กลมตรวจสอบคณภาพยาสตว และวตถอนตรายดานการปศสตว หนา 1 จาก 19

โครงการการพสจนเอกลกษณสมนไพร ทมใชในการเลยงสตวดวยเทคนค TLC/HPTLC การพฒนาวธวเคราะหหาปรมาณสารส าคญ andrographolide ในฟาทะลายโจรดวยเทคนค TLC และ HPTLC และ การพฒนาวธการตรวจสอบเอกลกษณทางเคมทเปนลกษณะเฉพาะตวในสมนไพร

ฟาทะลายโจรดวยเทคนค TLC รวมกบ ion trap mass spectrometer

สนนท กตตจารวฒนา ชศกด อาจสงเนน ศศกานต วฒกานตนนท

บทคดยอ

ท าการพฒนาวธวเคราะหหาปรมาณสารส าคญ andrographolide ในฟาทะลายโจร จากใบและล าตนอบแหง และชนดบรรจในแคปซล โดยดดแปลงวธจาก Thai Herbal Pharmacopoeia (2016) โดยเปลยนชนด TLC plate ชนด silica gel GF254 เปน HPTLC plate ชนด silica gel 60 F254 เปลยน mobile phase จาก chloroform เปน dichloromethane และไมใชการ derivatization เนองจากเครองถายภาพ (TLC visualizer) สามารถวดคา Rf ของสารส าคญ andrographolide บนแผน TLC/ HPTLC ได ผลการพฒนาพบวา ต าแหนง band ของ andrographolide ในตวอยาง มคา Rf เทากบ band ของสารมาตรฐาน andrographolide (Rf = 0.45 ± 0.01)

ท าการพฒนาวธการตรวจสอบเอกลกษณทางเคมทเปนลกษณะเฉพาะตว ( fingerprints) ในสมนไพรฟาทะลายโจรชนดบรรจในแคปซล ดวยเทคนค TLC รวมกบ ion trap mass spectrometer โดยวธทพฒนาขนเอง ผลการพฒนา พบวา การสกดผงยาจากภายในแคปซลแลวน าไปวเคราะหดวย TLC ตามวธใน Thai Herbal Pharmacopoeia (2016) แลวท าการขด silica บน TLC plate บรเวณ band ทคาดวาเปนสารส าคญ ไปละลายดวย 80% warm ethanol ปรมาตร 1 มลลลตร vortex และ sonicate นาน 5 นาท น าไปฉดเขาเครอง mass spectrometer ชนด ion trap พบวา band ต าแหนงท 4 จากการด TLC plate ท 254 นาโนเมตร สามารถตรวจพบ mass spectrum ท 409.0 (acetic acid adduction) > 349.0, 331.0, 286.9 m/z ซงเปนลกษณะเฉพาะของ andrographolide

ค าส าคญ : ฟาทะลายโจร, andrographolide, วเคราะหหาปรมาณสารส าคญ, TLC / HPTLC กลมตรวจสอบคณภาพยาสตวและวตถอนตรายดานการปศสตว ส านกตรวจสอบคณภาพสนคาปศสตว กรมปศสตว

กลมตรวจสอบคณภาพยาสตว และวตถอนตรายดานการปศสตว หนา 2 จาก 19

Method Development for Andrographolide Assay in Andrographis paniculata by TLC and HPTLC and

Method Development for Andrographolide Identification in Andrographis paniculata by TLC and Ion trap Mass Spectrometer

Sunan Kittijaruwattana, Chusak Ardsoongnearn and Sasikan Wutthikannon

Abstract

Method development of andrographolide assay in Andrographis paniculata by TLC

and HPTLC from dried leaves and stems and in capsules by adapting the method from Thai Herbal Pharmacopoeia (2016). By changing the TLC plate silica gel GF254 to HPTLC plate silica gel 60 F254, changing the mobile phase from chloroform to dichloromethane. The derivatization step was not required because the TLC visualizer can measure the Rf values of andrographolide in TLC/ HPTLC plate. The results show that the Rf value of andrographolide in the sample bands were equal to the Rf value of standard andrographolide bands (Rf = 0.45 ± 0.01).

Method for identifying chemical characteristics of andrographolide (fingerprints) in Andrographis paniculata in capsules by TLC and ion trap mass spectrometer by in-house method was developed. The method started from the extraction of Andrographis paniculata herb powder, analyzed using TLC according to the Thai Herbal Pharmacopoeia (2016) method. The silica on the TLC plate at the bands which expected to be andrographolide was scraped. Dissolved with 1 mL of warm 80% ethanol, vortex and sonicate for 5 minutes, then direct infused into ion trap mass spectrometer. The presence of mass spectrum at 409.0 (acetic acid adduction) > 349.0, 331.0 and 286.9 m/z which is the characteristic of andrographolide were measured from the 4th bands from the TLC plate which measured at 254 nm. Keywords: Andrographis paniculata, andrographolide, assay, identification, TLC,

HPTLC, ion trap mass spectrometer

Veterinary Drugs and Hazardous Substances Assay Division, Bureau of Quality Control of Livestock Products, Department of Livestock Development

