1

Transcriptional Regulation

דנה אטיאס.מנחה: פרופ' ניר פרידמן.

סמינריון בביולוגיה חישובית 2006.

2

מוטיבציה

לבקרת שעתוק תפקיד מרכזי בתהליכים ביולוגייםרבים.

שימוש בטכנולוגיתmicroarray.:המידע הרב מוביל לצורך בשיטות חישוביות לשם

.ניתוח המידע.זיהוי מוטיבים.הגדרת מודלים של בקרה

3

? על מה נדבר

Genome-Wide Location Analysisתיאור השיטה. :הפעלת השיטה על שני אקטיבטוריםGal4, Ste12.

A plethora of sites.מספרם הרב של אתרי הקישור.תפוצה רחבה.מידת התאמה לרצפי קונצנזוס

4

על מה נדבר ?

Control of Pancreas and Liver Gene Expression by HNF Transcription Factors

פרופיל הקישור של הפקטורים מסוגHNF בכבד ובלבלב.

כשלים ברגולצייתHNF4α מעלים את רמת הסיכון לסוכרת.

5

? על מה נדבר

Transcriptional Regulatory Code of a Eukaryotic Genome

.זיהוי מוטיבים.מיפוי הקוד הבקרתי של השמר.ארכיטקטורת פרומוטר.בקרה תלוית סביבה

6

Genome-Wide Location and Function of DNA Binding Proteins

Ren B et al. (2000) Genome-wide location and function of DNA binding proteins. Science. 290(5500):2306-2309.

7

Location Analysis

Crosslink protein to DNAin vivo with formaldehyde

Break open cells andshear DNA by sonication

Immunoprecipitate

Reverse-crosslinks,blunt DNA and ligateto unidirectional linkers LM-PCR

Hybridize to array

unenriched IP-enriched

8

מה קיבלנו?

9

איכות הקישור

10

ממוצע של שלושה ניסויים נפרדים

11

השיטה מאפשרת:

.איפיון רשתות רגולציה.גילוי תפקידי גנים.אישוש תפקידי גנים ידועים

12

Gal4

מאקטב גניםהנחוצים למטבוליזם

של גלקטוז. אחד

מהאקטיבטורים המוכרים והנחקרים

ביותר.

13

Gal4

גנים אליהם נקשר 10נמצאו Gal4 ושרמתהביטוי שלהם הוכפלה בנוכחות גלקטוז.

7גנים שהקישור אליהם ידוע :GAL1, GAL2, GAL3, GAL7, GAL10, GAL80,

GCY13גנים חדשים :

MTH1, PCL10, FUR4

14

Gal4ביטוי הגנים תלוי ב-

15

Gal4רצף קונצנזוס של

דומה לרצף שהוכר עד כה עבורGal4. נמצא באתרים רבים בגנום השמר, אליהםGal4 לא

.in vivoנקשר .ידיעת הרצף בלבד אינה מספיקה.מבנה הכרומטין משפיע על ספציפיות הקישור

16

רשתות רגולציה

17

Yeast Mating

:ישנם שני סוגי זוויגים בשמרa -ו α. תא שמר יכול לחיות אחת משתי צורות: כתא

הפלואידי או דיפלואידי. שני תאים הפלואידים יכולים להזדווג

)conjugate.וליצור תא דיפלואידי ( שמר מסוגa יכול להזדווג רק עם שמר מסוג α.

18

Yeast Mating

.שני תאים הפלואידים

התאים גדלים לכיווןמקור הפרומונים של

הזוויג השני.

התאים מתאחדיםליצירת תא דיפלואידי.

19

Ste12

-פועל בתגובת תאי שמר הפלואידים לmating pheromone.

:אקטיבצית שרשרת התגובה לפרומון גורמת ל עצירת מחזור התא בשלבG1.-גנים.200אקטיבציה של כ

גנים המאוקטבים ע"י 29מתוכם נמצאו α-factor אליהם נקשר Ste12.

20

Ste12

11 מוכרים כגנים המשתתפים בשלבי ההזדווגות השונים.

תפקידם של רבים מהגנים הנותרים, ככלהנראה קשור להזדווגות.

