INFORME FINAL DEL ESTUDIO: DETECCIÓN DE SECUENCIAS TRANSGÉNICAS EN COLECTAS DE MAÍZ NATIVO DESTINADAS PARA SU CONSERVACIÓN EN BANCOS

DE GERMOPLASMA

AGOSTO, 2009

DIRECCIÓN GENERAL

CENTRO NACIONAL DE INVESTIGACIÓN

Y CAPACITACIÓN AMBIENTAL

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RESPONSABLES TÉCNICOS: Dra. Martha Graciela Rocha Munive. Subdirectora de Análisis Genético y Toxicidad, INE-CENICA Dra. Beatriz Rendón Aguilar. Profesora Titular de T. C., UAM-Iztapalapa Dra. Alejandra Serrato Díaz. Responsable del Laboratorio Divisional de Biología Molecular, UAM-Iztapalapa Dra. Adriana Otero Arnaiz. Coordinadora del Programa de Bioseguridad. INE RESPONSABLES DE LOS ANÁLISIS P de Biól. Yanin Islas Barrios M. en C. Luis Adrián Castillo León Ing. Erika Lagunes Fortiz Q. A. José Miguel Ángel Castillo Minjarez Biól. Aldo Bernal Rojas M. en C. Alma Berenice Zúñiga Bustos Jesús Vergara Huerta Anaitzi Gabriela Rivera Villar

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Resumen Se seleccionaron muestras de accesiones de maíz depositadas en el Banco Nacional de Germoplasma Vegetal (BANGEV), de la Universidad Autónoma de Chapingo. De las mazorcas colectadas por cada accesión se desgranaron, secaron y homogeneizaron las semillas; se preparó una submuestra aleatoria de 400 semillas que fue enviada en sobre de papel al laboratorio de CENICA para su detección. Las muestras se molieron y homogeneizaron para extraer ADN a partir de una submuestra de 2 gramos. Se validaron las metodologías de amplificación por PCR del promotor 35s y terminador nos que son secuencias insertadas en maíz transgénico. Se analizaron las muestras para encontrar las secuencias y no se detectó la presencia de material genéticamente modificado en ellas. Se realizó un reporte dirigido al curador del banco de germoplasma informándole de la ausencia de maíz transgénico en las accesiones. Con este proyecto se avanza en el diagnóstico de la dispersión de transgenes en el país y se concluye la ausencia de los mismos en las colectas analizadas colectadas en la península de Yucatán. Introducción De acuerdo al artículo 86 de la Ley de Bioseguridad de Organismos Genéticamente Modificados (LBOGM), el Instituto Nacional de Ecología, junto con otras instituciones aportarán información para determinar las especies de las que México sea centro de origen y de diversidad genética así como las áreas geográficas en las que se localizan. La SEMARNAT y la SAGARPA establecerán en los acuerdos que expidan, las medidas necesarias para la protección de dichas especies y áreas geográficas. Entre las actividades realizadas para cumplir con este mandato, se desarrollan actualmente diversos proyectos institucionales de investigación relacionadas con la diversidad y distribución del maíz nativo y sus parientes silvestres en México, que apoyarán la definición de los centros de diversidad en el territorio nacional bajo la convocatoria INE-CONABIO-INIFAP: "Conocimiento de la diversidad y distribución actual de maíz nativo y sus parientes silvestres en México". El mejor plan de conservación para el maíz y sus parientes silvestres debe considerar una combinación de conservación in situ, en el campo, complementaria a una conservación ex situ en los bancos de germoplasma; por ello, diversas colectas maíz durante los años 2007 al 2009 se destinan a bancos de germoplasma de infraestructura de vanguardia (ver anexo). Se estima que para el 2009 un aproximado de 9375 muestras de maíz, de las cuales 7685 (81.97%) serán depositadas en el Banco de Germoplasma del Instituto Nacional de Investigaciones Forestales, Agrícolas y Pecuarias (INIFAP) y posteriormente serán caracterizadas empleando herramientas agronómicas, bioquímicas y moleculares que definirán la biodiversidad presente así como otras propiedades que les confieran valor agregado. Por otro lado, en la actualidad aún se desconoce los efectos que pueda tener la introgresión de transgenes en los genomas de variedades convencionales o criollas, por lo que el Estado Mexicano actúa con precaución, de manera prudente y con bases científicas y técnicas para prevenir, reducir o evitar los posibles riesgos que las actividades con OGMs pudieran ocasionar a la salud humana o al medio