กลมตรวจสอบคณภาพยาสตว และวตถอนตรายดานการปศสตว หนา 3 จาก 19

บทน า ฟาทะลายโจร (Andrographis paniculata (Burm.f.) Nees) เปนสมนไพรทไดรบการบรรจ

อยในบญชยาหลกแหงชาต ในสวนของบญชยาจากสมนไพร ปรบปรงลาสด เรองบญชยาหลกแหงชาต (ฉบบท 2) พ ..ศ 2555 (กลมยาบรรเทาอาการทองเสย และยารกษากลมยาระบบทางเดนหายใจ ยาแคปซล ยาเมด ยาลกกลอน) ซงมสรรพคณทางยาหลากหลายโดยมฤทธในการบรรเทาอาการทองเสยชนดทไมเกดจากการตดเชอ บรรเทาอาการเจบคอ บรรเทาอาการของโรคหวด (common cold) เชน เจบคอ ปวดเมอยกลามเนอ โดยมสารส าคญในการออกฤทธ คอ สารกลม Lactone คอ สารแอนโดรกราโฟไลด (andrographolide) นโอแอนโดรกราโฟไลด (neo-andrographolide) ดออกซแอนโดรกราโฟไลด (14-deoxy-andrographolide) สารกลมฟลาโวน เชน aroxylin, wagonin, andrographidine A

ลกษณะทางกายภาพและเคมของวตถดบฟาทะลายโจรทด คอ ปรมาณความชนไมเกน 11% w/w ปรมาณสงแปลกปลอมไมเกน 2% w/w ปรมาณเถาทไมละลายในกรด ไมเกน 2.0% w/w ปรมาณสารสกดดวยเอทานอล (85%) ไมนอยกวา 13% w/w สารสกดดวยน า ไมนอยกวา 18% w/w ปรมาณแลคโตนรวมค านวณเปนแอนโดรกราฟโฟไลดไมนอยกวารอยละ 6.0 และไมควรเกบวตถดบไวนาน ๆ เพราะปรมาณสารส าคญจะลดประมาณ 25 % เมอเกบไว 1 ป

ในมนษย มมาตรการสงเสรมการใชยาสมนไพรมาทดแทนยาแผนปจจบน โดยแนะน าใหใชยาขมนชน และยาฟาทะลายโจร เปนล าดบแรก (First line drug) ทแนะน า

จากการศกษาโดยใชสารสกดฟาทะลายโจรชนดตาง ๆ ในสตวทดลองพบวา 1. มฤทธลดการเกรงตวของกลามเนอล าไสและทอน าอสจ 2. การศกษาในหลอดทดลองแสดงใหเหนวาฟาทะลายโจรมฤทธตานเชอแบคทเรยทกอใหเกด

โรคทองเสย อยางไรกตามในบางการศกษาใหผลขดแยงกน 3. การศกษาในสตวทดลองยงพบวาสารสกดมฤทธลดไขอกดวย 4. มการน าสมนไพรฟาทะลายโจร ซงมสรรพคณแกเจบคอ ลดไข แกทองเสย ไปผสมรวมกบ

สมนไพรอนๆ เชน ไพล ผสมอาหารใหไกกน เพอปองกนและรกษาโรคระบบทางเดนหายใจและทางเดนอาหาร

ประกอบกบสมนไพรมราคาถก และหาไดงายในทองตลาด จงเปนทางเลอกหนงในการลดการใชยาแผนปจจบน

มวธวเคราะหหาปรมาณสารส าคญ andrographolide ในสมนไพรฟาทะลายโจรในรปแบบ total lactone content ดวยวธการไทเทรต และ andrographolide content ดวยเทคนค high performance liquid chromatography (HPLC) ตามทระบใน Thai Herbal Pharmacopoeia (2016) ซงเปนวธการทยงยาก ซบซอน กลมตรวจสอบคณภาพยาสตวและวตถอนตรายดานการปศสตวจงไดพฒนาวธการตรวจหาปรมาณสารส าคญ andrographolide ในสมนไพรฟาทะลายโจรดวยวธ thin layer chromatography (TLC)/ high performance thin layer chromatography (HPTLC) ซงดดแปลงมา

กลมตรวจสอบคณภาพยาสตว และวตถอนตรายดานการปศสตว หนา 4 จาก 19

จากว ธ ก า รตรวจ เอกล กษณ ของส ารส า ค ญ andrographolide ต ามท ร ะบ ใ น Thai Herbal Pharmacopoeia (2016)

นอกจากน ยงไดท าการพฒนาวธการตรวจสอบเอกลกษณของ andrographolide ในสมนไพรฟาทะลายโจร ดวยเทคนค TLC รวมกบ ion trap mass spectrometer 1. วตถประสงค

1.1 เพอพฒนาวธวเคราะหหาปรมาณสารส าคญ andrographolide ในสมนไพรฟาทะลายโจรดวยเทคนค TLC และ/ หรอ เทคนค HPTLC

1.2 เพอตรวจสอบเอกลกษณทางเคมทเปนลกษณะเฉพาะตว (fingerprints) ในสมนไพรฟาทะลายโจร ดวยเทคนค TLC รวมกบ ion trap mass spectrometer

