thèse perpignan

Université de Perpignan Via Domitia Année 2011

Laboratoire de Chimie des Biomolécules et de l’Environnement (LCBE) EA 4215 Laboratoire Génome et Développement des Plantes (LGDP) UMR 5096

Ecole Doctorale Energie et Environement (ED305)

N° d’ordre

THÈSE

Présentée devant l’Université de Perpignan Via Domitia pour l’obtention du grade de Docteur de l’Université

Discipline : Biologie

Par

Christophe CALVAYRAC

DÉGRADATION BIOLOGIQUE DE LA SULCOTRIONE

DANS UN SOL AGRICOLE : RECHERCHE D’UNE ÉVENTUELLE BIODÉGRADATION ACCÉLÉRÉE ET CARACTÉRISATION DE SOUCHES BACTÉRIENNES

POTENTIELLEMENT DÉGRADANTES

Soutenue publiquement le 20 septembre 2011

Composition du jury :

F. MARTIN-LAURENT Directeur de Recherches INRA, Dijon Rapporteur H. FENET Maître de Conférences, Université Montpellier 1 Rapporteur A. AMBLES Professeur, Université de Poitiers Examinateur R. ROUILLON Professeur, UPVD Examinateur C. GUYOT Expert Environnement, BayerCropScience Examinateur C. M. COSTE Professeur Émérite, UPVD Examinateur J. F. COOPER Professeur, UPVD Directeur de thèse O. PANAUD Professeur, UPVD Directeur de thèse

Université de Perpignan Via Domitia Année 2011

Laboratoire de Chimie des Biomolécules et de l’Environnement (LCBE) EA 4215 Laboratoire Génome et Développement des Plantes (LGDP) UMR 5096

Ecole Doctorale Energie et Environement (ED305)

N° d’ordre

THÈSE

Présentée devant l’Université de Perpignan Via Domitia pour l’obtention du grade de Docteur de l’Université

Discipline : Biologie

Par

Christophe CALVAYRAC

DÉGRADATION BIOLOGIQUE DE LA SULCOTRIONE DANS UN SOL AGRICOLE : RECHERCHE D’UNE

ÉVENTUELLE BIODÉGRADATION ACCÉLÉRÉE ET CARACTÉRISATION DE SOUCHES BACTÉRIENNES

POTENTIELLEMENT DÉGRADANTES

Soutenue publiquement le 20 septembre 2011

Composition du jury :

F. MARTIN-LAURENT Directeur de Recherches INRA, Dijon Rapporteur H. FENET Maître de Conférences, Université Montpellier 1 Rapporteur A. AMBLES Professeur, Université de Poitiers Examinateur R. ROUILLON Professeur, UPVD Examinateur C. GUYOT Expert Environnement, BayerCropScience Examinateur C. M. COSTE Professeur Émérite, UPVD Examinateur J. F. COOPER Professeur, UPVD Directeur de thèse O. PANAUD Professeur, UPVD Directeur de thèse

2

Ab nou cor et ab nou talen, Ab nou saber et ab nou sen, Et ab nou bel captenemen, Vuoill un bon vers commensar.

Raimbaut d’Aurenga, trobador.

3

Remerciements

Les travaux présentés dans ce manuscrit ont été effectués au sein du Laboratoire de Chimie

des Biomolécules et de l’Environnement (LCBE) et du Laboratoire Génome et

Développement des Plantes (LGDP) de l’Université de Perpignan Via Domitia (UPVD).

Au terme de ces nombreuses années passées sous la direction des mes deux directeurs de

thèse, qu’ils veuillent bien trouver dans ce travail, un modeste témoignage de mon profond

respect et de mon entière reconnaissance pour leur aide et leurs précieux conseils.

Je voudrais remercier Mr Jean-François Cooper de m’avoir accepté au sein de son équipe et

de m’avoir confié ce présent travail. Malgré les grandes difficultés et les nombreux obstacles

qui se sont présentés, il m’a toujours prodigué encouragements et conseils et a su porter un

intérêt constant à mon travail. J’ai beaucoup appris à ses cotés. Et bien au-delà de l’aspect

purement scientifique. Son érudition, son rayonnement personnel ainsi que son humanité sont

pour beaucoup dans la réussite de ce travail. Qu’il soit permis de lui exprimer mon

respectueux attachement ainsi que ma profonde admiration.

Je remercie également Mr Olivier Panaud qui a accepté de co-dirriger ce travail. Je lui suis

très reconnaissant pour la qualité de son accueil au sein de son équipe, son soutien permanent

ainsi que pour la confiance qu’il su m’accorder. Il a toujours manifesté à mon égard

gentillesse, marques de sympathie et une très grande disponibilité. La qualité de son

encadrement scientifique m’a permis de mener à bien une grande partie de ce travail. Qu’il

veuille bien trouver ici l’expression de mes très sincères remerciements.

Je tiens à exprimer toute ma gratitude à Mr Camille Michel Coste dont le précieux concours

m’a permis de réaliser une partie de mon travail. Ses conseils avisés, sa grande disponibilité,

sa bonne humeur ainsi que les nombreuses discussions scientifiques que nous avons pu

échanger ont été très constructives et m’ont été très profitables. Qu’il veuille bien trouver ici

la marque de ma sympathie et l’expression de mes très sincères remerciements.

4

Je remercie vivement les membres du jury qui ont accepté d’évaluer ce travail. Leur présence

signe l’intérêt qu’ils ont porté à la réalisation de cette thèse. Merci tout particulièrement à Mr

Fabrice Martin-Laurent et à Mme Hélène Fenet d’avoir accepté d’être les rapporteurs du

manuscrit, qu’ils soient assurés de ma profonde reconnaissance et de mes sentiments

respectueux.

J’adresse également un vif remerciement à Mr Régis Rouillon qui a accepté de présider ce

jury de thèse. Qu’il soit permis de lui exprimer toute ma profonde reconnaissance.

Je remercie BayerCropScience pour le soutien financier accordé tout au long de ce travail de

thèse. J’adresse notamment mes vifs respects à Mme Ilona Browjohn pour le rôle

d’interlocutrice qu’elle a pu jouer et pour l’intérêt qu’elle a su porter à cette étude. Je remercie

également Mr Christian Guyot pour sa collaboration.

Je ne saurai oublier dans mes remerciements tous les membres des laboratoires qui m’ont

accompagné dans la réalisation de ce travail.

Je tiens à exprimer ma profonde reconnaissance à Mr Fabrice Martin-Laurent pour son

soutien indéfectible, sa disponibilité et pour l’excellence de ses commentaires et de ses

remarques scientifiques toujours très instructifs et formateurs. Merci à Marion Devers-

Lamrani, Jérémie Beguet ainsi que tous les acteurs de l’INRA de Dijon de l’UMR

Microbiologie du Sol et de l’Environnement, pour leur accueil, leur formation et le temps

qu’ils ont su me consacrer lors de mes différents séjours.

Que tous mes collègues du LCBE, du LGDP, de l’IUT de Perpignan, Département Génie

Biologique et plus généralement de l’UPVD, soient également assurés de ma profonde

gratitude pour les nombreux conseils et les suggestions qu’ils mont prodigués. Merci pour les

sourires, les discussions, les coups de mains, les encouragements, votre bonne humeur et

votre implication dans la réalisation de cette thèse. Ce travail est aussi le vôtre.

5

Merci à Alexia pour son implication dans cette étude ainsi que pour le sérieux de son travail.

Merci à Julie pour sa bonne humeur et sa présence.

Merci également à Susan qui m’a soutenu dans les moments difficiles et qui a toujours cru en

moi.

Enfin, je souhaiterai remercier ma famille qui m’a accompagné et encouragé durant ce long

travail. Merci à mes parents, à Audrey, ma sœur. Merci à Philippe et à Gigi, qui par leur

soutien et leur présence, m’ont permis d’arriver au bout.

Je dédie cette thèse à ma fille Nina et à ma grand-mère Marie-Louise.

6

Sommaire

REMERCIEMENTS 3

SOMMAIRE 6

TABLEDESILLUSTRATIONS 9

INTRODUCTION 18

PREMIEREPARTIE:REVUEBIBLIOGRAPHIQUE 22

Chapitre1Soletdiversitémicrobienne 231‐Contexte 232‐Composantemicrobiennedusol 243‐Diversitémicrobiennedusol 26

Chapitre2Méthodologiesnonmoléculairesappliquéesàl’étudedessouchesbactériennestelluriques 271‐Méthodescultivablestraditionnelles 272‐Méthodescultivablesinnovantes 29

Chapitre3Méthodologiesmoléculairesappliquéesàl’étudedessouchesbactériennestelluriques 311‐AnalysedesprofilsderestrictiondesADNr16Samplifiés(ARDRA) 312‐AmplificationPCRdesséquencesrépétitives(REP‐PCR) 333‐SéquençagedesADNr16SetAnalysephylogénétique 35

Chapitre4Dégradationbiologiquedesproduitsphytosanitairesdanslessols 411‐Dégradationbiologiqueetrécalcitrancemoléculaire 412‐Inductionsenzymatiquesetadaptionsmicrobiennes 423‐Aspectscinétiquesdeladégradationbiologique:Métabolismedirectetco‐métabolisme. 454‐Casparticulierdedégradationbiologique:labiodégradationaccélérée(BDA)despesticides 47

DEUXIEMEPARTIE:PRESENTATIONGENERALEDEL’ETUDE 51

Chapitre1Lafamilledesherbicidestricétones 521‐Contextehistorique 522‐Lasubstanceactive 543‐Moded’actiondelasubstanceactive 564‐Approchestoxicologiqueetécotoxicologique 605‐Comportementdanslesdifférentscompartimentsdel’environnement 61

Chapitre2Matriced’étude:lesoldePerpignan 671‐Situationgéographiquedelaparcelle 672‐ParamètresédaphiquesdusoldePerpignan 683‐Historiquecultural 694‐Stratégied’échantillonnage 695‐Dispositifexpérimental:lesmicrocosmes 70

TROISIEMEPARTIE:METHODOLOGIESDETRAVAIL 73

7

Chapitre1Méthodologiedel’analysechimique 741‐Analysedeséchantillonsdesols 742‐Analysedeséchantillonsdemilieuxdeculture 77

Chapitre2Méthodologiedel’analysebiologique 871‐Cadredel’étude:organisationdestravaux 872‐Approchecultivable:essaid’isolementdesouchesbactériennesdégradantlasulcotrione 873‐Approchemoléculaire:caractérisationdesisolatsbactériensdégradantlasulcotrionevsisolatsnondégradants 99

QUATRIEMEPARTIE:RESULTATSETDISCUSSION 119

Chapitre1ConfirmationdupouvoirbiodégradantdusoldePerpignanetrecherched’uneéventuellebiodégradationaccélérée(BDA) 1201‐RéactivitébiologiquedusoldePerpignan 1202‐Recherched’uneéventuellebiodégradationaccélérée(BDA) 1243‐Conclusion 127

Chapitre2Isolementdesouchesbactériennespotentiellementdégradantesdelasulcotrione 1291‐Recherchedesouchessulcotrione‐résistantes 1292‐Isolementdesouchesbactériennesmétabolisantlasulcotrione 1303‐Etudedupotentieldedégradationdesisolatsdégradants:suivideladissipationdelasulcotrionedanslemilieudeculture(MS) 1344‐Recherchedemétabolitesdelasulcotrionedanslemilieudeculture(MS) 137

Chapitre3Caractérisationphylogénétiquedesisolats1OPet1TRANS 1421‐Vérificationdelaqualitédel’ADNmatrice 1422‐AnalysedupolymorphismedeséquencedesADNr16Samplifiés(ARDRA)desisolats 1423‐Analysedesisolatsbactériensparamplificationdesséquencesrépétitives(REP‐PCR) 1444‐Séquençagedel’ADNr16Sdesisolats1OPet1TRANS 1455‐Conclusion 154

Chapitre4Caractérisationfonctionnelledesisolats1OPet1TRANS 1591‐Préambule 1592‐DétectiondesgènesXylEcodantl’enzymecatéchol2,3‐dioxygénase 1603‐DétectiondesgènesC12Ocodantl’enzymecatéchol1,2‐dioxygénase 1644‐SéquençagedesampliconsXylE 1655‐SéquençagedesampliconsC12O 165

CONCLUSIONGENERALEETPERSPECTIVES 167

REFERENCESBIBLIOGRAPHIQUES 173

VALORISATIONDESTRAVAUXDERECHERCHE 207

Publicationn°1(SOUSPRESSE) 208

Publicationn°2 233

Communicationscientifique 241

TABLEDESANNEXES 252

ANNEXE1 253

8

ANNEXE2 260

ANNEXE3 262

TABLEDESMATIERES 263

9

Table des illustrations

10

Liste des figures

Figure I-1-1 : Principales caractéristiques du sol en tant que microhabitat (Nannipieri et al.,

2003).