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ambiente y la diversidad biológica; como se manifiesta en los principios mencionados en el artículo 9 de la LBOGM. La presencia de OGMs en variedades nativas de maíz se sospecha dado que entre los años 1993 y 1998, fueron autorizadas liberaciones de maíz genéticamente modificado, las cuales comprenden un total de nueve eventos de modificación genética asociados a resistencia a herbicida y/o resistencia a lepidópteros. Aunado a esto, ha sido reportada la presencia de secuencias que no pertenecen al genoma original del maíz (transgénicas) en maíces criollos, lo que indica problemas potenciales para los bancos de germoplasma, debido al flujo de genes y subsecuente introgresión de secuencias GM del material para conservación ex situ, por lo que se deben aplicar medidas precautorias para mitigar este riesgo. Una medida precautoria es el precisar con el mayor grado de sensibilidad y nivel de confianza, que las colectas de maíz nativo y sus parientes silvestres que se colecten y depositen en los diversos bancos de germoplasma, estén dentro de lo posible libres de secuencias transgénicas. Esta medida permitirá conservar material vivo de maíz con integridad original de su genoma para su futura incorporación a programas de mejoramiento, conforme lo definan las políticas de seguridad alimentaria. Aunado a lo anterior, con la detección oportuna de la posible presencia de secuencias transgénicas se contará a corto plazo con información para sustentar decisiones en términos de evaluaciones de riesgo y comunicación plasmadas en la Ley de Bioseguridad de Organismos Genéticamente Modificados. JUSTIFICACIÓN Ante el creciente riesgo de liberación no intencional e intencional de maíz genéticamente modificado en México, el riesgo de introgresión de genes con la consecuente repercusión negativa a las variedades nativas de maíz son inminentes. De ahí que resulte necesario un monitoreo sistemático y constante en distintas zonas del país en las que exista alta diversidad genética de este cultivo, así como establecer estrategias de conservación in situ y ex situ de este importante recurso genético. En el presente estudio se pretenden analizar las colectas derivadas del proyecto conocimiento de la diversidad y distribución actual de maíz nativo y sus parientes silvestres en México, para detectar la posible presencia de secuencias transgénicas y garantizar en la medida de lo posible, el depósito de colectas libres de éstas en los bancos de germoplasma nacionales de manera coordinada entre el Laboratorio de Biología Molecular de la DGCENICA y el laboratorio divisional de Biología Molecular de la UAMI, así como con la participación del Instituto Nacional de Investigaciones Forestales, Agrícolas y Pecuarias (INIFAP) y de la Comisión Nacional para el manejo y uso de la Biodiversidad (CONABIO).

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OBJETIVOS Analizar las colectas derivadas de los proyectos correspondientes a la convocatoria INE-CONABIO-INIFAP: "Conocimiento de la diversidad y distribución actual de maíz nativo y sus parientes silvestres en México", para detectar la posible presencia de secuencias transgénicas y garantizar en la medida de lo posible, que las colectas que se vayan a depositar en los bancos de germoplasma estén libres de éstas. MATERIALES Y MÉTODOS Las muestras cuyo destino final fueron los bancos de germoplasma del INIFAP son analizadas por esa institución para la presencia de transgenes. En el presente estudio se seleccionaron aquellas que serían depositadas en el Banco Nacional de Germoplasma Vegetal (BANGEV), Universidad Autónoma de Chapingo, provenientes del proyecto “Colecta de maíces nativos en regiones estratégicas de la península de Yucatán”. a) Preparación y envío de la muestra El curador del banco de germoplasma preparó las muestras para la detección de la siguiente manera: De las mazorcas colectadas por cada accesión se desgranaron, secaron y homogeneizaron las semillas; se preparó una submuestra aleatoria de 400 semillas identificadas con el número asignado por el banco de germoplasma y del proyecto. Las colectas fueron enviadas en sobres de papel al laboratorio para su detección. Se seleccionaron 156 muestras para su análisis. b) Sensibilidad del tamaño de la submuestra El grado de sensibilidad del tamaño de muestra se definió con la ecuación: r= (1-(p/100))n x 100 donde: r= Probabilidad de que exista un porcentaje máximo de semillas transgénicas igual a p, aún sin detectar transgenes. p= Porcentaje de OGM en el lote (0.9%, European Parliament and Council Regulation 1829/2003). n= Tamaño de muestra [Número de semillas]. Dado que se seleccionaron 400 semillas de maíz por accesión entonces: r= (1-(0.9/100))400 x 100. La probabilidad de que exista un porcentaje máximo de semillas transgénicas igual a 0.9% aun si no se detectan transgenes, será de 2.7%. En otras palabras, existe un nivel de confianza del 97.3% de encontrar niveles mayores o iguales a 0.9% de semillas transgénicas en las muestras analizadas. c) Análisis molecular Las 400 semillas se molieron en un molino de cuchillas Retsch modelo Grindomix. Para asegurar que la muestra analítica fuera representativa de la muestra de semillas, de este homogeneizado se tomaron 2 g de polvo de semilla de maíz y se extrajo ADN genómico, de acuerdo a las recomendaciones del Comité Europeo de Normalización/Organización Internacional para la estandarización (CEN/ISO).

