universidade federal de alfenas unifal - mg herick ulisses ... · herick ulisses de oliveira ......

97
UNIVERSIDADE FEDERAL DE ALFENAS Unifal - MG HERICK ULISSES DE OLIVEIRA INVESTIGAÇÃO DO ENVOLVIMENTO DO SISTEMA ENDOCANABINOIDE NA ANTINOCICEPÇAO INDUZIDA PELA ESTIMULAÇÃO ELÉTRICA TRANSCUTÂNEA DO NERVO -TENS ALFENAS- MG 2015

Upload: truongtruc

Post on 12-Feb-2019

220 views

Category:

Documents


0 download

TRANSCRIPT

UNIVERSIDADE FEDERAL DE ALFENAS Unifal - MG

HERICK ULISSES DE OLIVEIRA

INVESTIGAO DO ENVOLVIMENTO DO SISTEMA ENDOCANABINOIDE NA ANTINOCICEPAO INDUZIDA PELA ESTIMULAO ELTRICA

TRANSCUTNEA DO NERVO -TENS

ALFENAS- MG

2015

HERICK ULISSES DE OLIVEIRA

INVESTIGAO DO ENVOLVIMENTO DO SISTEMA ENDOCANABINOIDE NA ANTINOCICEPAO INDUZIDA PELA ESTIMULAO ELTRICA

TRANSCUTNEA DO NERVO -TENS

Alfenas/MG

2015

Dissertao apresentada como parte dos requisitos

para obteno do ttulo de Mestre em Cincias

Fisiolgicas pelo Programa Multicntrico em Cincias

Fisiolgicas da Sociedade Brasileira de Fisiologia na

Universidade Federal de Alfenas- UNIFAL/MG.

rea de concentrao: Fisiologia e Farmacologia da

dor

Orientador: Prof. Dr. Giovane Galdino de Souza

Dedico aos meus amores: minha esposa Soraya Oliveira e minha filha Ana Luiza.

AGRADECIMENTOS

A Deus, pela fora em momentos difceis, e por ser sempre meu guia, a Nossa

Senhora Aparecida que intercede e ilumina meus passos, abenoando com seu manto

maternal.

A minha esposa Soraya e minha filha Ana Luiza, que mesmo com a minha

ausncia, incentivaram e me inspiraram em todo percurso. A vocs peo desculpas

pelos momentos impares que perdemos, por dificuldades e receios. Apesar disso

sempre me recepcionaram com um sorriso no rosto e uma energia que me

impulsionava nesse objetivo. Obrigado pelo carinho, amo vocs.

Ao meu pai Valdir, minha me Izabel por serem exemplo de dedicao, unio

e sempre me apoiarem nas decises. Obrigado por disponibilizarem tempo para

ajudar e cuidar da minha famlia em momentos que estive ausente, juntamente com

meus irmos Douglas e Breno, minha cunhada, meu sogro e minha sogra.

A minha V Didi pelas Bnos e pelos ensinamentos de vida e de

simplicidade.

Aos meus primos, tios, tias: em especial a Tia Conceio e Cornlio pela

hospedagem nos perodos que estive em Belo Horizonte. Obrigado pela fora.

Ao amigo e orientador Dr. Giovane Galdino, pela credibilidade, ensinamentos e

por me aceitar nesse seleto grupo, fazendo que eu me dedicasse e gostasse cada vez

mais da pesquisa.

Aos professores do Programa de Ps graduao em Fisiologia e de graduao

em Fisioterapia da UNIFAL, em especial ao Dr. Alexandre Giusti-Paiva, Dra. Fabiana

Giust, Dr. Leonardo Carvalho, Dra Juliana Bassalobre , Dra Silvia Lanziotti , Dr

Marcelo, Dra Josie Resende , pelas dicas e disponibilidade.

Aos amigos e Colaboradores da UFMG Prof. Dr. nio Ferreira, Dr. Jos

Felippe, e Dra. Ana Flvia, pelo trabalho assistencial, dedicao e pela pacincia em

ensinar.

Aos ps-graduandos do laboratrio de Fisiologia da UNIFAL: Vanessa

Veronesi, Vanessa Cardoso, Mara, Ana Cludia, Slvia, Layla, Ana Laura, Luciana,

Merellym, Lidiane, Nathlia, Clarice, Kriss, Tatiane, Dlcio e Wesley e do LABFEX,

em especial a Rafaela Santos, Ana Clara, Gonalves Pedro, Marcelo, Jadina Santos,

Julia Parisi, Ricardo pela convivncia diria, ajuda e amizade.

Aos tcnicos Luiz, Luciana, Jos Reis, Marina Venncio, Luiz Felipe, Joo

Vitrio, Isabel as auxiliares Helena e D Zlia, pela disponibilidade e ateno,

sempre atenciosa Maria Antonieta Nogueira, secretria do PMPGCF da

UNIFAL

Aos amigos que me deram fora em especial eterna Rep. Projak.

Universidade Federal de Alfenas, Coordenao de Aperfeioamento de

Pessoal de Nvel Superior (CAPES) e Fundao de Amparo Pesquisa do Estado

de Minas Gerais (FAPEMIG) pelo auxlio financeiro.

O saber a gente aprende com os mestres e os livros. A sabedoria, se aprende com a vida e com os humildes

Cora Coralina

http://pensador.uol.com.br/autor/cora_coralina/

RESUMO

A dor patolgica acomete 30% da populao mundial. Visando seu controle, inmeras intervenes so utilizadas, as quais envolvem alm dos meios farmacolgicos, procedimentos no farmacolgicos. Assim, uma estratgia no farmacolgica utilizada tem sido a Estimulao Eltrica Transcutnea do Nervo (TENS), um mtodo que utiliza a corrente eltrica para induzir analgesia. No entanto, os mecanismos envolvidos no efeito antinociceptivo da TENS no esto totalmente elucidados. Com a descoberta do sistema endocanabinide e a partir de estudos que demonstraram seu importante papel na modulao da dor, o presente estudo objetivou investigar o envolvimento desse sistema no efeito antinociceptivo proporcionado pela TENS em nveis perifrico e central. Para tal, foram utilizados camundongos machos Swiss pesando 25 a 30, submetidos a um modelo de dor por meio de clulas tumorais de Ehrlich, injetadas em pata. Em seguida, com o intuito de verificar o efeito antinociceptivo da TENS de baixa e alta frequncia sobre a alodinia mecnica induzida pelas clulas, os animais foram estimulados por ambas as frequncias por 20 minutos, aplicadas por meio de eletrodos em pata posterior direita. A avaliao do limiar nociceptivo foi realizada pelo teste de filamentos de von Frey. J, para avaliar a participao do sistema endocanabinide, foram pr administrados por vias intra plantar (i.pl.), intratecal (i.t.) e intra Substncia Cinzenta Periaquedutal dorso lateral (i.SCPd.l.), o antagonista para receptores canabinides do tipo 1 (CB1), o AM 251 e o inibidor da enzima responsvel pela degradao de endocanabinide anandamida (AEA), o MAFP. Alm disso, tambm foram realizadas a anlise de Western Blot, para investigar a expresso de receptores CB1 e anlise de imunofluorescncia para quantificar e co-localizar esses receptores. Nossos resultados verificaram que ambas as frequncias utilizadas reverteram de maneira significativa (P < 0.05) a alodinia mecnica induzida pelas clulas do tumor de Ehrlich. Em adio, esse efeito foi revertido pelo AM251 e prolongado pelo MAFP, ambos pr injetados pelas vias i.pl, e i.t. e i.SCPd.l. Somando a esses resultados, o ensaio de Western Blot demonstrou um aumento da expresso de receptores CB1 aps a aplicao da TENS, em ambas as frequncias, em tecido subcutneo de pata e em SCPd.l. aps 3 horas da injeo de clulas de Erlinch. Resultado similar foi encontrado aps a anlise de imunofluorescncia, onde verificou-se um aumento no nmero de receptores CB1 aps a estimulao com a TENS, em corno dorsal da medula espinal e SCPd.l. Assim, o presente estudo conclui que o sistema endocanabinide pode estar envolvido no efeito antinociceptivo induzido pela TENS, tanto de baixa quanto de alta frequncia, em nveis perifrico e central e sugere que esse efeito ocorre pela ativao da via descendente inibitria da dor, principalmente pela liberao de endocanabinides e a ativao dos receptores CB1.

Palavras-chave: Endocanabinide. TENS. Antinocicepo. Alodinia

ABSTRACT

The pathological pain affects 30% of the world population. Aiming their control, many interventions are used, which involving pharmacological and non-pharmacological treatments. Thus, a non-pharmacological strategy used has been Transcutaneous Electrical Nerve Stimulation (TENS), a method that use the electric current to induce analgesia. However, the mechanisms involved in the antinociceptive effect induced by TENS are not fully elucidated. With the discovery of the endocannabinoid system and studies demonstrated that its system have an important role in the modulation of pain, the present study aimed to investigate the involvement of this system in TENS antinociceptive effect at central and peripheral levels. For such, male Swiss mice weighing 25 to 30g, were underwent to a pain model using tumor cells of Ehrlich, injected into the paw. After that, in order to evaluate the analgesic effect of low and high TENS frequency in the mechanical allodynia induced by the cells, the animals were stimulated for both frequencies for 20 minutes, which were applied by electrodes in the right hind paw. The nociceptive threshold was measured by the von Frey hairs test. To evaluate the involvement of the endocannabinoid system, were pre administered by intra plantar (i.pl.), intrathecal (i.t.) and intra dorsolateral Periaqueductal Gray Matter (i.d.l.PAG) via, the antagonist for cannabinoid receptors type 1 (CB1), the AM 251 and the inhibitor of the enzyme responsible for the degradation of the endocannabinoid anandamide (AEA), the MAFP. Furthermore, were also used the Western blot analysis to investigate the expression of CB1 receptors and immunofluorescence analysis to quantify and co-locate these receptors. Our results found that both frequencies used reverted significantly (P < 0.05) the mechanical allodynia induced by Ehrlich tumor cells. In addition, this effect was reversed by AM251 and prolonged by MAFF, both pre injected by i.pl., i.t. and i.d.l.PAG routes. In addition to these results, the Western Blot analysis showed an increase in expression of CB1 receptors after the application of TENS, in both frequencies, in paw subcutaneous tissues and d.l.PAG, 3 hours after injection Erlinch cells. A similar result was found after immunofluorescence analysis, which found an increase in the number of CB1 receptors after stimulation with TENS, in the dorsal horn of the spinal cord and d.l.PAG. Thus, this study concludes that the endocannabinoid system may be involved in the antinociceptive effect induced by TENS, in both low and high frequency, at central and peripheral levels and suggests that this effect occurs by the activation of the descending inhibitory pain pathway, mainly by release of endocannabinoids and activation of CB1 receptors.

Key words: Endocannabinoids. TENS. Antinociception. Allodynia

LISTA DE FIGURAS

Figura 1- Via ascendente da nocicepo................................................... 21

Figura 2- Esquema representativo da teoria do porto modificada............ 23

Figura 3- Via descendente inibitria da dor e principais reas envolvidas no controle descente....................................................................

24

Figura 4- Ilustrao dos possveis caminhos ativados pela TENS de baixa freqncia (TB) ou de alta frequncia (TA)..................................

