troubleshooting in der hplc - agilent · 3 february 10, 2012 hplc probleme lc gc leserumfrage...

February 10, 2012 1

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Troubleshooting

in der HPLC

Fehler vermeiden

Fehler erkennen

Friedbert Ruppel

Agilent Technologies

February 10, 2012 2

Welche HPLC Probleme haben Sie ?

February 10, 2012 3

HPLC Probleme LC GC Leserumfrage

Column Problem

Percentage of Respondents

Back Pressure, Plugged Frits 24%

Poor Reproducibility 16%

Sample Recovery 14%

Loss of Resolution 13%

Instability 11%

Voids 8.1%

Leaks, Fittings 4.8%

pH Range 2.0%

Low Plate Count 2.0%

Column Overload 2.0%

Cost 1.7%

Miscellaneous 15%

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Vermeidung von Fehlern

February 10, 2012 5

Vermeidung von Fehlern

Lösungsmittel für die RP -Chromatographie

1. Wasser

• hohe Reinheit notwendig (wichtiger als die Reinheit des organischen LM)

• HPLC-reines Wasser oder Reinigung über eine RP-Phase

• Reinheitstest: Anreicherung des Wasser auf RP-18-Saule und linearer Gradient

• Test des Wassers in einem dunklen Raum mit einem Laserpointer

2. Acetonitril

• geringe Viskosität

gute Diffusion (hohe Bodenzahl), geringer Druckabfall (hoher Fluß kleine Partikel möglich)

• sehr gute UV-Durchlässigkeit

Gradienten möglich, sehr niedrige Nachweisgrenzen für Analyten erreichbar

• teuer und toxisch

1.Wahl für die Methodenentwicklung und für schwierige Trennungen

February 10, 2012 6

3. Methanol

• hohe Viskosität, (Viskositätsmaximum !)

• preiswert

• MeOH -Wasser -Mischungen lösen oft Salze besser als Mischungen mit Acetonitril

für einfacheTrennungen, hohe Salzkonzentrationen, Erreichen bestimmter Selektivitäten

4. Tetrahydrofuran

• hohe Viskosität, (Viskositätsmaximum !)

• Peroxidbildner

• sehr gutes Löseverhalten (z.B. Polymere)

• mischt sich mit jedem anderen Lösungsmittel

für schwerlösliche Proben und zum Umspülen der Anlage von Alkanen/Chloroform ect. auf wässrige Lösungsmittel und umgekehrt, für das Erreichen bestimmter Selektivitäten

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Viskosität unterschiedlicher LM

February 10, 2012 8

Vermeidung von Fehlern - LM

• HPLC-reine LM verwenden → Test über Leergradient - Wasser !!!

• LM über Fritten ansaugen

• Fritten regelmäßig reinigen

• Entgasen (bes. bei Gradienten)

• 1<pH<8 bei Säulen auf Kieselgelbasis

• Mischbarkeit der LM beachten

• Haltbarkeit der LM beachten

• LM unter Helium stehen lassen (THF,Dioxan)

• Probe im Eluenten lösen (besser in einem schwächeren LM)

• bei isokratischen Versuchen LM im Kreislauf fahren

• besonders empfohlen: bei NP-Trennung auf Kieselgel (konstanter Wassergehalt)

• bei der Mischung Volumenkontraktion beachten (MeOH / Wasser) 500ml Wasser mit 500 ml

• MeOH mischen und nicht ein LM vorlegen und auf 1 l auffüllen

• Verhindern von Algenwachstum in Pufferlösungen

a) Natriumazid dem Puffer zufügen (0.005 %)

b) 2..5% Acetonitril dem Puffer zufügen

c) Umspülen der Anlage, wenn sie längere Zeit steht

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Gradient zum Wassertest

February 10, 2012 10

Geister-Peaks

20% - 100%

MeOH Gradient

No Sample Injected

Geisterpeaks = Peaks die erscheinen, wenn keine Probe

injiziert wurde

Problem – Verunreinigungen der mobilen Phase

60

15

30

15

0 3 7 15 17


Ursache

n Absorbtion der Probe ist geringer als das LM

n Brechungindexunterschiede LM-Probe im RI Detektor

Normal Negativ

Negative Peaks


Gradientenelution

Mobile Phase ist nicht im Gleichgewicht

Driftende Baselinie


Probe filtern

• Probe filtern

• mobile Phase filtern

• In-line filter verwenden

• Vorsäulen verwenden

• Sample clean-up (i.e. SPE)

• Regelmäßiges Spülen der Säule


Lösungsmittel Elutionsmittel

Lösungsmittel Elution Bodenzahl

Phenol Diphenyl

100% THF 60% THF 5167 8012

80% THF 60% THF 6912 12551

60% THF 60% THF 8982 15463

40% THF 60% THF 9970 16528

70 % ACN 70% ACN 12616 20796

Probe in möglichst schwachem Lösungsmittel injizieren (Löslichkeit ?)