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Extracción de ADN La extracción de ADN se realizó empleando el kit de extracción Fast ID de Genetic ID siguiendo las instrucciones del fabricante. Estándares empleados Se emplearon los siguientes materiales de referencia: ERM-BF412f Bt11 5.0%, ERM-BF412a Bt11 0.0%, de los cuales se extrajo el ADN a partir de 100 mg de harina. Amplificación por PCR punto final de los marcadores: zeina, p35s y tnos Para verificar la amplificación de los ADNs obtenidos de las muestras se realizó la amplificación por PCR del gen endógeno zeina. Una vez verificada la amplificación con el gen endógeno se realizó la detección de OGMs en las muestras, mediante la amplificación por PCR punto final de los marcadores p35s y tnos de acuerdo al procedimiento acreditado de CENICA (CENICA/Procedimiento Técnico/BM-01: Detección de maíz genéticamente modificado mediante la amplificación de ADN con la reacción en cadena de la polimerasa). La amplificación se realizó con la enzima de alta fidelidad HotStar Taq ADN polimerasa de Qiagen, para garantizar una alta eficiencia en la amplificación. Los iniciadores empleados se encuentran en la Tabla 1 y las condiciones de reacción de la PCR y el programa de amplificación se encuentran en las tablas 2, 3, 4 y 5. Las amplificación se llevó a cabo en el termociclador 2720 thermal cycler de Applied Biosystems. Los productos de PCR se visualizaron en geles de agarosa al 2%, teñidos con bromuro de etidio. Tabla 1. Iniciadores empleados

Gen/Evento Iniciador F Iniciador R Tamaño del amplicon (pb)

Referencia

zeina ZEIN3: AGTGCGACCCATATTCCAG

ZEIN4: GACATTGTGGCATCATCATTT

277 Studer et al, 1997

p35s p35S-cf3 CCACGTCTTCAAAGCAAGTGG

p35S-cr4 TCCTCTCCAAATGAAATGAACTTCC

123 Lipp et al, 2001

tnos HA-nos118f GCATGACGTTATTTATGAGATGGG

HA-nos118r GACACCGCGCGCGATAATTTATCC

118 Lipp et al, 2001

Tabla 2. Reacción de PCR para el marcador zeina

Reactivo Concentración inicial

Concentración final

Volumen para una reacción de 25 µl

Buffer para PCR 10X 1X 2.5 µl

Mezcla de dNTP 10 mM 0.2 mM 0.5 µl

Solución MgCl2 25 mM 2.5 mM 2.5 µl

iniciador Zein3 20 uM 0.5 uM 0.625 µl

iniciador Zein4 20 uM 0.5 uM 0.625 µl

Taq DNA polimerasa

5U ul 0.025 U/ul 0.125 µl

Agua ultrapura ---- ---- 17.625 µl

ADN molde 30 ng/µl 0.6 ng/ul 0.5 µl

Volumen total ---- ---- 25 µl

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Tabla 3. Reacción de PCR para el marcador p35s

