UNIVERSIDADE FEDERAL DO PARÁ PRÓ-REITORIA DE PESQUISA E PÓS-GRADUAÇÃO

DEPARTAMENTO DE PESQUISA PROGRAMA INSTITUCIONAL DE BOLSAS DE INICIAÇÃO CIENTÍFICA –

PIBIC CNPq e PIBIC UFPA/AF

RELATÓRIO TÉCNICO – CIENTÍFICO

Período: ( ) PARCIAL

( X ) FINAL

IDENTIFICAÇÃO DO PROJETO Título do Projeto de Pesquisa: Estudo Bioguiado de Extratos de Fungos Endofíticos da Amazônia Visando o Combate as Leishmanioses no Estado do Pará

Nome do Orientador: Andrey Moacir do Rosario Marinho Titulação do Orientador: Doutor

FACULDADE DE QUÍMICA Unidade: ICEN/ UFPA

Titulação do plano de Trabalho: Estudo Químico de Atividade Leishmanicida de Fungos Endofíticos.

Nome do Bolsista: Tiago Sergio Aleixo Barros

Tipo de Bolsa: ( ) FAPESPA/ PADRC

( X ) PIBIC/UFPA – AF

1. INTRODUÇÃO

A necessidade de fontes alternativas para substâncias de importância farmacológica, de novas substâncias biologicamente ativas, e a descoberta de novos processos químicos, vem de encontro à química de microorganismos. Devido ao pequeno ciclo de vida e à fácil adaptação ao meio externo, os micro-organismos fornecem a possibilidade de inúmeras manipulações, visando à otimização da produção de metabólitos secundários. Como exemplo, temos o caso clássico das penicilinas, onde a otimização do meio de cultura e manipulações genéticas elevaram a produção de poucos para milhares de µg/mL em cepas de Penicillium.

Fungos endofíticos são fungos que durante certo período de suas vidas, colonizam os tecidos internos de plantas sem causar sintomas a estas (Petrini, et al, 1992). É estimado que cerca de 80% das plantas são hospedeiras de fungos (Zhang, et al, 1997). A interação planta-fungo endofítico pode ser benéfica à planta (Jarvis, et al, 1996), pois esses são capazes de produzir metabólitos que podem auxiliar o sistema imonológico da planta com produção de toxinas e fitoalexinas. Há relatos de um possível “aprendizado” conhecido por “ transferência genética horizontal” , entre os fungo e planta que seria a capacidade dos organismos associados produzirem a mesma classe de substâncias (Rohr, 1997).

A aplicação desses micro-oganismos já é realidade e configura-se como avanço nas seguintes áreas: controle de pragas e doenças, bioerbicídas, bioindicadores de vitalidade, vetores para introdução de genes, biorremediação de solos contaminados com poluentes e como produtores de antibióticos e outros metabólitos secundários de interesse farmacológico (Trabulsi, 2002; Strobel & Dayse, 2003;Strobel, et al., Vanisree, et al., 2004).

É conhecido que alguns compostos de origem vegetal são produzidos por fungos que habitam essas plantas indicando haver um transmissor de genes entre vegetais e fungos em uma verdadeira engenharia genética in vivo (Azevedo, 1998). Assim, é esperado que os metabólitos secundários produzidos pelos fungos que habitam os tecidos da planta, também apresentem tais atividades.

O uso de fungos endofíticos abre novas áreas de exploração biotecnológica, que dita a necessidade de isolar, caracterizar e investigar os metabólitos secundários oriundos da relação planta/microorganismo, sendo que muitas dessas substâncias são inéditas e que podem ser utilizadas na indústria farmacêutica e na agricultura.

Em trabalhos anteriores realizados por nós foram isoladas substâncias de fungos endofíticos com boas atividades leishmanicida. Assim, nossa proposta de trabalho é a obtenção dos estratos de fungos endofíticos visando a obtenção de micoterápicos ou substâncias que possam servir de protótipos para medicamentos usados no combate das leishmanioses.