21

22

Ste12

-גנים הקשורים לSte12 לפני ואחרי החשיפה לפרומון:

.מאוקטבים מיד לאחר החשיפה לפרומון הפיכתSte12. לא פעיל לאקטיבטור הסרה של מעכביSte12.

-גנים הקשורים לSte12:לאחר החשיפה לפרומון .אקטיבציה איטית.מעורבים אקטיבטורים נוספים

23

חסרונות השיטה

.חסרה יכולת הבחנה בין השפעה ישירה לעקיפה.אזור הקישור שמתקבל אינו ספציפי

,יש לשלב את השיטה עם מידע נוסף (למשלגנומיקה השוואתית).

בעזרת שיטות חישוביות נוכל למצוא רצפים מדויקיםיותר.

...כל זה יבוא בהמשך

24

מה עוד ניתן לבדוק ?

.קשרי חלבון-חלבון-קשרי חלבוןRNA.

25

A Plethora of Sites

Euskirchen G, Snyder M, A plethora of sites,. (2004) Nat Genet. 36(4):325-326.

26

בקרת שעתוק

המטרה: לזהות אתרי קישור של פקטורישעתוק בתאי האדם ברמת הכרומוזום.

הבעיה היא שאתרי הקישור הם קצרים מאוד)6-9 bp(.

איך אפשר לאפיין רצפים קצרים כ"כ מתוך ביליוני בסיסים ?3גנום האדם שאורכו כ-

27

ChIP-chip

28

ChIP-chip

.הטכנולוגיה נוסתה ראשית בשמר יישום השיטה למציאת אתרי קישור של פקטורי

שעתוק בגנום האדם. מיפויNF-κB-ו CREB 22 בכרומוזום. מיפויSp1, c-Myc-ו p53 22 ו-21 בכרומוזומים.

29

תוצאות

עבורNF-κB, CREB, c-Myc-ו Sp1 התגלו כמויות עצומות של אתרי קישור:

-21 על כרומוזום 12,000כ.-22 על כרומוזום 25,000כ.

נמצא קישור ליד גנים שתפקידם מתועד היטבוגם ליד גנים שתפקידם אינו ידוע.

30

תוצאות

מס' גנים שמבקריםNF-κB-ו CREB מקודדים בעצמם לפקטורי שעתוק.

,מעיד על קיום שרשראות רגולציהRegulatory cascade.

31

תפוצה רחבה

:אתרי קישור באדם .הרחק מאזור התחלת השעתוק.בתוך גנים

9-27% 1 מאתרי הקישור נמצאים באזור kb מתחילת הגן.

עבורNF-κB-ו CREB-נמצאים באזור 25%, כ 1-10 kb.מהגן

32

תפוצה רחבה

40%.מהאתרים נמצאים בתוך אינטרונים ' של הגן.3אתרים רבים נמצאים באזור

רגולציה של שעתוקanti-sense.' 3 ו-'5קיימים פקטורים שנקשרים בצד.

33

אין התאמה מלאה

בהשוואה בין רצפי קונצנזוס של פקטורים לביןאתרי הקישור בפועל נמצא:

-מאתרי הקישור מתאימים בדיוק 2-35%רק כ לרצף הקונצנזוס.

קישורים רבים נעשים דרך אתרים דומים אךשונים.

.קישור דרך גורמים מתווכים

34

אין התאמה מלאה

בבחינתNF-κB-ו CREB נמצא שהם מאקטבים גנים חסרי אתר קישור מתאים.

.מצביע על בקרה לא ישירה -נמצא שNF-κB.מתפקד גם כרפרסור פקטורים רבים יכולים לשמש כאקטיבטורים

וגם כרפרסורים.

35

מסקנות

.בכל אחד מהמחקרים נמצאו אתרי קישור רבים מהי תרומתו של כל אתר למערך הרגולציה

הכולל ?.ייתכן כי קיים עודף של אתרי קישור ייתכן שאתרים מסוימים מבקרים גנים לא

פונקציונליים.

קיים "רעש" רגולטורי.»