2. ขอบขาย การพฒนาวธวเคราะหหาสารส าคญในสมนไพรฟาทะลายโจร จากใบและล าตนอบแหง และชนด

บรรจในแคปซล ดวยเทคนค TLC และ/ หรอ เทคนค HPTLC ใหมความเหมาะสม และพรอมส าหรบน าไปทดสอบความใชไดของวธ

การตรวจสอบเอกลกษณของสมนไพรฟาทะลายโจรชนดแคปซล ดวยเทคนค TLC รวมกบ ion trap mass spectrometer

3. ประโยชนทคาดวาจะไดรบ สามารถตรวจวเคราะหหาสารส าคญ andrographolide และพสจนเอกลกษณสมนไพรฟาทะลาย

โจรไดดวยเครองมอวเคราะหทมใชในหองปฏบตการ

4. เครองมอและวสดวทยาศาสตร 4.1 เครองมอและอปกรณ

4.1.1 เครองชงน าหนกไฟฟาทศนยม 5 ต าแหนงยหอ Mettler Toledo 4.1.2 เครองท าน าบรสทธพรอมอปกรณยหอ Thermo scientific 4.1.3 ชดวเคราะหชนดและปรมาณสารโดยหลกการ HPTLC พรอมอปกรณยหอ CAMAG 4.1.4 เครองถายภาพพรอมเกบขอมลบนแผน TLC/ HPTLC ยหอ CAMAG 4.1.5 ชดเตรยมความเขมขนสารละลายพรอมอปกรณยหอ Caliper Life sciences 4.1.6 Mass spectrometerรน HTC ยหอ BRUKER 4.1.7 TLC developing chamber 4.1.8 Vortex mixer 4.1.9 เครอง Hot plate magnetic stirrer 4.1.10 TLC SCRAPER KIT 4.1.11 เครอง LC -MS ชนด ion trap

กลมตรวจสอบคณภาพยาสตว และวตถอนตรายดานการปศสตว หนา 5 จาก 19

4.2 วสดวทยาศาสตร 4.2.1 Methanol (CH3OH), AR grade 4.2.2 Chloroform Reagent grade 4.2.3 Activated charcoal 4.2.4 Ethanol Absolute 4.2.5 Dichloromethane AR grade 4.2.6 Andrographolide 4.2.7 Beaker แกวขนาด 50และ100 mL 4.2.8 Stainless beaker ขนาด1000 mL 4.2.9 Volumetric flask ขนาด 10 และ 100 mL class A 4.2.10 Volumetric pipette ขนาด 20 mL class A 4.2.11 Amber glass vial ขนาด 16 mL 4.2.12 Vial HPTLC สใส พรอมฝา ขนาด 2 mL 4.2.13 Disposable syringe ขนาด 3 mL 4.2.14 Syringe membrane filter nylon 0.45µm. 13 mm 4.2.15 Cylinder ขนาด 25, 50 และ 100 mL 4.2.16 Centrifuge tube ขนาด 50 mL 4.2.17 Culture tube ขนาด 20 x 150 mm 4.2.18 กรวยกรอง 4.2.19 กระดาษชงสาร 4.2.20 กระดาษกรอง เบอร 4 4.2.21 TLC plate silica gel 60 F254 4.2.22 HPTLC plate silica gel 60 F254 4.2.23 โกรงบดยา

5. งานวจยทเกยวของ Thai Herbal Pharmacopoeia (2016) เ ป นต า ร าย าท ม ก า ร ร ะบ ว ธ ก า ร ตรวจ เ อก ล ก ษณ

(Identification) สารส าคญ andrographolide ในสมนไพรฟาทะลาย หรอฟาทะลายโจร (FA-THA-LAI CHON) โ ด ย ใ ช ว ธ thin layer chromatography (TLC) และกา รห าป ร ม า ณ ข อ งส า ร ส า ค ญ andrographolide (andrographolide content) ในยาแคปซลฟาทะลาย (FA-THA-LAI CAPSULES) ดวยวธ high-pressure liquid chromatography และหาปรมาณ total lactone content โดยวธการไทเทรต นอกจากน ยงมระบในต าราของสหราชอาณาจกร (British Pharmacopoeia, 2018) ถงวธการตรวจเอกลกษณของสารกลม andrographis herb ดวยเทคนค thin layer chromatography (TLC) และการหาปรมาณ (content) สารส าคญดวยเทคนค liquid chromatography

กลมตรวจสอบคณภาพยาสตว และวตถอนตรายดานการปศสตว หนา 6 จาก 19

Wang และคณะ (2014) ไดศกษาการหาองคประกอบสารส าคญจ านวน 6 ชนดในสารสกดฟาทะลายโจร และตรวจ metabolite ในสารส าคญ andrographolide ในพลาสมาหน โดยวธ LCMS-MS

ศวะรกษ และคณะ (2548) ไดศกษาผลการอบแหงสารสกดทไดจากการสกดสารส าคญจากฟาทะลายโจร และน าผลตภณฑทไดไปวเคราะหปรมาณ andrographolide ดวยเทคนค HPLC

Reich และ Schibli (2008) ไดท าการทดสอบความใชไดของวธการตรวจสอบเอกลกษณของสมนไพร โดยก าหนดเกณฑการยอมรบของคา precision วา Rf ตองตางกนไมเกน

