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Dolznig VOTransla*onskontrolleCellSize Institut fürMedizinische Genetik

Helmut Dolznig VO Translationskontrolle: Cancer WS 2007/2008

mTOR und Cell Size

Helmut Dolznig Inst für Medizinische Genetik MedUniWien, Waehringer Srasse 10 Tel 4277 67502 | email [email protected]

VO TRANSLATIONSKONTROLLE

Helmut Dolznig, Teil 2


Helmut Dolznig VO Translationskontrolle: Signalling

S6 Kinase IV: Substrat rpS6

P-S6 aktiviert die Translation von 5‘ TOP-RNAs: ribosmale Proteine, Proteine der Translationsmaschinerie…

= FALSCH

5‘ TOP-RNAs

Experimente in Mäusen haben gezeigt, dass die P von S6 nichts an der Translation von 5‘ TOP RNAs ändert (rpS6-/- Mäuse mit S6P-/- knock in)

= translationell reprimiert in Zellzyklus arrest, AS starvation Translationell aktiviert bei Proliferationsinduktion und AS Zugabe


mTOR und Translation

control

Torin

2h

MEF

Ribosome profiling

Quantification of Ribosome protected mRNA fragments (Ribosome footprints, RF) by RNA Seq

AAAAAAAA

AAAAAAAA



mTOR Inhibition hemmt die Translation von 99.8% mRNAs (61% Reduktion) à stärkste Inhibition versus schlechteste Inhibition à 253 inhibierte versus 198 resistant

à Proteinsynthese Gene und ribosomale Proteine betroffen à Histon und IRES mRNAs resistent

à TOP und TOP like



4EBP1+2 KO

WT


eIF4G1



WT àIm Gegensatz zu anderen mRNAs, brauchen TOP mRNAs eIF4G1 um eIF4E am CAP zu verankern àselektive translationelle regulation durch 4E-BPs und mTORC1

Dolznig VOTransla*onskontrolleCellSize Institut fürMedizinische Genetik Helmut Dolznig VO

Translationskontrolle: Cancer WS 2007/2008

mTOR downstream targets: Phosphoproteom Anaylse



Zwei ursprünglich gleiche Zellkulturen werden mit unterschiedlichen Nährmedien kultiviert. Eine der Zellkulturen erhält im Medium nur Aminosäuren, die ein schweres Isotop tragen. Beispielsweise kann das Medium Arginin mit sechs 13C-Atomen enthalten, anstatt des üblichen 12C. Bei der Proteinbiosynthese werden die Proteine markiert. Dadurch sind in Folge alle Arginin-enthaltenen Peptide sechs Dalton schwerer als die nicht-markierten Peptide der anderen Zellkultur. Zur Analyse werden die Proteine beider Zellkulturen vereint und gemeinsam vermessen. Anhand der unterschiedlichen Massen können die markierten Peptide identifiziert werden. Die Verhältnisse der Signalintensitäten entsprechen den Mengenverhältnissen der Peptide.

SILAC (stable isotype labeling with AA)


light [12C6

14N2]Lys, [12C6

14N4]Arg DMEM

SILAC (stable isotype labeling with AA)

heavy [13C6

15N2]Lys, [13C6

15N4]Arg DMEM

TSC2-/- MEF TSC2-/- MEF

17h

2h rapamycin

lysis lysis

1:1 digestion

SCX-IMAC (Phosphopeptid Anreicherung)