Probe filtern

Regenerierte Zellulose (RC) Empfohlen

• Universielle hydrophile Membran,

• Kompatibel mit den meisten LM

• hochrein (wenig extrahierbare Bestandteile)

• Hohe Wiederfindungsrate

• Einheitliche Oberfläche

In-line Filters

Fritten mit 0.2,0.5 und 2.0µ Porosität

Mini-UniPrep Vials

UniPrep vials mit integrierten Filter

(PTFE, PP, RC, Nylon - 0.2 or 0.45µm

Porosität)


Säulenpackung

Partikelgröße

Fläche

(µm2)

Durchmesser

(µm)

Porosität der

Fritte (µm)

5.0 2.7 0.9 2.0

3.5 1.3 0.6 2.0

3.0 1.0 0.6 0.5

2.5 0.7 0.5

1.8 0.4 0.4 0.2

1.7 0.3 0.3

Puffersalze enthalten unlösliche Bestandteile– Filtern

Löslichkeit der Puffer nimmt mit steigenden % organic*

ab – vermeiden von 100%B mit Puffern

*Schellinger,A.P. and Carr,P.W., LC-GC North America, 22, 6, 544-548 (2004)


Degasser • Ansaugfritten regelmäßig reinigen

Schwankende Retentionszeiten bei partiell blockierten Ansaugfritten / Degasserkanal

Falsche Zusammensetzung des Eluenten beim Niederdruckgradienten

Pumpe • Raum hinter den Kolbendichtringen regelmäßig spülen

• Fritten im Purgeventil regelmäßig tauschen

Injektionsventil / Autosampler • nur HPLC-Spritzen verwenden

• Richtigen“ Gradienten für den ALS fahren

• Jeden Gradienten mit der Ausgangsmischung der nächsten Analyse beenden

• nach Ende der Arbeiten mit Puffern reines Wasser/ACN injizieren

Detektor • Restriktor am Detektorausgang (leichtflüchtige Verbindungen)

• Referenz spülen (RI), Temperaturkonstanz (RI,ECD,Leitfähigkeit)

• Richtige Datenrate

Kapillaren und Fittings • Kapillaren gerade schneiden und entgraten

• passende Schneidringe verwenden (Valco, Rheodyne)


Quaternäre Pump

Vacuum chamber

Proportioning valve

Inlet valve

Waste

Damper Purge valve

Solvent bottles


Autosampler

From pump

To column

Metering device

6-port valve

Sampling

unit

To waste

Vial gripper

Standard loop volume 300 µl

Total delay volume 300 µl + Vinj

Minimal (bypass) delay volume 6.2 µl


Autosampler

Metering device

6-port valve

Sampling

unit

From pump

To column

To waste

Bypass Position

Aufziehen der Probe

Main pass und Injektion


Data

Rate

Peak

Width

Resolution Peak

Capacity

80 Hz 0.300 2.25 60

40 Hz 0.329 2.05 55

20 Hz 0.416 1.71 45

10 Hz 0.666 1.17 29

5 Hz 1.236 0.67 16

min 0.1 0.2 0.3 0.4 0.5 0

80Hz

PW=0.30sec

40Hz

PW=0.33sec

20Hz

PW=0.42sec

10Hz PW=0.67sec

5Hz PW=1.24sec

Sample: Phenones Test Mix

Column: Zorbax SB-C18, 4.6x30, 1.8um

Gradient:: 50-100%ACN in 0.3min

Flow Rate: 5ml/min

80Hz versus 10Hz (20Hz) Data Rate

• Peak Width: – 55% (– 30%)

• Resolution: + 90% (+ 30%)

• Peak Capacity: + 120% (+ 40%)

• App. Column Eff.: + 260% (+ 70%)

Richtige Datenrate für schnelle Trennungen


n Kurze Kapillaren mit kleinem Durchmesser verwenden

(insbesondere zwischen Injektor und Detektor)

n Geeignete Verbinder (Ferrules und Fittings verwenden

n Detektorzelle mit kleinem Volumen.

n Kleines Probenvolumen in einem schwachen LM injizieren

n .

steigendes Extra-Column Volume

Bandenverbreiterung außerhalb der Säule

minimieren


Ferrules und Fittings

0.090

in.

0.130

in.

0.090

in.

0.170

in.

Swagelok Waters

Parker Rheodyne

Valco Uptight

0.090

in. 0.080

in.

Troubleshooting LC Fittings, Part II. J. W. Dolan and P. Upchurch. LC/GC Magazine 6:788 (1988)


Fehlermöglichkeiten

Zu lang – undicht !

Zu Kurz -

Totvolumen

X


Blau 0.25 mm

Farbe i.d.

Rot 0.12 mm

Grün 0.17 mm

Agilent Kapillar Farbcode


Säule

• Säuleneinlassfilter ( 0.2μm) verwenden

• Sättigersäule bei alkalischen Eluenten

• zwischen Pumpe und Injektor Eluent sättigt sich mit Kieselgel

• Vorsäule

• vor Trennsäule, identisches Material wie Trennsäule verwenden

• mechanisches Filter, irreversible Adsorption, Sättigung mit Kieselgel, preiswert

• Druckstöße vermeiden - schnelle Injektion, langsames Anfahren der Pumpe

• Proben filtern

• Säule täglich spülen

• 10 Säulenvolumen mit einem starken Eluenten

• Säulenlagerung gut verschlossen kein Austrocknen, keine Puffersalze

• RP-Säulen in MeOH oder ACN, Silica in Hexan, Ionenaustauscher in Wasser 0.01% NaN3

• Konstante Säulentemperatur (< 60 C)


