μεταξύ

ορολογικών δοκιμών (TAS-ELISA) (Α) και μοριακών δοκιμών

(συμβατικής και TaqMan PCR) (Β) για την ανίχνευση του

TYLCV σε αραιώσεις φυτικού χυμού και ολικού DNA από

μολυσμένα φυτά τομάτας

1/1 1/10 1/100 1/1000

10-1 10-2 10-3 10-5 10-4 10-7 10-6 10-8

Συμβατική PCR

TaqMan PCR

Αραιώσεις DNA:

Α

Β

Έντα

ση

φθ

ορ

ισμ

ού

Κύκλοι ενίσχυσης (Ct)

Εικόνα 2. Διαδικασία μοριακής

ανίχνευσης του TYLCV στα

εργαστήρια Φυτοπαθολογίας του ΙΓΕ

Α Β Γ