- 0.01 ทสารชนดเดยวกนในเพลทเดยวกน - 0.02 ในการท าซ าตางเพลท - 0.05 ในการท า intermediate precision (ตางวน) - 0.07 ในการท า reproducibility (ตางหองปฏบตการ)

6. วธด าเนนการ

6.1 การวเคราะหหาสารส าคญ andrographolide ดวยเทคนค TLC โดยใชสภาวะตาม Thai Herbal Pharmacopoeia (2016)

6.1.1 การเตรยมสารละลายมาตรฐาน andrographolide ชงสารมาตรฐาน andrographolide ปรมาณ 20 มลลกรมลงใน volumetric flask

ขนาด 10 mL ละลายและปรบปรมาตรดวย ethanol ผสมใหเขากน จะไดความเขมขน2.0 มลลกรม/มลลลตรตามวธมาตรฐาน Thai Herbal pharmacopoeia (2016)

6.1.2 การเตรยมตวอยางชนดของตวอยาง ม 2 ชนด ไดแก Sample A คอ ตวอยางสมนไพรฟาทะลายโจรชนดแคปซล น าผงยาภายในแคปซล

( 1 แคปซล ม ทะลายโจร 400 มลลกรม) จ านวน 4 แคปซลผสมรวมกนแลวน าไปชงปรมาณ1 กรม Sample B ตวอยางสมนไพรฟาทะลายโจรสวนใบและล าตนอบแหงบดละเอยดชง

ปรมาณ 1 กรม ขนตอนการเตรยมตวอยางสมนไพรฟาทะลายโจรสวนใบและล าตนอบแหงบดละเอยด (ศวะรกษ และคณะ, 2548)

- น าตวอยางฟาทะลายโจรมาลางท าความสะอาด ผงแหงทอณหภมหอง 24 ชวโมง - ชงตวอยาง 5 กรม ใสในหอกระดาษ ขนาด 5 x 5 cm. - น าไปอบแหงท อณหภม 40 - 50 C ประมาณ 18 ชวโมง - น ามาลดขนาดดวยการบด - เกบในถงพลาสตกแหงในหองปรบอากาศ น ามาใชในระยะเวลาไมเกนกวา 1 สปดาห

น าตวอยาง (Sample A และ Sample B) แยกใสลงใน centrifuge tube แกวขนาด 50 มลลลตรละลายดวย ethanol ปรมาตร 20 มลลลตร น าไปตม 5 นาท เตม activated charcoal ปรมาณ 300 มลลกรมน าไปผสมใหเขากนโดยใชเครอง vortex mixer และกรองดวยกระดาษกรองเบอร

กลมตรวจสอบคณภาพยาสตว และวตถอนตรายดานการปศสตว หนา 7 จาก 19

4 น าสวนใสทกรองไดไประเหยแหงดวยเครอง TurboVap จนแหง ละลายดวย 80 % ethanol ทอนปรมาตร 1 มลลลตร น าไปทดสอบหาปรมาณ andrographolide ดวยเทคนค TLC ตามขอ 6.4

6.1.3 สภาวะในการวเคราะหหาสารส าคญ andrographolide ดวยเทคนค TLC โดยใชสภาวะตาม Thai Herbal Pharmacopoeia (2016) ดงน

สภาวะทใชในการทดสอบ TLC silica gel 60 F254 ขนาด 20 x 10 cm. Mobile phase Chloroform: absolute ethanol (85:15, v/v) Injection volume 2 และ 5 ไมโครลตร Detector 254, 366 nm และแสงขาว

6.2 การวเคราะหหาสารส าคญ andrographolide ดวยเทคนค TLC/ HPTLCโดยดดแปลงจาก Thai Herbal Pharmacopoeia (2016)

6.2.1 การเตรยมสารละลายมาตรฐาน andrographolide ตามขอ 6.1.1 6.2.2 การเตรยมตวอยางตามขอ 6.1.2 โดยชนดของตวอยาง ม 2 ชนด ไดแก

Sample A คอ ตวอยางสมนไพรฟาทะลายโจรชนดแคปซล น าผงยาภายในแคปซลจ านวน 2 แคปซลผสมรวมกนแลวน าไปชงปรมาณ150 มลลกรม

Sample B ตวอยางสมนไพรฟาทะลายโจรสวนใบและล าตนอบแหงบดละเอยดชงปรมาณ 150 มลลกรม

6.2.3 สภาวะในการวเคราะหหาสารส าคญ andrographolide ดวยเทคนค HPTLC โดยดดแปลงจาก Thai Herbal pharmacopoeia (2016) ดงน

- เปลยนชนด TLC plate ชนด silica gel GF254 เปน HPTLC plate ชนด silica gel 60F254 และ TLC plate silica gel 60 F254

- เปลยน mobile phase จาก chloroform เปน dichloromethane - ไมใชการ derivatization เนองจากเครองถายภาพพรอมเกบขอมลบนแผน TLC/

HPTLC สามารถวดคา Rf ของสารส าคญ andrographolide ใน band ของสารมาตรฐาน และตวอยางได สภาวะทใชในการทดสอบ TLC plate silica gel 60 F254 ขนาด 20 x 10 cm. HPTLC plate silica gel 60 F254 ขนาด 10 x 10 cm. Injection volume 2 µL Detector 254 nm