Figure I-2-1 : Répartition des différents phyla (%) représentés dans la banque « Australian

Collection of Microorganisms », après entrée en collection des isolats bactériens (Hugenholtz,

2002).

Figure I-3-1 : (a) Agrandissement d’un ribosome chez une bactérie. (b) Modélisation

tridimentionnelle du ribosome 70S composé de la grande sous-unité 50S (ARNr 5S + ARNr

23S + 31 protéines) et la petite sous-unité 30S (ARNr 16S + 21 protéines). (c) Exemple de

repliement dans l’espace de l’ARNr 16S provenant de la petite sous-unité 30S du ribosome

(Stern et al., 1988b). (d) Exemple de la structure secondaire de l’ARNr 16S de Vibrio.

parahaemolyticus X56580 présentant la structure secondaire des 4 principales séquences

provenant de différents isolats de Vibrio parahaemolyticus (Harth et al., 2007).

Figure I-3-2 : Principe de la REP-PCR.

Figure I-4-1 : Principaux mécanismes moléculaires intervenant dans le transfert génétique

horizontal (HGT), d’après Zaneveld et al. (2008).

Figure I-4-2 : Modélisation conceptuelle de l’adaptation des communautés bactériennes à la

biodégradation accélérée (BDA) de l’atrazine. Dispersion (flèches rouges) des gènes atz et trz

par conjugaison plasmidique et diversification (flèches vertes) du support des gènes atz par

transposition, d’après Devers et al. (2008).

Figure II-1-1 : Formule développée de la leptospermone (C15H22O4).

Figure II-1-2 : Structure de la 2-[2,4-benzoyl disubstitué]-1,3 cyclohexanedione.

11

Figure II-1-3 : Formes tautomériques dominantes de benzoyl-cyclohexane-1,3-dione en

solution aqueuse (X = Cl pour la sulcotrione, X = NO2 pour la mésotrione.

Figure II-1-4 : Comportement d’une benzoylcyclohexane-1,3-dione à caractère acide faible

en solution aqueuse.

Figure II-1-5 : Voie métabolique de biosynthèse des tocophérols et des plastoquinones à

partir du 4-Hydroxyphénylpyruvate chez la plante : site d’inhibition de l’enzyme 4-

phénylhydroxypyruvate dioxygénase par un herbicide tricétonique (sulcotrione).

Figure II-1-6 : Formules développées des principaux produits de dégradation de la

sulcotrione issus des voies A et B décrites dans la littérature.

Figure II-1-7 : Principaux photoproduits de la sulcotrione (chaabane et al, 2007).

(A) : (2-hydroxy-4-méthylsulfonyl)-1,3-cyclohexanedione, (B) : Acide 5,7-dicéto-7-(2-

chloro-4-méthylsulfonylphényl) heptanoïque, (C) : Acide 5,7-dicéto-(2-hydroxy-4-

méthylsulfonyl) heptanoïque, (D) : 1,3-cyclohexanedione, (E) : Acide 2-chloro-4-

méthylsulfonylbenzoïque, (F) : Acide 2-hydroxy-4-méthylsulfonyl benzoïque.

Figure II-1-8 : Variation de Ln Kobs en fonction de 1/T pour la dégradation de la sulcotrione

dans le sol de Belgique dans la gamme de températures 25, 40 et 60°C.

Figure II-2-1 : Plan de la parcelle expérimentale (IUT de Perpignan, UPVD).

Figure II-2-2 : Parcelle expérimentale (avant traitement phytosanitaire) située sur le site de

l’IUT de Perpignan, Université de Perpignan Via Domitia (Pyrénées Orientales).

Figure II-2-3 : Synoptique du calendrier de traitements et de prélèvements des essais en

microcosmes.

Figure II-2-4 : Préparation et mise en place des microcosmes.

Figure III-1-1 : Appareillage CLHP/UV Shimadzu utilisé pour les analyses de la sulcotrione

à partir de la matrice sol.

12

Figure III-1-2 : Chromatogramme CLHP/UV de la sulcotrione et de ses principaux

métabolites (CHD et CMBA).

Figure III-1-3 : (a) Spectre de masse (CLHP/SM-ESI) de la 1,3-cyclohexane dione (CHD) en

mode positif. (b) Chromatogrammes du standard analytique (10 mg.L-1) par détection barrette

de diodes et (c) détection SM par extraction du fragment m/z 113 en mode positif.

Figure III-1-4: (a) Spectre de masse de l’acide 2-chloro-4 methylsulfonyl benzoïque

(CMBA) (standard analytique à 20 mg.L-1) obtenu en CPG/SM (mode positif, SM, impact

électronique). (b) Chromatogramme montrant la présence du CMBA (fragments m/z, 217, 248

et 250) dans le milieu de culture (MS) supplémenté en sulcotrione de la souche 1OP après 27

jours d’incubation.

Figure III-1-5: Droite d’étalonnage de l’ester méthylique provenant du CMBA obtenu après

dérivation et analyse en CPG/SM.

Figure III-1-6: Droite d’étalonnage de la sulcotrione surajoutée dans le milieu de culture MS,

après extraction et analyses CLHP/UV.

Figure III-1-7: Principe de la réaction de dérivation de l’acide 2-chloro-4 methylsulfonyl

benzoïque (CMBA), en présence d’un excès de triméthylsilyldiazométhane (TMSCHN2) et de

méthanol conduisant à la formation de l’ester méthylique correspondant.

Figure III-2-1 : Exemples d’appareillages et de matériels utilisés en culture Pasteurienne lors

de l’étude. IUT de Perpignan, Département Génie Biologique (UPVD).

Figure III-2-2 : Protocole d’isolement de souches bactériennes telluriques sulcotrione-

résistantes.

Figure III-2-3 : Cultures répétées des isolats sulcotrione-résistants avec pression de sélection

de l’herbicide.

13

Figure III-2-4 : Protocole de sélection de souches bactériennes sulcotrione-dégradantes après cinq cycles de cultures répétées.

Figure III-2-5 : Spectrophotomètre Nanodrop (ThermoFisherScientific) utilisé pour la

quantification des échantillons d’ADN génomique issus des isolats bactériens.

Figure III-2-6 : (a) Imageur de gel autonome (système UGenius, SynGene), (b) Système

compact d’électrophorèse, (c) Thermocycleurs PTC 200 Gradient Cycler (Bio-Rad et MJ

Research), disponibles au LGDP (UPVD).

Figure III-2-7 : Carte du vecteur de clonage utilisé lors de l’étape de ligation des produits

PCR, délimitant la positionde l’insert d’intérêt (insert cloned) situé entre les deux promoteurs

T7 et SP6 nécessaire à la transcription (plasmide pGEM®-T Easy Vector Ligation kit,

Promega, Madison, USA).

Figure III-2-8 : Croissance des colonies après étalement de 20 µL (gauche) et de 80 µL

(droite) de cellules compétentes Escherichia coli DH5α™ ayant intégré le vecteur de clonage

pGEM®-T easy sur milieu LB + ampicilline (20 µg.mL-1).

Figure III-2-9 : Séquenceur Applied Biosystems Hitachi 3130xl Genetic Analyzers.

Figure III-2-10 : Voies de clivage du noyau aromatique du catéchol (voies ortho et méta)

catalysées par les catéchol dioxygénases.

Figure IV-1-1 : Suivi de la dissipation de la sulcotrione dans les microcosmes de sol (4S) vs

(St4S) après traitements successifs.

Figure IV-1-2 : Suivi de la dissipation de la sulcotrione dans les microcosmes de sol (C) vs

(StC) après traitements successifs.

Figure IV-2-1 : Colonies isolées sur milieu minimum (MS) supplémenté en sulcotrione

comme seule source de carbone et/ou d’énergie après croissance à 24°C à l’obscurité.

14

Figure IV-2-2 : Suivi de la croissance des souches 1OP vs 1TRANS dans le milieu de culture

(MS) supplémenté en sulcotrione par mesure de l’absorbance à 600 nm.

Figure IV-2-3 : Suivi de la croissance des souches 1OP vs 1TRANS dans le milieu de culture

(MS) non supplémenté en sulcotrione par mesure de l’absorbance à 600 nm.

Figure IV-2-4 : Suivi de la dissipation de la sulcotrione en fonction du temps dans le milieu

de culture (MS) supplémenté et ensemencé par les souches 1OP ou 1TRANS. Le contrôle est

un milieu (MS) supplémenté non ensemencé.

Figure IV-2-5 : Suivi de l’accumulation de l’acide 2-chloro-4 methylsulfonyl benzoïque

(CMBA) et de la dissipation de la sulcotrione en fonction du temps dans le milieu de culture

(MS) supplémenté et ensemencé par la souche 1OP.

Figure IV-3-1 : Empreintes ARDRA des isolats 1OP et 1TRANS générées après digestion

des ADNr 16S par Alu I et migration sur gel d’agarose (1%). La taille des fragments est

indiquée en paires de bases (pb).

Figure IV-3-2 : Empreintes ARDRA des isolats 1OP et 1TRANS générées après digestion

des ADNr 16S par Hae III et migration sur gel d’agarose (1%). La taille des fragments est

indiquée en paires de bases (pb).

Figure IV-3-3 : Profils REP PCR des isolats 1OP et 1TRANS.

Puits 1, 2, 5 et 6: REP PCR réalisée avec 1 ng.µL-1 d’ADN matrice. Puits 3, 4, 7 et 8: REP

PCR réalisée avec 2 ng.µL-1 d’ADN matrice.

Figure IV-3-4 : Migration sur gel d’agarose (1%) des ADNr 16S des isolats 1OP et 1TRANS

après amplification PCR à l’aide des amorces universelles 27f et 1492r.

Figure IV-3-5 : Mise en culture des colonies recombinantes (colonies blanches T7-SP6-PCR

positives) pour la préparation de l’ADN plasmidique (MiniPreps) destiné au séquençage, à

partir des banques de clones d’ADNr 16S des isolats 1OP et 1TRANS (milieu gélosé LB +

Ampicilline).

15

Figure IV-3-6 (a) : Migration sur gel d’agarose (1% ) des amplicons après amplification PCR

à partir des colonies blanches issues de la banque d’ADNr 16S de la souche 1OP.

Figure IV-3-6 (b) : Migration sur gel d’agarose (1% ) des amplicons après amplification PCR

à partir des colonies blanches issues de la banque d’ADNr 16S de la souche 1TRANS.

Figure IV-3-7 : Alignement des séquences consensus des ADNr 16S des isolats 1OP et

1TRANS. BIODE : souche 1OP ; N-BIO : souche 1TRANS.

Figure IV-3-8 : Analyse phylogénétique des ADNr 16S des isolats Pseudomonas sp.

1TRANS (NBD) et Pseudomonas sp. 1OP (BD). Les numéros d’accession GenBank des

séquences d’ADNr16S utilisées pour l’analyse sont indiqués entre parenthèse dans la légende.

Figure IV-4-1 : Migration des produits PCR sur gel d’agarose (1,2%) après amplification de

l’ADN génomique des deux isolats 1OP et 1TRANS à l’aide des amorces XylEaf et XylEar.

Contrôle 1 : ADN génomique E. coli DH5α ; contrôle 2 : ADN plasmidique pCambia 3300.

La taille des fragments est indiquée en paires de bases (pb).

Figure IV-4-2 : Migration des produits PCR sur gel d’agarose (1,2%) après amplification de

l’ADN génomique des deux isolats 1OP et 1TRANS à l’aide des amorces C12Of et C12Or.

La taille des fragments est indiquée en paires de bases (pb).

Figure IV-4-3 : Alignement multiple des séquences provenant des fragments d’ADN (taille

approximative 500 pb) obtenus lors du ciblage du gène C12O chez les isolats 1OP et

1TRANS à l’aide du logiciel ClustalX V. 2.0.10 (Thompson et al., 1997).

16

Liste des tableaux

Tableau II-1-1 : Activité herbicide (DC50 : Dose moyenne nécessaire pour le contrôle de 50

% de 7 espèces différentes de dicotylédones) des composés 2-[2,4-benzoyl disubstitués]-1,3

cyclohexanedione (d’après Lee et al.,1998).

Tableau II-1-2 : Sensibilité des adventices à la sulcotrione pour un traitement en post-levée à

450 g.ha-1. TS = très sensible, S = sensible, MS = moyennement sensible, MR =

moyennement résistante, R = résistante (d’après Compagnon et Beraud, 1992).

Tableau II-1-3 : Toxicité et écotoxicité de la sulcotrione non formulée (The Pesticide

Manual, 2007).

Tableau II-2-1 : Propriétés pédologiques et physico-chimiques du sol de la parcelle de

l’Institut Universitaire de Technologie (IUT) de Perpignan, déterminées par les protocoles

standardisés (Laboratoire d’Analyses Agricoles de Perpignan et LCBE –UPVD).

Tableau III-1-1: Performances de la méthodologie d’analyse de la sulcotrione dans le sol.