2. JUSTIFICATIVA

Leishmanioses são doenças tropicais causadas por protozoários do gênero Leishmania. Estas infectam em torno de 12 milhões de pessoas em 80 países do mundo e é estimado que existam 3 milhões de novos casos por ano. É também considerado que existam 350 milhões de pessoas em risco de contaminação. As várias formas de manifestação da doença têm usadas pela Organização Mundial da Saúde como base para classificar as leishmanioses em quatro formas: a) visceral, b) cutânea-mucosa, c) cutânea difusa ou disseminada e d) cutânea. Leishmaniose visceral é a forma mais severa da doença e pode ser fatal quando não tratada. Esta é caracterizada por infecções nos órgãos internos, particularmente o fígado, baço e medula óssea. Leishmaniose cutânea-mucosa frequentemente resulta em desfiguração facial devido a erosões das mucosas da boca e nariz. Leishmaniose cutânea difusa é caracterizada pela formação de nódulos, placas ou tumores, especialmente em volta da face ou nos braços e pernas. Leishmaniose cutânea é a forma menos severa da doença e é geralmente considerada como uma infecção limitada. No Brasil as leishmanioses são um sério problema, tendo crescido consideravelmente com o passar dos anos. Os parasitas que mais ocorrem no país são L. (Leishmania) chagassi causador da leishmaniose visceral e L. (Viannia) braziliensis, L. (V.) guyanensis, L. (L.) amazonenses causadores da leishmaniose cutânea. Na Amazônia, em especial no Estado do Pará, são registrados anualmente diversos casos de leishmanioses. Segundo dados divulgados em 2007 pela Secretaria de Estado de Saúde Pública (SESPA) no período de 2005 a agosto de 2007 foram notificados no Estado 10565 casos de leishmaniose tegumentar e 1070 casos de leishmaniose visceral, forma letal da doença, o que torna o Pará um foco deste tipo de doença no Brasil. Os tratamentos medicamentosos disponíveis para as leishmanioses são à base de remédios antimoniais pentavalentes, como o Pentostan® e Glucantime®, que são tóxicos e nem sempre efetivos. Por outro lado, as leishmanioses são doenças típicas de países do hemisfério sul, países pobres, por isso não há interesse das grandes indústrias farmacêuticas em investir em pesquisas que levem a medicamentos eficazes contra as leishmanioses, devido à população consumidora ser de baixa renda, o que não geraria “lucro” para as indústrias. Assim, se faz necessária a busca de novas fontes de medicamentos que sejam eficazes no tratamento desta doença. Embora o Brasil seja um país tropical, um clima propício à proliferação de microorganismos, ainda é desprezível o número de trabalhos no campo da já tradicional área de produtos naturais vegetais. Os fungos endofíticos são muito diferenciados em relação aos demais microorganismos quanto ao seu modo de associação com as plantas, que pode se dar em níveis de intimidade bioquímica muito próxima. Várias abordagens podem ser dadas nesses estudos de interações planta-microorganismos, enfatizando os microorganismos endofíticos. Alguns pesquisadores sugerem que o metabolismo secundário de microorganismos endofíticos pode ser extremamente ativo quando eles são cultivados em ambiente rico em nutrientes, já que, quando associado ao hospedeiro, eles têm seu metabolismo “controlado” pela planta. Assim, essa pode ser uma fonte útil, versátil e renovável de muitas substâncias potencialmente úteis à humanidade. Sabe-se que na