36

סיכום

המחקרים מראים לראשונה כי ניתן למפות.in vivoאתרי רגולציה על כרומוזומים שלמים

? ומה הלאה פקטורי שעתוק באדם.1500~ניתוח סוגי תאים ביונקים.250~מיפוי בקרתי של

37

Control of Pancreas and Liver Gene Expression by HNF Transcription FactorsOdom T et al. (2004) Control of Pancreas and Liver Gene Expression by HNF Transcription Factors. Science. 303:1378-1381.

38

Islets of Langerhansאיי לנגרהנס –

תאים אנדוקרינים בלבלב המפרישיםהורמונים.

תאיα .גלוקגון – תאיβ .אינסולין – סומטוסטטין.תאי דלתא – תאיPP –Pancreatic polypeptide .

39

Hepatocytes

-ממסת הכבד.60-80%תאים המהווים כ :אחראים על

.סינתזת חלבונים.מטבוליזם של סוכרים.מטבוליזם של ליפידיםDetoxification אינאקטיבציה ומטבוליזם של –

סמים וסטרואידים.

40

פקטורי השעתוק הנחקרים

HNF1α, HNF6, HNF4α: פועלים בצורה קואופרטיבית.בכבד – מנגנון הרגולציה אינו מוכר.בלבלב –

שלושתם נחוצים לשם פעילות תקינה בכבדובלבלב.

-מוטציות בHNF1α-וב HNF4α גורמות לסוכרת.

41

Genome-Wide Location Analysis

Microarray גנים.13,000 שמכיל :עבור כל גן נכללים האזורים

700 bp upstream.200 bp downstream.

42

תוצאות

43

תוצאות

HNF4α:מבקר ~12% -מהגנים במערך ה Hepatocytes.~11% -מהגנים במערך ה Pancreatic Islets .

44

בדיקת אמינות התוצאות

נעשו מס' ניסויים בלתי-תלויים ע"מ לוודא אתנכונות התוצאות.

:בעיות אפשריות שנבדקו.ספציפיות נמוכה של נוגדנים-בעיות באנליזה של הmicroarray.

45

בדיקת אמינות התוצאות

-נוגדנים שונים.2שימוש ב .בדיקת ספציפיות הנוגדנים.ווידוא הקישור בשיטות נוספות.שימוש בנוגדנים עבור פקטורים אחרים

מסקנה :HNF4α פעיל מאוד ברקמות הנבדקות.

46

RNA Polymerase IIבדיקת קישור ל-

-מתוך הגנים הקשורים לRNA Polymerase II:42%-קשורים ל HNF4α -ב Hepatocytes.43%-קשורים ל HNF4α -ב Pancreatic Islets.

47

RNA Polymerase IIבדיקת קישור ל-

ביטוי יתר שלHNF4α עלול לפגוע בהפרשת .βאינסולין תקינה בתאי

48

רשתות רגולציה

.העלאת הסיכון לחלות בסוכרת

49

Transcriptional Regulatory Code of a Eukaryotic Genome

Harbison CT et al. (2004) Transcriptional regulatory code of a eukaryotic genome. Nature. 431:99-104.

50

שימוש בשיטות מוכרות

:גנומיקה השוואתית.נמצאו אתרים ציס-רגולטורים שמורים בגנום השמר

Genome-Wide Location Analysis: פקטורי שעתוק במדיה 203נחקר אופי הקישור של

עשירה.84.מהם נחקרו תחת תנאים נוספים .נבדקו האזורים שבין הגנים בשמר

.ידע קודם

51

שילוב של השיטות

52

שילוב של השיטות

.יצירת מפה של הקוד הרגולטורי של השמר מציאת רצפים שמורים אבולוציונית הנקשרים

בתנאים מסוימים..הבנת סידור הרצפים בפרומוטר.השפעת תנאי הסביבה על הרגולציה

53

גילוי מוטיבים

על הרצפים הופעלה תוכנות 6סדרה של

למציאת מוטיבים. נבחרו מוטיבים שעברו

מבחנים סטטיסטיים אל מול רצפים רנדומליים.