Tableau III-1-2 : Origine, références et pureté des standards analytiques utilisés lors de

l’analyse chimique.

Tableau III-1-3 : Calibration de l’analyse sulcotrione + métabolites sur milieu de culture

avec l’appareillage CLHP Jasco).

Tableau III-2-1: Préparation du milieu de culture minimum (MS).

Tableau III-2-2: Composition du milieu de culture TS (pH 7,3 ± 0,2) pour 1 litre d’eau

purifiée.

Tableau III-2-3: Composition du tampon Knapp (pH 6,6) pour 1 litre d’eau purifiée.

17

Tableau III-2-4 : Préparation, composition et conditions de conservation du tampon Giescher

5X nécessaire à la réaction de REP-PCR.

Tableau III-2-5 : Préparation et composition du milieu Luria Bertani (LB) nécessaire à la

sélection des cellules bactériennes transformées par le plasmide pGEM®-T easy.

Tableau III-2-6 : Caractéristiques des amorces utilisées pour la détection des gènes codant la

catéchol 2,3-dioxygénase (C23O) et la catéchol 1,2-dioxygénase (C12O) par amplification

PCR.

Tableau III-2-7 : Quantité d’ADN (en ng) nécessaire par réaction de séquençage pour les

fragments PCR. Etalonnage du séquenceur Applied Biosystems Hitachi 3130xl Genetic

Analyzers.

Tableau IV-1-1 : Constantes cinétiques (k), temps de demi-vie (t1/2) et coefficients de

détermination (R2) relatifs à la cinétique de dégradation de la sulcotrione en conditions de

microcosmes pour le sol de Perpignan.

Tableau IV-1-2 : Paramètres cinétiques relatifs aux différents traitements successifs effectués

pour les sols (4S), (St4S), (C) et (StC).

Tableau IV-2-1 : Evolution des concentrations en substance active et métabolites dans le

milieu de culture (MS) supplémenté en sulcotrione et ensemencé par l’isolat bactérien 1OP

(ND : non détecté).

Tableau IV-3-1 : Quantification et évaluation de la qualité de l’ADN génomique des isolats

bactériens 1OP et 1TRANS.

Tableau IV-3-2 : Quantification et évaluation de la qualité des ADNr 16S des isolats

bactériens 1OP et 1TRANS obtenus après amplification PCR et purification.

18

Introduction

Introduction

19

La présence de résidus de composés xénobiotiques dans les principaux compartiments

de l’environnement est avérée depuis plusieurs décennies. Les diverses activités anthropiques

(développement urbain, pollutions industrielles, agriculture, épandage des boues de stations

d’épuration, …) exercent des pressions environnementales variables, que les institutions

nationales et/ou supranationales s’efforcent d’identifier et de limiter (plan national Ecophyto

2018, législation Européenne REACH,…).

L’agriculture intensive conventionnelle participe de manière notable à la dégradation de la

qualité des eaux de surface et souterraines, du sol et de l’atmosphère, consécutivement à

l’utilisation d’intrants agricoles tels que les engrais, le lisier et les produits

phytopharmaceutiques. Dans son bulletin daté de juin 2010 (L’environnement en France :

l’eau), le Service de l’Observation et des Statistiques du Commissariat Général au

Développement Durable (ex IFEN) a publié des données relatives à l’état des cours d’eau en

2007 : 82 % des stations sélectionnées présentaient une concentration en pesticides totaux <

0,5 µg.L-1 en moyenne annuelle, les teneurs supérieures (18 %) affectant les cours d’eau des

régions pratiquant une agriculture intensive (Midi-Pyrénées, bassin parisien, vallée du Rhône,

nord de la France). Les eaux souterraines apparaissent sensiblement moins contaminées.

Le rôle du sol, zone majoritaire de charge en produits phytopharmaceutiques (PPP), est

évidemment essentiel dans leur transfert vers les différents compartiments aquatiques

terrestres. Dans cette matrice, le comportement de ces composés est fortement conditionné par

plusieurs processus :

- La volatilisation, principalement en surface ;

- L’adsorption-désorption, contrôlant la distribution et la mobilité des molécules

pesticides ;

- La dégradation chimique, essentiellement hydrolyse, photolyse et oxydo-

réduction ;

- La dégradation biologique ;

- Les phénomènes de transport (diffusion moléculaire, convection, transport de

composés dissous ou en phase particulaire, …).

Les herbicides de la famille chimique des tricétones, mis sur le marché dans les années 90, ont

été homologués dans certains itinéraires techniques agricoles, notamment en maïsiculture,

Introduction

20

« bénéficiant » du retrait de substances actives comme l’atrazine. Ces molécules de nouvelle

génération (mésotrione et sulcotrione), employées à doses inférieures à celles de l’atrazine

(150 - 450 g.Ha-1 vs 1200 g.Ha-1) ont été qualifiées de composés « présentant des risques

minimes pour l’environnement (Mitchell et al., 2001). Cependant, afin de limiter les risques

de pollution future du milieu naturel et de la ressource en eau, diverses études ont été

entreprises afin d’établir le profil comportemental de cette famille chimique. Un premier

travail à été précédemment mené au Laboratoire de Chimie des Biomolécules et de

l’Environnement (LCBE) et a conduit, en collaboration avec BayerCropScience (BCS), à la

soutenance de thèse de H. Chaabane (2005). Cet auteur a étudié le comportement de la

sulcotrione dans différents sols agricoles (Belgique, Martinique, Landes et Perpignan) par une

approche phénoménologique « classique ». A propos de la rétention, quel que soit le type de

sol, la capacité d’adsorption s’est avérée modérée pour la substance active ainsi que pour un

de ses produits de dégradation principaux (acide 2-chloro-4-mésyl benzoïque, CMBA) et leur

désorption relativement aisée. La 1,3-cyclohexanedione (CHD), autre produit de dégradation,

est apparu plus fortement adsorbée sur les composantes du sol. Le transfert de ces composés a

été estimé modéré dans l’horizon 0-10 cm. Dans le cas de la dégradation abiotique, l’étude de

l’hydrolyse, en conditions naturelles puis en conditions de laboratoire, selon différentes

modalités (pH, température, présence du cation Fe++,…) a permis de qualifier la sulcotrione

de composé stable. La photolyse, étudiée dans diverses eaux (eau de laboratoire, eau de mer et

eau de rivière) a montré une vitesse de dégradation supérieure à celle observée pour

l’hydrolyse. La dégradation biologique, généralement associée à une dégradation abiotique,

est apparu prépondérante notamment dans le sol de Perpignan.

Le sol de Perpignan, présentant donc une réactivité biologique notable et ayant reçu

antérieurement des traitements répétés par la sulcotrione lors des travaux de H. Chaabane, a

constitué un outil précieux pour essayer de provoquer puis de caractériser une éventuelle

biodégradation accélérée (BDA) en conditions contrôlées, consécutivement à une possible

adaptation de la microflore tellurique par acquisition de gènes codant les enzymes

cataboliques responsables de la dégradation.

Par ailleurs, nous avons souhaité utiliser la réactivité avérée de ce sol de Perpignan afin d’en

isoler des microorganismes dégradants spécifiques, capables d’utiliser la sulcotrione comme

Introduction

21

seule source de carbone et /ou d’énergie. La culture de ces microorganismes au laboratoire, et

le souhait de les caractériser de la manière la plus formelle possible, nous ont amené à

proposer une stratégie expérimentale comprenant plusieurs étapes successives :

- sélection de milieux adaptés à la culture, au laboratoire, de souches telluriques,

généralement réputées comme difficilement cultivables sur milieux synthétiques ;

- sélection des souches d’intérêt ;

- évaluation de leur potentiel biodégradant ;

- caractérisations phylogénétique et fonctionnelle des isolats retenus.

L’ensemble de ces données sera discuté, avec pour objectif la perspective d’une valorisation

biotechnologique possible des isolats présentant le plus fort potentiel de dégradation.

En outre, ce travail devrait s’inscrire dans une thématique de recherche plus fondamentale

visant à appréhender certains mécanismes évolutifs conduisant à l’adaptation des

microorganismes en réponse aux changements de leur environnement.

22

Première partie: Revue bibliographique

Première partie – Chapitre 1 : Sol et diversité microbienne

23

Chapitre1‐Soletdiversitémicrobienne

1- Contexte

Tous les pesticides épandus sur les surfaces agricoles ou plus généralement sur tout

type de sol, sont plus ou moins rapidement dégradés. La dégradation peut ainsi s’appuyer sur

des mécanismes biochimiques consistant essentiellement en des réactions d’hydrolyse,

d’oxydation, de réduction et de déshalogénation (Van der Meer et al., 1992 ; Castillo et

Tortensson, 2007). Ce processus est qualifié de dégradation biologique, catalysée par les

microorganismes telluriques plus ou moins spécifiques, en aérobiose ou anaérobiose, avec

formation de métabolites. Ce mécanisme est dans la majorité des cas quantitativement plus

important que la dégradation chimique des composés xénobiotiques (exception faite de

composés très récalcitrants, comme les polychlorobiphényles).

Nous présenterons ici les principales composantes de ce processus avant de nous attarder sur

un cas particulier de dégradation biologique, qualifié de biodégradation accélérée (BDA).

Cependant, dans un premier temps, il nous a semblé nécessaire de considérer le sol comme

une matrice présentant ses propres spécificités, et dont le rôle sera prépondérant dans les

processus de biodégradation des produits phytosanitaires.

La phénoménologie des pesticides dans le sol fait intervenir de nombreux facteurs parmi

lesquels figurent la nature chimique de la substance, la formulation appliquée, mais également

la nature du sol, sa texture, ses propriétés physico-chimiques, sa capacité de rétention, la

diversité des communautés microbiennes présentes, …

Notre travail s’est donc limité à décrire l’étude de la biodégradation de l’herbicide

sulcotrione ; nous avons donc souhaité présenter, dans cette partie bibliographique : (i) le sol

en tant que microhabitat, source de diversité microbienne, (ii) les méthodologies retenues

pour caractériser les microorganismes et leur action et, (iii) le rôle de cette microflore

tellurique largement impliquée dans la dégradation des produits phytosanitaires.


24

2- Composante microbienne du sol

Le sol est un micro-habitat pourvu d’importantes propriétés distinctives (cf figure I-1-

1) qui en font une matrice originale (Kuster et Hattori, 1973). En premier lieu, la population

microbienne y est très diversifiée. En prenant la taille du génome d'Escherichia coli comme

unité de référence, Torsvik et al. (1996) ont estimé la présence d'environ 6000 génomes

bactériens différents par gramme de sol. A titre d’exemple, la biomasse microbienne dans un

sol de prairie tempérée s'élève environ à 1 à 2 t.Ha-1 de biomasse bactérienne et à 2 à 5 t.Ha-1

de biomasse fongique (Killham, 1994).

Le sol est un système structuré, hétérogène et discontinu, généralement pauvre en

éléments nutritifs. Les sources de carbone et d'énergie disponibles pour les microorganismes

vivants sont relativement plus faibles que les concentrations optimales en éléments nutritifs

obtenues au laboratoire pour assurer la croissance microbienne sur milieux synthétiques

(Stotzky, 1961). Les caractéristiques chimiques, physiques et biologiques de ces micro-

habitats diffèrent également dans le temps et l'espace. La taille des habitats dépend

principalement de la nature des organismes qui s’y trouvent : quelques µm pour les bactéries,

moins de 100 µm pour les champignons et entre 100 µm et 2 mm pour les acariens et

collemboles et, enfin, entre 2 et 20 mm pour les isopodes (Coleman et Crossley, 1996). De

plus, même si l'espace disponible est vaste dans le sol, l'espace biologique, occupé par les

microorganismes vivants, représente une faible proportion, généralement inférieure à 5% de

l'espace total disponible (Ingham et Horton, 1987). Une autre particularité du sol est la

présence de zones d'activités biologiques accrues : les agrégats de sols, présentant des

propriétés physico-chimiques différentes selon leur origine (Sexstone et al., 1985) et riches en

particules organiques (Parkin, 1987 ; Petersen et al., 1996) et la rhizosphère (Lynch, 1994 ;

Morgan et al., 2005) sont les principaux représentants de ces zones biologiquement actives.

De plus, de nombreux facteurs environnementaux contrôlent cette vie microbienne : les

sources de carbone et d'énergie, les substances minérales présentes, les facteurs de croissance,

l'eau disponible ainsi que sa composition ionique, la température et la pression, l’oxygénation,

le pH, les potentiels d'oxydo-réduction sont autant de paramètres écologiques influençant la

croissance des populations microbiennes telluriques. Enfin, la nature des surfaces et les

interactions spatiales entre les micro-organismes jouent également un rôle fondamental. Selon

Hattori (1973), près de 80 à 90% des micro-organismes telluriques se trouvent sur des


25

surfaces solides. Huang et al. (1998) et Chen et al. (2006) ont montré que certaines cellules

bactériennes produisent des polysaccharides extracellulaires interagissant avec les particules

d'argile et que ces complexes argilo-polysaccharides peuvent persister même après la mort

des microorganismes. Ainsi, la majorité de la microflore vit libre ou attachée à des surfaces, et

se répartit dans les films liquidiens entourant les particules solides et à l’intérieur d'agrégats

(Stotzky, 1961).