29

Figura 5- Representao esquemtica do sistema endocanabinide........ 33

Figura 6- Administrao intraplantar das drogas........................................ 40

Figura 7- Via de administrao intratecal................................................... 41

Figura 8- Equipamento estereotxico utilizado no experimento............ 42

Figura 9- Posicionamento do camundongo para cirurgia estereotxica......

43

Figura 10- Ilustrao do altas Franklin e Paxinos (1997) com a seta indicando a Substancia Cinzenta Periaquedutal dorso lateral.....

45

Figura 11- Representao da injeo de azul de metileno na SCPd.l......... 45

Figura 12- Teste de excluso do corante Azul de Tripan. Visualizao atravs de microscpio................................................................

47

Figura 13- Aparelho de TENS Neurodyn II (IBRAMED, Brasil).................... 48

Figura 14- Imagem da aplicao da TENS, e o posicionamento dos animais na capela......................................................................................

49

Figura 15- Teste de von Frey filamento: aparato utilizado para colocar os animais durante o experimento....................................................

50

Figura 16 Clculo usado para especificar a mdia do limiar mecnico de retirada da pata.............................................................................

51

Figura 17- Esquema com a periodicidade da mensurao do limiar nociceptivo de retirada da pata....................................................

52

Figura 18- Esquema com a periodicidade da mensurao do limiar nociceptivo de retirada da pata, aps a aplicao da estimulao eltrica transcutnea do nervo.................................

52

Figura 19- Esquema com a periodicidade da mensurao do limiar

nociceptivo de retirada da pata, ps injeo da droga e a administrao da estimulao eltrica transcutnea do nervo.....

53

Figura 20- Imagens por imunofluorescncia de receptores CB1, mostrando a expresso do receptor em neurnios na SCPd.l. e no corno dorsal da medula espinal............................................................

71

Figura 21- Esquema do envolvimento do sistema endocanabinide na antinocicepo induzida pela TENS de baixa freqncia (TB) ou de alta frequncia (TA), demonstrando esse efeito a partir da via descendente inibitria da dor, especificada pelos locais de atuao.........................................................................................

84

LISTA DE GRFICOS

Grfico 1- Efeito de diferentes concentraes de clulas tumorais de Ehrlich sobre o limiar nociceptivo mecnico de retirada da pata avaliado pelo teste de filamentos de Von Frey............................................................................................

57

Grfico 2- Efeito da TENS de alta e baixa frequncia sobre o limiar nociceptivo mecnico de retirada da pata em gramas , avaliado filamento de Von Frey aps inoculao do tumor slido de Ehrlich na concentrao de 2,5x106.......................................................................................

58

Grfico 3- Efeito da TENS de baixa frequncia (A) e alta frequncia (B) apsa injeo i.pl. do AM251 sobre o limiar nociceptivo mecnico de retirada da pata, pelo teste de filamentos de Von Frey aps inoculao do tumor slido de Ehrlich na concentrao de 2,5x106............................................................

60

Grfico 4- Efeito da TENS de baixa frequncia (A) e alta frequncia (B) com a injeo intratecal (i.t.) do antagonista do receptor CB1 (AM251), sobre o limiar nociceptivo mecnico de retirada da pata, pelo teste de filamentos de Von Frey aps inoculao do tumor slido de Ehrlich na concentrao de 2,5x106.......................................................................................

62

Grfico 5- Efeito da TENS de baixa frequncia (A) e alta frequncia (B) com a injeo intra substncia cinzenta periaquedutal dorso lateral (i.SCPd.l.) do antagonista do receptor CB1, AM251 sobre o limiar nociceptivo mecnico de retirada da pata, pelo teste de filamentos de Von Frey aps inoculao do tumor slido de Ehrlich na concentrao de 2,5x106.............................

63

Grfico 6- Efeito da administrao intraplantar (i.p.l) do MAFP (inibidor da enzima que degrada Anandamida) sobre o limiar nociceptivo mecnico de retirada da pata, pelo teste de filamentos de Von Frey aps inoculao do tumor slido de Ehrlich na concentrao de 2,5x106............................................................

65

Grfico 7- Efeito da administrao intratecal (i.t.) do MAFP (inibidor da enzima que degrada Anandamida) sobre o limiar nociceptivo mecnico de retirada da pata, pelo teste de filamentos de Von Frey aps inoculao do tumor slido de Ehrlich na concentrao de 2,5x106............................................................

67

Grfico 8- Efeito da administrao intra substncia cinzenta periaquedutal dorso lateral (i.SCPd.l) do MAFP (inibidor da enzima que degrada Anandamida) sobre o limiar nociceptivo mecnico de

retirada da pata, pelo teste de filamentos de Von Frey aps inoculao do tumor slido de Ehrlich na concentrao de 2,5x106.......................................................................................

68

Grfico 9- Deteco por Western Blot da expresso de receptor CB1 a nvel central (SCP e medula) e na periferia (pata) ps aplicao da TENS de alta ou baixa frequncia..........................................

69

Grfico10- Co-localizao atravs de ensaio de imunofluorescncia de receptores CB1 a nvel supra medular: substncia cinzenta periaquedutal (SCP) e medular aps a aplicao da TENS de alta ou baixa frequncia..............................................................

71

LISTA DE ABREVIATURAS E SIGLAS

AC - Adenilil Ciclase

AEA - Anandamida

AM 251 - (N-(peperidina-1-il) -5-(4-iodofenil) -1-(2,4-diclorofenil) -4-metil-1H-pitazole-3-carboixamida)

AM 404 - N- araquidonoilaminofenol

AMPc - Monofosfato cclico de adenosina

ASP - Aspartato

ATP - Trifosfato de Adenosina

CB1 - Receptor para canabinide do tipo 1

CB2 - Receptor para canabinide do tipo 2

CCQ - Receptor de colecistoquinina

DAG - Diacilglicerol

DAGL - Enzima diacilglicerol lipase

DMSO - Dimetilsulfxido ou sulfxido de dimetilo

Ehr - Tumor de Ehrlich

EPM - Erro padro da mdia

FAAH - cido graxo amino hidrolase

g - Gramas

GABA - cido aminobutrico

GLU - Glutamato

Hz - Hertz

i.c.v. - Intra crebro ventricular

i.p. - Intraperitoneal

i.pl. - Intraplantar

i.RVM - Intra regio rostro ventro medial

i.SCP.d.l. - Intra Substancia Cinzenta Periaquedutal dorso lateral

i.t. - Intratecal

i.v. - Intra venoso

IASP - Associao Internacional para o Estudo da Dor

LPS - Lipopolissacardeo

M - Receptor muscarnicos

m/s - Milissegundo

MAFP - cido metil araquidonil fluorfosfano/ (5Z, 8Z, 11Z, 14Z) -5, 8, 11, 14-eicosatetraenil-metil ester fosfofluordrico)

MB - Medida basal

MGL - Monoacilglicerol lipase

mL - Mililitro

Mm - Milmetro

RNA - cido ribonucleico

mRNA - RNA mensageiro

NAPE - N-araquidonoil-fosfatidiletanolamina diacilglicerol

NAPE-PLDN - Fosfolipase D especfica que hidrolisa N-araquidonoil-fosfatidiletanolamina diacilglicerol

NMDA - N-metil D-Aspartato

NRM - Ncleo magno da rafe

NRPG - Ncleo reticular paragigantocelular

PBS - Tampo fosfato salino

PE - Tubo de polietileno

PEA - N-palmitoil-etanolamina

PFA - Paraformaldedo

RIPA - Radioimuno de precipitao

RVM - Regio bulbar rostro ventro medial

s.c. - Subcutneo

SNP - Sistema nervoso perifrico

SCP - Substncia Cinzenta Periaquedutal

SCPv.l. - Substncia cinzenta periaquedutal ventrolateral

SG - Substncia gelatinosa

SNC - Sistema nervoso central

TENS - Estimulao eltrica transcutnea do nervo

THC - 9- tetrahidrocanabinol

VEC - Veculo

VPL - Ventroposterolateral

- Alfa

- Beta

- Delta

l - Microlitro

g - Micrograma

2-AG - 2-Araquidonilglicerol

5HT - Serotonina

5-HT2 / 5-HT3 - Receptores serotoninrgicos

5HTAA - Araquidonoil serotonina

SUMRIO

1 INTRODUAO....................................................................................... 19

2 REVISO BIBLIOGRFICA................................................................. 20

2.1 CONSIDERAES SOBRE A DOR..................................................... 20

2.2 ESTIMULAO ELTRICA TRANSCUTNEA DO NERVO (TENS)... 25

2.3 SISTEMA ENDOCANABINIDE.......................................................... 30

2.3.1 Sistema endocanabinide na modulao da dor............................. 34

3 OBJETIVOS.......................................................................................... 37

3.1 OBJETIVO GERAL................................................................................ 37

3.2 OBJETIVOS ESPECFICOS.................................................................. 37

4 MATERIAIS E MTODOS..................................................................... 38

4.1 ANIMAIS DE EXPERIMENTAO........................................................ 38

4.2 DROGAS............................................................................................... 39

4.3 ADMINISTRAO DAS DROGAS........................................................ 39

4.4 INDUO DO MODELO DE DOR........................................................ 46

4.5 ADMINISTRAO DA ESTIMULAO ELTRICA TRANSCUTNEA DO NERVO (TENS)...............................................................................

47

4.6 AVALIAO DO LIMIAR NOCICEPTIVO............................................. 49

4.7 DELINEAMENTO DO ESTUDO............................................................ 51

4.8 ANLISE DE WESTERN BLOT............................................................ 53

4.9 IMUNOFLUORESCNCIA.................................................................... 54

4.10 ANLISE ESTATSTICA........................................................................ 55

5 RESULTADOS...................................................................................... 56

5.1 EFEITO DA INJEO DO TUMOR DE EHRLICH SOBRE O LIMIAR NOCICEPTIVO MECNICO DE RETIRADA DE PATA........................

56

5.2 EFEITO ANTINOCICEPTIVO DA TENS DE ALTA E BAIXA FREQUNCIA.......................................................................................

57

5.3 EFEITO DO AM251 NA ANTINOCICEPO INDUZIDA PELA TENS DE BAIXA E ALTA FREQUNCIA.........................................................

59

5.4 EFEITO DO MAFP NA ANTINOCICEPO INDUZIDA PELA TENS DE BAIXA E ALTA FREQUNCIA.........................................................

64

6 DISCUSSO.......................................................................................... 72

7 CONCLUSO........................................................................................ 84

REFERNCIAS..................................................................................... 85

19

1 INTRODUO

A dor um mecanismo adaptativo de carter protetor que proporciona s

diversas espcies garantirem a sobrevivncia, uma vez que, so capazes de

reconhecer estmulos nocivos e desencadear respostas fisiolgicas e

comportamentais adequadas de proteo (WALTERS, 2009). Por outro lado, quando

esse sintoma se torna patolgico, prejudica consideravelmente a qualidade de vida e

estima-se que 30% da populao de um pas sofra com esse sintoma sendo

necessrio intervenes para controla-la. Sendo assim, o tratamento farmacolgico

atualmente o mais utilizado para minimizar os sintomas oriundos da dor, entretanto

esse recurso provoca muitos efeitos colaterais, alguns medicamentos so de difcil

acesso alm de possurem um alto custo financeiro. Nesse contexto, recursos no

farmacolgicos ganham destaque, uma vez que a grande maioria envolve baixo custo

financeiro, boa eficcia analgsica e pouqussimos efeitos colaterais. (PALCE et al.,

2010),

Dentro desses recursos no farmacolgicos, destaca-se a estimulao eltrica

transcutnea do nervo, que devido a sigla derivada do nome em ingls

(Transcutaneous Eletrical Nerve Stimulation) conhecido popularmente como TENS.