Fehler erkennen


Test der Anlage

Test des Systems mit einer Testmischung

a) Typische Stoffklassen im Labor

b) Uracil (C3H4N2O2), Phenol (C6H6O), p-Methylaminobenzen (C7H9N - p-Toluidin),

Diphenyl (C12H10),

c) Uracil, Acetophenon, Benzen, Toluen

d) Test nach Herstellerangaben

Buchführung über Belastung der Säule, Bodenzahlen Retentionszeiten, Druck

Test analog OQ Prozeduren der Hersteller


Test der Anlage

Uracil: Eluiert in den meisten RP-

Systemen zur Totzeit Hinweis auf

Flußprobleme

Phenol: sauer, zeigt Tailing bei basischen

Gruppen auf der stationären Phase

p-Toluidin: basisch, zeigt Tailing bei

sauren Silanolgruppen

Diphenyl: neutral, Bestimmung der

Bodenzahl, gibt Hinweise auf

Bandenverbreiterung innerhalb und

außerhalb der Säule (schlechte

Packung, Anschlüsse)

wird in den meisten RP-Systemen getrennt

effektiver Schnelltest für die Säule


Totzeit

Zeit für ein Molekül, das in die Poren des Trennmaterials eindringen kann und nicht zurückgehalten wird

Arten der Totzeitbestimmung

Näherungsberechnung

D Säulendurchmesser

L Säulenlänge

F Fluss

Porositätsfaktor ε ≈ 0.7 . . 0.8

Solvenspeak

Referenzsubstanzen z. B. Uracil, Thioharnstoff

Können Peaks vor der Totzeit kommen?

F

Ldt

4

2

0


Totzeit - t0

Fluss: 1.0 ml/min Fluss: 0.5 ml/min


Wann wurde der Peak injiziert?

Theoretische Bodenzahl

Mass für die Qualität der Säule

N = Bodenzahl

tr = Retentionszeit

W0,5 = Peakbreite in halber Höhe

Retentionszeit

2

5,0

2

54,5w

tN r

54,55,0

Nwtr


Druckprobleme

Durch Überlagerung der Druckkurve in das Chromatogramm

werden Probleme während der Analyse sichtbar und

helfen bei der Fehlersuche.


bar

min

50

150

Drucktest

Verschliessen des Pumpenausgangs

mit Metallstopfen.

Flow 1.0 ml/min. Pumpe schaltet bei

Erreichen des maximalen Druckes

( 400 bar meist) ab.

Druckabfall sollte nicht größer als

2 bar/min. sein


Leaktest


Rauschende Baselines

Ursachen:

n Schmutzige Meßzelle

n Alte Lampe

n Pulsation der Pumpe

n Luftblasen im Detektor

Zei t ( mi n. )


Intensitätstest

Limits:

190-220nm > 2000

221-350nm > 5000

351-500nm > 2000

501-950nm > 4000

Mögliche Fehlerquellen:

- Absorbierendes Lösemittel oder Luftblasen in der Zelle

- Schmutzige oder kontaminierte Flusszelle

- Kontaminierte optische Komponenten

- Alte Lampe


Detektionsprobleme - Wellenlängengenauigkeit

Kalibrierung der Wellenlänge mit den Alpha- und Beta-Emissionslinien 656,1 und

486,0nm


Column Problems

A. Pressure

B. Peak shape

C. Retention


Determining the Cause and Correcting High Back Pressure

Many pressure problems relate to blockages in the system.

Check system pressure with / without column

If column pressure is high:

• Back flush column (care regarding future performance)

• Clear blocked frit (reverse flush with strong solvent)

• Wash column

Eliminate column contamination and clear blocked packing

Remove high Mw / adsorbed compounds

Clear precipitate introduced from the sample or buffer

Correcting Overpressure


Column Cleaning

Use at least 25 mL of each solvent for analytical

columns

Flush with stronger solvents than

your mobile phase. Reversed-Phase Solvent Choices

in Order of Increasing Strength

• Mobile phase without buffer salts

• 100% Methanol

• 100% Acetonitrile

• 75% Acetonitrile:25%

Isopropanol

• 100% Isopropanol

• 100% Methylene Chloride*

• 100% Hexane*

*Tip: When using either Hexane or Methylene Chloride the column must be flushed

with Isopropanol before returning to your reversed-phase mobile phase.

Must Reverse

to

Re-Equilibrate

This Is Time Consuming

Often Performed Offline


Use at least 50mL or 20 30 column volume changes for analytical columns

• Typical normal phase solvent choices in order of increasing strength:

Solvent Composition

Methanol:Chloroform 50:50%

Ethyl Acetate 100%

Column Cleaning – Normal Phase


What Are Common Peak Shape Issues?