กลมตรวจสอบคณภาพยาสตว และวตถอนตรายดานการปศสตว หนา 8 จาก 19

6.3 ตรวจสอบเอกลกษณทางเคมทเปนลกษณะเฉพาะตว (fingerprints) ในสมนไพรฟาทะลายโจร ดวยเทคนค TLC/ HPTLC รวมกบ ion trap mass spectrometer

6.3.1 การเตรยมตวอยางตามขอ 6.1.2 แตใชตวอยางเพยง 1 ชนด ไดแก ตวอยางสมนไพรฟาทะลายโจรชนดแคปซล โดยน าผงยาจากภายในแคปซลจ านวน 8 แคปซล ผสมรวมกน แลวน าไปชงปรมาณ 2 กรม

6.3.2 สภาวะในการตรวจเอกลกษณดวยเทคนค TLC และ HPTLC โดยใชสภาวะตาม Thai Herbal Pharmacopoeia (2016) ตามขอ 6.1.3

6.3.3 การยนยนชนดสารส าคญ andrographolide โดยวธทพฒนาขนเอง ดงน - ท าการขด silica ท TLC plate และ HPTLC plate บรเวณ band ทคาดวาเปน

สารส าคญ - น าไปละลายดวย 80% warm ethanol ปรมาตร 1 มลลลตร vortex และ

sonicate นาน 5 นาท - น าไปฉดเขาเครอง mass spectrometer ชนด ion trap ดพคท 409.0, 349.2,

331.0 และ 287.0 m/z (Wang et al., 2014)

ตารางท 1 สภาวะทใชในการทดสอบดวยเครอง mass spectrometer Tune Source Trap

Trap Drive 41.2 Rolling on Octopole RF Amplitude 120.8 Vpp Rolling, Averages 5 cts Lens 2 77.5 Volt Scan Begin 50 m/z Capillary Exit -91.7 Volt Scan End 500 m/z Dry Temp (Set) 300 ºC Averages 8 Spectra Nabulizer (Set) 30.00 psi Max. Accu. Time 200000 µs Dry Gas (Set) 6.00 l/min (Smart ICC Target 50000

HV Capillary 4050 V ICC on

HV End Plate Offset -500 V

กลมตรวจสอบคณภาพยาสตว และวตถอนตรายดานการปศสตว หนา 9 จาก 19

7 ผลการทดลอง

7.1 ผลการวเคราะหหาสารส าคญ andrographolide ดวยเทคนค TLC โดยใชสภาวะตาม Thai Herbal Pharmacopoeia (2016)

รปท 1 TLC plate เมอดท 366 นาโนเมตร

Solution A ตวอยางฟาทะลายโจรจากแคปซล Solution B ตวอยางจากใบและล าตนอบแหง

รปท 2 TLC plate เมอดท 254 นาโนเมตร

Solution A ตวอยางฟาทะลายโจรจากแคปซล Solution B ตวอยางจากใบและล าตนอบแหง

1

2

3

4

กลมตรวจสอบคณภาพยาสตว และวตถอนตรายดานการปศสตว หนา 10 จาก 19

รปท 3 TLC plate เมอดทแสงขาว

Solution A ตวอยางฟาทะลายโจรจากแคปซล Solution B ตวอยางจากใบและล าตนอบแหง แตเนองจากยงไมไดรบสารมาตรฐาน ท าใหไมสามารถยนยนไดวา band ทสงสยในต าแหนงท 1– 4

band ใดเปนสารส าคญ andrographolide จงท าการพฒนาการตรวจเอกลกษณสมนไพรฟาทะลายโจร ดวยเทคนค TLC รวมกบ ion trap mass spectrometer

7.2 ผลการตรวจเอกลกษณสมนไพรฟาทะลายโจร ดวยเทคนค TLC รวมกบ ion trap mass spectrometer

ท าการพฒนาวธการตรวจสอบเอกลกษณทางเคมทเปนลกษณะเฉพาะตว ( fingerprints) ในสมนไพรฟาทะลายโจรชนดบรรจในแคปซล ดวยเทคนค TLC/ HPTLC รวมกบ ion trap mass spectrometer โดยวธทพฒนาขนเอง ผลการพฒนา พบวา การขด plate ชนด TLC ท าไดงายกวา เนองจากมการแยกไดชดเจนกวาชนด HPTLC จงไดเลอกพฒนาตอไปดวยเทคนค TLC รวมกบ ion trap mass spectrometer

กลมตรวจสอบคณภาพยาสตว และวตถอนตรายดานการปศสตว หนา 11 จาก 19

รปท 4 TLC plate เมอดท 366 นาโนเมตร band คาดวาเปนสารส าคญ คอ ต าแหนงท 1 และ 2

Solution A ตวอยางฟาทะลายโจรจากแคปซล Solution B ตวอยางจากใบและล าตนอบแหง

รปท 5 TLC plate เมอดท 254 นาโนเมตร band คาดวาเปนสารส าคญ คอ ต าแหนงท 3 และ 4

Solution A ตวอยางฟาทะลายโจรจากแคปซล Solution B ตวอยางจากใบและล าตนอบแหง

1

2

3

3

4

กลมตรวจสอบคณภาพยาสตว และวตถอนตรายดานการปศสตว หนา 12 จาก 19

รปท 6 Product ion scan and proposed fragmentation pattern of andrographolide (Wang et al.,2014)