La phase solide du sol adsorbe d'importantes molécules biologiques comme les

protéines et les acides nucléiques. De cette façon, certaines enzymes extracellulaires

adsorbées par les minéraux argileux ou piégées par les molécules d’acides humiques peuvent

maintenir leur activité biologique, et sont protégés contre la protéolyse, la dénaturation

thermique et les effets du pH (Nannipieri et al., 2003). Les acides nucléiques adsorbés ou

éventuellement liés à des molécules d’acides humiques ou à des particules d'argile et de sable

sont protégés contre la dégradation par les nucléases, rendant donc possible les processus de

transfert génétique horizontal (HGT) rencontrés au sein des populations microbiennes

telluriques, facteur important de la diversité génétique des populations microbiennes

telluriques (Lorenz et al., 1991 et 1994 ; Trevors et al., 1996 ; Paget et al., 1992;

Pietramellara et al., 2002).

Figure I-1-1 : Principales caractéristiques du sol en tant que microhabitat (d’après Nannipieri et al., 2003).


26

3- Diversité microbienne du sol La diversité microbienne est un terme général qui comprend la diversité génétique, (c’est-à-

dire la répartition des données génétiques au sein des espèces microbiennes), la diversité des

espèces (bactéries et de champignons dans les communautés microbiennes) et la diversité

écologique correspondant à la variation de la structure des communautés, la complexité des

interactions et le nombre de niveaux trophiques. La diversité microbienne peut être mesurée

par le nombre d’espèces différentes (richness) ainsi que leur abondance relative (evenness)

dans la microflore du sol (Kennedy et Smith, 1998). En ce qui concerne la diversité

bactérienne, il est généralement admis qu’elle est comprise entre 5 x 103 et 5 x 104 espèces par

gramme de sol pour des abondances pouvant varier de 108 à 1011 cellules par gramme de sol

(Kennedy et Papendick, 1995 ; Torsvik et al., 2002 ; Curtis et al., 2002 ; Roesch et al., 2007).

Accéder à cette diversité du sol peut globalement se résumer à l’utilisation de deux

approches : (i) les techniques non moléculaires, représentées par les méthodes traditionnelles

de microbiologie pasteurienne, faisant appel aux approches cultivables par l’utilisation de

divers milieux synthétiques utilisés en fonction des objectifs définis (milieux sélectifs ou non

et/ou différentiels) ou par des comptages in situ des échantillons à l’aide de marqueurs

spécifiques ; (ii) les techniques moléculaires faisant appel à la biologie moléculaire et/ou aux

méthodes biochimiques.

Première partie – Chapitre 2 : Méthodologies non moléculaires appliquées à lʼétude des souches bactériennes telluriques

27

Chapitre2‐Méthodologiesnonmoléculairesappliquéesàl’étudedessouchesbactériennestelluriques

Dans cette partie bibliographique, nous nous limiterons à décrire brièvement le principe des

méthodologies retenues au cours de notre travail de thèse.

1- Méthodes cultivables traditionnelles

La possibilité de cultiver des souches bactériennes telluriques au laboratoire est

fondamentale car elle contribue à mieux appréhender leurs propriétés et leurs capacités

fonctionnelles. Historiquement, les techniques cultivables appliquées à la microbiologie du

sol ont connu un essor important à la fin du 19ième siècle avec les travaux de Winogradsky

(caractérisation des microorganismes responsables de la nitrification dans le sol ; Van Elsas et

al., 2007) et de Beijerinck (obtention de cultures pures de Thiobacillus denitrificans par

enrichissements successifs). Les techniques par enrichissements sélectifs, fondées sur

l’utilisation de nutriments cibles et/ou d’inhibiteurs spécifiques, ont permis de mettre en

évidence un nombre important et croissant de groupes spécifiques de microorganismes du sol.

L’unique procédure d’énumération des souches microbiennes vivantes présentes dans

leur habitat naturel a été pendant très longtemps la technique du nombre le plus probable ou

Most-Probable-Number (Bakken, 1997; Johnsen et al., 2001). La découverte de nouveaux

groupes taxonomiques ou fonctionnels n’a été possible que par la sélection de souches

microbiennes à partir de milieux gélosés spécifiques et la diversité cultivable étudiée par

isolement de ces colonies, complétées par une identification par typage moléculaire

(Vandamme et al., 1996). Certains auteurs ont également évalué la diversité des micro-

organismes cultivables en suivant la chronologie d’apparition des différentes colonies

identifiées sur le milieu gélosé choisi (Ishikuri et Hattori, 1985). Néanmoins, étudier la

diversité microbienne du sol par ce type de méthodologie présente des limites, non seulement


28

parce que le nombre de micro-organismes cultivables sur milieux synthétiques est limité, mais

aussi parce que les procédures d’isolement sont très souvent extrêmement laborieuses. De

plus, ces techniques présentent une estimation biaisée de la diversité microbienne du sol.

Hugenholtz et al. (1998) et Hugenholtz (2002) rapportent que les microorganismes facilement

isolés représentent 0,1 à 1% de la totalité des espèces microbiennes du sol. A titre d’exemple,

pour un même échantillon de sol, le comptage in situ par microscopie à épifluorescence

permet de multiplier d’un facteur 100 à 1000 les résultats de dénombrements obtenus par les

techniques cultivables conventionnelles (Johnsen et al., 2001). Ce phénomène appelé « Great

Plate Count Anomaly » par Staley et Konopla (1985), a largement été décrit par de nombreux

microbiologistes du sol. En outre, ces microorganismes cultivables, bien que présentant une

diversité de genres et d’espèces, appartiennent très majoritairement aux quatre phyla

suivants (the big four) : Proteobacteries, Firmicutes, Actinobacteries et Bacteroidetes

(Hugenholtz, 2002). A titre d’exemple, la figure I-2-1, illustre ce « biais cultivable » (place

dominante des « big four ») décrit dans la banque « Australian Collection of

Microorganisms ».

Figure I-2-1 : Répartition des différents phyla (%) représentés dans la banque « Australian Collection of Microorganisms », après entrée en collection des isolats bactériens (Hugenholtz, 2002).


29

Ces données s’expliquent essentiellement par l'interdépendance trophique des

différents organismes présents dans un écosystème spécifique et à l'incapacité de créer, en

culture pure, les conditions environnementales rencontrées par les micro-organismes du sol.

Ainsi, seules certaines espèces microbiennes sont cultivables et uniquement sous certaines

conditions physiologiques (Bakken, 1997; Muyzer et Smalla, 1998; Heuer et al., 2001). De

nombreux auteurs ont en effet démontré que le choix du milieu de culture affecte

sensiblement les colonies formées (Sørheim et al., 1989; Johnsen et Nielsen, 1999). D’après

Bakken (1997), les cellules bactériennes de petites dimensions (ultramicrobactéries) ne sont

pas cultivables sur milieu gélosé car incapables de former des colonies en présence d’agar. En

considérant que les cellules de grandes dimensions occupent environ 80 % du volume total

dans lequel est confinée la totalité des bactéries telluriques, il a émis l’hypothèse que seules

ces dernières présentent une importance écologique majeure dans le sol.

Ce type de méthodologie demeure une approche fondamentale en écologie microbienne, mais

présente finalement des limites importantes d’accès à la diversité microbienne.

2- Méthodes cultivables innovantes

L’approche cultivable demeure une technique incontournable lorsque l’on souhaite

isoler et cultiver des souches microbiennes telluriques d’intérêt. De nouvelles méthodologies

alternatives sont aujourd’hui disponibles et laissent entrevoir des perspectives intéressantes

pour l’avenir. Globalement, ces technologies suivent trois stratégies distinctes mais

complémentaires (Keller et Zengler, 2004): (i) une amélioration des techniques cultivables

conventionnelles par optimisation des milieux synthétiques, (ii) une stimulation de la

croissance microbienne in situ par utilisation directe de l’échantillon environnemental comme

milieu de culture approprié, supplémenté ou non avec de faibles concentrations en nutriments

et, (iii) un développement de protocoles de cultures haut-débit accompagnées de système

haute résolution de détection de la croissance microbienne.

Ainsi, en jouant de façon synergique sur les divers paramètres contrôlant les étapes du

protocole d’isolement (sonication des particules de sol, faible concentration en nutriments,

pH, substitution de l’agar par de la gomme gellane, longue durée d’incubation et observation

minutieuse des colonies en développement sur la gélose), Janssen et al. (2002) ont pu isoler


30

pour la première fois de nouvelles souches bactériennes réparties dans différentes divisions

(Acidobacteria, Actinobacteria, Proteobacteria et Verrucomicrobia) et jusqu’alors décrites

seulement par des méthodes non cultivables.

L’utilisation de faibles concentrations de nutriments dans les milieux d’enrichissement peut se

révéler efficace pour isoler des souches à faible vitesse de croissance, généralement perdues

dans des milieux conventionnels au profit de celles à développement rapide (Connon et

Giovannoni, 2002). Le développement de certaines colonies sur milieux synthétiques peut

être excessivement lent et demander des semaines, voire des mois avant d’être observables à

l’œil nu (Harris et Paul, 1994 ; Davis et al., 2005 et 2011).

D’après des études relativement récentes (Janssen et al., 2002 ; Joseph et al., 2003 ; Sangwan

et al., 2005 ; Stevenson et al., 2004 ; Zengler, et al., 2002 ; Kaeberlein et al., 2002 ; Ferrari et

al., 2005 ; Davis et al., 2005, 2011 ; Sait et al., 2002 et 2006 ;Vartoukian et al., 2010), la mise

au point de nouveaux milieux de culture et le développement de techniques cultivables

innovantes permettent d’envisager de nouvelles perspectives d’isolement et d’entrée en

collection de souches microbiennes telluriques non cultivables sur milieux conventionnels.

Selon certains auteurs comme Nichols (2007) ou Ellis et al. (2003), il est donc nécessaire de

nuancer quelque peu le paradigme qui consistait à considérer la majorité des espèces

microbiennes présentes dans le sol comme étant non cultivables.

Première partie – Chapitre 3 : Méthodologies moléculaires appliquées à lʼétude des souches bactériennes telluriques

31

Chapitre3‐Méthodologiesmoléculairesappliquéesàl’étudedessouchesbactériennestelluriques

Les techniques moléculaires impliquent généralement l'extraction des acides

nucléiques (ADN ou ARN) issus des populations microbiennes de façon directe ou indirecte à

partir du sol. Elles sont indépendantes des méthodes cultivables et ont un pouvoir de

résolution variable qui peut généralement être ajusté en fonction des objectifs, de l’analyse

des grands groupes taxonomiques jusqu’à la mise en évidence d’espèces au sein

d’échantillons de sols. Nous nous limiterons à décrire les techniques utilisées dans le cadre de

notre étude.

1- Analyse des profils de restriction des ADNr 16S amplifiés (ARDRA)

Les travaux de Carl Woese (1987) ont véritablement révolutionné l’approche

taxonomique en microbiologie. Ils ont démontré que les séquences d’ADN ribosomaux

(ADNr) présentes sous forme d’opérons chez tous les microorganismes (leur nombre variant

environ de 1 à 15 copies par génome bactérien (Rainey et al., 1996) étaient des marqueurs

évolutifs relativement robustes, semblables à des « chronomètres », très utiles pour déchiffrer

la phylogénie et l’évolution des populations microbiennes au cours du temps (Woese, 1987).

Les ribosomes (cf figure I-3-1) sont formés de deux sous-unités (une grande sous-unité 50S et

une petite sous-unité 30S) comportant chacune des protéines ribosomales (31 et 21 protéines

respectivement) assemblées sur une matrice d'acides ribonucléiques (ARNr). Les ARN

ribosomiques (petite sous unité = ARNr 16S, grande sous-unité = ARNr 23S) se sont imposés

comme référence de taxonomie moléculaire car ils réunissent l'ensemble des qualités requises.

En premier lieu, ils sont un élément clé de la synthèse protéique, fonction très conservée car

indispensable à la vie de la cellule. Ensuite, ils ont une structure particulière faite d'une

succession de domaines dont les vitesses d'évolution sont très variables, de relativement

élevée à presque nulle et chacun de ces domaines a son importance pour l'identification

moléculaire des micro-organismes. Certaines parties sont identiques chez toutes les bactéries

et donc utilisables comme sites de complémentarité pour des amorces universelles de


32

séquences ou d'amplification (PCR). La comparaison des domaines conservés permet de

retracer les liens de parenté qui unissent des bactéries éloignées, tandis que les domaines à

vitesse d'évolution plus rapide permettent l'étude des relations phylogénétiques d'espèces plus

proches. D'autres parties de séquences sont propres à un groupe et permettent ainsi

l'identification de séquences dites signatures caractéristiques d'ordres taxonomiques différents

(espèce, genre, famille ou royaume). A titre d’exemple, Heuer et al. (1999) ont indiqué que 14

régions différentes de l'ADNr 16S (A, B, C, D, E, F, V1–V3 et V5–V9) ont pu être utilisées

pour générer des empreintes des communautés bactériennes.