1. Split peaks

2. Peak tailing

3. Broad peaks

• Many peak shape issues are also combinations - i.e. broad and tailing

or tailing with increased retention

•Symptoms do not necessarily affect all peaks in the chromatogram

•Each of these problems can have multiple causes


Peak Splitting Caused By Disrupted Sample Path

Split or Double Peaks

Normal Double

Peaks

Tip: Similar Effect Can be Caused by Partially Plugged Frit

•Flow Path Disrupted by Void

•Sample Allowed to Follow Different Paths

Through Column

•Poorly Packed Bed Settles in Use

•High pH Dissolves Silica


Split Peaks from Injection Solvent Effects

Column: StableBond SB-C8, 4.6 x 150 mm, 5 m Mobile Phase: 82% H2O : 18% ACN

Injection Volume: 30 L Sample: 1. Caffeine 2. Salicylamide

A. Injection Solvent

100% Acetonitrile

B. Injection Solvent

Mobile Phase

Tip: Injecting in a solvent stronger than the mobile phase can cause peak shape

problems such as peak splitting or broadening

Trick: Keep Organic Concentration in Sample Solvent < Mobile Phase

0 10Time (min)

1

2

0 10Time (min)

1

2


Peak Tailing, Broadening

and Loss of Efficiency

May be caused by:

• Column “secondary interactions”

• Column contamination

• Column aging

• Column loading

• Extra-column effects


Normal Tailing

Normal Tailing

Symmetry > 1.2

All Peaks Tail:

Extra-Column Effects.

Build up of Contamination on Column

Inlet.

Heavy Metals.

Bad Column.

Causes

Some Peaks Tail:

Secondary - Retention Effects.

Residual Silanol Interactions.

Small Peak Eluting on Tail of Larger Peak.

Peak Shape: Tailing Peaks


Page 51

Causes:

Column Overload

Normal Fronting

Symmetry < 0.9

2000

1500

1000

500

0

0 5 10 15 20 25

Time (min)

mA

U

Peak Shape: Fronting Peaks


Page 52

Peak Tailing/Broadening

Sample Load Effects Columns: 4.6 x 150 mm, 5 m Mobile Phase: 40% 25 mM Na2HPO4 pH 7.0 : 60% ACN Flow Rate: 1.5 mL/min

Temperature: 40°C Sample: 1. Desipramine 2. Nortriptyline 3. Doxepin 4. Imipramine 5. Amitriptyline 6. Trimipramine

Broadening

Competitive C8

Plates

A.

B.

C.

D.

High Load

x10

Low Load

C D

1. 850 5941

2. 815 7842

3. 2776 6231

4. 2539 8359

5. 2735 10022

6. 5189 10725

Tailing

Eclpse XDB-C8

USP TF (5%) i

A B

1. 1.60 1.70

2. 2.00 1.90

3. 1.56 1.56

4. 2.13 1.70

5. 2.15 1.86

6. 1.25 1.25

0 5 10Time (min)

0 5 10Time (min)

0 5T im e (m in )

0 5T im e (m in )

Tip: Evaluate Both Volume and Mass Loading

February 10, 2012 53 Page 53

Peak Shape: Broad Peaks

All Peaks Broadened:

• Loss of Column Efficiency.

• Column Void.

• Large Injection Volume.

Some Peaks Broadened:

• Late Elution from Previous Sample

(Ghost Peak).

– High Molecular Weight.

– Sample - Protein or Polymer.


Page 54

Time (min)

3

1

2

0 5 10 15

Unknown “Phantom” Peaks

Column: Extend-C18, 4.6 x 150 mm, 5 m Mobile Phase: 40% 10 mM TEA, pH 11 : 60% MeOH Flow Rate: 1.0 mL/min

Temperature: R.T. Detection: UV 254 Sample: 1. Maleate 2. Pseudoephedrine 3. Chlorpheniramine

Plates

1. 5922

2. 9879

3. 779

Tip: The extremely low plates for moderately retained peaks are an indication of a

very late eluting peak from a preceding run.

Time (min)

1

0 5 10

Sample 1: Chlorpheniramine maleate

Peak 1: maleate

Sample 2 : Chlorpheniramine

maleate

and Pseudoephedrine

Peak 1: maleate

Peak 2: pseudoephedrine

Peak 3: chlorpheniramine (from 1st

injection)

“Phantom” peak from

first injection


Page 55

Changes in Retention Can Be Chemical or Physical

May be caused by:

• Column aging

• Column contamination

• Insufficient equilibration

• Poor column/mobile phase combination

• Change in mobile phase

• Change in flow rate

• Different Gradient Delay Volumes


Page 60

Mobile Phase pH and pH Buffers

Why Are These So Important in HPLC?

•pH Effects Ionization

– Silica Surface of Column

– Sample Components of Interest

• Buffers

– Resist Changes in pH and Maintain Retention

– Improve Peak Shape for Ionizable Compounds

• Effects Column Life

– Low pH strips Bonded Phase

– High pH Dissolves Silica


Page 63

Effect of pH on Peak Shape at or

Near the Sample pKa

0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10

Time (min) Time (min)

Column: ZORBAX SB-C8 4.6 x 150 mm, 5 mm Mobile Phase: 40% 5 mM KH2PO4: 60% ACN

Flow Rate: 1.0 mL/min. Temperature: RT

pH 4.4 pH 3.0

Ibuprofen

pKa = 4.4

CH3CHCOOH

CH2CH(CH3)2

• Inconsistent and tailing peaks may occur when operating close to an analyte

pKa and should be avoided.


Page 64

Why Worry About pH? pH, pKa and Weak Bases

At pH 9 – the sample exists as protonated and unprotonated diphenhydramine

in a ratio of 1:1. Peak shape can be poor.

At pH 10 – 91% of the sample exists as unprotonated diphenhydramine.