A TENS um mtodo no invasivo de fcil aplicabilidade e com resposta analgsica

comprovada (DESANTANA et al., 2009). Alm disso, a TENS consiste na aplicao

de estimulo eltrico a partir de eletrodos prprios colocados sobre a pele e

comumente utilizado no tratamento de dores agudas e crnicas (DESANTANA et al.,

2008).

Em relao a resposta analgsica proporcionada pela TENS, estudos sugerem

que esse efeito est relacionado tanto a nvel central quanto ao perifrico e os

mecanismos neurofisiolgicos so evidenciados principalmente pela liberao de

neurotransmissores endgenos e consequente ativao de seus respectivos

receptores. (VANCE et al., 2014).

No entanto, apesar de diversos estudos salientarem a eficcia analgsica

proporcionada pela TENS, os mecanismos envolvidos que explicam esse efeito

antinociceptivo ainda no esto completamente esclarecidos.

20

2 REVISO BIBLIOGRFICA

Os tpicos a seguir, apresentam o embasamento terico e contextualizaes

referentes aos temas de maior relevncia nesse estudo.

2.1 CONSIDERAES SOBRE A DOR

A cincia descreve a dor como uma modalidade sensorial importante na

evoluo do indivduo, cuja principal funo a comunicao de danos estruturais ou

funcionais do corpo, atravs de informaes concernentes localizao e

intensidade dos estmulos nocivos e potencialmente lesivos, de forma que alguma

reao de defesa possa ser tomada, evitando danos maiores e preservando a

integridade do indivduo (MILLAN, 1999).

Assim, a dor foi conceituada, em 1986, pela Associao Internacional para o

Estudo da Dor (IASP), como uma experincia sensorial e emocional desagradvel

que est associada com leses reais ou potenciais ou descrita em termos de tais

leses (MERSKEY, H.; BOGDUK, N, 1994).

Nesse sentido, essa reao pode ser considerada uma experincia subjetiva

complexa, que no envolve apenas a transduo de um estmulo nocivo ambiental,

mas tambm o processamento cognitivo e emocional pelo encfalo (JULIUS;

BASBAUM, 2001).

Nesse contexto, existe uma diferena conceitual quando utiliza-se os termos

nocicepo e dor. O primeiro conceito consiste na recepo e decodificao do

estmulo nocivo por estruturas altamente especializadas do sistema nervoso

denominados: nocieptores. Essas estruturas consistem em terminaes nervosas

livres associadas a fibras aferentes primrias (carreiam estimulo nociceptivo da

periferia medula) com caractersticas distintas (limiar de ativao e sensibilidade)

em relao a outras estruturas nervosas sensoriais. Entre essas fibras aferentes

temos as do tipo C e A, que possuem um menor calibre e esto relacionadas

transduo e conduo do estimulo nocivo, vale ressaltar que as fibras C so

file:///C:/Users/Herick-Pc/Desktop/Mestrado%20UNIFAL/projeto/PROJETO%20MESTRADO%20%20%20RELATORIO%20corrigido.docx%23_ENREF_239file:///C:/Users/Herick-Pc/Desktop/Mestrado%20UNIFAL/projeto/PROJETO%20MESTRADO%20%20%20RELATORIO%20corrigido.docx%23_ENREF_145

21

amielinizadas (ausncia de mielina, uma camada de revestimento rica em lipdios e

protenas que possuem ndulos de Ranvier o qual, proporcionam aumento da

velocidade de conduo do estimulo pela fibra) e as fibras A apresentam mielina e

possuem uma maior velocidade de conduo do impulso nervoso em relao a fibra

C (JULIUS; BASBAUM, 2001).

Na medula espinal, essas fibras aferentes primrias fazem sinapse com

neurnios de segunda ordem, que por sua vez, ascendem a reas supra-espinhais

por meio tratos neuronais especficos, como por exemplo, o trato espinotalmico.

Assim, os neurnios de segunda ordem faro no tlamo uma segunda sinapse com

neurnios de terceira ordem, os quais enviaro a informao nociceptiva at as reas

especficas do crtex cerebral, onde aspectos como intensidade, localizao e

durao do estmulo nociceptivo sero integrados e componentes afetivos e

emocionais sero interpretados e contextualizados, proporcionando a percepo da

dor (VANDERAH, 2007). Figura 1.

Figura 1- Via ascendente da nocicepo. Fonte: Adaptado de LONG-BALINOT, 2010. Nota: Os axnios das fibras aferentes primrias (C e A) que inervam as regies

perifricas transmitem o impulso nociceptivo at as lminas do corno dorsal da medula espinal, onde neurnios de segunda ordem repassam a informao para tratos neurais ascendentes.

22

Existem tambm as fibras A que so mielinizadas, mais calibrosas e detectam

estmulos incuos aplicados na pele, msculos e articulaes e em condies

fisiolgicas no so relacionadas transmisso dolorosa (JULIUS; BASBAUM,2001).

Em continuidade contextualizao da dor, de acordo com o protocolo de

terminologia bsica proposta pela IASP, existem terminologias que esto diretamente

relacionadas com essa sintomatologia como a hiperalgesia" que um termo

psicofsico utilizado para todas as condies que envolvem aumento da sensibilidade

dor. Como tal, essa definio correlaciona-se com o termo '' sensibilizao " que

uma reduo no limiar nociceptivo e um aumento na resposta a diferentes estmulos

supra limiares. tambm importante ressaltar a terminologia Alodnia, que

mediada pela ativao perifrica de receptores tteis, que tornam-se processadas por

caractersticas nociceptivas, sendo assim, h a percepo da dor em resposta a um

estmulo perifrico normalmente incuo (LOESER, 2008).

Em adio, a dor tambm pode ser classificada como: dor inflamatria (envolve

estruturas somticas, caracterizada por intensa hipersensibilidade); dor visceral

(caracterizada por ser profunda, mal localizada e, frequentemente referida a uma

regio cutnea) e dor neuroptica (envolvendo leses do sistema nervoso)

(SCHAIBLE, 2006).

importante tambm, a caracterizao temporal da dor, fazendo distino entre

dor aguda, que tipicamente surge do trauma de tecidos moles ou inflamao e est

relacionada com um processo adaptativo biolgico para facilitar o reparo tecidual e

cicatricial, ou dor crnica, que persiste alm do perodo esperado de uma doena ou

leso e tem sido arbitrariamente definida como aquela com durao maior que 3 a 6

meses (LAMONT; TRANQUILLI, 2000).

O fenmeno da dor dinmico, uma vez que, ao longo de todo trajeto nervoso,

as aferncias nociceptivas recebem inmeros estmulos excitatrios e inibitrios de

diferentes mecanismos de modulao da dor que podem ocorrer no sistema nervoso

perifrico (SNP) pela ao de neuromediadores como bradicinina, prostaglandina e

serotonina, e no sistema nervoso central (SNC) pela transmisso de

neurotransmissores como noradrenalina, serotonina, encefalina e dopamina (SOUZA,

2009).

Em relao esses mecanismos de modulao da dor, existem teorias como a

Teoria do Porto da Dor, (figura 2) a qual admite existir nos cornos posteriores da

medula espinal um mecanismo neuronal que atua como porto, podendo aumentar

23

ou diminuir impulsos provenientes de fibras aferentes nociceptivas perifricas s

regies supraespinais, ocorrendo ento uma resposta reguladora, mesmo antes de

acontecer a interpretao desse impulso como uma resposta dolorosa (MELZACK;

WALL, 1965; MILLAN, 1999).

De acordo com essa teoria, Melzack e Wall (1965), explicam que a ativao de

nocieptores perifricos e a consequente estimulao das fibras nociceptivas aferentes

que levam esse estimulo at o corno dorsal da medula, mais especificadamente na

lmina II (substncia gelatinosa- SG), pode ser inibida pela ativao de fibras tteis

do tipo A, as quais so muito mielinizadas e conduzem o estmulo mais rapidamente

que as fibras nociceptivas at essa rea da medula, onde iro ativar interneurnios

inibitrios, que por sua vez, iro modular e regular a sinapse entre as fibras aferentes

nociceptivas primarias e os neurnios de segunda ordem responsveis pela

transmisso do estmulo ao SNC, atravs do trato espinotalmico. Dessa maneira, o

estimulo aferente que anteriormente seria nociceptivo passa a ser minimizado e/ou

inibido.

Figura 2- Esquema representativo da teoria do porto da dor. Fonte: Adaptado MELZACK, 1999. Nota: ..... Observa-se as fibras no nociceptivas (A, A) ativando

.......... interneurnios na substncia gelatinosa (SG), os

...........quais inibem os impulsos provenientes das fibras

...........nociceptivas (A e C).

24

Outra teoria que enfatiza a modulao da dor est relacionada ativao a

nvel central de uma via inibitria descendente a partir da Substncia Cinzenta

Periaquedutal (SCP). Essa teoria foi inicialmente estudada por Reynolds (1969), o

qual observou que a estimulao eltrica na substncia cinzenta periaquedutal (SCP),

produzia analgesia intensa em ratos Wistar (TOKADA et al., 2004).

Sendo assim, quando a SCP estimulada, por meio dos prprios estmulos

nocivos ascendentes oriundos tambm do trato espinomesenceflico, ativa um circuito

que excita uma rea do bulbo denominada regio rosto ventro medial (RVM), que

compreende o ncleo magno da rafe (NRM) e o ncleo reticular paragigantocelular

(NRPG), a partir da, por fibras que percorrem o funculo dorsolateral da medula

espinal, formando conexes com interneurnios do corno dorsal na medula. Essas

clulas nervosas atuam modulando estmulos nocieptores ascendentes atravs da

liberao de neurotransmissores (figura 3), de modo que esse sistema inibitrio

descendente possa fazer parte de uma ala de retroalimentao reguladora, atravs

da qual a transmisso pelo corno dorsal controlada de acordo com os estmulos que

alcanam a regio do tlamo (MILLAN, 2002).

Figura 3- Via descendente inibitria da dor e principais reas envolvidas no controle descente. SCP:

Fonte: . adaptado de KANDEL,2000. Nota: .. SCP: substncia cinzenta periaquedutal; NRM: ..................ncleo magno da rafe; DRG: gnglio da raiz dorsal.

25

Alm desses controles endgenos para a modulao da dor, existem tambm

alternativas exgenas como a morfina, iniciada no sculo XIX, um alcalide isolado a

partir do pio, que representou um significativo avano dentro da terapia da dor. A

partir desse advento, com o desenvolvimento de novos analgsicos, e aps o

surgimento da seringa e da agulha em 1846, essas drogas comearam a ser utilizadas

para o controle da dor durante procedimentos cirrgicos e no cirrgicos. No entanto,

devido aos inmeros gastos econmicos e efeitos adversos oriundos da terapia

farmacolgica para o controle da dor, outros tipos de tratamentos, como os

tratamentos no farmacolgicos, tem obtido cada vez mais importncia os quais

destacam a cinesioterapia, hidroterapia, termoterapia e principalmente a estimulao

eltrica transcutnea do nervo (BONICA; LOESER, 2001).