Amazônia Brasileira encontra-se a maior biodiversidade de espécies vegetais, e estima-se que cerca de 80% das plantas são infestadas por microorganismos o que torna essa região rica em espécies de microorganismos, muitos ainda não descritos na literatura. Atualmente existem poucos grupos de pesquisa no Brasil trabalhando na área de isolamento de metabólitos secundários de fungos endofíticos, onde as maiorias desses grupos encontram-se na região sudeste do país, sobre tudo no interior paulista. A presença de um grupo de pesquisa que trabalhe com a química desses microorganismos na região norte seria de grande importância para o desenvolvimento científico do Estado do Pará. A obtenção de micoterápicos dos extratos de fungos endofíticos é de grande importância para o combate as doenças negligenciadas, pois o rápido ciclo de vida dos fungos e a possibilidade de repiques abrem a possibilidade de obtenção de rápida e grande quantidade de micoterápicos sem a necessidade de derrubada de várias árvores como ocorre na obtenção dos tradicionais fitoterápicos, colocando quase de imediato medicamento a disposição do sistema de saúde para ser usado no combate as leishmanioses. 3. OBJETIVOS OBJETIVO GERAL Este projeto tem como objetivo a busca de extratos ativos que possam ser usados para a obtenção de micoterápicos e também o isolamento de substâncias que possam servir como protótipos de medicamentos úteis no combate as leishmanioses, além de contribuir nos estudos dos metabólitos secundários de microorganismos associados a plantas. Para isso será necessário realizar as seguintes etapas: Objetivo específico 1 – Cultivar os fungos em pequena escala (realizado) 2 – Obtenções dos extratos das biomassas (realizado) 3 – Determinação da atividade leishmanicida dos extratos (realizado) 4 – Determinação do perfil químico dos fungos através de CCDA, EM e RMN (realizado) 5 – Apontar uma ou mais espécies de fungos com potencial para estudos mais específicos. (realizado) 6 – Cultivar os fungos selecionados em diferentes meios de cultura para crescimento das colônias. 7 – Obter os extratos fúngicos dos meios de cultura. (realizado) 8 – Isolar os constituintes químicos dos extratos através de cromatografia. (realizado) 9 – Identificar a estrutura das substâncias isoladas através de métodos espectroscópicos de RMN, IV, UV e EM. (realizado) 10 – Realizar ensaio leismanicida com as substâncias isoladas. (ainda não realizado)

4. MATERIAIS E MÉTODOS Equipamentos

• Capela de fluxo laminar: Modelo PA 320 PACHANE, para manuseio dos microorganismos;

• Evaporador rotativo a vácuo QUIMIS, modelo Q-344-2, para concentração dos extratos fúngicos;

• Câmera de análise de fluorescência por luz ultravioleta: Cabine e luz SPECTROLINE, modelos CM-10/ ENF-260C, para análise das cromatoplacas.

• Agitador orbital (Shaker);

• Placa de Elisa 96 furos;

• Autoclave vertical 75 L: Modelo Au 75 WB PHOENIX;

• Incubadora de B.O.D (Biochemical Oxigen Demand) QUIMIS, para crescimento dos microorganismos;

• Espectrômetro de ressonância magnética nuclear: VARIAN modelo MERCURY-300, Laboratório de RMN, Programa de Pós-graduação em Química, Instituto de Ciências Exatas e naturais, UFPA;

• Balança analítica: SARTORIUS, modelo BP210S;

• Estufa de secagem e esterilização FAMO.

Reagentes utilizados

• Solventes: Metanol (MeOH), Acetato de Etila (AcOEt), Hexâno (Hex) e Diclorometano, todos de grau PA, para a extração e nos procedimentos cromatográficos;

• Solventes deuterados (CDCl3 e MeOD), para análise de RMN;

• Ce(SO4)2, para revelação das cramatoplacas;

• H2SO4

• BaCl2 • Dimetilsulfóxido (DMSO)

Técnicas cromatográficas

• Cromatografia em camada delgada analítica (CCDA): cromatoplacas em folhas de alumínio medindo 4 x 4 cm;

• Cromatografia em coluna por via úmida (CCVU).

Meios de cultura

• B.D.A (batata, dextrose, ágar);

• Caldo B.H.I ( Infuso Cérebro Coração);

• Ágar e caldo Mueller Hinton;

• Ágar e caldo Saboround, TTC.