At pH 8 – 91% of the sample exists as protonated diphenhydramine.

Ka = [R3N][H+]

[R3NH+]

Ka = 1 x 10-9

pKa = 9

R3NH+ R3N + H+

CHOCH CH N2 2

CH3

CH3

+

HCH

3

CH3

CHOCH CH N2 2 + H+


Page 65

pH vs. Selectivity for Acids and Bases

5

SCD

+

+

2 +

1

1.5

1.0

0.5

0.0

-0.5

log

k«

3 4 5 6 7 8 pH

A B C

2

4

5

3

3 5 7 9

ELUENT pH

40

30

20

10

10

Ret

entio

n

+++

3

17,12 - OC

UDC

SOC4

6

C12-OC

J.C. 268(1983) 1

J.C. 111(1975) 149

Column: Nucleosil-C18

Mobile Phase: 45% ACN/55% phosphate buffer

Sample: Bile Acids

Column: mBondapak-C18

Mobile Phase: 60% 25 mM phosphate buffer

40% Methanol

1. Salicylic acid

2. Phenobarbital

3. Phenacetin

4. Nicotine

5. Methamphetamine

• Retention and selectivity can change dramatically when pH is changed.


Page 66

Importance of pH and Buffers

A Practical Example

•Why the Sample Dictates Use

•What Happens When Buffer Used Effectively

•What Happens When Buffer Ignored or Used Improperly


Page 67

Importance of pH and Buffers - A Practical

Example Optimized Isocratic Conditions for

Cardiac Drugs

0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14

Time (min)

5

4

32

1

0 1 2 3 4 5 6Time (min)

5

4

32

1Column: StableBond SB-C18, 4.6 x 150 mm, 5 mm Mobile Phase: 45% 25 mM NaH2PO4, pH 3.0 55% MeOH Flow Rate: 2.0 mL/min.

Temperature: 35 C

Detection: UV 254 nm

Sample: Cardiac Drugs 1. Diltiazem 2. Dipyridamole 3. Nifedipine 4. Lidoflazine 5. Flunarizine


Commonly Used Buffers for Reversed

Phase HPLC Buffer pKa Buffer Range UV Cutoff (nm)

Phosphate 2.1 1.1-3.1 200

7.2 6.2-8.2

12.3 11.3-13.3

Formic acid* 3.8 2.8-4.8 210

Acetic acid* 4.8 3.8-5.8 210

Citrate 3.1 2.1-4.1 230

4.7 3.7-5.7

5.4 4.4-6.4

Tris 8.3 7.3-9.3 205

Triethylamine* 11.0 10.0-12.0 200

Pyrrolidine 11.3 10.3-12.3 200

* Volatile buffers for LC/MS applications

Page 70

Optimum buffering capacity occurs at a pH equal to the pKa of the buffer. Most buffers provide

adequate buffering capacity for controlling mobile phase pH only within ±1 unit of their pKa


Fehlersuche nach Problembildern

Nur ein Problem, das mindestens zweimal auftritt ist ein HPLC-Problem

Durchführung von Wiederholungsmessungen

Test der Anlage mit Testmischungen

Vergleich mit Tests der Einzelkomponenten der Anlage

U Ursache

D Diagnose

L Lösung


I) Druckprobleme

a) Druck zu niedrig aber konstant

U Lecks

D Test mit Filterpapier an allen Verbindungsteilen

Dichtheit nach Geruch (z.B. Acetatpuffer)

Nadelsitz am Autosampler prüfen

U Ansaugleitungen sind verstopft (Fritten, Degasser..)

D Entfernen von Degasser und Ansaugfritten

L Reinigung der Ansaugfritten im Ultraschallbad

U Kolbendichtringe der Pumpe undicht

L Auswechseln

U Säule hat sich im alkalischem Medium aufgelöst

L Sättigersäule verwenden


b) Druck zu hoch

U Kapillare "zugedrückt"

D Vom Detektor beginnend alle Komponenten von

der Anlage trennen

L Kapillare auswechseln, finger tighten – Anschlüsse verwenden

U Abrieb aus dem Packungsbett der Säule

L Säule drehen und ohne Detektor spülen

U Mikrobiologische Verunreinigungen

L der mobilen Phase 5% ACN zusetzen oder

0.005% NaN3 (bedingt für Gradientenelution geeignet)


b) Druck zu hoch

U ausgefallene Probenbestandteile

L Probe filtern

Säuleneinlassfilter verwenden

Vorsäule wechseln

Säule nach Regenerierungsvorschrift spülen

U Eluentenbestandteile (Puffersalze) fallen aus

D Leergradient

L Wechsel von ACN zu MeOH,

Pufferkonzentration ↓

U Viskosität des Eluenten ist zu hoch

L Wechsel zu niederviskosen Eluenten (ACN)

Temperatur ↑


Druck zu niedrig aber konstant

U Lecks

D Test mit Filterpapier an allen Verbindungsteilen

Dichtheit nach Geruch (z.B. Acetatpuffer)

Nadelsitz am Autosampler prüfen

U Ansaugleitungen sind verstopft (Fritten, Degasser..)