Reactivo Concentración

inicial Concentración final

Volumen para una reacción de 25 µl

Buffer para PCR 10X 1X 2.5 µl

Mezcla de dNTP 2.5 mM/cu 0.1 mM/cu 1 µl

Solución MgCl2 25 mM 1 mM 1 µl

Solución Q 5X 1X 5 µl

Iniciador p35S-cf3

20 uM 0.4 uM 0.5 µl

Iniciador p35S-cr4

20 uM 0.4 uM 0.5 µl

Taq DNA polimerasa

5U ul 0.025 U/ul 0.125µl

Agua ultrapura ---- ---- 9.375 µl

ADN molde 30 ng/µl 150 ng 5 µl

Volumen total ---- ---- 25 µl

Tabla 4. Reacción de PCR para el marcador tnos

Reactivo Concentración inicial

Concentración final

Volumen para una reacción de 25 µl

Buffer para PCR 10X 1X 2.5 µl

Mezcla de dNTP 2.5 mM/cu 0.1 mM/cu 1 µl

Solución MgCl2 25 mM 1 mM 1 µl

Solución Q 5X 1X 5 µl

Iniciador HA-nos118f

20 uM 0.4 uM 0.5 µl

Iniciador HA-nos118r

20 uM 0.4 uM 0.5 µl

Taq DNA polimerasa

5U ul 0.025 U/ul 0.125µl

Agua ultrapura ---- ---- 9.375 µl

ADN molde 30 ng/µl 150 ng 5 µl

Volumen total ---- ---- 25 µl

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Tabla 6. Programas de amplificación para las diferentes regiones amplificadas

Nombre del evento

Etapa Paso Temperatura Tiempo Número de ciclos

1 1 95 ºC 0:03:00 1

Zeina

(endógeno)

2 1

2

3

96 ºC

60 ºC

72 ºC

0:01:00

0:01:00

0:00:45

40

3 1 72 ºC 0:03:00 1

2 4 ºC

1 1 95 ºC 0:15:00 1

p-35s y t-nos

2 1

2

94 ºC

55 ºC

0:00:20

0:00:55

37

3 1 72 ºC 0:10:00 1

2 4 ºC

RESULTADOS Amplificación del gen endógeno zeina Con la amplificación del gen endógeno para todas las muestras se demostró que el ADN obtenido es amplificable en la PCR y que no tiene inhibidores que pudieran producir falsos negativos en las pruebas de amplificación de transgenes. En la figura 1 se observa el resultado de la amplificación en una submuestra representativa. PM CP1 CP2 B Muestras

Figura 1: Amplificación por PCR punto final del gen endógeno Zeina (277 pb). Carril PM (marcador de peso molecular). Carril CP1 y CP2 (Controles Positivos: Maíz Bt11 0% y 5%). Carril B (Blanco: buffer TE).

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Amplificación de los marcadores p35s y tnos Todas las muestras analizadas resultaron negativas a la presencia de los marcadores p35s y tnos (Figuras 2a, 2b, 2c, 3a, 3b, y 3c). A PM Muestras (abajo) Muestras B CN CP

B PM CP CN B Muestras

C PM CP CN B Muestras

Figura 2: Amplificación por PCR punto final del marcador p35s (127 pb). Carril PM (marcador de peso molecular). En A se muestran los controles al final: Carril CN (Control Negativo Maíz Bt11 0%). Carril B (Blanco/TE) y el control positivo CP (Control Positivo Maíz Bt11 5%).

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A PM CP CN B Muestras

B PM CP CN B Muestras

CPM CP CN B Muestras

Figura 3: Amplificación por PCR punto final del marcador tnos (118 pb). Carril PM (marcador de peso molecular). Carril CP (Control Positivo Maíz Bt11 5%). Carril CN (Control Negativo Maíz Bt11 0%). Carril B (Blanco/TE).

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Discusión y conclusiones Desde la publicación de la presencia de maíz transgénico en el estado de Oaxaca (Quist y Chapela, 2001), se ha mantenido una preocupación constante por mantener las variedades criollas de maíz libres de material genéticamente modificado o transgénico. Los bancos de germoplasma constituyen una estrategia para preservar la diversidad genética contenida en plantas como el maíz, en donde se conservan tanto variedades criollas como materiales híbridos que puedan ser empleados en planes de mejoramiento o para reintroducir en lugares en los que se ha perdido el germoplasma original. Por este motivo es de suma importancia que el material que ingresa a los bancos este libre de material exógeno, tal como es el maíz GM. El esfuerzo más importante a la fecha para analizar muestras de maíz de bancos de germoplasma es el realizado en el CIMMYT (Centro internacional para el mejoramiento de maíz y trigo), en el que han más de 150 razas criollas mexicanas y no se ha detectado la presencia del promotor 35S en ellas. El presente estudio representa un avance en el conocimiento del estado de variedades criollas ante la inminente presencia de maíz genéticamente modificado en otras partes del mundo. De acuerdo a los resultados obtenidos, no se encuentra presencia de material GM en las muestras analizadas en este estudio y colectadas en la península de Yucatán. Se recomienda extender el alcance de esta investigación a otras regiones del país, ya que los bancos de germoplasma representan un reservorio importante de maíz que debe ser salvaguardado para generaciones futuras y cuya reserva genética constituye un patrimonio natural del país. Bibliografía CEN/ISO (2005a) Methods of analysis for the detection of genetically modified organisms