Figure I-3-1 : (a) Agrandissement d’un ribosome chez une bactérie. (b) Modélisation tridimentionnelle du ribosome 70S composé de la grande sous-unité 50S (ARNr 5S + ARNr 23S + 31 protéines) et la petite sous-unité 30S (ARNr 16S + 21 protéines). (c) Exemple de repliement dans l’espace de l’ARNr 16S provenant de la petite sous-unité 30S du ribosome (Stern et al., 1988b). (d) Structure secondaire de l’ARNr 16S de Vibrio. parahaemolyticus X56580 présentant les quatre principales séquences provenant de différents isolats de Vibrio parahaemolyticus (Harth et al., 2007).


33

L’ARDRA consiste, après amplification par PCR d’une partie de la séquence du gène de

l’ADNr 16S, à analyser, après digestion enzymatique, les profils de restriction obtenus entre

différents échantillons d’ADNr 16S. Cette méthodologie est, d’une façon générale et quel que

soit le gène auquel elle est appliquée, appelée analyse du polymorphisme de longueur des

fragments de restriction ou RFLP (Restriction Fragment Length Polymorphism). En revanche,

lorsqu’elle est appliquée à des ADN ribosomaux (ADNr), on parle plutôt d’analyse de

restriction d’ADN ribosomaux amplifiés ou d’ARDRA. Cette technique a été reconnue

comme étant un outil d’analyse phylogénétique fiable et a donc été largement utilisée dans de

nombreuses études taxonomiques sur divers microorganismes cultivables ou non cultivables,

issus de différents échantillons environnementaux (Vaneechoutte et al., 1992, 1993;

Martinez-Murcia et al., 1995). Les travaux de Moyer et al. (1994) ont démontré que

l’utilisation de 2 endonucléases reconnaissant des sites de restriction à 4 nucléotides

permettait de discriminer la majeure partie des ADNr 16S présents au sein d’un mélange

complexe, en révélant le polymorphisme de séquence de l’opéron ribosomique bactérien

(Massol-Deya et al., 1995). Il est communément admis que l’ARDRA permet de différencier

des échantillons jusqu’au niveau du genre bactérien (Martin-Laurent et al., 2001). Toutefois,

il est faut être très prudent dans l'interprétation de la composition des communautés

microbiennes car la méthode d'extraction des ADN peut influencer les résultats obtenus

(Martin-Laurent et al., 2001).

2- Amplification PCR des séquences répétitives (REP-PCR)

L’amplification des séquences répétitives (REP-PCR), permet l’amplification, par la

réaction de polymérisation en chaine (PCR), de fragments d’ADN de tailles différentes

(amplicons) constitutifs de séquences extragéniques (non codantes) répétitives et

palindromiques présentes dans de nombreux génomes microbiens. Les séquences REP,

comprises à l’intérieur de séquences non traduites des opérons bactériens, ont été décrites

comme étant vraisemblablement des éléments génétiques régulateurs potentiels, (Townsend et

al., 1997) intervenant notamment dans leur capacité à former des structures stables en boucles

lors du processus de transcription. Dès 1984, les premières séquences REP ont été mises en

évidence chez Escherichia coli et Salmonella typhimurium par Stern et al. (1984). Ces


34

éléments palindromiques, constitués de séquences consensus conservées (environ 38 paires de

bases), pouvant former une structure stable sous forme de boucle avec une région centrale

variable d’environ 5 paires de bases, sont largement présents dans les génomes de la plupart

des genres bactériens. Les séquences REP ont donc été utilisées comme amorces pour

l'amplification par PCR de régions de l'ADN génomique bactérien (de Bruijn, 1992). Ainsi,

lors de la réaction, les amorces utilisées se fixent sur plusieurs séquences d’ADN réparties

dans tout le génome des microorganismes. Plusieurs fragments amplifiés, hautement

spécifiques et de différentes longueurs sont donc ainsi facilement obtenus et séparés par

électrophorèse sur gel d’agarose. Le principe de cette technique est présenté figure I-3-2.

En écologie microbienne moléculaire, la présence des éléments REP dans la grande majorité

des génomes des Eubactéries présente une approche d’investigation moléculaire relativement

utile dans la caractérisation d’échantillons environnementaux. Cette méthodologie de travail

permet (i) de rendre compte de la variabilité de l'ensemble du génome bactérien (Versalovic et

al., 1991), (ii) d'analyser les génomes ou de différencier des souches bactériennes appartenant

à des groupes phylogénétiquement très proches pouvant aller jusqu’au niveau de l’espèce,

(iii) de rendre compte de la dispersion des séquences REP caractéristiques de chaque souche

bactérienne (Menna et al., 2009) et, enfin, (iiii) de réaliser une analyse de la diversité

génotypique plus fine que par la technique de l’ ARDRA. (Frey et al., 1996).

Figure I-3-2 : Principe de la REP-PCR


35

3- Séquençage des ADNr 16S et Analyse phylogénétique 3-1- Principe général

La systématique peut être définie comme une nomenclature hiérarchisée des

organismes vivants, lié à la théorie de l’évolution, et dont l’objectif principal est d’assurer une

classification des espèces s’appuyant sur les relations phylogénétiques (Harayama et Kasai,

2006). L’espèce constitue l’unité taxonomique fondamentale. Wayne et al. (1987) ont proposé

une définition de l’espèce microbienne s’appuyant sur les propriétés de dénaturation et de

renaturation de l’ADN génomique. Ainsi, les valeurs d’hybridation ADN-ADN entre deux

souches supérieures ou égales à 70 %, accompagnées de valeurs de ∆Tm inférieures ou égales

à 5°C, constituent des bornes raisonnables et acceptables de définition de l’espèce

microbienne. Néanmoins, certains auteurs ont pu mettre en évidence que cette méthodologie

présentait certains biais (Stackebrandt et Goebel, 1994 ; Vandamme et al., 1996). En outre,

Rossello-Mora et Amann (2001) ont montré que pour décrire de nouvelles espèces

microbiennes, une approche polyphasique intégrant des données à la fois génotypiques et

phénotypiques s’avérait nécessaire. Les spécialistes de la systématique bactérienne n’ont donc

pas encore totalement trouvé de consensus satisfaisant pour définir sensu stricto le terme

d’espèce (Cohan, 2002). En effet, donner une définition de l’espèce bactérienne applicable à

tous les microorganismes semble difficile, aucun critère de classification phylogénétique

n’étant suffisamment discriminant, stable et universel (Stackebrandt, 2003).

Malgré les biais inhérents à chaque méthode, l’étude de l’hybridation ADN-ADN associée à

l’analyse des séquences d’ADNr 16S constitue une méthodologie très largement admise par

les microbiologistes pour discerner les souches microbiennes étroitement apparentées.

Historiquement, le début des phylogénies moléculaires basées sur l’analyse comparée

de séquences remonte aux années 60, avec les travaux de Zucklerkandl et Pauling (1965) et

Fitch et Margoliash (1967) sur les séquences protéiques de cytochrome c et de globines.

Dans le cadre de notre étude, l’analyse phylogénétique s’est appuyée sur le séquençage des

ADNr 16S (Woese et al., 1990). Cette procédure s’est déroulée en plusieurs étapes

consécutives : (i) amplification des séquences d’ADNr 16S (environ 1500 paires de bases) à

partir d’amorces universelles de la division Bacteria, (ii) séquençage, (iii) édition et

alignement des séquences obtenues par comparaison avec des séquences de références


36

présentes dans les bases de données internationales, (iiii) estimation des distances évolutives

entre les séquences concernées par application de modèles évolutifs et enfin, (iiiii)

construction d’un arbre phylogénétique à partir des distances évaluées précédemment par

l’application d’un algorithme associé à une analyse statistique afin de tester la robustesse de

l’arbre retenu.

Il nous a semblé opportun, dans cette partie bibliographique, de rappeler le principe général

des méthodologies de l’après-séquençage nécessaires à l’exploitation des données

génomiques.

3-2- Méthode d’alignement

Pour construire un arbre à partir de séquences nucléotidiques, il faut tout d'abord éditer

ces séquences afin d’en éliminer le début et de la fin (baisse de qualité, donc de confiance),

d’identifier et d’éliminer les pics parasites (à géométrie irrégulière) et les fragments du

vecteur de clonage. Il s’agit également de corriger les ambiguïtés dues à des superpositions de

pics insuffisamment discriminés par le programme et assurer manuellement une correction

des erreurs.

L’alignement consiste à faire correspondre les positions dans la séquence ayant une origine

commune avec les autres séquences disponibles. Cette étape permet de mettre en regard des

nucléotides homologues présents dans les séquences d’ADNr 16S. Le travail d’alignement est

particulièrement délicat à réaliser, et, même s’il existe des logiciels adaptés, les alignements

nécessitent d’être très souvent réajustés manuellement. Deux nucléotides pourront être

homologues et informatifs pour deux espèces proches alors qu’ils ne le seront pas pour deux

espèces lointaines. En outre, les phénomènes d’homoplasie (similarité ne dérivant pas d’un

caractère ancestral) compliquent l’analyse des séquences dans les zones hypervariables. Les

homoplasies sont consécutives à des évènements de type réversion (changement dans une

séquence annulé par un second changement G→ C→G), parallélisme (changements parallèles

dans deux séquences conduisant à des nucléotides identiques) ou convergence (séquences

ancestrales différentes qui évoluent vers des séquences identiques).

En fonction des séquences à analyser, il convient donc de déterminer quelles sont les

positions informatives et de délimiter les zones réellement comparables. Pour évaluer la

confiance que l’on peut avoir dans un alignement, il est possible de s’assurer que les


37

séquences signatures d’un groupe phylogénétique sont bien en regard les unes des autres.

L’analyse des structures secondaires s’avère, également, très souvent nécessaire.

3-3- Reconstruction des arbres phylogénétiques

La phylogénie moléculaire a pour objectif de retrouver les liens de parenté entre des

séquences de nucléotides. Ces relations de parenté sont généralement représentées sous forme

d’arbre, composé de branches et de nœuds, les branches connectant les nœuds eux-mêmes

définis comme des points au niveau desquels deux branches ou plus divergent. Les branches

et les nœuds peuvent être internes ou externes. Dans le cas d’un arbre de gènes, un nœud

interne correspond à la séquence ancestrale hypothétique avant le ou les évènements de

duplications qui ont donné naissance aux séquences actuelles. Les nœuds terminaux

(également dénommés « Operational Taxonomic Units » ou OTU) correspondent aux

séquences à partir desquelles l’arbre a été construit. Les branches définissent les relations de

parenté entre les différents nœuds. Un nœud interne et l’ensemble des OTU qui en dérivent

forment un groupe monophylétique ou clade. Un groupe incluant un nœud interne et une

partie seulement des OTU qui en dérivent est appelé groupe paraphylétique. Enfin, un groupe

rassemblant des OTU n’ayant pas de nœud interne qui leur est spécifique est appelé groupe

polyphylétique.

L’arbre phylogénétique peut être enraciné ou pas. La racine constitue l’ancêtre commun de

toutes les OTU représentées dans l’arbre. La direction entre la racine et les différentes OTU

représente le temps évolutif. Dans un arbre non enraciné, seules les relations entre les

différentes OTU sont représentées.

Il existe différentes méthodes pour calculer des arbres phylogénétiques à partir d’alignements

multiples de séquences. Ces méthodes sont généralement regroupées en trois catégories : (i)

les méthodes de distance, (ii) les méthodes de maximum de parcimonie et (iii) les méthodes

probabilistes.

Les méthodes de distance sont les plus simples et les plus rapides à mettre en oeuvre. Elles

sont basées sur l’utilisation d’une matrice où sont consignées les distances calculées pour

toutes les combinaisons deux par deux des séquences analysées. Des algorithmes de calculs


38

sont ensuite utilisés pour déduire, à partir de la matrice de distance, les relations

phylogénétiques des OTU. Dans la méthode de distance, la longueur des branches sera

proportionnelle à la distance. A côté de la méthode UPGMA « Unweighted Pair Group

Method with Arithmetic mean » (Sneath et Sokal , 1973) et de la méthode de Fitch-

Margoliash (1967), nous avons utilisé la méthode de Neighbor-Joining (Saitou et Nei, 1987).