L Reinigung der Ansaugfritten im Ultraschallbad

U Kolbendichtringe der Pumpe undicht

L Auswechseln

U Säule hat sich im alkalischem Medium aufgelöst



c) Druck schwankend

innerhalb von Sekunden

U Ventile der Pumpe schließen nicht richtig

L Luft aus der Pumpe entfernen (Purgen)

Lösungsmittel sorgfältig entgasen

U Unterdruck in einem Kanal des Ansaugsystems (LM-Filter, Degasser)

D LM-Filter / Degasser entfernen

L LM Filter reinigen (THF / Wasser im Ultraschallbad)

U flüchtige Eluenten (Ether..) erzeugen Dampfblasen

L höhersiedende Eluenten (z.B. Methyl-tert. Butylether) verwenden

mit jedem Versuch

U Viskositätsunterschiede im Gradienten

Viskositätsmaximum bei Alkoholen und THF bei mittlerer Zusammensetzung


c) Druck schwankend

am Tage

U Temperaturunterschiede

L Säule temperieren

U Probenbestandteile lösen sich auf

D p ↓

L Säule regenerieren

U Packungsbett setzt sich

D p ↑

L Säule drehen

U Säule löst sich auf

D p ↓


2 < pH < 8

U Probenbestandteile fallen aus

D p ↑

L Säule regenerieren


II) Basislinienprobleme

Rauschen der Basislinie

Rauschen bei Flow =0

U alte Deuteriumlampe

L nach ca. 2000 h muß die Lampe ausgewechselt werden

Rauschen bei Flow <>0 kein Rauschen bei Flow =0

U Luftblasen im Detektor

D Prüfung ob Signal sich stark ändert, wenn Auslaß des Detektors

kurz verschlossen wird (Vorsicht Druckbelastbarkeit der Detektorzelle

beachten -besonders RI / FLD)

L Entgasen, Restriktor am Detektorausgang

U späteluierende Analyten

L Säule spülen

→ siehe Systemeignungstest und IIIc Geisterpeaks


Rauschen der Basislinie

U Eluent verdampft

L hochsiedende Eluenten verwenden

L Eluent nach der Säule kühlen

U Temperaturunterschiede

L Zwischen Säule und Detektor der Eluent temperieren

bes. bei höheren Säulentemperaturen


Drift

Zyklisch in jedem Chromatogramm

U Änderung der Zusammensetzung der mobilen Phase ( < 230 nm)

L UV-inaktive Eluenten verwenden

↑

Zyklisch an jedem Tag

U Temperatur ändert sich

L Detektor warmlaufen lassen,

Säule thermostatisieren


Störungen der Basislinie zur Totzeit

U Lösungsmittel ≠ Elutionsmittel

Brechungsindexunterschiede zwischen Elutionsmittel und Lösungsmittel der Probe

U Zusätze zur Stabilisierung der Proben im LM (z.B. NaN3)

L Methodenentwicklung: keine Stabilisatoren einsetzen

Routine: Analyten 1 < k' < 5


III) Peakprobleme

keine Peaks

kein Injektionspeak sichtbar

U keine Probe injiziert

L Vial und Sampler prüfen

U Gerät misst zu unempfindlich

L Geräteeinstellungen prüfen

U Lampe des Detektors defekt

D Software - Fehlermeldung

L Wellenlänge ändern

Injektionspeak sichtbar

U Probe ist noch auf der Säule

L anderes Lösungsmittel

U kein Fluss durch den Detektor

D Druck prüfen

Fluss am Detektorausgang prüfen


b) sehr kleine Peaks

U zu geringe Konzentration der Probe

U Empfindlichkeit des Detektors verstellt

D Testmischung analysieren

U Detektorzelle ist verschmutzt

L Reinigen mit warmen Wasser, THF,

U Probe hat sich zersetzt


c) Geisterpeaks

U Luftblasen

D Sichtkontrolle

meist mit Pulsation der Pumpe verbunden (Niederdruckgradient)

L Lösungsmittel sorgfältig entgasen

Undichtigkeiten vor dem Hochdruckkolben prüfen

U Pulsation der Pumpe

L → Druckschwankungen im Sekundenbereich


c) Geisterpeaks

U ungenügende Reinheit des Wassers

→ Anreicherung der Verunreinigung im Gradienten

D Test mit Leergradient

(20 min A, 20min 0 → 100 %B, 10min 100%B = klein (215nm)

bei Verdopplung der Anreicherungszeit 40 min müssten doppelt so hohe Peaks erscheinen

L HPLC -Wasser verwenden

Wasserbereitungsanlage warten

Wasser nachreinigen über eine aktivierte (MeOH) C18 Kartusche

U Zusätze in der mobilen Phase

D Test mit Leergradient

L Wechsel zu UV-inaktiven Additiven

Veränderung der Trennbedingungen, um Geisterpeaks in einen leeren Bereich des Chromatogrammes zu bringen


c) Geisterpeaks

U spät eluierende Komponenten aus vorhergehender Probe

D Peakbreite !