54

גילוי מוטיבים

נעשה סינון על פי שמירותהרצפים המתקבלים

מהמוטיב. נבחר מוטיב יחיד לכל

פקטור על בסיס:מידע ממסדי הנתונים

.Transfac, YPD, SCPD.מובהקות סטטיסטית

55

דוגמאות למוטיבים שהתקבלו

56

Transcriptional Regulatory Code

.נעשה מיפוי של אתרי הבקרה על גנום השמר המידע מכיל קישורים שנעשו תחת תנאי מחיה

שונים..קיבלנו מפת פוטנציאל בקרתי

57

Transcriptional Regulatory Code

58

Transcriptional Regulatory Code

:המידע שהתקבל מתאים לצפי עבור פקטורים בעלי תפקיד ידוע, הגנים אליהם הם

נקשרו נמצאו כבעלי תפקיד תואם. עבור פקטורים בעלי תפקיד ידוע שנקשרו לגנים

בעלי תפקיד לא ידוע, נקבע כי תפקיד הגן קשור לתפקיד הפקטור.

59

שילוב מקורות מידע

כל הרצפיםשמתאימים לאחד

מהמוטיבים שהתקבלו.

60

שילוב מקורות מידע

תת הקבוצהשהראתה שמירות בין מס' מיני שמר.

61

שילוב מקורות מידע

אתרים שמוריםשנמצא שהם

קשורים לפקטור in vivo.

62

שילוב מקורות מידע

'יש לשים לב למסההתאמות הגבוה.

מציאת המוטיביםהתחשבה ב:

שמירותאבולוציונית.

קישור לפקטוריםin vivo.

63

התפלגות אתרי הקישור

אתרי הקישור אינםמפולגים בצורה אחידה.

אתרים מעטים במרחק מהרצף bp 100קטן מ-

המקודד.איזור זה מכיל בדרך

כלל את אתר תחילתהשעתוק הקשור לקומפלקס האיניציאציה.

64

התפלגות אתרי הקישור

74% מהאתרים באזור ה-100-500 bp

מהרצף המקודד. עבור התפלגות

אקראית היו מתקבלים מהאתרים.53%באזור זה

74%

65

התפלגות אתרי הקישור

-מעבר לאזור ה500 bp מתקבלים

פחות אתרי קישורמאשר היו מתקבלים

באופן אקראי.

74%

66

התפלגות אתרי הקישור

:מסקנה פקטורי שעתוק בשמר

פועלים בקרבה לאתר Transcription Startה-

Site. כך נמנעת אקטיבציה

שגויה של גנים סמוכים.

74%

67

ארכיטקטורת פרומוטר

בתוך כל פרומוטר קיים סידור מסוים של אתריהקישור.

.מניחים כי הסידור מעיד על מודל רגולציה סוגי ארכיטקטורה.4נמצאו

68

Single Regulator

.הפרומוטר מכיל אתרי קישור לפקטור יחיד.זוהי הארכיטקטורה הפשוטה ביותר

69

Single Regulator

:גנים המעורבים בתהליכים ביולוגיים נפוצים.מטבוליזם של חומצות אמינו.מטבוליזם של נוקלאוטידים.ייצור ריבוזומים.נשימה

70

Repetitive Motifs

.הפרומוטר מכיל חזרות של רצף קישור מסוים

71

החזרות נחוצות לקישור היציב של הפקטורDal80. החזרות יכולות להוות בסיס לתגובה הדרגתית

).HIS4לבקרה (למשל עבור הגן פקטורים מסוימים מראים העדפה לקישור

לרצפים חוזרים.

Repetitive Motifs

72

Multiple Regulators

'הפרומוטר מכיל אתרי קישור של מספקטורים. 'גנים רבים מקודדים לתוצרים הדרושים למס

תהליכים מטבוליים. הגנים מבוקרים באופן שונה כתלות בסביבת

המחייה.

73

Co-occurring Regulators

זוגות של פקטורים מופיעים באותו פרומוטרבתדירות שאינה מקרית.

:הופעת צמדי פקטורים יכולה להעיד על הפקטורים.2קשר פיזי בין .תפקיד רגולטורי דומה עבור מס' גנים

74

בקרה תלוית סביבה

נעשו מס' ניסוייLocation Analysis תחת תנאי מחייה שונים:

Rich media.Amino acid starvation.Filamentation inducing – בנוכחות בוטנול.Mating Inducing – בנוכחות פקטור אלפא.Galactose medium.Elevated temperature.