Cette méthodologie consiste à regrouper les séquences les plus similaires entre elles (c’est-à-

dire ayant une distance faible), ce regroupement se faisant par étapes, avec comme contrainte

principale de minimiser la longueur totale de l’arbre. Cette méthode donnera toujours un seul

arbre pour une matrice de distance donnée.

Le principe des méthodes de maximum de parcimonie est basé sur l’identification, parmi

tous les arbres phylogénétiques possibles, de celui qui demande le plus petit nombre de

modifications évolutives (« pas évolutifs ») pour expliquer les différences observées entre les

séquences ou OTU qui sont étudiées. La longueur des branches des arbres obtenus sera

proportionnelle au nombre de modifications évolutives requises pour passer d’un nœud à

l’autre.

Les principales différences avec la méthode de distance sont : (i) la totalité des sites de la

séquence n’est pas utilisé mais seuls les sites dits informatifs (c’est-à-dire ceux qui vont

tendre à favoriser un ou plusieurs arbres par rapport aux autres) sont pris en compte, (ii)

plusieurs arbres phylogénétiques sont possibles avec cette méthode de reconstruction.

Si la construction de l’arbre est effectuée dans le cadre d’une analyse cladistique, seront

considérés comme informatifs uniquement les sites où plusieurs OTU partagent un état

dérivé. En pratique, dès qu’il y a plusieurs OTU et un nombre de sites importants, la

construction nécessite un équipement informatique performant car le nombre d’arbres

possible augmente de manière exponentielle avec le nombre d’OTU. Il arrive donc très

souvent qu’il soit impossible d’estimer tous les arbres. La solution alternative est

généralement d’utiliser des approches « heuristiques » qui ne vont explorer qu’une partie des

arbres possibles : il s’agit généralement de partir d’un arbre choisi aléatoirement et de le

modifier tout aussi aléatoirement. Le nombre de pas évolutif est à chaque fois calculé pour

chaque arbre obtenu. L’analyse se perpétue tant que l’on obtient des arbres plus parcimonieux

que les précédents.


39

La méthode de maximum de parcimonie permet ainsi d’obtenir plusieurs arbres

équiparcimonieux possibles, ne diffèrant généralement les uns des autres que par quelques

nœuds. La construction d’un arbre consensus s’avère donc nécessaire.

Parmi les méthodes probabilistes, la méthode de maximum de vraisemblance ou

« Maximum of Likelihood » (Felsentein, 1973) est généralement la plus utilisée. Elle s’appuie

sur l’utilisation de modèles d’évolution, c’est-à-dire un ensemble d’hypothèses traduisant les

processus d’évolution possibles des séquences concernées. Par exemple, le principe est de

proposer des algorithmes donnant les probabilités de changement d’un nucléotide vers un

autre, différentes pour les transitions (substitution d’un nucléotide comportant une purine par

un autre nucléotide comportant également une purine ou substitution d’un nucléotide

comportant une pyrimidine par un autre nucléotide comportant également une pyrimidine) et

les transversions (susbtitution d’un nucléotide comportant une purine par un nucléotide

comportant une pyrimidine ou inversement). Cette modélisation va estimer la probabilité de

réaliser l’alignement de séquences en fonction de différentes hypothèses. Cette probabilité est

appelée la vraisemblance. La méthode de maximum de vraisemblance va donc consister à

retenir, parmi un ensemble d’arbres possibles, celui dans lequel la vraisemblance est

maximale. L’arbre retenu dans ce cas, est considéré comme la représentation phylogénétique

la plus plausible, étant donné le modèle d’évolution utilisé. La limitation principale des

méthodes probabilistes est le temps de calcul nécessaire à trouver l’arbre maximisant la

vraisemblance. En outre, cette méthodologie implique également d’utiliser le modèle

d’évolution le plus proche de la réalité.

3-4- Estimation de la robustesse des arbres

Toutes les méthodes d’analyse phylogénétique possèdent des avantages et des

inconvénients car aucune n’incorpore véritablement tous les aspects des mécanismes

biologiques de l’évolution des séquences. Ainsi, aucune méthode probabiliste disponible n’est

donc susceptible de fournir un arbre phylogénétique « vrai ». Généralement, seules les

branches des arbres retrouvées par les trois méthodes (Neighbor-Joining, maximum de

parcimonie et maximum de vraisemblance) sont susceptibles de s’approcher de la réalité

(Huelsenbeck et Hillis, 1993).


40

Néanmoins, d’autres méthodes d’évaluation sont possibles. C’est le cas de l’analyse en

boostrap (Felsenstein, 1985 ; Felsenstein et Kishino, 1993). C’est la méthode la plus souvent

utilisée pour tester la fiabilité des branches internes de l’arbre. Elle consiste à effectuer un

tirage aléatoire des sites au hasard avec remise.

Cette opération est effectuée entre 100 (pour les arbres de maximum de parcimonie ou de

maximum de vraisemblance) et 1000 fois (arbres de distances) et un arbre est proposé pour

chaque échantillonnage. Les différentes topologies d’arbres sont ensuite comparées et

compilées en un arbre consensus, présentant un pourcentage de robustesse attribué à chacun

des nœuds de l’arbre en fonction du nombre de fois où celui-ci a été retrouvé à cette position.

En pratique, seules les branches définies par une valeur supérieure à 90 % sont considérées

comme fiables.

C’est cette méthode que nous avons retenue dans notre travail de caractérisation des souches

d’intérêt.

Première partie – Chapitre 4 : Dégradation biologique des produits phytosanitaires dans les sols

41

Chapitre4‐Dégradationbiologiquedesproduitsphytosanitairesdanslessols

1- Dégradation biologique et récalcitrance moléculaire

Les microorganismes assurent une fonction essentielle du sol grâce à leur grande

diversité (Topp, 2003). Cette diversité des communautés microbiennes telluriques jouerait un

rôle important dans la dégradation des pesticides (Entry et Emmingham, 1995 ; Voos et

Groffman, 1997). Cependant, d’autres auteurs ont également observé une forte corrélation

entre la quantité de biomasse d’un sol ou l’activité microbienne et la dégradation des

pesticides (Anderson, 1984 ; Walker et Welch, 1989 ; Wardle et Parkinson, 1991 ; Flint et

Witt, 1997; Walker et al., 2001 ; de Lipthay et al., 2007). Une des conditions fondamentales à

la dégradation biologique est la présence d’accepteurs d’électrons. Dans les systèmes

aérobies, l’accepteur final d’électrons est l’oxygène moléculaire (Castillo et Tortensson,

2007) alors qu’en conditions anaérobies, les accepteurs d’électrons inorganiques sont très

majoritairement le NO3-, SO4

2-, S, CO2 ou Fe3+. Les premières étapes de la dégradation

provoquent les transformations de la structure moléculaire du pesticide avec l’apparition de

métabolites pouvant, dans certains cas, être plus toxiques que la molécule mère. La

minéralisation de la substance active, avec la transformation du carbone organique en CO2 est

le processus ultime. Il n’y a pas de relation univoque entre la stabilité chimique d’une

molécule et sa stabilité biologique.

Les réactions de transformation ou de dégradation des pesticides par les populations

microbiennes telluriques sont essentiellement des réactions d’oxydation, de réduction et

d’hydrolyse. Les réactions d’oxydation sont majoritairement représentées par les mécanismes

d’hydroxylation, déalkylation, époxydation et sulfoxydation. Ces systèmes réactionnels sont

généralement catalysés par les familles d’enzymes suivantes : les mono et di-oxygénases, les

laccases et les peroxydases. Les microorganismes ont la possibilité de dégrader les polluants

aromatiques par ortho ou méta clivage. La position des substituants a également un impact

important sur la biodégradation de la molécule (Baker et Woods, 1977, Baker et Mayfield,

1980). Outre la récalcitrance propre à la molécule, les processus de dégradation biologique


42

dépendent également de nombreux facteurs physiques, chimiques et physiologiques dont le

degré d’importance varie selon l’environnement (Alexander, 1994).

Cependant, les polluants présentant une structure chimique électroniquement stable ou ayant

de nombreux substituants halogénés sont généralement les plus difficiles à dégrader (Sims et

al., 1986 ; Goulding et al., 1988 ; Scheneurt et al., 1993). Dans ce cas, la stratégie

communément retenue par la microflore peut consister en l’introduction de groupes polaires

qui ont pour effet d’accroître le caractère hydrophile et de faciliter ainsi leur dégradation

ultérieure.

2- Inductions enzymatiques et adaptions microbiennes

La biodégradation d’un pesticide dans le sol suppose que les microorganismes

présents soient capables de mobiliser des fonctions catalytiques appropriées. La spécificité

enzymatique, parfois étroite, est rarement absolue (Soulas, 1990). Ainsi, la biodégradation

d’un grand nombre de composés chimiques de synthèse est très souvent accomplie par des

voies métaboliques préexistantes qui permettent aux microorganismes d’utiliser des substrats

naturels. Cette prédisposition enzymatique reposerait sur la similitude de certains composés

naturels d’origine végétale avec certaines molécules phytosanitaires, appelées molécules

analogues (Alexander, 1994). L’attaque du xénobiotique a donc un caractère fortuit

(Knackmus, 1981 ; Slater, 1984) et peut s’opérer jusqu’à un stade avancé qui peut aller

jusqu’à la minéralisation complète (Schmidt et al., 1987). En outre, certains auteurs (Parales

et al., 2002 ; Pandey et Jain, 2002) précisent que l’induction enzymatique s’accompagnerait

d’une aptitude chimiotactique des microorganismes. Pour autant, cette analogie structurale

n’est pas la seule explication possible du phénomène de biodégradation et le cas des acides

phénoxyacétiques en constitue un contre-exemple (Soulas, 1990). De plus, parler

véritablement d’adaptation microbienne vis-à-vis d’un xénobiotique donné présuppose la

mise en place d’évènements génétiques affectant des régulations ou des activités

enzymatiques (Soulas, 1990). Ainsi, certains auteurs ont mis en évidence que l’expression des

gènes codant pour la catalyse de ces molécules est étroitement liée à la concentration du

pesticide (Alexander, 1985 ; Fomsgaard et Kristenssen, 1999 ; de Lipthay et al., 2007). Dans

le cas de sols n’ayant jamais été exposés à un xénobiotique ou dans des horizons profonds


43

(Fomsgaard et Kristenssen, 1999), il est nécessaire d’avoir une certaine concentration afin que

le xénobiotique soit accepté en tant que substrat pour microflore.

Il existe également des systèmes enzymatiques spécialisés traduisant l’existence d’adaptations

génétiques organisées en structures simples ou polycistroniques (opérons) et codant pour des

enzymes spécifiques au sein d’une voie de biodégradation responsable d’un métabolisme

direct (Dick et Quinn, 1995 ; Mandelbaum et al.,1995 ; Sorensen et al., 2001). La sélection de

telles adaptations est guidée par le résultat du bilan entre le coût de la synthèse d’enzymes

spécialisées et le gain énergétique procuré par la dégradation du xénobiotique, sans oublier

pour autant l’avantage sélectif procuré par ce réarrangement en réponse aux pressions

environnementales subies par les communautés microbiennes (Garcia-Gonzales et al., 2003 ;

Rhine et al., 2003 ; Sims, 2006). Citons dans ce cas l’exemple de la dégradation de l’acide

2,4-dichloro-phénoxyacétique ou 2,4-D (Streber et al., 1987), de l’atrazine (de Souza et al.,

1996), des urées substituées (Turnbull et al., 2001 ; El Sebaï et al., 2004 ; Hussain et al.,

2009) comme des illustrations de ce phénomène adaptatif.

Globalement, trois mécanismes fondamentaux peuvent décrire de façon satisfaisante

ce mécanisme adaptatif des populations microbiennes : (i) soit une mutation des gènes

régulateurs contrôlant la transcription des gènes structuraux pouvant amener à une production

continue d’enzymes correspondantes à un niveau élevé, (ii) soit une amplification des gènes

structuraux aboutissant à l’existence, dans le génome microbien, de plusieurs copies d’un

même gène ou d’un ensemble de gènes responsables, par effet additifs, à des concentrations

enzymatiques suffisantes pour que la transformation d’une molécule de xénobiotique

devienne possible, (iii) soit l’apparition de mutations ponctuelles des gènes structuraux

précédée d’une amplification du ou des gènes correspondants, à l’origine de la production de

protéines enzymatiques dotées de fonctions catalytiques nouvelles ou améliorées (Soulas,

1990). L’évolution indépendante des différentes copies du gène peut ainsi permettre le

maintien de la fonction métabolique ancienne et la mise en place puis la spécialisation

progressive de fonctions métaboliques nouvelles.