LC-MS/MS


mTOR downstream targets: Phosphoproteom Anaylse


mTOR downstream targets


mTOR targets

GeneSymbol Annota.onMyo18a Isoform4ofMyosin-XVIIIaBrd2 Isoform2ofBromodomain-containingprotein26330577E15Rik UncharacterizedproteinC10orf78homologBest3 Bestrophin-3Larp1 Isoform1ofLa-relatedprotein1Fam62c Isoform1ofExtendedsynaptotagmin-3Mdn1 MidasinhomologRtn4 Isoform2ofRe*culon-4Pcdh24 Pcdh24proteinSynj1 similartomKIAA0910proteinZfp318 zincfingerprotein318isoform1Akt1s1 Proline-richAKT1substrate1Alpk3 myocyteinduc*ondifferen*a*onoriginatorZc3h14 Isoform2ofZincfingerCCCHdomain-containingprotein14Edc4 Isoform1ofEnhancerofmRNA-decappingprotein4Srrm2 Isoform3ofSerine/argininerepe**vematrixprotein2Kif20b Isoform1ofM-phasephosphoprotein11110007A13Rik UPF0557proteinC10orf119homologPi4k2a Phospha*dylinositol4-kinasetype2-alphaTop2b DNAtopoisomerase2-betaBC021381 Isoform2ofUncharacterizedproteinKIAA1931Bbx Isoform1ofHMGboxtranscrip*onfactorBBXVcl VinculinEif4ebp1 Eukaryo*ctransla*onini*a*onfactor4E-bindingprotein1Rrp15 RRP15-likeproteinD10Wsu102e UncharacterizedproteinC12orf45homologBraf Isoform1ofB-Rafproto-oncogeneserine/threonine-proteinkinaseAtg2b Isoform1ofAutophagy-relatedprotein2homologBNpm1 NucleophosminPcsk5 proproteinconvertasesub*lisin/kexintype5Mtap1b Microtubule-associatedprotein1BErcc6l DNAexcisionrepairproteinERCC-6-likeSerinc1 Serineincorporator1Klf3;LOC100046855 Krueppel-likefactor3Smarca4 Puta*veuncharacterizedproteinAak1 UncharacterizedproteinFLJ45252homologEif4ebp2 Eukaryo*ctransla*onini*a*onfactor4E-bindingprotein2Ndrg1 ProteinNDRG1Melk MaternalembryonicleucinezipperkinaseArhgef17 Isoform1ofRhoguaninenucleo*deexchangefactor17Grit Isoform2ofRho/Cdc42/RacGTPase-ac*va*ngproteinRICSMdc1 mediatorofDNAdamagecheckpoint1Nbb2 NF-kB2splicevariant4Pcm1 Isoform1ofPericentriolarmaterial1proteinMybbp1a Myb-bindingprotein1ASf3b1 Splicingfactor3Bsubunit1Atrx Transcrip*onalregulatorATRXCcdc88a Isoform2ofGirdinBaz1b Isoform1ofTyrosine-proteinkinaseBAZ1BNedd4l Isoform3ofE3ubiqui*n-proteinligaseNEDD4-like

Orc6l Originrecogni*oncomplexsubunit6Trp53bp1 Transforma*onrelatedprotein53bindingprotein1Map3k2 Mitogen-ac*vatedproteinkinasekinasekinase2Hectd2 Hectd2proteinUsp10 Ubiqui*ncarboxyl-terminalhydrolase10D830031N03Rik similartomKIAA0754proteinNck1 non-cataly*cregionoftyrosinekinaseadaptorprotein1Exosc9 ExosomecomplexexonucleaseRRP45Dap Death-associatedprotein1Rps6kb1 IsoformAlphaIofRibosomalproteinS6kinasebeta-1Lmna IsoformC2ofLamin-A/CSltm Isoform1ofSAFB-liketranscrip*onmodulatorSh3pxd2a Isoform1ofSH3andPXdomain-containingprotein2AFlnc Isoform1ofFilamin-COxr1 Isoform2ofOxida*onresistanceprotein1Rin2 Isoform1ofRasandRabinteractor2Nek9 Serine/threonine-proteinkinaseNek9Pebp1 Phospha*dylethanolamine-bindingprotein1Pop1 Processingof1ribonucleaseP/MRPfamilySerhl Serinehydrolase-likeproteinEpb4.1l3 Isoform1ofBand4.1-likeprotein3Hnrpll Isoform1ofHeterogeneousnuclearribonucleoproteinL-likeSamhd1 SAMdomainandHDdomain-containingprotein1Zfp828 Zincfingerprotein828Larp7 Isoform1ofLa-relatedprotein7Myc mycproto-oncogeneproteinMyo9a Isoform2ofMyosin-IXaGsk3b Glycogensynthasekinase-3betaZfp395 zincfingerprotein395Bend3 BENdomain-containingprotein3Akap12 Isoform1ofA-kinaseanchorprotein12Eif4g1 Isoform1ofEukaryo*ctransla*onini*a*onfactor4gamma1Eif4b Eukaryo*ctransla*onini*a*onfactor4BDock7 Isoform2ofDedicatorofcytokinesisprotein7Patl1 ProteinPAT1homolog1Slc7a11 Cys*ne/glutamatetransporterMyo9b Isoform1ofMyosin-IXbSetd2 SETdomaincontaining2Gphn GephyrinErf ETSdomain-containingtranscrip*onfactorERFSpnb2 Isoform2ofSpectrinbetachainbrain1Phip PH-interac*ngproteinSdpr Serumdepriva*on-responseproteinTcof1 TreacleproteinPwp1 Periodictryptophanprotein1homologRbl1 IsoformLongofRe*noblastoma-likeprotein1Eef1b2 Elonga*onfactor1-betaPhactr4 Isoform1ofPhosphataseandac*nregulator4C230081A13Rik Tyrosine-proteinkinase-proteinkinaseSgK269Ahnak2 Puta*veuncharacterizedprotein