Metodologia

Fungo

Foram usados os fungos isolados de V. michelli depositados na micoteca do Laboratório de Bioensaios e Química de Microorganismos – LaBQuiM/ ICEN. Estes fungos estão em fase de identificação na Universidade Estadual do Amazonas, dentre estes foi utilizado o fungo CGGVM05 isolado dos galhos de Virola michelli para a realização do trabalho. O fungo CGGVM05 foi identificado como Colletotrichum

gloesporioides.

Cultivo dos microorganismos

Para o preparo do meio, cozinhou-se 200g de batata em 400mL de água destilada, em seguida filtrou-se e adicionou-se ao caldo 20g de Ágar e 20g de Dextrose, completou-se o volume com água destilada até atingir 1L de solução. Após transferiu-se a solução para um Erlenmeyer esterilizado, onde foi autoclavada a 121ºc por cerca de 15 minutos para esterilização, evitando o risco de contaminação. Posteriormente, pequenos pedaços do fungo CGGVM05 conservados em um frasco de 10 mL com água destilada, foram transferidos para placas de Petri contendo meio B.D.A, e confinado em estufa B.O.D, por 8 dias para o desenvolvimento da hifas do fungo.

Cultivo em meio sólido

Os fungos foram cultivados em 25 frascos de Erlenmeyer com capacidade de 1000 mL, contendo em cada 200 gramas de arroz e 100 mL de água destilada, posteriormente os frascos foram autoclavados durante 45 minutos a 121ºc, após o resfriamento, na capela de fluxo laminar, inocularam-se três cubículos do fungo em cada um dos frascos, em condição estéril. Posteriormente foram incubados ao abrigo de luz e a temperatura ambiente na micoteca do Laboratório de Bioensáios e Química de Microorganismos – LaBQuiM – UFPA por cerca de 30 dias em modo estático para o crescimento das colônias.

Obtenção dos extratos fúngicos

Após o período de cultivo do fungo em meio sólido, foi adicionado metanol a biomassa com a finalidade de matar o fungo, garantindo a não contaminação durante a manipulação dos frascos. Após três dias, a solução metanólica foi filtrada e concentrada em evaporador rotativo, resultando no Extrato MeOH 1. O resíduo da biomassa foi submetido a sucessivas extrações com solventes orgânicos em ordem crescente de polaridade (Hexano, Acetato de Etila e Metanol), como mostra o fluxograma abaixo:

FLUXOGRAMA 1: Obtenção dos extratos fúngicos.

Fracionamento do Extrato Hexânico

Após a concentração do extrato hexânico, parte do mesmo foi submetido a cromatografia em coluna. Utilizou-se sílica-gel como fase estacionária e Hex, AcOEt e MeOH em gradiente crescente de polaridade como fase móvel, resultando em seis frações (Fluxograma 2), as quais, após secas, foram analisadas por cromatografia em camada delgada analítica. De acordo com o perfil cromatográfico optou-se inicialmente pela fração 3 (C1CGGVM05-03), onde foi refracionada por cromatografia em coluna de sílica-gel, eluída com hexâno, AcOEt e MeOH em gradiente crescente de polaridade, resultando no isolamento da substância S-1, S-2 e S-3 (Ilustrado no fluxograma 3).

FLUXOGRAMA 2: Fracionamento cromatográfico do Extrato Hexânico.

Biomassa

fúngica

Ext. MeOH

1Ext. Hex Ext. AcOEt

Ext. MeOH

2

Extrato hexânico submetido a cromatografia em coluna

Fração 1

C1CGGVM05-01

Fração 2

C1CGGVM05-02

Fração 3

C1CGGVM05-03

Fração 4

C1CGGVM05-04

Fração 5

C1CGGVM05-05

Fração 6

C1CGGVM05-06

FLUXOGRAMA 3: Fracionamento da fração 3 (C1CGGVM-03) e isolamento das substâncias S-1, S-2 e S-3.