Dès lors qu’une fonction nouvelle est apparue, sa dispersion au sein d’une population

microbienne emprunte classiquement les voies de reproduction sexuée (appariement


44

chromosomique et recombinaison) et parasexuée (transformation, transduction généralisée et

conjugaison). Ainsi, ces mécanismes adaptatifs s’appuieraient sur l’existence d’éléments

génétiques mobiles présents au sein des communautés microbiennes. Ces structures

génétiques, représentées par les plasmides, les transposons, les intégrons, les ilots génomiques

ainsi que par les bactériophages, sont également collectivement reconnues comme des

vecteurs responsables du transfert génétique horizontal (HGT), jouant un rôle fondamental

dans la dégradation des pesticides. Ces groupes de gènes, à forte mobilité, sont définis comme

étant des éléments relativement flexibles pouvant s’intégrer avec plus ou moins de facilité

dans les génomes des bactéries hôtes (Funchain et al., 2001 ; Frost et al., 2005).

Trois mécanismes moléculaires principaux contrôlent ce transfert génétique horizontal

(HGT) dans le sol : la transformation, la transduction et le mécanisme de conjugaison. La

transformation est un processus physiologique d’absorption d’un fragment d’ADN extra-

cellulaire (plasmide ou partie du chromosome bactérien) à l’intérieur de cellules dites

compétentes, qui requiert ou non la présence de séquences spécifiques (séquences

d’absorption) dans le fragment d’ADN transféré pour qu’il soit retrouvé dans le cytoplasme

de la cellule hôte (Lorenz et Wackernagel, 1994 ; Trevors, 1996 ; Thomas et Nielsen, 2005).

Le mécanisme de transduction est un processus dans lequel un fragment d’ADN pris au

hasard dans le génome d’une bactérie et provenant soit d’une cellule hôte préalablement

infectée par un bactériophage (transduction généralisée), soit d’une séquence d’ADN d’un

hôte flanquée de deux séquences d’insertion ayant préalablement intégré de l’ADN de

bactériophage excisé (transduction spécialisée), se retrouve encapsidé pour constituer de

nouvelles particules phagiques (Ochman et al., 2000 ; Ochman, 2005). De nombreuses études

ont récemment suggéré que les fréquences de transduction dans le sol sont largement sous-

estimées et que de nombreuses populations de bactériophages se trouvent dans cette matrice.

(Ashelford et al., 2000). Enfin, la conjugaison bactérienne, processus de transfert génétique

qui semble être largement majoritaire dans le sol (Burrus et Waldor, 2004), est un mécanisme

contact-dépendant où le transfert d’un fragment d’ADN se fait d’une cellule donneuse vers

une cellule hôte pour la majorité des genres bactériens (Davison, 1999). Enfin, la présence de

séquences spécifiques codant pour le contrôle de leur transfert, lors des mécanismes de

conjugaison ou de transduction, confèrent aux éléments génétiques mobiles une fréquence de

transfert plus élevée et une stabilité supérieure dans les génomes des cellules hôtes,


45

comparativement aux fragments d’ADN reçus par le mécanisme de transformation (Burrus et

Waldor, 2004). La figure I-4-1 présente les principaux mécanismes moléculaires impliqués

dans le transfert génétique horizontal (HGT).

Figure I-4-1 : Principaux mécanismes moléculaires intervenant dans le transfert génétique horizontal (HGT), d’après Zaneveld et al. (2008) 3- Aspects cinétiques de la dégradation biologique : Métabolisme direct et co-métabolisme.

Les microorganismes responsables de la dégradation d’un pesticide sont généralement

regroupés en deux catégories : ceux qui disposent de l’intégralité des enzymes pour

transformer le substrat (acide 2,4,5-trichlorophénoxyacétique, par exemple) par les voies du

métabolisme central (Kilbane et al., 1983), et ceux dont l’équipement enzymatique est

incomplet pour mener à terme la dégradation de la molécule (Baker et Woods, 1977 ;

Horvath, 1972 ; Dalton et al., 1982 ; Anderson, 2002).


46

Dans le premier cas, on parle de métabolisme direct. Le composé organique est utilisé

par les microorganismes comme source de carbone et d’énergie à des fins de croissance. Le

stade ultime correspond à une minéralisation du composé organique (acide 2,4-

dichlorophénoxyacétique, atrazine, isoproturon, organophosphorés…) se traduisant

généralement par l’apparition de CO2, d’H2O et/ou de sels inorganiques. Dans la plupart des

cas, ce processus de dégradation n’entraîne pas l’accumulation de métabolites. La courbe de

dégradation est caractérisée par une période de latence suivie d’une phase exponentielle

d’accélération (Soulas, 1990 ; Radosevitch et al., 1995 ; El Sebaï, 2004 ; …). La vitesse de

minéralisation du produit phytosanitaire augmente avec la répétition de son application. La

cinétique de dégradation est sous la dépendance de différents paramètres : (i) les facteurs

climatiques, (ii) la taille initiale de la microflore dégradante, (iii) la dose de pesticide

appliquée, (iiii) la fréquence et le nombre des apports du produit phytosanitaire. Ainsi, ce

processus de dégradation va tendre vers la sélection et le développement progressif d’une

communauté microbienne tellurique dégradante susceptible d’entraîner une biodégradation

accélérée (BDA).

Dans le second cas, la transformation partielle de la substance active ne permet pas de

récupérer l’énergie nécessaire à la croissance des souches microbiennes. On parle alors de co-

métabolisme. La dégradation ultime de la molécule nécessite la présence d’un consortium

microbien composé par des populations spécialisées chacune dans une étape métabolique bien

spécifique (Daughton et Hsieh, 1977 ; Soulas, 1990). Cette complémentarité métabolique des

voies de dégradation entre les différents microorganismes du consortium pourrait s’expliquer

par l’utilisation en cascade des métabolites produits lors des étapes de dégradation successives

(Soulas, 1990 ; de Souza et al. 1998 ; Pelz et al., 1999 ; Smith et al., 2003a, 2003b).

Cependant, ces mécanismes restent bien souvent partiels et entraînent une accumulation de

produits de dégradation qui peuvent être à leur tour transformés ou stabilisés en résidus liés

(Horvath, 1972). Dans certains cas, les métabolites produits peuvent être plus toxiques et plus

mobiles que le produit phytosanitaire dont ils sont issus (Somasundaram et Coats, 1990). Les

microorganismes participant à ce type de dégradation biologique ont nécessairement besoin

d’oxyder d’autres sources de carbone pour se développer. La matière organique, présente sous

différentes formes dans les sols, est souvent utilisée comme co-substrat (Houot et al., 1998).


47

De plus, les microorganismes dotés d’enzymes à large spectre d’activité (champignons par

exemple) sont souvent impliqués dans ce type de processus métabolique.

Différentes hypothèses peuvent être avancées pour expliquer la dégradation dite co-

métabolique : (i) soit les micro-organismes ne possèdent pas toutes les enzymes nécessaires à

l’ensemble des étapes métaboliques, (ii) soit les enzymes présentes sont peu efficaces vis-à-

vis du substrat, (iii) soit un métabolite présente une toxicité particulière et son accumulation

nuit au fonctionnement métabolique et éventuellement à la viabilité de la cellule microbienne

(Janke et Fritsche, 1985). Dans ce cas, la courbe de dégradation s’apparente à une

transformation chimique catalysée sans point d’inflexion. Ainsi, l’absence de croissance des

populations responsables de la dégradation, jointe à leur faible taille, fait du co-métabolisme

une voie lente de dégradation dont la vitesse n’augmente pas au cours du temps (Soulas,

1990). Il s’agit là d’une caractéristique cinétique essentielle des transformations co-

métaboliques. La plupart des produits phytosanitaires sont dégradés par voie ce type de voie

co-métabolique.

4- Cas particulier de dégradation biologique : la biodégradation accélérée (BDA) des pesticides 4-1- Contexte et définition

La biodégradation accélérée (BDA) des pesticides correspond à la diminution de la

persistance et, quelques fois, de l’efficacité agronomique d’un produit phytosanitaire,

consécutivement à des applications répétées dans une parcelle agricole (Suett, 1987 ; Suett et

Jukes, 1988 ; Suett et al., 1993 ; Arbeli et al., 2007). D’après Rouchaud et al., (1996, 1997 et

2000) ce phénomène est une des conséquences majeures de la structure et de l’évolution des

populations microbiennes impliquées dans la dégradation des pesticides. Le produit

phytosanitaire est dans ce cas utilisé comme source de nutriments et/ou d’énergie par un

nombre restreint de microorganismes adaptés conduisant à la sélection progressive de

populations microbiennes telluriques. Audus (1949) fut le premier auteur à parfaitement

décrire ce phénomène en travaillant sur la dégradation du 2,4-D. En effet, il mit en évidence

la corrélation existant entre les effets de la répétition des traitements et la vitesse de

dégradation de ce pesticide. Ces travaux ont été confirmés par de nombreuses études sur


48

d’autres familles phytosanitaires : carbamates (Felsot et al., 1981 ; Racke et Coats, 1988a),

organophosphorés (Racke et Coats, 1988b ; Chung et Ou, 1996), s-triazines (Barriuso et

Houot, 1996 ; Puissemier et al., 1997 ; Radosevich et al. ; 1995 ; Mandelbaum et al., 1995 ;

Yassir et al., 1999 ; Topp et al., 2000) et urées substituées notamment (Walker et Welch,

1991 ; Cox et al., 1996 ; Sorensen et al., 2001 ; El Sebaï et al., 2004 ; Sorensen et Aamand,

2003 ; Sorensen et al., 2003). Ces données ont suggéré la nécessité de prendre en compte le

risque potentiel d’adaptation des sols face aux traitements répétés de pesticides. En effet, d’un

point de vue agronomique, la BDA est un facteur limitant l’efficacité des produits

phytosanitaires puisqu’ils sont rapidement dégradés par la microflore tellurique. En revanche,

la mise en place d’une BDA au sein d’un parcelle agricole impacte positivement

l’environnement, puisque ce phénomène adaptatif peut limiter la persistance et le transfert des

produits phytosanitaires du sol vers les autres compartiments.

4-2- Mécanismes responsables de la biodégradation accélérée

L’origine du mécanisme est liée à l’activité de la biomasse microbienne du sol

(Chapman et Harris, 1990). Le schéma général est toujours identique : la première application

d’un produit phytosanitaire dans une parcelle agricole se traduit par une dégradation de la

substance active après une période plus ou moins longue selon la nature du produit, appelée

période de latence. Cette première phase correspond à l’induction enzymatique pouvant

s’expliquer par une adaptation physiologique et/ou génétique des populations microbiennes

concernées. Au cours d’une deuxième phase, la dégradation de la substance active se traduit

très souvent par une décroissance exponentielle de la concentration résiduelle. Cette phase

n’est réellement mesurable qu’à la seule condition d’avoir une densité cellulaire suffisante. Si

l’application du même produit est successivement répétée un grand nombre de fois, la

présence d’une très forte densité de souches microbiennes adaptées entraine une diminution,

voire une suppression de la phase de latence. Dans ce cas, au sein de ces sols dits « adaptés »,

80 % du produit phytosanitaire appliqué peut ainsi être rapidement biodégradé en moins de 15

jours (Devers, 2008). Ce potentiel dégradant d’un sol adapté à la substance active peut se

maintenir sur des périodes allant de quelques semaines à plusieurs années après l’arrêt total

des traitements (Roeth, 1986 ; Walker et Welch, 1991 ; Parekh et al., 1992 ; Anderson et


49

Lafuerza, 1992 ; Suett et al., 1993 ; Smelt et al., 1996 ; Morel-Chevillet, 1998). La disparition

de cette capacité catabolique peut résulter de la perte du caractère génétique en l’absence de

pression de sélection suffisante au sein des communautés microbiennes telluriques.

Certains auteurs (Fournier et al., 1998) précisent que le développement d’une BDA

puis sa propagation dans la parcelle agricole est généralement graduel dans le temps et dans

l’espace, et nécessite la mise en oeuvre de différents mécanismes de dispersion (travaux

agricoles, ruissellement, phénomènes météorologiques).

Le transfert génétique horizontal (HGT) présent au sein des communautés microbiennes (cf

paragraphe I-4-2) joue un rôle fondamental dans le développement du phénomène de BDA.

Cet échange de matériel génétique peut en effet s’opérer : (i) via la conjugaison bactérienne

par échange de plasmides conjugatifs (molécules d’ADN circulaires, double brins, extra-

chromosomiques, autoréplicables et transférables dans certains cas), (ii) ; via la transposition

par l’intermédiaire d’éléments transposables (petites unités d’ADN mobiles intégrées au

chromosome bactérien pouvant s’exciser et se repositionner ailleurs dans le génome) ; (iii) via

la transformation bactérienne d’ADN extra-chromosomique. Dans le cas des BDA, les

transferts génétiques sont pour la plupart pilotés par les deux premiers mécanismes.

Le modèle conceptuel de l’adaptation des communautés bactériennes à la biodégradation

accélérée (BDA) de l’atrazine proposé par Devers (2008) et Devers et al. (2004, 2005, 2007a,

2007b et 2008) est une illustration de ces mécanismes génétiques adaptatifs (cf figure I-4-2).