75

בקרה תלוית סביבה

פקטורים שנבדקו בסביבה ספציפית:חיוניים למחייה בסביבה זו.קיים מידע המקשר אותם לרגולציה בסביבה זו.

נמצא שפקטורים שונים נקשרים לקבוצה שונה.של אתרי קישור תחת תנאים שונים

דפוסי בקרה תלוית סביבה4נמצאו .

76

Condition Invariant

פקטורים נקשרים לאותה קבוצת רצפים תחת.תנאי סביבה שונים

77

Leu3

מבקר גנים המעורבים.בביוסינתזת חומצות אמינו

קישורLeu3 in vivo הכרחי אך אינו מספיק עבור אקטיבציית

.הגנים נדרש קישור חלבון נוסף שהופך

מרפרסור Leu3את .לאקטיבטור

78

Leu3

עוד פקטורים מטיפוסZinc cluster שייכים לקבוצה

.ומראים התנהגות דומה ככל הנראה, אקטיבציה או

רפרסייה של פקטורים בקבוצה זו תלויה בגורמים נוספים

.DNAמלבד הקישור ל-

79

Condition Enabled

בתנאי סביבה מסוימים אין קישור כללובתנאים אחרים קיים קישור למס' רב של

אתרים.

80

Msn2

במצב נורמאליMsn2 נמצא בציטופלסמה.

במצב שלstress, Msn2 עובר טרנסלוקציה לגרעין ומתחיל

להצטבר שם. מניחים שפקטורים רבים בקבוצה מבוקרים ע"י

nuclear exclusion.או מכאניזם דומה

81

Condition Expanded

הפקטורים נקשרים לקבוצה מסוימת שלאתרים תחת תנאי מחיה מסוימים.

תחת תנאים אחרים, קבוצת אתרי הקישורמתרחבת.

82

Gcn4

מאקטב גנים המעורביםבביוסינתזת חומצות אמינו.

רמותGcn4 בתא גדלות כשתא שמר נמצא 6פי

במדיה ענייה בנוטריינטים. במצב זהGcn4 נקשר

לקבוצה נרחבת של אתרי קישור.

83

Gcn4

האתרים הנקשריםבנוכחות רמות נמוכות של

Gcn4 מתאימים יותר לרצף הקונצנזוס שלו מהאתרים הנקשרים

בנוכחות רמות גבוהות.

84

Condition Altered

הפקטורים מעדיפים סט שונה של אתרי קישורתחת תנאי מחייה שונים.

85

Ste12

הספציפיות שלSte12 ותפקידו משתנים בהתאם לאינטראקציות עם פקטורים אחרים.

-בתנאי רעב, מאקטב גנים המעורבים בfilamentous growth.

,בתנאים אלוSte12 נקשר בצורה אל Tec1קואופרטיבית יחד עם הפקטור

. DNAה-

86

Condition Altered

:הספציפיות של פקטורים משתנה בעקבות.אינטראקציות עם פקטורים נוספים.שינוי (למשל כימי) בסביבת המחייה

87

סיכום

חושבים כי חלקים גדולים מהגנום האאוקריוטימעורבים בבקרה.

ע"י מיפוי הרצפים הנקשרים תחת תנאיםשונים, ניתן לתאר את הפוטנציאל הבקרתי

הטמון בגנום. מכך תתקבל תשתית להבנת מודלים

בקרתיים.

88

אתגרים לעתיד

:מס' אפשרויות לפיתוח הגישה שננקטה כאן.איסוף מידע ניסויי נוסף

פקטורי שעתוק תחת מס' מוגבל 203בניסוי נבדקו של תנאי סביבה.

.כדאי לבדוק פקטורים אלו תחת תנאים נוספים) האם הרגולציה תלויה בסוג התאa או α ,

הפלואידי או דיפלואידי) ?.פיתוח שיטות נוספות לאיסוף מידע

89

אתגרים לעתיד

.בחינת מודלים בחינת מודלים של פעולה בקרתית שעלו מתוך

המידע שנאסף תחת תנאי סביבה שונים. איך מוטציות בפקטורי שעתוק או ברצפי הקישור

משפיעים על הבקרה ?.אלגוריתמים חישוביים מתקדמים

פיתוח אלגוריתמים לאינטגרציה של נתוניםשנאספו ממקורות שונים.

90