Ensaio leishmanicida

Os ensaios leishmanicidas foram realizados na Universidade Estadual de Maringá pela Profa Dra Izabel Piloto utilizando a metodologia descrita abaixo. Cultura e manutenção do parasita

Formas promastigota de Leishmania viannia braziliensis MHOM/BR1987/M11272 foram cultivadas a 25 ºC em meio Schneider’s Drosophila suplementado com 10 % de soro bovino fetal (FCS). Células foram coletadas na fase logarítimica, ressuspensas em meio fresco, contadas em câmara de Neubauer e a concentração ajustada par 4x10 6 cel/mL. Ensaio leishmanicida

O ensaio foi realizado in vitro com as formas promastigotas do parasita. As substâncias foram adicionadas nas culturas de promastigotas com 4x10 6 cel/mL nas

concentrações de 320 a 0,125 µg/mL solubilizados em DMSO e incubados a 25 °C por 24 h. Após esse período os parasitas sobreviventes foram contados em câmara de Neubauer e comparados com controles, os quais continham somente DMSO. Isetionato de pentamidina (Eurofarma) foi usado como fármaco controle. O valor da LD50/24 foi determinado pela analise de regressão linear do percentual de inibição com erro estatístico de 10%.

Fração

C1CGGVM05-03

C2CGGV

M05-01

C2CGGV

M05-02

C2CGGV

M05-03

C2CGGV

M05-04

C2CGGV

M05-05

C2CGGV

M05-06

C2CGGV

M05-07

(S-3)

C2CGGV

M05-08

(S-1)

C2CGGV

M05-09

C2CGGV

M05-10

C2CGGV

M05-11

(S-2)

C2CGGV

M05-12

C2CGGV

M05-13

C2CGGV

M05-14

C2CGGV

M05-15

C2CGGV

M05-16

5. RESULTADOS E DISCURSÕES

Ensaios leishmanicidas dos extratos

Foram enviados 22 extratos para realizar os ensaios, no entanto devido a problemas principalmente de solubilidade dos extratos no solvente utilizado no ensaio foram testados com sucesso somente 06 extratos. Foram testado os extratos metanólicos dos fungos CGGVM05, FEGVM25, FEGVM16, PGGVM10, PVFVM11 e FEFVM23

(Quadro 01). Os valores de DL50/24h superiores a 320,0 µg/mL indicam que os extratos apresentaram baixo potencial leishmanicida. Contudo os dois extratos com valores de

DL50/24h de 264 µg/mL e 144µg/mL apresentaram atividade inferior a 320,0 µg/mL justificando a necessidade de serem refracionados a fim de se constatar a presença ou não de um possível metabólito ativo. O extrato 05-CGGVM apontou para uma potente

atividade leishmanicida com DL50/24h de 40µg/mL e foi escolhido para refracionamento a fim de isolar os metabólitos secundários ativos.

Quadro 01: resultados dos ensaios leishmanicidas dos extratos metanólicos das biomassas em diferentes concentrações frente a Leishmania braziliensis.

Código (amostra) DL50 / 24h Potencial Leishmanicida em Leishmania (V.)

braziliensis 05 – CGGVM 40 µg/mL Alto 25 – FEGVM 144 µg/mL Moderada 16 – FEGVM 264 µg/mL Moderada 10 – PGGVM > 320µg/mL Baixo 11 – PVFVM > 320µg/mL Baixo 23 – FEFVM > 320µg/mL Baixo