and derived products. Nucleic acid extraction. ISO21571:2005 CEN/ISO (2005b) Methods of analysis for the detection of genetically modified organisms

and derived products. Qualitative nucleic acid based methods. ISO 21569:2005. CEN/ISO (2005c) Methods of analysis for the detection of genetically modified organisms

and derived products. Quantitative nucleic acid based methods. ISO 21570:2005 CEN/ISO (2006) Methods of analysis for the detection of genetically modified organisms and

derived products. General requirements and definitions. ISO 24276:2006 Lipp, M., Bluth, A., Eyquem, F., Kruse, L., Schimmel, H., Van den Eede, G. y Anklam, E.

2001 “Validation of a method based on polymerase chain reaction for the detection of genetically modified organisms in various processed foodstuffs”. European Food Research Technology 2121,497-504

Quist, D. y I. H., Chapela. 2001. Transgenic DNA introgressed into traditional maize landraces in Oaxaca, México. Nature, 414:541-543

Studer, E., I. Dahinden, J. Luthy, y P. Hübner. 1997. Nachweis des gentechnisch veräderten “Maximizer”-Mais mittels der Polymerase-Kettenreaktion (PCR). Mitteilungen aus dem Gebiet der Lebensmittel und Hygiene 88, 515-524.

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ANEXO Proyectos bajo la Convocatoria: “Conocimiento de la diversidad y distribución actual del maíz nativo y sus parientes silvestres en México” emitida por CONABIO, financiados por la SEMARNAT, la CIBIOGEM y la SAGARPA.

Ref Título Responsable Núm. de

accesiones a colectar

Estatus de proyecto

Banco de germoplasma depositario de

muestras FZ001 Estudio de la diversidad

genética y su distribución de los maíces criollos y sus parientes silvestres en Michoacán

J. A. Carrera V. 320 En ejecución

Universidad de Guadalajara (U de G)

FZ002 Conocimiento de la diversidad y distribución actual del maíz nativo y sus parientes silvestres en México

A. Ortega C. 1125 En ejecución

Instituto Nacional de Investigaciones Forestales, Agrícolas y Pecuarias (INIFAP)- Campos Experimentales ubicados en los estados donde se lleven a cabo recolectas. Universidad Autónoma Agraria Antonio Narro (UAAAN)

FZ003 Diversidad y distribución altitudinal de maíces nativos en la región de los Loxicha, Sierra Madre del Sur Oaxaca

B. Rendón A. 900 a 1,300 En ejecución

Universidad Autónoma de Chapingo (UACh) INIFAP-Campo Experimental Valle de México (CEVAMEX)

FZ007 Monitoreo y recolección de la diversidad de razas de maíz criollo en la región de la Huasteca en México para complementar las colecciones de los Bancos de maíz de INIFAP y CIMMYT

S. Taba 200 En ejecución

Centro Internacional de Mejoramiento del Maíz y Trigo (CIMMYT) INIFAP-CEVAMEX

FZ014 Colecta de maíces nativos en regiones estratégicas de la península de Yucatán

J. Mijangos C. 200 En ejecución

UACh

FZ015 Conocimiento de la diversidad y distribución actual del maíz nativo en Nuevo León

F. Zavala G. 270 Inicio 2008 Universidad Autónoma de Nuevo León (UANL)

FZ016 Conocimiento de la diversidad y distribución actual del maíz nativo y sus parientes silvestres en México, segunda etapa 2008-2009

A. Ortega C. 4860 Inicio 2008 INIFAP- Campos Experimentales ubicados en los estados donde se lleven a cabo recolectas. UAAAN Duplicados INIFAP-CEVAMEX

FZ018 Conocimiento de la diversidad y distribución actual del maíz nativo y Tripsacum en el estado de Tamaulipas

R. Garza C. 200 En ejecución

Universidad Autónoma de Tamaulipas (UAT-IEA) INIFAP UAAAN

FZ019 Exploración del sur del estado de Sonora (Valles del Yaqui y Mayo)

J. Apolinar Aguilar

800-900

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Figura A1. Cobertura nacional de colecta de maíz nativo 2007-2009 dentro de la convocatoria: “Conocimiento de la diversidad y distribución actual del maíz nativo y sus parientes silvestres en México”.