mTOR downstream targets Pathway Analyse


mTOR consensus target site


Grb10


mTOR downstream targets


Cell Size and DNA content

Kidney Tubules

Organismus weiß wie groß er sein sollte, unabhängig von Zellgröße oder Anzahl der Zellen Wie wird die gesamte Zellmasse gemessen? Größe des Organismus abhängig von :

1. Hormonen (GH, IGF-1) 2. Nährstoffverfügbarkeit 3. Anzahl der Zellen: - Zellteilung - Zelltod 4. Zellgröße


Cell Size and Organs

Thymus

Spleen

intrinsic regulation of organ size

whole body regulates organ size


Cell Cycle

G1 S

G2 M

Replikation Synthese Phase

Gap 2

Gap 1

Mitose


Growth versus Proliferation

Proliferation, Cell division

Normaler Zellzyklus

Maintain cell size Growth and division

Growth, Mass Increase

Growth: Massenzunahme / Zeit Protein / Makromolekülzunahme: =mehr Synthese als Abbau Konzentration von Proteinen/ Makromolekülzunahme pro Volumen ändert sich nicht Volumszunahme = Massenzunahme = Growth


Ma

sse

/Vo

lum

en

Zeit

Langzeitproliferation braucht Massenzunahme


Growth = Prerequisite for Sustained Proliferation

Stetige Größenreduktion der Zellen bei jeder Teilung ->Proteinsynthese notwendig in Krebszellen

ansonsten:

No Mass Increase

Ma

sse

/ V

olu

me

n

Zeit


Growth versus Proliferation

Cell division in the absence of growth

Early embryonic divisions

Normal cell cycle

Maintain cell size Growth and division

Terminal erythropoiesis

Cell division at reduced growth


Proliferation, Cell division


Size during the cycle

POM1 (G2/M inhibitor)

S. cerevisiae S. pombe mammalian cells


Cln3 system Yeast

Start (checkpoint) spät in G1: S Phase Eintritt nur wenn kritische Größe erreicht =Anpassung an variiierende Nährstoffversorgung (sonst immer kleiner oder größer) CLN3 (cyclin D1 homolog) keine Trk Regulation im Zellzyklus upstream ORF ->trl Effizienz schwach, Keine Akkumulation unter Starvation Nährstoffüberschuß: mehr Ribosomen, effizientere Trl von Cln3 -> akkumuliert wenn Nährstoffmangel: dauert länger bis kritische Größe erreicht wird, längere G1 coupling of cell growth to division

CLN3

Nitrogen supply cAMP mTOR

removal of start codon in uORF of Cln3, no trl control any more increased S phase progression under poor growth conditions

Cln3-cdc28 SBF/MBF Cln1/2 Cln1/2-cdc28 budding DNA sytnhesis

G1 S

G2

Hefe hat Cell Size Checkpoint


Wiegen von Zellen (Suspended microchannel resonator (SMR))

à MESSUNG DES STATISCHEN AUFTRIEBS IN FLÜSSIGKEITEN


centrifugal force

counterflow

Centrifugal Elutriation: Principle


Elutriation

420 fl


Elutriation-Recultivation


“Age distribution”