5.1 IDENTIFICAÇÃO DAS SUBSTÂNCIAS ISOLADAS DO FUNGO CGGVM05.

SUBSTÂNCIA ISOLADA S-1: ERGOSTEROL

A substância S-1 foi isolada das frações apolares do extrato Hex do fungo CGGVM05 na forma de um sólido branco cristalino, solúvel em diclorometano, e em grande quantidade (440,7 mg). No espectro de RMN ¹H (300 MHz; δ = ppm) (Fig. 1) de S-1 foi possível observar sinais na região dos hidrogênios ligados a carbonos sp² em δ 5,20 (m), δ 5,38 (m) e δ 5,56 (m), o sinal na região dos hidrogênios oximetínicos em δ 3,63 (m). Juntamente com os sinais δ 0,62 (s), δ 0,82 (d; 6,6), δ 0,84 (d; 6,6), δ 0,92 (d;

6,6), δ 0,94 (s) e δ 1,04 (d; 6,6) que caracterizam uma substância com esqueleto esteroidal. Os dados espectrais de S-1 foram confrontados com os da literatura e mostraram similaridade dos deslocamentos químicos dos sinais de S-1 com o ergosterol (TABELA 1). O ergosterol é um esteroide muito comum e abundante na maioria das espécies de fungos. É essencial para a permeabilidade e fluidez da membrana, garantindo a modulação de enzimas ligadas à membrana plasmática. A ausência do ergosterol e de seus precursores afeta a estrutura da membrana plasmática e absorção de vários nutrientes (CAMIZOTTI 2008).

FIGURA 1: Estrutura do Ergosterol.

SUBSTANCIA ISOLADA S-2: PERÓXIDO DE ERGOSTEROL

A substância S-2 (Fig. 2) foi isolada do extrato hexânico, na forma de cristais brancos solúveis em diclorometano, com massa de 113,9 mg. O espectro de RMN 1H (Fig. 4), mostra um multipleto em δ 3,96, atribuído à presença do hidrogênio carbinólico. Os dois dupletos em δ 6,24 (d, 8,4 Hz) e δ 6,47 (d; 8,7 Hz) apresentam constantes de acoplamento características de dupla ligação em cis. Os sinais em δ 5,15 (m) e δ 5,21 (m) são atribuídos a existência de ligações duplas na cadeia lateral de um esteroide. Os sinais em δ 0,86 (s), δ 0,81 (s), δ 0,90 (d; 6,6 Hz), δ 0,80 (d), δ 0,83 (d) e δ 1,00 (d; 6,6 Hz) foram atribuídos aos hidrogênios metílicos. Os dados espectrais de S-2 (Tabela 1) foram comparados aos da literatura do peróxido de ergosterol e apresentaram similaridade em seus deslocamentos químicos.

FIGURA 2: Estrutura do Peróxido de ergosterol.

S-1 S-2 H δ 1H [MARINHO 2005] δ 1H [LEPTOKARYDIS 2008]

(δ, multiplicidade, J) (δ, multiplicidade, J) 1 2 1,66 (m) 1,67 (m) 3 3,63 (m) 3,63 (m) 3,96 (m) 3,96 (m) 4 1,21 (m) 1,21 (m) 5 6 5,56 (dd; 5,4 e 2,4) 5,56 (m) 6,24 (d; 8,4) 6,23 (d; 8,5) 7 5,38 (m) 5,38 (m) 6,47 (d; 8,7) 6,48 (d; 8,5) 8 9 1,46 (m) 1,47 (m)