รปท 7 ผลการตรวจวดดวยเครอง mass spectrometer ของ band ต าแหนงท 1

รปท 8 ผลการตรวจวดดวยเครอง mass spectrometer ของ band ต าแหนงท 2

กลมตรวจสอบคณภาพยาสตว และวตถอนตรายดานการปศสตว หนา 13 จาก 19

รปท 9 ผลการตรวจวดดวยเครอง Mass Spectrometer ใน band ต าแหนงท 3

รปท 10 ผลการตรวจวดดวยเครอง mass spectrometer ของ band ต าแหนงท 4 พบ mass spectrum ท 409.0 (acetic acid adduction) > 349.0, 331.0, 286.9 m/z

จากรปท 7 - 9 พบว า band ต าแหน งท 1 - 3 เม อน า ไปตรวจวดด วย เคร อง mass spectrometer ไมพบ mass spectrum ของ andrographolide ท 409.0, 287.0, 331.0 และ 349.2 m/z (Wang et. al., 2014) แตพบใน band ต าแหนงท 4 ดงรปท 10

7.3 ผลการวเคราะหหาปรมาณสารส าคญ andrographolide ดวยเทคนค TLC/ HPTLC โดยดดแปลงจาก Thai Herbal Pharmacopoeia (2016)

เมอทราบวา ต าแหนงท 4 คอ andrographolide จงไดท าการปรบสภาวะ เพอแยก band ของสารต าแหนงท 3 และ 4 ใหชดเจนขน โดยเตรยมสารมาตรฐานตามขอ 6.2.1 และเตรยมตวอยางตามขอ 6.2.2 เปลยน mobile phase เพอลดความเปนพษของสาร ตามขอ 6.2.3

กลมตรวจสอบคณภาพยาสตว และวตถอนตรายดานการปศสตว หนา 14 จาก 19

รปท 11 HPTLC plate silica gel 60 F254 ขนาด 10 x 10 เซนตเมตร ท 254 นาโนเมตร ต าแหนงท 1 เปนต าแหนง band ของ andrographolide ในตวอยางฟาทะลายโจรจากแคปซล ต าแหนงท 2 เปนต าแหนง band ของอนพนธอนในตวอยาง

จากรปท 11 พบ band ทมการแยกของสารส าคญ andrographolide ต าแหนงท 1 กบสารอนพนธอนในต าแหนงท 2 ของตวอยางหลงจากมการปรบอตราสวนของ mobile phase ตามขอ 6.2.3และพบวาคา Rf ของสารมาตรฐาน และ Sample A มคา Rf ตางกนไมเกน 0.01 (0.45 ± 0.01)

รปท 12 Spectrum ของสารมาตรฐาน และ Sample A โดย เสนสแดงเขมเปน spectrum ของสารมาตรฐาน เสนสชมพเปน spectrum ของ Sample A (ตวอยางฟาทะลายโจรจากแคปซล)

จากรปท 12 พบวา spectrum ของสารมาตรฐาน และตวอยางเหมอนกน แตชวงทายของ spectrum ของตวอยางมความแตกตาง อาจเปนเพราะตวอยางยงมสวนของอนพนธอนรวมอย

2

1

กลมตรวจสอบคณภาพยาสตว และวตถอนตรายดานการปศสตว หนา 15 จาก 19

1

รปท 13 Area ของสารมาตรฐาน และ Sample A ต าแหนงท 1 เปน area ของสารมาตรฐาน ต าแหนงท 2 เปน area ของ Sample A (ตวอยางฟาทะลายโจรจากแคปซล)

จากรปท 13 พบวา area ของ Sample A มคามากกวา Area ของสารมาตรฐาน อาจเปนเพราะมอนพนธอนรวมอยดวย หรอมปรมาณของสารส าคญ andrographolide มากกวาสารมาตรฐาน

รปท 14 TLC plate silica gel 60 F254ขนาด 20 x 10 เซนตเมตรท 254 นาโนเมตร Track ท 1, 4 และ 9 คอสารมาตรฐาน andrographolide Track ท 2-3 และ 7-8 คอ ตวอยางฟาทะลายโจรจากแคปซล Track ท 5-6 และ 10-11 คอ ตวอยางจากใบและล าตนอบแหง

การค านวณ หาคา Rf

RF = ระยะทางทสารเคลอนท

ระยะทางทตวท าละลายเคลอนท

1

2

1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11

กลมตรวจสอบคณภาพยาสตว และวตถอนตรายดานการปศสตว หนา 16 จาก 19

รปท 15 Area ของสารส าคญ andrographolide หมายเลข 1 Area ของสารมาตรฐาน andrographolide หมายเลข 2 Area ของส าคญ andrographolide ใน sample A (ตวอยางฟาทะลายโจรจากแคปซล) หมายเลข 3 Area ของส าคญ andrographolide ใน sample B (ตวอยางจากใบและล าตนอบแหง)

จากการค านวณหาปรมาณ andrographolide ในการวเคราะหดวย HPTLC พบปรมาณสารส าคญ andrographolide ใน Sample A และ Sample B ดงน