N = 5,54 (tR / w0,5)2 → tR = N0,5 w0,5 / 2,35

→ Abschätzung aus welcher Probe der Analyt kommt

U Bestandteile des Septum

D Peaks erscheinen vor oder in der Nähe der Totzeit

L Vial stets nach 20 Injektionen erneuern

Alle Analyten sollte im Bereich 1< k' < 20 liegen

U Bestandteile der Probenmatrix

L Verbesserung der Probenvorbereitung

U sterischer Ausschluss einzelner Analyten

D tr < t0

L Partikel mit größerem Porenvolumen verwenden


d) negative Peaks

U Analyten haben geringere UV-Absorption als Eluent (UV-Detektor)

L Änderung der Wellenlänge

Auswertung negativer Peaks ("Detect Negative Peaks on")

U Analyten haben geringeren Brechungsindex als Eluent (RI-Detektor)

L Auswertung negativer Peaks ("Detect Negative Peaks on")


e) Tailing

alle Komponenten einschließlich Inertpeak zeigen Tailing

U Totvolumen

schlechte Anschlüsse zwischen Injektor und Detektor

zu große / lange Kapillaren

falsche Schneidringe

unsauber bearbeitete Kapillarenden

U Totvolumen

beschädigtes Säulenbett

L Probe filtern


Vorsäule wechseln



e) Tailing

inerte Komponente zeigt kein Tailing

U Wechselwirkung der Analyten mit Restsilanolgruppen

L Änderung des pH-Wertes, damit Analyten undissoziiert vorliegen

Einsatz von Additiven wie Acetat oder Triethylamin (50 mmol/l)

Säulen mit endcapping benutzen

polymere Phasen benutzen

U Dissoziation sauer Silanolgruppen

L pH↓

Konzentration Puffer ↑

U andere chemische Ursachen

L Probe filtern


Vorsäule wechseln



e) Tailing

die früh eluierenden Analyten tailen, die spät eluierenden Analyten nicht

U zu starke Lösungsmittel im Vergleich zum Eluenten

L Probe im Eluenten lösen

U in der Probenschleife ist noch starker Eluent vom vorhergehenden Versuch (meist bei

Gradientenversuchen !)

L Gradientenversuch immer mit der mindestens 2 min Equilibrierung auf die

Ausgangsbedingungen für den nächsten Versuch beenden


e) Tailing

Einige Komponenten zeigen Tailing

U falscher Puffer

U falscher pH-Wert,

U zu geringe Konzentration des Puffers

U Nicht getrennte Analyten

D Peakreinheitstest

L Änderung der Trennbedingungen

Peakunterdrückung durch Änderung der Detektionsbedingungen


f) Fronting

U Überladung der Säule

L Reduktion der Probenmenge

Abtrennung von Matrix durch Probenvorbereitung

Säulendurchmesser ↑

Trennmaterial mit höherer Kapazität verwenden


g) Doppelpeaks

alle Peaks

U Verschmutzung der Säule, Einlassfritte

L Vorsäule wechseln


U Probenvolumen zu hoch

L max. 1/6 Säulenvolumen injizieren

ein Peak

U Nicht getrennte Analyten

D Peakreinheitstest (Ratio Plot, Peak Purity Analysis, Spectra Plot)

L Änderung der Trennbedingungen

Peakunterdrückung durch Änderung der Detektionsbedingungen

U vorhergehende Analyse

D Peakbreite !

N = 5,54 (tR / b0,5)2 → tR = N0,5 b0,5 / 2,35

→ Abschätzung aus welcher Probe der Analyt kommt

→ siehe Geisterpeaks


h) breite Peaks

U Überladung der Säule

L Reduktion der Probenmenge

U Probenkonzentration zu hoch

U Injektionsvolumen zu groß

L schwächere Eluenten

Gradient

U Detektor ist nicht mehr im linearen Bereich

L Ändern der Wellenlänge


h) breite Peaks

U Anlage nicht optimal aufgebaut

Detektorzelle zu groß

Kapillaren zu lang, zu dick, schlecht bearbeitet

Injektionsvolumen zu groß

D → Beispiele zur Berechnung der Bandenverbreiterung außerhalb der Säule

U lange Retentionszeiten

D 1< k' < 20

L stärkere Eluenten

Gradient

U Viskosität der Eluenten zu hoch

L Übergang zu niedrigviskosen Eluenten (ACN)


h) breite Peaks

U Bodenzahl der Säule zu gering

D Analyse Testmischung und Vergleich mit Herstellerangaben

L andere Säule

längere Säule

kleinere Partikel

U Zeitkonstante am Detektor zu groß


IV) Probleme mit der qualitativen und quantitativen

Bewertung der Peaks

a) schwankende Retentionszeiten

Retention des Totzeitpeaks hat sich geändert

U Fluss hat sich geändert

D Flusskontrolle

Retention des Totzeitpeaks hat sich nicht geändert

U Säule nicht ausreichend äquilibriert

L mindestens 20 Säulenvolumen äquilibrieren



U keine reproduzierbare Herstellung der mobilen Phase

L Volumenkontraktion beachten

pH in der wässrigen Phase messen

U Komponenten verdunsten beim Entgasen

L separat entgasen und dann mischen

U Änderung der Zusammensetzung der mobilen Phase

- Reaktion (Peroxide, Algenwachstum)

- Verdampfung

D pH-Wert prüfen

U keine korrekte Gradientenmischung

Ansaugleitungen sind verstopft (Fritten, Degasser..)