2.2 ESTIMULAO ELTRICA TRANSCUTNEA DO NERVO (TENS)

A utilizao do estmulo eltrico para fins teraputicos, datada inicialmente

em 2.500 A.C., onde h evidncias de que os antigos egpcios usavam peixe

eltrognico para tratar doenas. Posteriormente, o mdico romano Scribonius Largus

creditado como primeiro a documentar a utilizao desses peixes eletrognicos para

esses fins em 46 D.C. Alm disso, com o desenvolvimento de geradores eletrostticos

no sculo XVIII, as pesquisas envolvendo o recurso eltrico aumentaram. Em 1858,

Francis, recebeu uma patente da Associao de estudo dos Cirurgies Dentistas dos

E.U.A, aps desenvolver um instrumento magntico vibratrio com corrente interrupta

que propiciava analgesia em seus procedimentos odontolgicos. Em seu trabalho ele

descreveu 164 extraes de dente indolores realizadas juntamente com a aplicao

dessa corrente. (KANE; TAUB, 1975).

Aps um longo perodo sem grandes estudos a respeito do uso de energia

elctrica para fins teraputicos, esse tema volta a despertar interesse em 1965,

suportado pela hiptese do mecanismo demonstrado por Melzack e Wall (1965), que

idealizaram a teoria das comportas. Essa teoria sugere a importncia da estimulao

de fibras no nociceptivas de maior calibre na modulao da dor. Nesse mesmo

enfoque, Wall e Sweet (1967), usando uma estimulao eltrica percutnea de alta

frequncia (50-100 Hz), observaram o alvio da dor crnica em pacientes. Alm disso,

file:///C:/Users/Herick-Pc/Desktop/Mestrado%20UNIFAL/projeto/PROJETO%20MESTRADO%20%20%20RELATORIO%20corrigido.docx%23_ENREF_32

26

Reynolds (1969), utilizou a corrente eltrica para estimular a SCP em ratos, concluindo

que a estimulao somente nesse local induziu analgesia, sem que o estmulo fosse

aplicado em todo o crebro.

Atualmente, a TENS tem sido o estmulo eltrico mais utilizado clinicamente com

objetivo de modular a dor. Esse recurso definido pela American Physical Therapy

Association como a aplicao de estmulos eltricos na superfcie cutnea para

controle lgico. A TENS trata-se de um aparelho amplamente utilizado na prtica

clnica fisioteraputica como terapia analgsica simples, o qual tem algumas

vantagens como no ser um tratamento farmacolgico e invasivo, alm de possuir

baixo custo financeiro. (SLUKA et al. 2003).

De acordo com Orange (2003), a TENS um recurso seguro que modula a dor,

favorecendo ao indivduo a execuo de suas atividades de via diria. Sua

aplicabilidade consiste de um estimulador sensitivo, pelo qual os impulsos da corrente

so transmitidos atravs da pele por meio de eletrodos com auxlio de gel a base de

gua para no haver interrupes nessa transmisso.

Segundo Claydon e colaboradores (2011), essa supresso da dor

proporcionada pela TENS, pode ocorrer a nvel perifrico atravs de ativao de

receptores noradrenrgicos do tipo 2A ou de receptores opiidergicos do tipo , os

quais uma vez ativados podem modular a excitabilidade de fibras nociceptivas

aferentes primrias.

Quando verificado a atuao da TENS a nvel medular, aps a aplicao,

principalmente da alta frequncia, h uma reduo da liberao de

neurotransmissores excitatrios como glutamato e substncia P, em ratos com

modelo de inflamao intra articular (joelho) por carragenina. A reduo de glutamato

revertida pelo bloqueio espinal de receptores com a administrao i.t de naltrindole

(antagonista receptor opiides) (SLUKA et al., 2005). No entanto, a nvel supra

medular, a antinocicepo ocorre principalmente pela estimulao da via inibitria

descendente da dor, com consequente ativao de receptores opiides, gabargico,

serotoninrgicos e muscarnicos no corno dorsal da medula (VANCE et al., 2014);

Esse esclarecimento elucidado com o bloqueio dos receptores opiides

(DeSANTANA et al., 2009), dos receptores GABA, de serotonina (5-HT2A e 5-HT3) e

dos receptores colinrgicos (M1 e M3), por meio da injeo i.t. na medula espinal de

ratos, onde verificaram reverso do efeito antinociceptivo proporcionado pela TENS

(RADHAKRISHNAN et al., 2003).

27

Sendo assim, umas das primeiras teorias mais vigentes para justificar o

mecanismo de analgesia proporcionado pela TENS a teoria das comportas. Em

concordncia com essa teoria, estudos sugerem que a TENS estimula as fibras

sensoriais do tipo A e proporciona analgesia atravs da ativao dos interneurnios

inibitrios situados no corno dorsal da medula. Esse processo de reduo ou

minimizao da transmisso da dor conhecido como neuromodulao (YAKSH et

al., 1994; SLUKA; WALSH, 2003).

Dando nfase na analgesia proporcionada pela TENS pela ativao da teoria

das comportas, Woolf e Thompson (1994), sugerem que as caractersticas

eletrofisiolgicas da TENS relacionam-se a parmetros como a frequncia utilizada,

durao do pulso e tempo de aplicao. A alterao desses parmetros pode ativar

de maneira seletiva diferentes fibras nervosas, alm de promover estmulos

musculares que tendem a produzir resultados analgsicos de caractersticas

temporais diferentes, principalmente por meio da ativao de fibras nervosas de maior

dimetro como A e A que tm baixo limiar de ativao a estmulos eltricos quando

comparada com fibras de menor dimetro (A e C) (WOOLF E THOMPSON, 1994).

Alm da teoria das comportas, alguns estudos mostram que a TENS capaz de

ativar o sistema descendente inibitrio da dor e modular a atividade dos neurnios

envolvidos na transmisso de impulsos nociceptivos situados no corno dorsal da

medula pela liberao de opiides endgenos (SLUKA et al., 2003; CARROL et al.,

2005).

Para proporcionar esse efeito, a TENS possui parmetros que so utilizados de

acordo a especificidade do tratamento. Inicialmente, a TENS era classificada em

quatro modalidades: convencional (apresentando baixa intensidade e alta frequncia,

entre 10 a 200 Hz), acupuntura (alta intensidade e baixa freqncia, entre 2 a 4 Hz),

burst (alta intensidade e freqncia entre 70 e 100 Hz, com modulaes de pulso de

0,5ms) e breve-intensa (alta intensidade e freqncia entre 100 e 150 Hz).

Atualmente, h uma tendncia em classific-la em apenas de baixa frequncia

(50Hz) (DESANTANA et al., 2008).

Em relao s essas frequncias, estudos sugerem que quando utilizada a alta

frequncia h uma atuao das fibras A, com consequente ativao da teoria das

comportas a nvel medular (SLUKA et al., 2003). Estudo realizado por Lee e

colaboradores (1985), investigou a inibio de clulas do trato espinotalmico pela

TENS em sete macacos anestesiados. As clulas desse trato eram ativadas por

28

estimulao do nervo fibular comum em uma intensidade supra limiar para fibras C.

As respostas evocadas por essas fibras eram comparadas antes, durante e aps a

aplicao da TENS durante cinco minutos. Em quatorze clulas do trato

espinotalmico, alguns graus de inibio de fibras C ocorriam somente quando a

intensidade da TENS excedia o limiar de fibras A. Para algumas intensidades de

estimulo, pulsos de baixa freqncia, eram mais efetivos que os de alta frequncia.

De acordo com esse trabalho, a TENS era mais efetiva quando aplicada dentro do

campo receptivo dessas clulas e que a ativao de fibras do tipo C, registrada a partir

do nervo perifrico, no foi reduzida em magnitude, e no houve mudanas em sua

latncia devido a TENS. Com isso, a inibio da atividade de clulas do trato

espinotalmico no foi alterada apreciavelmente aps injeo do cloridrato de

naloxona. Esse estudo sugere que a TENS pode produzir inibio no sistema nervoso

central (SNC), por ativarem fibras aferentes A e que os efeitos inibitrios da TENS

nas clulas do trato espinotalmico ocorreu devido a um mecanismo que no

envolvesse liberao de substncias opiides endgenas.

Abrangendo ainda a relao das frequncias na analgesia proporcionada pela

TENS, Salar e colaboradores (1981), demonstraram que a TENS de alta frequncia

aumenta a concentrao de endorfinas na corrente sangunea e no lquido

cefalorraquidiano e metionina-encefalina no liquido cefalorraquidiano, em humanos.

Alm disso, antinocicepo produzida pela TENS de alta frequncia foi inibida

pelo bloqueio de receptores opiides, muscarnicos (M1 e M3) e receptores para

GABA na medula espinal. J, a reduo da hiperalgesia pela TENS de baixa

frequncia foi inibida pelo bloqueio dos receptores opiides, GABAA,

serotoninrgicos (5-HT3) e muscarnicos (M1 e M3) nesse mesmo local (DeSANTANA

et al., 2009; RADHAKRISHNAN et al., 2003, KALRA et al., 2001, SLUKA et al., 1999).

Assim, esses estudos sugerem que a TENS alta e baixa freqncia

proporcionam seus efeitos antinociceptivos pela ativao dos receptores

muscarnicos, e opiides e na medula e receptores e na RVM. Alm disso, a

TENS de baixa frequncia liberta serotonina na medula espinal e ativa os receptores

serotoninrgicos 5HT2 e 5HT3, e a TENS de alta freqncia libera GABA que ativa

receptores GABAA. Contudo, ambas as frequncias, reduziram a sensibilizao

neuronal no corno dorsal da medula e a consequente hiperalgesia (MA E SLUKA,

2001). Em suma, a TENS de alta e baixa frequncia utilizam mecanismos opiides

29

para produzir analgesia pela ativao de neurnios na SCP, na RVM e na medula

espinal (DeSANTANA et al., 2009) (Figura 4).

Figura 4 Ilustrao dos possveis caminhos ativados pela TENS de ....................baixa freqncia (TB) ou de alta frequncia (TA). Fonte: ........Adaptado DESANTANA et al., 2009. Nota: ..........Projees da substncia cinzenta periaquedutal ventrolateral ...........v.......(SCPv.l.) enviam informaes para a medula rostro ventro ....................medial (RVM), que por sua vez envia projees para a medula ....................espinal promovendo a modulao da nocicepo. ....................Receptores envolvidos na antinocicepo produzida pela ....................TENS so listados em cada local. 5HT- serotonina; ASP- ....................aspartato; GABA - cido aminobutrico; Glu- glutamato; M -...................receptor muscarnicos.

Entretanto, vale ressaltar que o bloqueio dos receptores serotoninrgicos ou

noradrenrgicos na medula espinal no alterou a reverso da hiperalgesia produzida

pela TENS de alta frequncia (RADHAKRISHNAN et al., 2003).

Desse modo, novas vias envolvidas na antinocicepo proporcionada pela TENS

podero ainda ser descobertas. Seguindo esse raciocnio, o presente estudo objetivou

30

investigar a participao do Sistema Endocanabinide no efeito antinociceptivo

induzido pela TENS em modelo de dor inflamatria.