การค านวณหาปรมาณสารส าคญในตวอยาง

=น าหนกสารมาตรฐาน

ปรมาตรตวท าละลาย x Purity ของสารมาตรฐาน x

ปรมาตรตวท าละลาย

น าหนกตวอยางx

พนทพคตวอยาง

พนทพคสารมาตรฐาน

เมอน า TLC plate silica gel 60 F254 มาวเคราะหโดยใชสภาวะตามขอ 6.2.3 พบวา สามารถแยกสารส าคญ andrographolide ไดเชนเดยวกบการใช HPTLC plate silica gel 60 F254

ตารางท 2 ปรมาณ andrographolide จากการวเคราะหดวย HPTLC Sample % (w/w)

Sample A 1 1.786 Sample A 2 1.769 Sample B 1 1.028 Sample B 2 1.040

Sample A1, A2 คอ ตวอยางฟาทะลายโจรจากแคปซล Solution B1, B2 ตวอยางจากใบและล าตนอบแหง

1

2

3

กลมตรวจสอบคณภาพยาสตว และวตถอนตรายดานการปศสตว หนา 17 จาก 19

8 สรปผลการทดลอง ท าการพฒนาวธวเคราะหหาปรมาณสารส าคญ andrographolide ในฟาทะลายโจร จากใบและ

ล าตนอบแหง และชนดบรรจในแคปซล โดยดดแปลงวธจาก Thai Herbal Pharmacopoeia (2016) โดยเปลยนชนด TLC plate ชนด silica gel 60 GF254 เปน HPTLC plate ชนด silica gel 60 F254 เปลยน mobile phase จาก chloroform เปน dichloromethane และไมใชการ derivatization เนองจากเครองถายภาพ (TLC visualizer) สามารถวดคา Rf ของสารส าคญ andrographolide บนแผน TLC/ HPTLC ได ผลการพฒนาพบวา ต าแหนง band ของ andrographolide ในตวอยางมคา Rf เทากบ band ของส า รม าต ร ฐ า น andrographolide (Rf = 0.45 ± 0.01) ส ามา รถแยกส า ร ส า ค ญ andrographolide ออกจากอนพนธในกลมของสาร andrographis ได

ตามมาตรฐาน Thai Herbal Pharmacopoeia (2016) ระบวา การวเคราะหดวย HPLC จะตองม andrographolide ไมนอยกวา 1. 0 เปอรเซนต และจากการค านวนหาในการ วเคราะหดวย HPTLC พบปรมาณสารส าคญ andrographolide ใน Sample A และ Sample B ไมนอยกวา 1. 0 เปอรเซน ตและพบวา Sample A และ Sample B ทมน าหนกเทากน แตมปรมาณสารส าคญไมเทากน อาจดวยปจจยจากการเตรยมผลตภณฑ การเกบรกษา หบหอบรรจ โดยในผลตภณฑฟาทะลายโจรในแคปซลมบรรจภณฑทมฝาปดและสามารถปองกนความชนไดระดบหนง จะมปรมาณสารส าคญมากกวาตวอยางทเปนใบและล าตนอบแหงทไมมภาชนะบรรจ จงอาจท าใหเกดการสญเสยสารส าคญได

ท าการพฒนาวธการตรวจสอบเอกลกษณทางเคมทเปนลกษณะเฉพาะตว ( fingerprints) ในสมนไพรฟาทะลายโจรชนดบรรจในแคปซล ดวยเทคนค TLC/ HPTLC รวมกบ ion trap mass spectrometer โดยวธทพฒนาขนเอง ผลการพฒนา พบวา

1. การขด plate ชนด TLC ท าไดงายกวา เนองจากมการแยกไดชดเจนกวาชนด HPTLC จงไดเลอกพฒนาตอไปดวยเทคนค TLC รวมกบ ion trap mass spectrometer

2. การสกดผงยาจากภายในแคปซล แลวน าไปวเคราะหดวย TLC ตามวธใน Thai Herbal Pharmacopoeia (2016) แลวท าการขด silica บน TLC plate บรเวณ band ทคาดวาเปนสารส าคญ ไปละลายดวย 80% warm ethanol ปรมาตร 1 มลลลตร vortex และ sonicate นาน 5 นาท น าไปฉดเขาเครอง mass spectrometer ชนด ion trap พบวา band ต าแหนงท 4 จากการด TLC plate ท 254 นาโนเมตร สามารถตรวจพบ mass spectrum ท 409.0, 349.0, 331.0, 286.9 m/z ซงใกลเคยงกบ mass spectrum ท Wang และคณะ )2014 (ระบ (409 .0, 349.2, 331.0 287.0 m/z) ซ งเปนลกษณะเฉพาะของ andrographolide จงสามารถใชวธทพฒนาขนนในการตรวจสอบเอกลกษณในสมนไพรฟาทะลายโจรได ทดแทนการซอสารมาตรฐาน andrographolide ทมราคาแพง