10 11 0,97 (d; 6,6) 0,98 (d; 6,6) 12 2,00 (m) 2,00 (m) 13 14 1,57 (m) 1,57 (m) 15 1,48 (m) 1,48 (m) 16 17 1,20 (m) 1,20 (m) 18 0,94 (d; 5,1) 0,95 (s) 0,81 (s) 0,81 (s) 19 0,62 (s) 0,63 (s) 0,86 (s) 0,87 (s) 20 1,92 (m) 1,92 (m) 21 1,04 (d; 6,6) 1,04 (d; 6,7) 0,90 (d; 6,6) 0,90 (d; 6,9) 22 5,19 (tl) 5,20 (m) 5,21 (m) 5,21 (dd; 8,1; 15,6) 23 5,19 (tl) 5,20 (m) 5,15 (m) 5,14 (dd; 8,1; 15,6) 24 1,83 (m) 1,83 (m) 25 2,30 (m) 2,30 (m) 26 0,82 (d; 6,6) 0,82 (d; 6,8) 0,80 (d) 0,80 (d; 6,8) 27 0,84 (d; 6,6) 0,84 (d; 6,8) 0,83 (d) 0,82 (d; 6,8) 28 0,92 (d; 6,6) 0,92 (d; 6,8) 1,00 (d; 6,6) 1,00 (d; 6,6) TABELA 1: Dados de RMN ¹H (300 MHz) de S-1 e S-2

FIGURA 3: Espectro de RMN 1H (300 MHz, CDCl3) do ergosterol (S-1)

FIGURA 4: Espectro de RMN 1H (300 MHz, CDCl3) do peróxido de ergosterol (S-2)

SUBSTÂNCIA EM MISTURA S-3: SITOSTEROL E ESTIGMASTEROL

O composto S-3 foi obtido das frações apolares do extrato hexânico. Foi feito uma recristalização com Hex e MeOH para a purificação da amostra. A substância S-3 foi isolada como cristais incolores nas formas de agulhas. A análise do espectro de 1H (Fig.7) da fração em estudo mostrou que se tratava de uma mistura de substâncias codificadas S-3 a (fig. 5) e S-3 b (Fig. 6). No espectro observaram-se sinais característicos de esteroides, tais como o de hidrogênio olefínico em δ 5,35 (d; 5,1Hz) e de hidrogênio oximetínico na faixa de δ 3,48 a δ 3,66 ppm. Além do acumulo de sinais na região de δ 0,64 a δ 2,40 ppm atribuídos a grupos de hidrogênios metílicos,

metilênicos e metínicos, são sinais característicos do sitosterol (S-3 a). Os duplos dupletos na região de δ 5,01 a δ 5,20 ppm, são atribuídos a hidrogênios olefínicos da dupla de estereoquimica trans da cadeia lateral de um estigmastano. Esses duplos dupletos mais os demais sinais atribuídos para o sitosterol caracterizam a presença do estigmasterol (S-3 b).

No espectro de RMN 13C (Fig. 8) da mistura S-3 apresentou sinais de carbonos insaturados característicos de sitosterol e estigmasterol em δ 140, 6, δ 121,7, δ 138,2 e δ 129,6, correspondentes a carbonos olefínicos. Em δ 71,7 sinal condizente com o de um carbono oximetínico. Na região entre δ 12,0 a δ 19,8 sinais característicos de grupos metílicos. Sinais de carbonos metilênicos entre δ 21,0 e δ 42,2. No espectro de RMN DEPT (Fig. 9) o padrão de hidrogenação em δ 121,7 e δ 140,6 são do tipo (CH), sinais entre δ 12,0 a δ 19,8 do grupo das metilas (CH3) e grupos metilênicos (CH2) em δ 21,0 e δ 42,2 ppm. Pela comparação dos dados espectrais de 1H e 13C com os descritos na literatura (Tabela 2) o composto S-3 foi identificado como uma mistura dos esteroides Sitosterol e Estigmasterol.

Os fitoesteróides são de ampla ocorrência no reino vegetal. Normalmente aparecem em misturas de difícil separação, pois, apresentam propriedades físicas semelhantes. Os mais comuns são: o sitosterol, estigmasterol e campesterol. (Marinho 2008), porém, é a primeira vez em que o sitosterol e estigmasterol são isolados a partir de fungos do gênero Colletotrichum.