Postmitotische Fibroblasten

à konstante Größe à Proteinsynthese an (wie unter Proliferationsbedingungen) à Proteinabbau mehr (hält sich die Waage mit Synthese)


IGF Pathway


Neuronal Size: NGF Signaling: Heterotypische Interaktion

Größe der postmitotischen Neuronen ist abhängig von der große des innervierten Organs (NGF levels)

Heterotypische Interaktion


Neuronal Size: NRG/ErbB2/3 Signaling: Heterotypische Interaktion

Größe der postmitotischen Schwannzellen ist abhängig vom Durchmesser des Axons <1 μm: keine myelination >1 μm: Myelinschichten abhängig von Durchmesser

mTORC1: biogenes Signal neg Feedback loop: Dlg1


Kidney tubule cell size: Mechanischer Einfluß auf die Zellgröße

Polycystische Nieren: Große renale tubulus zellen, keine Cilien Cilien: Urin Flußàkleinere Zellen, bessere Durchgängigkeit der Tubuli

mTORC1: biogenes Signal neg Feedback loop: LKB1


Muskelzellen

Training: Myozyten Hypertrophie Nichtgebrauch, Fasten: Atrophie 2 pathways: Anabol: IGF/PI3K/mTOR Katabol: Myostatin/Smad2/3 Muskelgröße: Balance der beiden Pathways Training: é mTORC1 Aktivität, (PI3K, Akt nicht invoviert), à Mechanosensoren à mehr Proteinsynthese, mehr Abbau; Synthese überwiegt


Model

Proliferation und Growth sind unabhängig voneinender aktivierbar In mitotisch wachsenden Zellen spielen sie jedoch zusammen


Literatur

Extracellular control of cell size. Ian J. Conlon et al, Nature Cell Biology, 3 (2001) 918 - 21 Size control in animal development. Conlon and Raff, Cell 96 (1999) 235-44 Does size matter. Wells, JCB 158 (2002) 1156-59 Checking cell size in yeast. Rupes. TiG 18 (2002) 479-85 Genetic control of cell size. Stocker and Hafen, COGD 10 (2000) 529-35 The coupling of cell growth to the cell cycle, COCB 13 (2001) 731-37 Mammalian cell size is controlled by mTOR and its downstream targets S6K1 and $EBP1/eIF4E, Fingar et al, GenesDev 16, 2002 Does phosphorylation of the cap-binding protein eIF4E play a role in translation initiation? Scheper and Proud Eur J Biochem. 2002 Nov;269(22):5350-9] Regulation of mammalian translation factors by nutrients. Proud. Eur J Biochem. 2002 Nov;269(22):5338-4


Zusammenfassung Cell Size

Organismusgröße, Organgröße =reguliert

Zellgröße wird durch DNA Gehalt beeinflußt

Cell Growth ist Massenzunahme/Zeit (Volumszunahme, Zunahme an Protein)

Growth (Massenzunahme) = Proliferation (Zellteilung)

Growth ist nicht unbedingt mit Proliferation gekoppelt

mTOR zentraler Knotenpunkt: Ser/Thr Kinase, großes Protein, Proteinbindungsdomänen

Zellgröße = beeinflußt durch Komponenten des upstream Translationssignallings

Growth = linear in Vertebraten (im Gegesatz zu Hefe: Growth = exponentiell)

Zellgröße wird gemessen:

in Hefe gibt es einen Cell size checkpoint in G1 (START)

in Vertebraten: Kontroverse: gibt es eine kritische Größe, die gemessen wird?

Checkpoint nicht unbedingt notwendig, weil lineares Wachstum

es gibt eine minimale kritische Größe, die erreicht werden muß, damit eine Zelle in S Phase gehen kann

(eigene Daten für hematopoietische Zellen und Fibroblasten)


Restriction Point

Nature Reviews Cancer1 (2001), 222-31


G1/S Transition



Growth <-> Division



Transgenes and KOs imn mouse and drosophila affecting cell size


Rat1 fibroblasts

• growth and proliferation distinct: p16, p21... expression: cycle arrest, continued growth

• tet inducible p16: G1 arrest, cell growth +Ly or rapamycin: no growth (PI3K, mTOR Abhängigkeit)