2.3 SISTEMA ENDOCANABINIDE

Um dos primeiros indcios do uso teraputico de canabinides foi descrito por

Carolus Linnaeus em 1753, o qual relatou que a folha e a flor da Cannabis sativa eram

utilizadas para uso medicinal h milhares de anos. A Cannabis sativa possui mais de

60 compostos terpenofenlicos denominados canabinides, cujo, o principal princpio

ativo o 9- tetrahidrocanabinol (THC). Esse princpio ativo possui uma caracterstica

lipoflica e por esse motivo acreditavam-se, a princpio, que seu mecanismo de ao

seria proporcionado pela interao e modificao da fluidez da membrana plasmtica.

(WILSON; NICOLL, 2002).

No entanto, Howlett (1984), demonstrou que os canabinides possuam um

outro meio de atuao. Atravs da cultura de neuroblastoma observou que havia uma

diminuio da quantidade de AMPc (Adenosina Monofosfato Cclico), um mediador

intracelular caracterizado como um segundo mensageiro que regula muitos aspectos

da funo celular, incluindo enzimas envolvidas no metabolismo energtico, diviso e

diferenciao celular, transporte de ons etc. (HADLEY, 1988). Sugerindo assim, que

a ao dos canabinides fosse por meio de receptores acoplados a protena G.

(HOWLETTET al., 2004).

Novos estudos direcionaram para esse achado e a existncia do sistema

canabinide endgeno foi inicialmente investigada em 1988, por meio da tcnica de

radioimunoensaio realizada em crebros de ratos, que demonstrou a ligao

consistente de um canabinide exgeno a um receptor associado a um sistema de

segundo mensageiro, por meio da protena G. Alm disso, a saturabilidade dessa

ligao consistente com valores reportados para canabinides (DEVANE et al.,

1988).

Logo em seguida, Matsuda e colaboradores (1990), relataram a clonagem e

expresso de um DNA complementar, a partir do crebro de ratos, que codificou um

receptor acoplado a protena G, o qual apresentava todas as propriedades

direcionadas para canabinides (natureza hidrofbica, envolvimento com a protena

file:///C:/Users/Herick-Pc/Desktop/Mestrado%20UNIFAL/projeto/PROJETO%20MESTRADO%20%20%20RELATORIO%20corrigido.docx%23_ENREF_79file:///C:/Users/Herick-Pc/Desktop/Mestrado%20UNIFAL/projeto/PROJETO%20MESTRADO%20%20%20RELATORIO%20corrigido.docx%23_ENREF_79

31

G, e maior responsividade para canabinides psicoativos). A partir dessa descoberta,

sugeriu-se ento, a relao de canabinides com a superfamlia dos receptores

acoplados protena G, o qual negativamente acoplado ao Adenilil Ciclase (AC),

podendo inibir a converso do ATP (Trifosfato de Adenosina) em Monofosfato cclico

de adenosina (AMPc) e, consequentemente, inibir a abertura de canais de clcio

voltagem-dependente (MATSUDA et al., 1990).

A partir de ento, ocorreu a descoberta do primeiro receptor canabinide, o qual

foi descrito como receptor para canabinide do tipo 1 (CB1). Dogrul e colaboradores

(2012), verificaram que a expresso do CB1 mais significativa no sistema nervoso

central (SNC), principalmente nas regies cerebrais envolvendo crtex, hipocampo,

amigdala, gnglios basais, substncia negra reticular, globo plido e cerebelo. Alm

disso, so encontrados tambm em reas que esto envolvidas na transmisso e

modulao da dor, como na SCP, bulbo rostro ventromedial e no corno dorsal da

medula.

No entanto, estudos mostram que h existncia desses receptores tambm na

periferia, mais precisamente na glndula adrenal, tecido adiposo, corao, fgado,

pulmo, prstata, tero, ovrio, testculo, medula ssea, timo e tal dispem-se

preferencialmente pr-sinapticamente nos axnios e terminais de neurnios,

mediando a inibio da libertao de neurotransmissores (HOHMANN; HERKENHAM,

1999; GUINDON, 2009).

Com novos estudos e investigaes desse sistema, foi descoberto

posteriormente um segundo receptor para canabinide (CB2), localizado

principalmente em regies do sistema imune responsveis pela produo e regulao

de clulas imunes (mastcitos, clulas B, clulas T4 e T8, e macrfagos), como em

bao, amigdalas e timo (PERTWEE; ROSS, 2002; VAN SICKLE et al 2005).

Alm disso, estudos utilizando ferramentas farmacolgicas e genticas apontam

para a existncia de outros receptores canabinides, entretanto so necessrios mais

trabalhos para sustentar essa hiptese. (DOGRUL et al., 2012).

Com a descoberta dos receptores canabinides, questionamentos para

possveis ligantes endgenos ficaram em aberto. Nesse contexto, foi isolado o

primeiro endocanabinide" a partir de tecido cerebral, descrito como Anandamida

(AEA). Logo em seguida, outros endocanabinides foram isolados, principalmente o

2-Araquidonilglicerol (2-AG). (DEVANE et al., 1992, MECHOULAM et al., 1995).

file:///C:/Users/Herick-Pc/Desktop/Mestrado%20UNIFAL/projeto/PROJETO%20MESTRADO%20%20%20RELATORIO%20corrigido.docx%23_ENREF_219

32

Ambos AEA e 2-AG se ligam aos receptores para canabinides do tipo CB1 e CB2,

apresentando diferentes afinidades e eficcias (HOWLETT, 2002).

Esses endocanabinides so caracterizados como molculas de sinalizao

para lpidos endgenos sintetizados na membrana celular (DI MARZO, 2008).

Segundo Jin e colaboradores (2009), diferentes enzimas esto envolvidas na sntese

de AEA e 2-AG. Estudos anteriores salientavam que a clivagem enzimtica de

endocanabinides fosse somente de um precursor fosfolpide, o N-araquidonoil-

fosfatidiletanolamina (NAPE), que quando hidrolisado por uma fosfolipase D

especfica (NAPE-PLD) originava a AEA. No entanto, camundongos Knockout NAPE-

PLD no mostraram dficit na produo de AEA, sugerindo possivelmente que outras

enzimas possam estar envolvidas na biossntese desse endocanabinide (LEUNG et

al., 2006; LIU et al., 2008).

Em relao a biossntese do 2-AG, esse sintetizado a partir da hidrlise do seu

precursor diacilglicerol (DAG) pela enzima diacilglicerol lipase (DAGL) (BISOGNO,

2003).

Esse processo de biognese de endocanabinides regulado mediante fatores

intrnsecos como a despolarizao da membrana, aumento no nvel de clcio

intracelulares e o estmulo nos receptores para canabinides. (DI MARZO, 2008).

Em conjunto, os endocanabinides possuem propriedades canabimimeticas e

aps sintetizados ligam ou ativam um ou mais subtipos de receptores (AEA

preferencialmente a CB1). Desse modo, eles esto envolvidos em diferentes funes

fisiolgicas, como a regulao da ingesto alimentar, imunomodulao, inflamao,

analgesia, comportamentos e outras (DI MARZO; DE PETROCELLIS, 2006).

Em suma, a partir da sua sntese no neurnio pssinptico, os

endocanabinides so liberados na fenda sinptica de acordo com o aumento de

clcio intracelular. Logo em seguida, ativam os receptores CB1 e CB2 no neurnio pr-

sinpticos, por meio de um mecanismo de sinalizao retrograda, restringindo a

atividade neuronal, com consequente inibio de alguns neurotransmissores, como o

glutamato. Aps ativarem seus receptores, a AEA e 2-AG so removidos da fenda

sinptica e direcionadas para dentro do neurnio ps e pr-sinptico, por meio de uma

protena de membrana com funo recaptadora (SAITO et al., 2010).

Depois de recapturados aos seus respectivos neurnios, os endocanabinides

sero metabolizados. O metabolismo desses endocanabinides (AEA e 2-AG)

ocorrem atravs de hidrlise enzimtica, pela ao da cido graxo amino hidrolase

33

(FAAH) e pela monoacilglicerol lipase (MGL) (GIUFFRIDA et al., 2001; KARLSSON et

al., 1997) (Figura 5).

Em adio, estudos verificaram que a administrao de inibidores da FAAH e

de MGL, promoveu aumento da expresso de endocanabinides (AEA e 2-AG

respectivamente). Alm da administrao desses inibidores enzimticos, antagonistas

e agonistas de receptores para canabinides podem auxiliar em estudos a respeito da

ativao desse sistema e as diversas funes por ele desempenhada (HOWLETT,

2002).

Figura 5 - Representao esquemtica do sistema endocanabinide. Fonte: .......Adaptado de Sato et al., 2010. Nota: ........AEA: Anandamida/ 2- AG: 2 Araquidonilglicerol / FAAH: cido Graxo ..................Aminohidrolase / MGL: Monoacilglicerol Lipase/ TRPV1: Receptor Vanilide ..................de Potencial Transitrio do Tipo 1 / CB1-CB2: Receptores canabinides tipo ..................1 e tipo 2.

file:///C:/Users/Herick-Pc/Desktop/Mestrado%20UNIFAL/projeto/PROJETO%20MESTRADO%20%20%20RELATORIO%20corrigido.docx%23_ENREF_108file:///C:/Users/Herick-Pc/Desktop/Mestrado%20UNIFAL/projeto/PROJETO%20MESTRADO%20%20%20RELATORIO%20corrigido.docx%23_ENREF_164file:///C:/Users/Herick-Pc/Desktop/Mestrado%20UNIFAL/projeto/PROJETO%20MESTRADO%20%20%20RELATORIO%20corrigido.docx%23_ENREF_164

34

2.3.1 Sistema endocanabinide na modulao da dor

Os receptores para canabinides e endocanabinides, bem como as enzimas

que controlam sua sntese e degradao, esto localizados em vrios nveis do neuro-

eixo, envolvendo estruturas tanto da periferia quanto do SNC (Hohmann, 2002).

Sendo assim, Tsou e colaboradores (1998) descrevem a localizao dos

endocanabinides e seus respectivos receptores na via de modulao da dor,

principalmente em locais como como SCP, NMR, ncleo reticular paragigantocelular

e corno dorsal da medula espinal.

A participao desse sistema nessas regies tambm foi relatada por Martin e

colaboradores (1996), aps administrarem por via intravenosa, o agonista canabinide

WIN 55,212-2, que suprimiu a atividade de neurnios presentes no ncleo

ventroposterolateral (VPL) do tlamo, evocada por estmulo nocivo mecnico aplicado

de maneira gradual sobre a pata em ratos.

Alm disso, a analgesia induzida por estresse, em um modelo de estmulo

eltrico aplicado nas patas de ratos, foi correlacionada com o aumento da expresso

de 2-AG e AEA, principalmente na SCP (HOHMANN et al., 2005).

Outras reas de modulao do impulso nociceptivo, como o NMR e o ncleo

paragigantocelular, tm demostrado considervel importncia na analgesia frente a

agonistas canabinides sintticos, uma vez que, a administrao direta desses

agonistas nessas reas, aumentou a latncia da retirada da cauda no teste tail-flick,

correlacionando esse efeito antinocicepo. No entanto, a administrao desses

agonistas na regio ventrolateral ou anterior da SCP no alterou a latncia de retirada

da cauda (MARTIN et al.,1998).