FIGURA 5: Sitosterol

FIGURA 6: Estigmasterol

H S-3 [COQUEIRO]

C S-3 a S-3 b β-sitosterol Estigmasterol

1H 1H [COQUEIRO] [COQUEIRO] (δ, multiplicidade, J)

1 1 37,0 37,0 37,2 37,2 2 2 31,7 31,7 31,6 31,6

3 3,54-0,47

(m) 3,55-3,51 (m) 3 71,7 71,7 71,8 71,8

4 4 42,2 42,2 42,2 42,2 5 5 140,6 140,6 140,7 140,7

6 5,35 (d;

5,1) 5,35 (d; 5,1) 6 121,7 121,7 121,7 121,7

7 7 31,8 31,8 31,8 31,8 8 8 31,8 31,8 31,8 31,8 9 9 49,9 49,9 50,1 50,1

10 10 36,4 36,4 36,4 36,4 11 11 21,0 21,0 21,0 21,0 12 12 39,7 39,7 39,7 39,6 13 13 42,2 42,2 42,2 42,2 14 14 56,7 56,8 56,7 56,8 15 15 24,2 24,5 24,3 24,3 16 16 28,2 28,2 28,2 28,2 17 17 55,9 55,9 56,0 55,9 18 18 11,6 11,6 11,8 11,8 19 19 19,0 19,0 19,3 19,3 20 20 36,2 39,5 36,1 40,5 21 1,00 (s) 1,02 (s) 21 19,0 20,1 19,0 21,2 22 22 33,6 138,2 33,9 138,4 23 23 39,0 129,6 39,1 129,2 24 24 45,6 51,2 45,8 51,2 25 25 27,1 31,8 26,0 31,8

26 0,93 (d;

6,6) 0,92 (d; 6,6) 26 18,6 19,0 18,7 19,0

27 0,82 (d;

6,6) 0,81 (d; 6,6) 27 19,8 19,0 19,8 19,0

28 28 22,7 25,3 23,0 25,4 29 29 12,0 12,2 11,9 12,2 TABELA 2: Dados de 1H (300 MHz) e 13C (75 MHz) de S-3 a e S-3 b.

FIGURA 7: Espectro de RMN 1H (CDCl3, 300 MHz) de S-3.

FIGURA 8: Espectro de RMN 13C (CDCl3, 75 MHz) de S-3.

FIGURA 9: Espectro de RMN 13C DEPT (CDCl3, 75 MHz) de S-3.

6. CONSIDERAÇÕES FINAIS

Foram obtidos na etapa passada do trabalho cerca de 25 extratos dos fungos isolados de V. michelli dos quais foram determinados os perfis químicos por CCDA e RMN 1H, como descrito no relatório anterior. Nesta etapa foram realizados ensaios leishmanicidas com os fungos CGGVM05, FEGVM25, FEGVM16, PGGVM10, PVFVM11 e FEFVM23. O fungo CGGVM05 foi o mais ativo e foi escolhido para cultivo em grande escala e isolamento dos metabólitos secundários. O fracionamento dos extratos levou até o momento ao isolamento e identificação estrutural dos esteróides ergosterol (S-1), peróxido de ergosterol (S-2), sitosterol (S-3 a) e estigmasterol (S-3 b), estes dois últimos são comumente encontrados em plantas, sendo essa a primeira ocorrência em fungos do gênero Colletotrichum.

7. REFERÊNCIAS

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89(2), 205-217, 1997.

PARECER DO ORIENTADOR

O aluno desempenhou as suas atividades com destreza e segurança. Também

demonstrou grande interesse no assunto abordado no projeto e apresentou evolução

visível no domínio das técnicas usadas no laboratório. Foi assíduo, o que refletiu no

cumprimento de suas atividades dentro do cronograma previsto. Vale relembrar que a

etapa inicial do projeto foi realizada por outro aluno e este foi substituído pelo atual

bolsista, que mesmo em pouco tempo de execução do trabalho conseguiu bons

resultados.

DATA: __09__/_08___/_2012___

ASSINATURA DO ORIENTADOR

Tiago Sergio Aleixo Barros

ASSINATURA DO ALUNO