9 ขอเสนอแนะ -

กลมตรวจสอบคณภาพยาสตว และวตถอนตรายดานการปศสตว หนา 18 จาก 19

10 กตตกรรมประกาศ ขอขอบคณผอ านวยการส านกตรวจสอบคณภาพสนคาปศสตวทพจารณาใหด าเนนการใน

ปงบประมาณ 2562 เจาหนาทหองปฏบตการ กลมตรวจสอบคณภาพยาสตวฯ ทชวยเหลอในการปฏบตงานใหส าเรจลลวงไปดวยด

11 เอกสารอางอง Thai Herbal pharmacopoeia (2016) ฟาทะลาย (FA-THA-LAI). 103-111 Thai Herbal pharmacopoeia (2016) ยาแคปซลฟาทะลาย (FA-THA-LAI CAPSULES). 112-113 British Pharmacopeia 2018 Volume IVAndrographis Herb IV-62 – IV-64 J AOAC Int. Author manuscript; available in PMC 2009 March 30. Wang,J., W. Yang, G. Wang, P. Tang and Y. Sai. (2014) Determination of six components of

Andrographis paniculate extract and one major metabolite of andrographolide in rat plasma by liquid chromatography-tandem mass spectrometry. Journal of Chromatography B, 951-952, 78-88

คณะการแพทยแผนไทย มหาวทยาลยสงขลานครนทร (2510) “ฟาทะลายโจรกบไขหวด” สบคนเมอ 21 กนยายน 2562 จาก http://www.ttmed.psu.ac.th/blog.php?p=11

ส านกงานสาธารณสขจงหวดล าปาง (2560) “การใชยาสมนไพรทดแทนยาแผนปจจบน” สบคนเมอ 21 ก นยายน 2562 จาก www.lpho.go.th › plugins › download-attachments › includes › download

ศวะรกษ สดานนท ผงผาย พรรณวด เชาว อนทรประสทธ สรพจน วงศใหญ วศวกรรมสาร มก. ฉบบท 57 ปท 19 ธนวาคม 2548 – มนาคม 2549 การอบแหงสารสกดจากสมนไพรฟาทะลายโจร 24-31

กลมตรวจสอบคณภาพยาสตว และวตถอนตรายดานการปศสตว หนา 19 จาก 19

ภาคผนวก ตารางท 3 สรปวธการเตรยมตวอยาง

ขนตอน 6.1.1 Sample A (ยาแคปซล)

6.1.2 Sample B (ใบและล าตนอบแหง)

6.3 Sample A (ยาแคปซล)

6.2.1 Sample A (ยาแคปซล)

6.2.2 Sample B (ใบและล าตนอบแหง)

เอกสารอางอง Thai Herbal Pharmacopoeia (2016) วธทพฒนาขน (in-house method)

ดดแปลงจากThai Herbal Pharmacopoeia (2016)

น าหนกตวอยาง 1 กรม 2 กรม 150 มลลกรม การเตรยมตวอยาง - น าตวอยาง

สมนไพรฟาทะลายโจรแคปซล มา 4 แคปซลน าผงยามาผสมรวมกนแลวน าไปชง 1 กรม

- ชงตวอยางสมนไพรฟาทะลายโจรสวนใบและล าตนอบแหงบดละเอยด 1 กรม

- น าตวอยางสมนไพรฟาทะลายโจรแคปซล มา 8 แคปซลน าผงยามาผสมรวมกนแลวน าไปชง 2 กรม

- น าตวอยางสมนไพรฟาทะลายโจรแคปซล มา 4 แคปซลน าผงยามาผสมรวมกนแลวน าไปชง 150 มลลกรม

- ชงตวอยางสมนไพรฟาทะลายโจรสวนใบและล าตนอบแหงบดละเอยด 150มลลกรม

การสกดและการกรอง

ใสตวอยางใน Centrifuge Tube แกวขนาด 50 มลลลตร - ละลายดวย 20 mL ethanol น าไปตม 5 นาท - เตม Activated charcoal ปรมาณ 300 มลลกรม น าไปผสมใหเขากนโดยใชเครอง Vortex mixer - กรองดวยกระดาษกรองเบอร 4

การระเหยแหง ดวยกาซไนโตรเจน โดยเครอง TurboVap ทอณหภม 40 องศาเซลเซยส การเจอจางตวอยาง - 1 mL of warm ethanol (80%), vortex และ sonicate 5 นาท TLC/HPTLC plat TLC plate

Silica gel 60 F254 TLC plate Silica gel 60 F254

TLC plate Silica gel 60 F254

TLC/HPTLC plate Silica gel 60 F254

Mobile phase Chloroform: absolute ethanol (85:15, v/v) Dichloromethane: absolute ethanol (94:6, v/v) Injection volume 2 และ 5 ไมโครลตร 10 ไมโครลตร 2 ไมโครลตร TLC/HPTLC Visualizer Detector

254 นาโนเมตร 366นาโนเมตรและแสงขาว

254 นาโนเมตร และ 366 นาโนเมตร

254 นาโนเมตร

การเตรยมตวอยาง กอนน าไปยนยนชนดสารส าคญ andrographolide

- - ขด plate บรเวณ band ทสงสย - ละลายดวย 1 mL of warm 80% ethanol - Vortex และ

Sonicate 5 นาท

-

Mass spectrometer ชนด ion trap

409.0, 287.0, 331.0 และ 349.2 m/z