Em adio, estudos eletrofisiolgicos tambm tm auxiliado a desvendar a

participao dessas reas no mecanismo da antinocicepo induzida por essas

substncias. Esses registros tm fornecido uma evidncia direta que os canabinides

exgenos podem modular as clulas ON OFF, situadas no bulbo rostro ventromedial

(RVM) do tronco enceflico, as quais aumentam ou inibem o impulso nociceptivo

(MENG; JOHANSEN, 2004).

Meng e colaboradores (1998), demonstraram tambm que a antinocicepo

produzida em ratos aps a administrao i.v. de WIN55,212-2 (agonista do receptor

canabinide), foi bloqueada nos animais que receberam uma pr microinjeo na

file:///C:/Users/Herick-Pc/Desktop/Mestrado%20UNIFAL/projeto/PROJETO%20MESTRADO%20%20%20RELATORIO%20corrigido.docx%23_ENREF_216

35

RVM de muscimol (agonista do receptor GABAA) quando comparado ao grupo

controle, formado por animais que no receberam o muscimol. Sugerindo uma

interao entre os sistemas gabargico e canabidinoidrgico na via descendente da

dor, uma vez que quando ativado o sistema gabargico, no h atividade

canabinoidrgica. Alm disso, estudos tem demonstrado que os receptores CB1

inibem a ao inibitria do GABA na SCP, facilitando a ativao da via descendente

da dor.

A nvel medular, quando investigado por meio de um ensaio de

imunofluorescncia, observou-se a presena expressiva do receptor CB1,

principalmente nas lminas I e II da medula espinal, sugerindo a importncia dessa

rea como um stio de atuao dos endocanabinides, com consequente funo de

modulao do processamento nociceptivo (FARQUHAR-SMITH et al., 2000).

Borsani e colaboradores (2007), sugerem que esse a AEA, assim como

receptor CB1, tambm esto envolvidos na modulao da dor a nvel medular, uma

vez que o aumento da expresso de c-fos (um marcador da ativao neuronal) no

corno dorsal da medula, induzida pelo teste da formalina (teste algesimtrico

caracterizado pela injeo de um agente lgico na pata de roedores, os quais

respondem lambendo a pata testada), foi reduzido pelo pr-tratamento com o AM 404

(inibidor da recaptao de Anandamida).

Alm disso, Petrosino e colaboradores, (2007), encontraram um aumento dos

nveis de AEA e 2-AG tanto na medula espinal quanto em regies supra medulares

como o ncleo dorsal da rafe, SCP e RVM, aps induo de neuropatia em ratos.

Sugerindo que esses endocanabinides so regulados positivamente durante uma

constrio do nervo citico.

Perifericamente, um estudo utilizando a tcnica de imunohistoquimica,

demonstrou a existncia de receptores de canabinides tanto CB1 quanto CB2 na pele

humana, mais precisamente em algumas estruturas como: fibras nervosas da pele,

mastcitos, glndulas sudorparas e clulas sebceas. Sugerindo a presena desse

sistema a esse nvel (STNDER et al., 2005).

Ao investigar antinocicepo, Mitrirattanakul e colaboradores (2006) tambm

evidenciaram o envolvimento do sistema endocanabinide a nvel perifrico. Isso foi

demonstrado aps a induo de neuropatia em ratos, onde receptores para

canabinides e seus ligantes endgenos apresentaram uma maior expresso no

gnglio da raiz dorsal dos nervos perifricos ipsilateral leso.

file:///C:/Users/Herick-Pc/Desktop/Mestrado%20UNIFAL/projeto/PROJETO%20MESTRADO%20%20%20RELATORIO%20corrigido.docx%23_ENREF_95

36

Romero e colaboradores (2013), demonstraram que endocanabinides (AEA e

N-palmitoil-etanolamina - PEA) promoveram antinocicepo perifrica pela ativao

de receptores CB1 e CB2. Alm disso, os autores verificaram que esse efeito est

relacionado com a ativao do sistema noradrenrgico endgeno, por meio da

ativao de receptores adrenrgicos perifricos pela liberao de noradrenalina

endgena. Para isso, foi demonstrado que, os antagonistas de adrenoceptores

seletivos (2C rauwolscine; propranolol) e no seletivos (2- ioimbina; 1

prazosina) promoveram um bloqueio dessa antinocicepo induzida pela AEA e PEA.

Assim, sabendo que o sistema endocanabinide tem um papel importante na

antinocicepo, esse estudo investigar a hiptese de sua participao na

antinocicepo induzida pela TENS.

37

3 OBJETIVOS

Nesse captulo delinearemos os objetivos propostos para esse estudo

3.1 OBJETIVO GERAL:

- Investigar a participao do sistema endocanabinides na antinocicepo

...induzida pela TENS de alta e baixa frequncia em modelo de dor.

3.2 OBJETIVOS ESPECFICOS:

a) Investigar farmacologicamente a participao de receptores para

.......canabinides do tipo 1 e de endocanabinides no efeito antinociceptivo

.......induzido pela TENS de alta e baixa frequncia;

b) ..Avaliar a expresso de receptores canabinides do tipo 1 ao nvel perifrico

......e central aps a aplicao da TENS em modelo de hiperalgesia inflamatria;

c) Verificar a co-localizao de receptores canabinides do tipo 1 ao nvel

......perifrico e central aps a aplicao da TENS em modelo de hiperalgesia

......inflamatria.

38

4 MATERIAIS E MTODOS

Esse projeto foi aprovado e conduzido de acordo com a Comisso de tica no

Uso de Animais (CEUA), da Universidade Federal de Alfenas (UNIFAL) / Minas

Gerais/ Brasil, sob o protocolo n: 557/2014.

4.1 ANIMAIS DE EXPERIMENTAO

Para a realizao dos experimentos utilizamos camundongos macho Swiss,

pesando entre 25 e 30 g, provenientes do biotrio central da Universidade Federal de

Alfenas (UNIFAL). Esses animais foram mantidos em condies controladas de

temperatura (232C) e luminosidade (ciclo claro/escuro de 12 horas, luzes acesas s

7:00h), com livre acesso rao e gua antes dos experimentos. Os animais foram

transferidos do biotrio para a sala de ambientao no mnimo dois dias antes dos

experimentos e agrupados em um nmero mximo de 4 a 6 animais por caixa.

Os experimentos foram realizados aproximadamente entre 7:00 e 15:30 horas

em sala silenciosa, mantendo o controle da temperatura a 23C. Para isso, a medida

basal do limiar nociceptivo era realizada as 8:00, em seguida administrado i.pl. o tumor

de Ehrlich e aps duas horas e meia os camundongos eram anestesiados para

aplicao da TENS, por vinte minutos. Os limiares nociceptivos seguintes foram

mensurados aproximadamente s 11:30, 13:30 e 15:30, que equivalem

respectivamente terceira, quinta e stima hora aps a injeo do modelo de dor.

Os animais foram divididos em grupos homogneos e subdivididos em:

Controles (caracterizado por injeo intraplantar (i.pl.) de salina ou veculo (VEC) e

com Clulas (caracterizado pela injeo i.pl. do Tumor de Ehrlich conforme protocolo

descrito adiante). Tambm foram utilizados grupos similares aos descritos

anteriormente, porm estes receberam drogas pr-injetadas pelas vias; i.pl., intratecal,

(i.t.), ou intra Substancia Cinzenta Periaquedutal dorso lateral (i.SCPd.l.), o

antagonista do receptor para canabinide do tipo 1 (CB1) ou o inibidor do cido graxo

amino hidrolase (FAAH).

39

4.2 DROGAS

Para a investigao da participao de receptores canabinides e

endocanabinides na antinocicepo induzida pela TENS foram utilizadas as

seguintes drogas:

- AM 251 (N-(peperidina-1-il) -5-(4-iodofenil) -1-(2,4-diclorofenil) -4-metil-1H-

pitazole-3-carboixamida) (TOCRIS - USA): Antagonista para o receptor CB1. Diludo

em soluo salina (0,9%) com 2% de DMSO.

- 15; 30; 60 l (i.pl.);

- 0,5; 1,0; 2,0 l (i.t.);

- 0,5; 1,0; 2,0 l - (i.SCPd.l.)

- MAFP (cido metil araquidonil fluorfosfano/ (5Z, 8Z, 11Z, 14Z) -5, 8, 11, 14-

eicosatetraenil-metil ester fosfofluordrico) (TOCRIS - USA): inibidor do cido graxo

amino hidrolase (FAAH). Diludo em salina (0,9%) com 3% de lcool.

- 0,5; 1,0; 2,0 l (i.pl.);

- 0,25; 0,50; 1,0 l (i.t.);

- 0,1; 0,2; 0,4 l (i.SCPd.l.)

4.3 ADMINISTRAO DAS DROGAS:

As drogas utilizadas nesse estudo foram administradas em trs diferentes vias:

- Via intraplantar (i.pl.): Essa via foi utilizada para verificar a participao ao

nvel perifrico do receptor CB1 e endocanabinides na antinocicepo induzida pela

TENS. Para esse procedimento foi utilizada uma seringa hipodrmica com agulhas

13 x 0.4 mm (BD, Brasil), pela qual as drogas foram injetadas na regio plantar da

pata direita do animal, no volume de 0,05 ml. Para os grupos controle, foram

administrados soluo salina (0.9%), ou seu respectivo veculo diluente, no mesmo

volume. Para tal procedimento, os animais foram anestesiados com isoflurano 2%,

por meio de um sistema de analgesia inalatria utilizando um vaporizador calibrado, a

pata direita foi previamente limpa com lcool etlico (70%) e cuidadosamente

posicionada para a administrao da droga conforme demonstrado na figura 6:

40

Figura 6- Administrao intraplantar das drogas.

Fonte: ......Do autor

- Via intratecal, (i.t.): Essa via foi utilizada para verificar o possvel envolvimento de

endocanabinides e do receptor CB1 na antinocicepo induzida pela TENS a nvel

medular. Previamente administrao das drogas, foi realizado tricotomia na regio

dorsal (lombar), ento, os animais foram anestesiados por inalao de isoflurano (2%)

(CRISTLIA, Brasil), atravs de um sistema de analgesia inalatria utilizando um

vaporizador calibrado. Para tal administrao, os animais foram posicionados de

forma que a palpao dos espaos intervertebrais fosse facilitada (figura 7). Logo em

seguida, uma injeo no volume de 5 l, foi feita atravs de uma agulha 13 x 0,3 mm,

acoplada a uma seringa hipodrmica (BD, Brasil) diretamente no espao

subaraquinide, entre a quinta e a sexta vrtebra lombar (HYLDEN; WILCOX ,1980)

Esse volume foi o mesmo administrado, tanto para as drogas quanto para seus

respectivos veculos diluentes.

Previamente a esse procedimento e com o objetivo de assegurar a

administrao correta das drogas, foi realizado um treinamento prvio para o

aprimoramento dessa tcnica com a injeo de 0,5 l de lidocana (2%). Como

resposta positiva da administrao i.t., observava-se a paralisia dos membros

posteriores dos animais (RADHAKRISHNAN et al., 2003).