Unterdruck entsteht


February 10, 2012 100


U Proportionierventil defekt

D → Anlagentest

U Temperatur ist nicht konstant

Retentionszeit schwankt um 1..2% je °C

U Pufferkapazität zu gering

L Pufferkonzentration ≥ 20 mM

U Säule hat sich verändert

D Säulentest

L Vorsäule wechseln

Regenerierung der Säule

February 10, 2012 101


U Matrixpeaks wurden an den aktivsten Zentren adsorbiert

D tr ↓

L "Konditionierung" der Säule mit Matrixproben

U Säule wurde überladen

D tr ↓

L Probenmenge ↓

Säulenvolumen ↑

Trennmaterial höherer Kapazität

U Verlust an gebundener stationärer Phase

D tr ↑

L 2 < pH < 8

endgecapptes Material

Material mit hohem C-Gehalt

February 10, 2012 102

b) schwankende Peakhöhen

alle Peaks schwanken

U keine reproduzierbare Injektion

- Luft in der Dosierspritze

- nicht ausreichend Probe vorhanden

- Analyt ist zu viskos

- Septum in der Autosampler- Nadel

February 10, 2012 103

Peakhöhen schwanken nur bei manueller Injektion

U Dosierschleife wird überfüllt (≈ 3 x Schleifenvolumen)

wenn Analyt in einem zu schwachen LM gelöst ist, dann adsorbiert Analyt am Injektionsventil

D Problem tritt nicht auf bei partiell gefüllten Schleifen (z.B. Autosampler)

U Lecks

D → siehe Druck zu niedrig

U Zersetzung der Probenkomponenten

D Test mit Mischungen aus Säulentest

U Fehlzuordnung der Peaks

D Spectra Library Search,

Analyse unter anderen Bedingungen

U Beladung und irreversible Adsorption bei neuer Säule

U Verlust bei der Probenvorbereitung

L interne Standards

February 10, 2012 104

c) schwankende Peakflächen

U → schwankende Peakhöhen

U → kein konstanter Fluß

U falsche Basislinienführung

U nicht aufgelöste Matrixpeaks

February 10, 2012 105

Übungen zur Fehlererkennung

a) Die Packung am Kopf der Säule hat sich zugesetzt

b) Die Flußgeschwindigkeit hat sich verringert

c) Die Säule war nicht im Gleichgewicht

d) Die Zusammensetzung der mobilen Phase hat sich geändert

February 10, 2012 106

C 18 Säule, ACN/Wasser,

Was muß man tun um das rechte Chromatogramm zu erhalten ?

a) Den Wasseranteil der mobilen Phase erhöhen

b) Eine C8 -Säule verwenden

c) Methanol anstelle von Acetonitril verwenden

d) Eine geanz andere stationäre Phase verwenden (Diol ?)

February 10, 2012 107

Beide Chromatogramme wurden mit demselben System aufgenommen.

Worauf beruht der Unterschied?

a) Auf einem Leck im Injektor

b) Auf einer Erhöhung der Säulentemperatur

c) Auf einer Verringerung der Säulentemperatur

d) Auf einem Leck in der Detektorzelle

February 10, 2012 108

rechts: Normalzustand, Was ist die Ursache für das linke Chromatogramm?

a) Die Injektion einer Mischung aus 4 Komponenten

b) Die Setzung des Packungsbettes am Kopf der Säule

c) Die ungleichmäßige Packung der Säule

d) Die schlechte Konstruktion der Detektorzelle

February 10, 2012 109

Analyse einer Lösung mit 2 verschiedenen Säulen, Was ist die Ursache für

diese unterschiedlichen Chromatogramme?

a) Der Injektor wurde zwischen beiden Analysen verschmutzt

b) Die Mischung enthielt 3 Komponenten, die Bedingungen waren für die

linke Säule nicht optimal

c) Eine Verbindung lag in sehr geringer Konzentration vor

d) Die HPLC Pumpe ist ausgefallen

February 10, 2012 110

Was ist Ursache für Drift (RI-Detektor) ?

a) Eine Luftblase in der Meßzelle

b) Temperaturänderung

c) Das System war noch nicht im Gleichgewicht

d) Verschmutzung der mobilen Phase

February 10, 2012 111

Ionenpaarchromatographie auf einer RP-Säule, Wie erreicht man das

rechte Chromatogramm ?

a) Konzentration des Ionenpaarreagenz

b) Fluß

c) C-Kette des Ionenpaarreagenz

February 10, 2012 112

Chromatogramm wurde mit UV-Detektor aufgenommen, Was gilt ?

a) Beide Komponenten habe ähnlich Konzentrationen

b) Die 2. Komponente hat eine höhere Konzentration

c) Es ist keine derartige Aussage möglich

February 10, 2012 113

RP-Säule, oben reines Wasser, Wie erhält man das untere Chromatogramm?

a) pH -Wert

b) pH-Wert

c) Ionenpaarreagenz zufügen

February 10, 2012 114

RI-Detektor, Warum wurde kein Peak gefunden ?

a) Komponenten absorbieren das Licht

c) Die Lösung ist nicht konzentriert genug

c) Am Injektor ist ein Leck

d) Der Brechungsindex der mobilen Phase ist zu hoch

February 10, 2012 115

Welche Lösungsansätze für Ihre HPLC

Probleme haben Sie jetzt ?

troubleshooting in der hplc - agilent · 3 february 10, 2012 hplc probleme lc gc leserumfrage...

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