Transfert d’un phénotype d’un organisme à un autre

Introduction

On veut introduire un plasmide contenant la séquence d’ADN codant pour la protéine GFP dans des bactéries pour qu’elles acquièrent les caractéristiques de fluorescence de la GFP.

GFP Gène de résistance à la Kanamycine

1 : ADN Génomique

2 : Plasmides

Extraction du plasmide de la

bactérie

Insertion des gènes codant pour la fluorescence (GFP) et

pour la résistance à la kanamycine

Extraction et modification du plasmide

On extrait le plasmide contenant une part de l’ADN de la bactérie. Il est utilisé comme outil génétique car il est facilement manipulable.

On insère dans le plasmides la séquence d’ADN codant pour la protéine GFP et celle codant pour la résistance à la Kanamycine. La kanamycine sera ajoutée au milieu de culture des bactéries afin de tuer toutes celle qui n’ont pas intégré le plasmide et ne sont donc pas résistantes à celle-ci

Obtention de bactéries compétentes

CaCl2

Bactéries

Le CaCl2 crée des pores dans la paroi des bactéries afin d’y laisser pénétrer les plasmides.

Ajout des plasmides

Bactéries contenant le plasmide modifié

On crée un choc thermique pour refermer les pores de la paroi

42°

Bain MarieOn rajoute ensuite du milieu LB puis on fait incuber les bactéries à 37° pendant 30 minutes afin de les laisser proliférer.

Etalement des bactéries

On étale les bactéries obtenues précédemment sur un milieu LB contenant de la kanamycine.

La kanamycine détruira toutes les bactéries n’ayant pas le plasmide résistant à l’antibiotique et donc pas la GFP.

Cela permet donc de ne sélectionner que les bactéries ayant intégré le plasmide contenant l’ADN qui code pour la GFP.

Milieu LB

Témoin

Contenant

Ampiciline

Contenant Kanamyci

ne

Bactéries

Contenant le plasmide codant pour la GFP et résistante à la kanamycine.

Sans plasmide et résistante à la kanamycine.

Contenant un plasmide non modifié

On laisse incuber les bactéries durant la nuit.L’ampiciline a détruit toutes les bactéries car elles ne possèdent pas de résistance à cet antibiotique.

Les bactéries qui se sont développées prouvent que le plasmide à bien été intégré par les bactéries car celles-ci ont résisté à l’antibiotique.Les bactéries se sont développées comme on l’attendait, elle sont bien résistantes à la kanamycine.L’ampiciline a détruit les bactéries car elles ne possédaient aucune résistance à un antibiotique.

Ces résultats ne concordent pas avec les résultats attendus, ils peuvent provenir d’une résistance naturelle à l’antibiotique ou d’un antibiotique défaillant, voire d’une erreur de manipulation.

Récupération des plasmides

Pour s’assurer de la présence des plasmides contenant l’ADN codant pour la GFP, on tente de les récupérer à l’intérieur des bactéries.

On lyse les bactéries de façon à récupérer les plasmides. Puis, après plusieurs réactions enzymatiques, on récupère la section du plasmide codant pour la GFP.

Action des enzymes…

… qui isolent la section d’ADN codant pour la GFP.

Afin de vérifier que la section d’ADN récupérée est bien celle codant pour la GFP, on coule ensuite un gel d’agarose dans lequel on compare la migration des plasmides avec celle d’un marqueur sous une lampe UV.

Bande correspondante à la section codant pour la GFP

Bande correspondante au plasmide

Marqueur

Réalisé par :

- HELICK Julien

-TANI Emilie

- GRARD Jérôme

- BOTZANOWSKI Thomas

- CERAULO Hugo