41

Figura 7 - Via de administrao intratecal. Fonte:....... Do autor Nota: Mostrando o posicionamento do animal e ..................o local da injeo de acordo com Hylden ..................e Wilcox (1980).

- Via Intra Substancia Cinzenta Periaquedutal dorso lateral (i.SCPd.l.): A escolha

dessa via foi com a finalidade de investigar o possvel envolvimento supra-medular de

endocanabinides e do receptor CB1 na antinocicepo induzida pela TENS. Para

tal, foi realizada uma neurocirurgia estereotxica, que baseia-se inicialmente no

deslocamento tridimensional de um ponto obedecendo coordenadas determinadas,

que permitem a projeo espacial deste ponto (bregma), e a localizao precisa de

qualquer estrutura por ele representada. usada quando se deseja atuar

especificadamente sobre uma determinada estrutura enceflica. Para isso, a cirurgia

foi realizada com auxlio de um aparelho estereotaxico digital (STOELTING CO,

WOOD DALE, USA). (Figura 8)

42

Figura 8- Equipamento de estereotxico utilizado no ...............experimento

Fonte: ....do autor

Para a realizao do procedimento cirrgico (estereotaxia) e a microinjeo das

drogas, os animais foram previamente anestesiados com uma soluo contendo

quetamina (0,5 ml), xilasina (0,25 ml) e salina (3,0 ml), injetadas intraperitonealmente

(i.p.) em um volume de 0,1 ml/kg. Aps confirmada anestesia, foi realizada uma

tricotomia da regio superior da cabea do animal, que permanecia posicionado e

fixado no estereotxico por meio de duas barras auriculares (figura 9).

43

Figura 9- Posicionamento do camundongo para ..................cirurgia estereotxica. Fonte: .....,.Do autor. Nota: ........Lateralmente cabea em amarelo as ................. barras auriculares de fixao

Aps posicionados, os animais foram ento submetidos a um implante craniano

de cnula-guia (26-gauge) de 7 mm de comprimento, sendo essa posicionada com

ngulo de 26, SCPd.l. A cnula foi fixada ao crnio do animal por meio de um cimento

acrlico auto polimerizante incolor clssico (JET- SO PAULO/ BRASIL). As

coordenadas estereotxicas para implantao da cnula-guia na SCPd.l. foram

definidas de acordo com o Atlas de Franklin e Paxinos (1997) (figura 10): Antero

posterior (AP)= - 4,1 mm; lateral (L)= -1,4 mm e ventral (V)= -2,3 mm, ao Bregma.

Uma cnula de menor dimetro (mandril) foi inserido dentro da cnula-guia para evitar

problemas com obstruo e para reduzir contaminao.

Logo aps a estereotaxia, os camundongos receberam administrao de 0,1

ml, intra muscular (i.m) de pentabitico (17 mg / 1ml de salina) e cetoprofeno

(0,1ml/10g) sub cutnea (s.c.) e foram devidamente colocados em caixas individuais

at a recuperao total ps cirrgica de cinco dias.

44

O procedimento de microinjeo das drogas i.SCPd.l. foi realizado no 5 ou 6

dia aps o procedimento cirrgico. A agulha de injeo (33-gauge), cujo comprimento

ultrapassa em 1,0 mm a ponta da cnula-guia, foi inserida dentro da mesma para a

infuso. A agulha de injeo foi conectada, por meio de tubo de polietileno (PE-10),

microseringa Hamilton Company (EUA) de 5 l. Em seguida foi injetado 0,2 l

durante um perodo de 45 segundos. O fluxo de infuso da droga foi confirmado pelo

movimento de uma pequena bolha de ar no tubo de polietileno antes, durante e depois

da microinjeo (NUNES-DE-SOUZA et al, 2000).

Aps o trmino do experimento todos os animais receberam injeo central de

0.2 l de uma soluo de 1% de azul de metileno, pelos mesmos procedimentos

descritos para a injeo de drogas. Logo em seguida, os animais foram anestesiados

com 1 ml de Tribromoetanol 2,5% (TBE), perfundidos transcardialmente com soluo

de formalina (10%) e em seguida decapitados. Seus crebros foram removidos e

colocados em recipientes contendo soluo de formalina (10%) e posteriormente,

utilizando o micrtomo (criostato SLEE - MNT), foram cortados em seces coronais

ao longo do trajeto da cnula. A inspeo da localizao correta da injeo foi

realizada atravs visualizao da disperso do azul de metileno na rea de interesse,

que indica local correto da injeo central de drogas (Figura 11). Os animais cujo as

injees no atingiram a SCPd.l., de acordo com Atlas de Franklin e Paxinos (1997),

foram excludos do estudo.

45

Figura 10- Ilustrao do altas Franklin e Paxinos (1997). Fonte:........ Atlas FRANKLIN; PAXINOS (1997)

Nota: ......... Seta indicando a Substancia Cinzenta Periaquedutal dorso lateral

Figura 11- Representao da injeo de azul de metileno ................. na SCPd.l.

Fonte: ......Do autor

46

4.4 INDUO DO MODELO DE DOR

Para esse procedimento foi utilizado o tumor de Ehrlich, um carcinoma mamrio

de camundongo fmea, caracterizado por ser uma neoplasia transplantvel de origem

epitelial maligna, transplantado pela primeira vez por Paul Ehrlich (EHRLICH;

APOLAND, 1905).

Esse tumor bem utilizado em estudos experimentais in vivo. Para tal,

importante o conhecimento prvio da quantidade e caractersticas das clulas

tumorais que sero inoculadas, a rapidez no desenvolvimento da neoplasia j que a

forma asctica atinge seu pico de proliferao no stimo dia, enquanto na forma slida

seu pico ocorre no dcimo quarto. Desse modo, tais caractersticas peculiares desse

tumor proporcionam uma vantagem sobre os demais modelos utilizados. (SILVA,

2006).

O tumor de Ehrlich induzido pelo transplante de clulas tumorais procedentes

de outro animal com a neoplasia desenvolvida, podendo ser inoculado diretamente no

peritnio do animal receptor, desenvolvendo a forma asctica, ou diretamente por via

subcutnea ou coxim plantar, desenvolvendo, assim, a forma slida do tumor de

Ehrlich (RAMALHO et al., 2010).

Para o preparo das clulas tumorais que foram utilizadas nesse trabalho,

realizou-se primeiramente a lavagem e a contagem das clulas. O mtodo de

inoculao empregado foi proposto por Dagli e colaboradores (1992). Para tal, foram

retirados 3,0 ml de fluido ascstico de um camundongo pr-inoculado a 7 dias com o

tumor de Ehrlich na cavidade peritoneal. Esse fluido foi centrifugado at a obteno

de um lquido denso e claro, correspondente a uma suspenso celular com o mnimo

de fibrina e hemcias. Seguiu-se, ento, a contagem das clulas tumorais.

O nmero total de clulas foi determinado mediante contagem em microscpio

ptico de campo claro, modelo NIKON H550L, com auxlio de cmara de Neubauer.

O teste de excluso do Azul de Tripan determinou a viabilidade das clulas tumorais.

Foram consideradas vivas as clulas que excluram o corante (figura 12) . (RAMALHO

et al. 2010).

47

A B

Figura 12- Teste de excluso do corante Azul de Tripan atravs de microscpio. Fonte: .......Do autor Nota: ........A: utilizando objetiva 4X, observa-se o campo visual de um quadrante da cmara de ..................Neubauer contendo as clulas (hipocoradas). B: imagem ampliada 20X evidenciando as ..................clulas tumorais.

Aps esse procedimento realizou-se a diluio das clulas para a injeo i.p.l.,

do padro para crescimento slido do tumor de Ehrlich na pata direita de cada animal

avaliado, na concentrao de 2,5x106 de clulas vivas em um volume de 0,05 ml.

A injeo das clulas ou veculo (salina estril), foi realizada com animais

anestesiados com isoflurano (2%), aps a medida basal do limiar nociceptivo (mtodo

detalhado no item 3.7).

4.5 ADMINISTRAO DA ESTIMULAO ELTRICA TRANSCUTNEA DO

........NERVO (TENS)

A estimulao eltrica nas patas dos camundongos com a TENS foi realizada

atravs de um aparelho da marca Neurodyn II (IBRAMED, Brasil) figura 13.

48

Figura 13- Aparelho de TENS Neurodyn II (IBRAMED, ..................Brasil).

Fonte : ......Do autor

Este aparelho foi previamente calibrado com os seguintes parmetros: 130 Hz

para a estimulao de alta frequncia e 4 Hz para a estimulao de baixa, com

durao do pulso de 100 m/s. (MA; SLUKA, 2001). O limite para a intensidade

sensorial foi considerada imediatamente abaixo do limiar motor (SLUKA et al.,1998).

O aparelho utilizado apresenta 4 pares de eletrodos, que permite uma estimulao em

at 4 animais simultaneamente.

Para a aplicao da TENS, os animais foram levemente anestesiados com

isoflurano (2%) e posicionados em uma capela, com sistema de anestesia por meio

de um vaporizador calibrado. Previamente estimulao eltrica, a pata direita foi

lavada com lcool etlico (70%) para fixao de eletrodos autocolantes. O tempo de

estimulao pela TENS foi de 20 minutos, a qual ocorreu por meio de dois eletrodos,

especialmente adaptados (tamanho de 1 cm2) sendo um fixado na regio dorsal e

outro na regio plantar da pata direita (DESANTANA et al., 2009) (figura 14).

49

Figura 14- .Imagem da aplicao da TENS, e o posicionamento dos ....................animais na capela. Fonte: ........ Do autor. Nota: ...........Indicando pela seta, os eletrodos autocolantes especialmente ....................adaptados

Imediatamente aps a TENS, os animais foram colocados em suas respectivas

divisrias do aparato de von Frey, por aproximadamente 15 min, antes do teste

nociceptivo (SLUKA et al., 1998).

importante ressaltar, que cada animal dos diferentes grupos foram

submetidos ao mesmo tempo TENS, assegurando que a mesma dosagem de

anestsico fosse igual para cada grupos. Esse procedimento foi realizado trs horas

aps a injeo do modelo de dor.

4.6 AVALIAO DO LIMIAR NOCICEPTIVO

O limiar nociceptivo foi avaliado durante a fase clara. Inicialmente, os animais foram

mantidos nas suas caixas na sala de comportamento por 30 minutos para se

ambientarem. Em seguida, foram colocados em caixas individuas de vidro, (figura

15A) posicionadas sobre uma grade de metal, a qual permitiu a avaliao do limiar

nociceptivo mecnico (figura 15B).

50

Os limiares nociceptivos foram avaliados por meio do teste de von Frey

filamento, o qual realiza uma presso mecnica, por meio de filamentos de diferentes

espessuras (figura 15C), aplicada de forma perpendicular com fora suficiente para

curv-los, na superfcie plantar da pata posterior direita de cada animal. Esse teste

foi realizado com base no descrito por Chaplan et al (1994), porm com algumas

modificaes, como as espessuras de filamentos distintas. Nesse experimento, foram

utilizados seis filamentos de forma crescente ou decrescente de: 0,07g, 0,16g, 0,4g,

0,6g, 1,0g, 1,4g e 2,0g.