•  • +Ly or rapamycin: reduced size (continuous effect) and proliferation rate • inhibited S6K activity, 4E-BP phosphorylation, • 4E-BP-4E association higher

• Rapamycin resistant mTOR: no rapamycin effect, S6K activity and 4E-BP phosphorylation restored no size phenotype

• ->mTOR, S6K und 4EBP wichtig für Größenregulation

Fingar et al, GenesDev 16, 2002

U2OS cells cycling


KOs

PDK1 (Lawlor et al. EMBOJ 2002) • -/- : dies E9.5 • hypomorph (floxed, 10% activity): adult, fertile, 40% smaller animals

• smaller cells, • no change in cell number

• no change in PKB/Akt (T308, S473), S6K and RSK Phosphorylation in hypomorph animals

• ES PDK1-/- cells: normal, no P of PKB, S6K, RSK

• Fibroblasts: PDK1-/fl 15% PDK1 activity, 70% of normal size, same apoptosis no difference in proliferation (? just monitored for 5 days)


KOs

S6 (Volarevic et al, Science 2000) • conditional in liver (MxCre)

• normal liver histology

• fasting (48h): 50% size reduction of liver weight, • total protein, ribosome content

• refeeding: normal size of liver, ribosome biogenesis activated, no proliferation involved -> cell size

• WT and KO no difference in liver size reduction/regrow upon fasting/feeding, 40S subunit sufficient to adjust to normal cell size

• partial liver hepatectomy: KO livers did not regenerate, no proliferation

• same cyclin D1, p21 increase, p27 decrease, cdk4 activity BUT: no cyclin E accumulation, no cdk2 activity


InsR cascade KOs

IGF-1, -2, IGF-R1, Ins-R, IRS-1, -2 KO • reduced body size

• IGF1-R KO MEFs: prolonged cell cycle, size?

• IGF-1 KO: reduced muscle fibre size

S6K-1-/- mice : smaller embryos


Cell size regulation : c-myc target genes

MycER cells PolI: direct and via pRB interaction: rRNA transcritption Dead box helicases: unwinding of RNA YY1 (delta factor): binds to myc, can repress or activate trk

important for ribosomal protein rpS16 trk eIF2alpha: general translation factor eIF4E: translation initiation factor indirect target cyclin D1 (posttranscriptional maybe via eIF4E) but: c-myc-/- cells no eIF4E downregulation, others not tested

Myc overexpression in human B cells: increase in cell size, normal proliferation


Cell size regulation : c-myc

BALB 3T3 cells: mycER (estradiol inducible) enter S phase after 24 h (E2 addition) protein synthesis proceeds DNA synthesis, +50% after 6h eIF4E, eIF2alpha, cyclin D1 protein induced

Rat1 fibroblasts myc+/-: myc expression reduced by 50% 3 h delay in S phase entry 3 h increase in doubling time

Rat1 fibroblasts myc-/-: no myc, no compensatory upregulation of N- or L-myc 2.5 fold increase in doubling time, G1 and G2 prolonged overall protein synthesis decreased 2.5 fold cell size same

Mas

se/V

olum

en

Zeit


Drosophila Mutants I

IRS (chico, Bohni et al. Cell 1999) • loss:small: cell size + number reduction

InsR • loss: small: cell size + number reduction

PI3K • loss: small cells, decreased growth • overexpression: bigger cells

PTEN loss: bigger cells overexpression: reduced size and cell number, increased cell cycle length (overall)

PKB/Akt loss: small cells overexpression: increased cell size, no effect on proliferation

PTEN loss PKB/Akt hypomorph: normal size

S6K loss: small cells, increased cell cycle length (overall)


Drosophila Mutants II

Myc • hypomorph heterozygote:small cell size • more severe mut: small cell size + number reduction • overexpression: bigger cells • mechanism: ? Myc targets: eIF4-E, RNA helicase->ribosomal biogenesis

• Ras/MapK pathway • partial loss of function mutants: small cells, slow growth • overexpression: bigger cells, Myc = posttranscriptional target

• Pitchoune (Dead box helicase): loss: small cell size (-> c-myc target)

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