A B

C

Figura 15- Teste de von Frey filamento. Fonte: .......Do autor Nota: ,,,,,,,,A e B aparato utilizado para colocar os animais durante o ..................experimento. A: viso completa das caixas dispostas sobre a ,,,,,,,,,,,,,,,,,,mesa; B: viso inferior da grade de metal e ..................posicionamento dos camundongos; C: os filamentos ..................utilizados e em destaque uma amostra do ..................posicionamento desse filamento durante a aplicao do ..................estmulo.

51

Durante o teste, foram realizadas 3 medidas do limiar nociceptivo em cada

animal, separadas por intervalos de 3 minutos e a mdia das 3 medidas foi descrita

como o limiar mecnico de retirada de pata em gramas (g) (figura16).

Figura 16: Clculo usado para especificar a mdia do limiar ...................mecnico de retirada da pata

Fonte: Do Autor

Em cada animal, o limiar nociceptivo mecnico foi avaliado antes da injeo

i.pl. do tumor de Ehrlich, descrita como medida basal (MB) e, em seguida nos

intervalos de 3, 5, 7 e 24 horas aps a injeo das clulas.

4.7 DELINEAMENTO DO ESTUDO

Inicialmente, com o intuito de selecionar a melhor concentrao de clulas do

tumor de Ehrlich que melhor reproduziria alodinia mecnica, foi realizado um

experimento com 3 concentraes diferentes dessas clulas (1.25 x106, 2.5 x 106,, 5.0

x106,)

Antes da injeo i.pl. das clulas, os animais foram submetidos a uma medida

basal (MB). O limiar nociceptivo de retirada da pata foi mensurado na primeira hora

aps a induo i.pl. das clulas at o decimo quinto dia que corresponde a 360 horas

conforme figura 17.

52

Figura 17 Esquema com a periodicidade da mensurao do limiar nociceptivo de retirada ....................da pata. Fonte: .........Do autor Nota: .......... MB: medida basal; i.pl.: injeo intra plantar; Ehr: Tumor de Ehrlich

Posteriormente, com a concentrao escolhida de 2,5 x106 clulas, foi realizado

o experimento para verificar o efeito da TENS na antinocicepo. Duas horas e meia

aps a injeo, os animais foram anestesiados e mantidos com isoflurano a 2%,

colocados em uma capela e os eletrodos fixados diretamente na pata para a aplicao

da TENS por 20 minutos. Aps esse procedimento, os camundongos foram

transferidos para caixas individuas de vidro, posicionadas sobre uma grade de metal

onde permaneceram por quinze minutos para aclimatao e em seguida foi realizada

a avaliao do limiar nociceptivo mecnico de acordo com Sluka et al., (1998). As

medidas subsequentes foram realizadas 5, 7 e 24 horas aps a induo i.pl. do tumor

de Ehrlich conforme figura 18.

Figura 18- Esquema com a periodicidade da mensurao do limiar nociceptivo de retirada da pata. Fonte: ........Do autor Nota: .........Aps a aplicao da estimulao eltrica transcutnea do nervo. MB: medida basal; i.pl.: ....................injeo intra plantar; Ehr: Tumor de Ehrlich; TENS: Estimulao eltrica ....................transcutnea do nervo.

Seguindo o protocolo utilizado anteriormente, foi investigado o envolvimento do

sistema endocanabinide na antinocicepo induzida pela TENS por meio da

administrao via i.pl. ou i.t. ou i.SCPd.l. de AM251 ou MAFP. Para a injeo i.pl., a

53

drogas foram administradas 20 minutos antes do incio da TENS. J, para aas

administraes i.t. ou i.SCPd.l., as drogas foram injetadas imediatamente antes do

incio da aplicao da TENS. Na sequncia foram avaliados os limiares nociceptivos

na quinta, stima e vigsima quarta hora aps a induo do tumor de Ehrlich

conforme, figura 19:

Figura 19 Esquema com a periodicidade da mensurao do limiar nociceptivo de retirada da pata (g), Fonte: ........Do autor. Nota:.......... Aps injeo da droga e a administrao da estimulao eltrica transcutnea do nervo. ...................MB:medida basal; i.pl. injeo intra plantar; Ehr: Tumor de Ehrlich; TENS: ...................Estimulao eltrica transcutnea do nervo; AM251: antagonista CB1; MAFP: ...................inibidor da FAAH.

4.8 ANLISE DE WESTERN BLOT

Esse procedimento foi utilizado para determinar a expresso de receptores CB1

aps a aplicao da TENS. Para tanto, os animais ainda anestesiados foram

sacrificados por decaptao e seus respectivos crebros, medulas e patas, foram

retirados e homogeneizados em homogeneizador de tecidos tipo Turrax (MARCONI,

Brasil) em tampo RIPA de lise e um cocktail de inibidores de proteases (SIGMA

FAST, Sigma). Ento, foi utilizada a proporo de aproximadamente 0,0200 g de

SCP isolada, 0,0030 g de tecido medular (regio lombar) e 0,0500 g de tecido da

regio plantar da pata direita para 200 l de tampo de lise enriquecido. Aps o

processamento, as amostras foram centrifugadas a 10.000 rpm por 10 minutos e o

sobrenadante foi aliquotado em tubos de polipropileno (1,5 ml, EPPENDORF,

54

BRASIL) e congelado a -80C para posterior utilizao. A quantidade de protenas das

amostras foi mensurada de acordo com o mtodo de Lowry (LOWRY et al., 1951).

Posteriormente, as amostras foram ento diludas em tampo de amostra (4X

TRIS HCl/SDS pH=6.8, 3% Glycerol, 1% SDS, 0.6% -mercaptoetanol, Azul de

Bromofenol). Para a separao, foram aplicados 50 g de protena em gel de SDS-

PAGE (sodio dodecil (lauril) sulfate-poliacrilamida). Para o gel de separao,

utilizado poliacrilamida em concentrao de 7,5% e 4%.

Desse modo, aps serem separadas em gel, as protenas foram transferidas

para uma membrana de nitrocelulose (MILLIPORE, USA) com poro de 0,45 m de

dimetro. A qualidade da transferncia monitorada atravs da colorao da

membrana com soluo de Ponceau 0,3%. A membrana foi ento lavada em agua

miliqui e colocada por 1 hora em soluo de bloqueio (TBS-Tween 0,1% com 2,5% de

leite em p desnatado). Aps o bloqueio, a membrana foi incubada overnight com o

anticorpo primrio especfico: CB1 (N-15): sc- 10066 (SANTA CRUZ, USA).

Em seguida, a membrana foi lavada com TBS contendo 0.3% de Tween 20 (TBS-

T) por 5 minutos (por trs vezes) e incubada por duas horas com o anticorpo

secundrio conjugado a peroxidase (HRP) (1:2000 anti-rabbit IgG-HRP, SANTA

CRUZ, EUA). Aps o perodo de incubao a membrana foi novamente lavada em

TBS-T (5 minutos por trs vezes). Ento, as bandas proteicas de interesse (53-60

kDa) foram detectadas por uma reao de quimioluminescncia (kit ECL plus

Amersham Biosciences do Brasil Ltda) de acordo com a intensidade da densidade

ptica de imunorreatividade atravs de um software. Foram utilizados no processo de

corrida e transferncia o sistema Mini Protean III-Tetracell e Mini Trans-Blot

Electrophoretic Transfer Cell, ambos da BIO-RAD, USA.

4.9 IMUNOFLUORESCNCIA

Com a finalidade de mostrar a presena da localizao de receptores CB1, a

nvel central, aps a aplicao da TENS, foi realizado ensaio de imunofluorescncia

em seces da regio medular lombar e SCP.

Duas horas aps a TENS, os animais foram anestesiados i.p. com

Tribromoetanol 2,5% (TBE) - (0,1ml/kg) e perfundidos transcardialmente com soluo

55

salina seguida por 4% de paraformaldedo (PFA) em tampo fosfato 0,1 M (PBS, pH

7,4). Os crebros, as medulas, foram removidos e ps-fixados durante 2 h, em PFA a

4% e armazenada durante 48 h em 30% de sacarose para crioproteo.

Seces coronais (40 mm) das amostras foram obtidas num criostato e lavadas

em PBS 0,1 M. Logo aps, foram incubadas em glicina 0,1 M, e novamente lavadas e

incubadas durante 1 h em 5% de soro bovino (BSA, Sigma) e PBS 0,1 M, pH 7,4

contendo 0,4% de Triton X-100. Em seguida, as seces foram incubadas durante 24

horas em uma mistura anticorpo primrio policlonal de cabra anti-CB1 (diludo 1:200,

SANTA CRUZ, USA) diluda em PBS + BSA a 5% + 0,4% de Triton. Aps incubao

no anticorpo primrio, as seces de tecido foram lavadas em PBS e incubou-se

sequencialmente com Alexa 488 donkey anti-goat IgGs (1:1000; Invitrogen) por 1 h

(CASAROTTO et al., 2012).

Aps o processo de imunofluorescncia, as seces foram lavadas em PBS.

Subsequentemente, os cortes foram montados em lminas gelatinizadas e cobertas

com lamelas usando Fluoromount. As seces foram analisadas por microscpio de

fluorescncia e as imagens capturadas pela cmera digital (both from Zeiss). A

contagem, apesar de serem realizadas com o auxlio do software de anlise de

imagem computadorizada, foi realizada manualmente.

4.10 ANLISE ESTATSTICA

Os resultados foram apresentados com a mdia + EPM. Para o tratamento estatstico

dos dados oriundos dos experimentos comportamentais, foi utilizada a anlise de

varincia Two way (ANOVA) e para os dados oriundos dos experimentos

biomoleculares (imunofluorescncia e western blot), foi utilizada a anlise de varincia

de uma via (ANOVA), ambos teste foram seguidos pelo teste de Bonferroni para

comparaes mltiplas, sendo considerados estatisticamente significativos valores de

P

56

5 RESULTADOS

Nesse capitulo descrevemos os resultados encontrados com os experimentos

comportamentais e com os ensaios moleculares.

5.1 EFEITO DA INJEO DO TUMOR DE EHRLICH SOBRE O LIMIAR

........NOCICEPTIVO MECNICO DE RETIRADA DE PATA

Inicialmente, utilizamos trs concentraes diferentes de clulas tumorais de

Ehrlich com a finalidade de escolher aquela que melhor reproduz uma resposta

nociceptiva.

De acordo com o grfico 1, observa-se que as trs concentraes pr-

determinadas de clulas (1,25x106 ou 2,5x106 ou 5.0x106) promoveram uma alodinia

mecnica, a qual perdurou por mais de 360 horas. Entretanto, somente a

concentrao de 2,5x106 promoveu alodinia nas primeiras 72 horas iniciais. Entre as

horas iniciais que equivale s mensuraes da primeira at a vigsima quarta hora,

no houve significncia estatstica em relao intensidade da alodnia mecnica

entre elas.

57

Grfico 1 Efeito de diferentes concentraes de clulas tumorais de Ehrlich sobre o limiar .................nociceptivo mecnico de retirada da pata, avaliado pelo teste de filamentos de Von .................Frey. Nota: .......Os dados representam a mdia + E.P.M. da medida do limiar nociceptivo. MB: medida .................basal do limiar nociceptivo; i.p.l.: injeo intraplantar de 0,05 ml; EHR: EHRLICH; .................CONTROLE: injeo de salina 0.9%; h: horas. Representaes de significncia: .................***(P

58

compostos po