Ces auteurs ont pu montrer la grande plasticité de ces phénomènes, pouvant s’appuyer

partiellement sur un mécanisme déjà cité : la conjugaison plasmidique comme acteur principal

de la dispersion des gènes atz et trz. Il faut associer à ce processus l’intervention probable des

transposons via leurs séquences d’insertion IS 1071 qui jouent un rôle important dans la

diversification du support (la localisation génomique des gènes atz et tr peut être

chromosomique et/ou plasmidique) et dans leur duplication par recombinaison homologue.

Ces transferts et réarrangements génétiques concourent, in fine, (i) à augmenter le potentiel de

dispersion des gènes cataboliques de l’atrazine par augmentation du spectre d’hôte au sein des

génomes bactériens, (ii) à optimiser la voie de dégradation du pesticide par duplication en

tandem de certains gènes codant pour des enzymes clefs des voies cataboliques.


50

Figure I-4-2 : Modélisation conceptuelle de l’adaptation des communautés bactériennes à la biodégradation accélérée (BDA) de l’atrazine. Dispersion (flèches rouges) des gènes atz et trz par conjugaison plasmidique et diversification (flèches vertes) du support des gènes atz par transposition, d’après Devers (2008).

Dans certains cas, le processus de BDA ne se limite pas à un seul pesticide en particulier ; au

contraire, c’est une mécanisme doué d’une importante plasticité puisqu’il peut concerner des

produits phytosanitaires présentant des structures chimiques apparentées (Audus, 1951 ;

Soulas, 1985 ; Roeth et al., 1989 ; Singh et al., 2005) mais également des substances actives

appartenant à des familles totalement différentes (Morel-Chevillet et al., 1996 ; Morel-

Chevillet, 1998 ; Warton et al., 2003). De plus, la BDA est un mécanisme microbien adaptatif

qui n’est pas seulement circonscrit aux produits phytosanitaires, mais, semble être généralisé

à l’ensemble des molécules organiques polluantes massivement répandues dans

l’environnement (Erickson et Mondello, 1993 ; Field et al., 1995).

51

Deuxième partie: Présentation générale de

l’Étude

Deuxième partie – Chapitre 1 : La famille des herbicides tricétones

52

Chapitre1‐Lafamilledesherbicidestricétones

1- Contexte historique

La présence de composés β-tricétoniques d’origine naturelle a été décrite par Hellyer

(1968) dans des huiles volatiles de certaines plantes australiennes appartenant à la famille des

Myrtacées. Une activité herbicide naturelle a été ensuite envisagée par des chercheurs de la

firme agro-pharmaceutique Zeneca Ag Products, consécutivement à l’observation de

l’absence de certaines espèces d’adventices autour d’arbustes connus sous le nom de Rince-

bouteilles ou Bottle-brush (Callistemon citrinus stapf). Différentes analyses ont permis

d’attribuer l’activité herbicide à la présence d’un composé tétracétonique, la leptospermone,

substance allélopathique (figure II-1-1) efficace sur de nombreuses adventices mais non

phytotoxique sur le maïs.

Figure II-1-1 : Formule développée de la leptospermone (C15H22O4).

Ces résultats ont été à la base du développement des herbicides de la famille des tricétones.

Michaely et Kratz (1986) ont synthétisé des dérivés substitués de la 2-benzoyl-1,3-

cyclohexanedione manifestant une activité herbicide plus intéressante. Les relations structure-

activité ont été décrites par Lee et al. (1998) et ont mis en évidence le caractère obligatoire de

la présence d’un substituant en position ortho sur le noyau aromatique pour obtenir une action

herbicide. Par ailleurs, cette activité est renforcée par la présence de substituants électro-


53

attracteurs en position 2,4 (cf figure II-1-2 et tableau II-1-1). A partir de ces études, deux

molécules ont ainsi connu un développement commercial, notamment en maïsiculture : la

sulcotrione et la mésotrione.

Figure II-1-2 : Structure de la 2-[2,4-benzoyl disubstituée]-1,3 cyclohexanedione.

Tableau II-1-1 : Activité herbicide (DC50 : Dose moyenne nécessaire pour le contrôle de 50 % de 7 espèces différentes de dicotylédones) des composés 2-[2,4-benzoyl disubstitués]-1,3 cyclohexanedione (d’après Lee et al.,1998).

Composé Substituant A

position ortho

Substituant Q

position para

DC50 (g.ha-1) Log DC50

3 Cl OCH3 5100 3,71

4 Cl CH3 2800 3,45

5 Cl H 830 2,92

6 Cl F 1600 3,2

7 Cl Cl 180 2,26

9 Cl SO2CH3 72 1,86

10 NO2 H 810 2,91

11 NO2 Cl 42 1,62

12 NO2 CF3 14 1,16

13 NO2 SO2CH3 13 1,12


54

2- La substance active 2-1- Fiche d’identité Nom commun : Sulcotrione

CAS-n° : 99105-77-8

Famille chimique : Benzoyl-cyclohexane-1,3-diones ou tricétones.

Formule brute : C14H13ClO5S

Formule développée :

Noms chimiques :

IUPAC : 2-(2-chloro-4-mésylbenzoyl)cyclohexane-1,3-dione

CAS : 1,3-cyclohexanedione, 2-[2-chloro(4-méthylsulfonyl) benzoyl]

Nom de code (R&D) : ICIA0051 ; SC-0051 (The Pesticide Manual, 2006)

Activité biologique : herbicide systémique, absorbé préférentiellement par les feuilles ;

contrôle des adventices dicotylédones et certaines graminées annuelles ; homologué en France

sur maïs, lin, ray-grass, sorgho, maïs doux (Index phytosanitaire, ACTA, 2011). Utilisation

décrite également sur canne à sucre (Pesticide Manual, 2006)

2-2- Propriétés physico-chimiques Poids moléculaire : 328,7 g.mol-1


55

Point de fusion : 139 ° C

pKa : 2,8 ± 0,2 (acide faible)

Etat physique : solide blanc à brun, amorphe.

Tension de vapeur : 5,4 10-6 Pa = 4,18 10-8 mm Hg (molécule peu volatile)

Masse volumique : 1,15 g.mL-1 à 20°C.

Solubilité dans l’eau : 165 mg.L-1 à 25°C (solubilité « intermédiaire »).

Solubilité dans les solvants organiques :

2-3- Les formes tautomériques de la sulcotrione

La tautomérisation céto-énolique des composés de la famille des benzoyl-

cyclohexane-1,3-dione a été étudiée par divers auteurs (Rouchaud et al., 1996 ; Lin et al.,

2000 ; Huang et al., 2002 ; Wu et al., 2002). Un calcul théorique a permis de déterminer

l’existence de trente deux tautomères. Néanmoins, deux conformations sont considérées

comme dominantes en solution aqueuse (Huang et al., 2002) : il s’agit de la forme

exocyclique et de la forme endocyclique, ce dernier le tautomère apparaissant comme le plus

stable (cf figure II-1-3).

Figure II-1-3 : Formes tautomériques dominantes de la benzoyl-cyclohexane-1,3-dione en solution aqueuse (X = Cl pour la sulcotrione, X = NO2 pour la mésotrione).

Solvant Solubilité (g.L-1)

Acétone 40

Chlorobenzène 10

Ethanol < 6

Xylène < 6


56

En outre, le caractère acide faible de la sulcotrione (et de la mésotrione), conditionnant la

forme moléculaire ou dissociée suivant le pH du milieu, est présenté dans la figure II-1-4

(Dyson et al., 2002).

Figure II-1-4 : Comportement « acide faible » en solution aqueuse d’une benzoylcyclohexane-1,3-dione.

3- Mode d’action de la substance active La sulcotrione est un herbicide sélectif du maïs dont la sélectivité est fondée sur la

métabolisation par la plante cultivée (Pallet et al., 2001). Cet herbicide est généralement

utilisé en post-levée des adventices au stade 4-6 feuilles, mais peut être aussi utilisé en pré-

émergence et en pré-semis. La substance active peut être absorbée par la voie foliaire (Wilson

et Foy, 1992 ; Reddy et Bhowmik, 1991 ; Lee et al., 1998 ; Townson et al., 1999) mais

également par la voie racinaire puisqu’elle a montré une certaine activité résiduelle dans le sol

(Compagnon et Beraud, 1992 ; Cools et al., 1997). Cet herbicide est transporté par le phloème

dans le cas d’une application foliaire et par le xylème dans le cas d’une application sur sol nu

(Index Phytosanitaire, ACTA, 2011).

Chez les plantes sensibles, les symptômes externes se manifestent surtout par le blanchiment

des feuilles (Mayonado et al., 1989 ; Reddy et Bhowmik, 1991 ; Schultz et al., 1993 ; Lee et

al., 1998 ; Index Phytosanitaire, ACTA, 2011) qui s’accompagne rapidement d’une nécrose

puis de la mort des plantes. Néanmoins, d’autres zones autres que le système foliaire vont

également présenter signes de perturbations physiologiques importantes. Par exemple, lorsque


57

la sulcotrione est appliquée en pré-levée, l’herbicide agit sur les graines traitées. Ces dernières

peuvent germer mais les plantules blanchies ne tardent pas à mourir (Townson et al., 1999).

Lee et al. (1998) ont pu mettre en évidence que les tissus méristématiques les plus récents

présentent des symptômes de chlorose plus rapidement que les tissus plus âgés de l’adventice.

Mayonado et al. (1989) ont remarqué que l’application de sulcotrione entraine généralement

une diminution de la concentration en caroténoïdes et favorise l’accumulation de pigments

incolores ou phytoènes, suite à la déplétion du taux de plastoquinones. Pour Tsegaye et al.

(2002) puis Falk et al. (2003), une telle diminution accompagnée de la baisse des alpha-

tocophérols entraine nécessairement une perturbation majeure de l’appareil photosynthétique

chez la plante. Chez le maïs, l’enzyme 4-hydroxyphénylpyruvate dioxygénase a été isolée,

extraite et purifiée par Barta et Böger (1996). C’est une enzyme Fe2+-dépendante, de nature

non héminique, qui convertit le 4-hydroxyphénylpyruvate en homogentisate, précurseur clé

dans la synthèse des tocophérols et des quinones. La protéine enzymatique catalyse une

décarboxylation, une substitution et une oxydation du cycle du composé aromatique. Cette

enzyme appartient à la famille des oxygénases acides alpha-cétoniques dépendantes

(Brownlee et al., 2004 ; Moran, 2005). L’étude a notamment montré que l'enzyme avait un

pH optimum de 7,3, une masse moléculaire apparente de 43 kDa et était semblable à celle de

l'enzyme correspondante trouvée dans le foie des mammifères. Les cinétiques réalisées lors de

ces travaux ont démontré que les herbicides de la famille des tricétones étaient de puissants

inhibiteurs compétitifs de l’enzyme 4-p HPPD, notamment pour des valeurs de Ki voisines de

5 nM pour la 2-(2-nitro-4-chlorobenzoyl)-5-(2-methoxyethyl) cyclohexane-1,3-dione and et

voisine de 15 nM pour la 2-(2-chloro-4-methanesulfonylbenzoyl)-cyclohexane-1,3-dione. Les

études qui ont suivi sont venues confirmer les premiers résultats des travaux de Barta et Böger

(Secor, 1994 ; Lee et al., 1998 ; Townson et al., 1999 ; Tsegaye et al., 2002 ; Matringe et al.,

2005, Dayan et al., 2007 ; Dayan et al., 2009 ; Beaudegnies et al., 2009). Les molécules de la

famille des tricétones interagissent en tant qu’inhibiteur compétitif au niveau du site

catalytique de l’enzyme par présence du groupement 1,3-cyclohexane-dione, « analogue » de

la partie alpha-cétonique du substrat de l’enzyme 4-phénylhydroxypyruvate (cf figure II-1-5).

La synthèse de l’homogentisate étant bloquée, les plastoquinones absentes n’assurent plus

leur rôle de co-facteur de l’enzyme phytoène désaturase, la synthèse des caroténoïdes est donc

stoppée (Kim et al., 2002 ; Artetxe et al., 2006). La sulcotrione classée F2 selon la liste des


58

cibles biochimiques des herbicides bloque donc indirectement cette enzyme. In fine, les

caroténoïdes ne jouent plus leur rôle protecteur dans la neutralisation de la chlorophylle à

l’état triplet et de l’oxygène singulet, et par voie de conséquence, les plantes présentent

progressivement un blanchiment des tissus.

Figure II-1-5 : Voie métabolique de biosynthèse des tocophérols et des plastoquinones à partir du 4-hydroxyphénylpyruvate chez la plante : site d’inhibition de l’enzyme 4-phénylhydroxypyruvate dioxygénase par un herbicide tricétonique (sulcotrione).

Parallèlement, chez les mammifères, les effets biologiques des tricétones ont été mis

en évidence, notamment chez le rat, à partir des effets ciblés du 2-(2-nitro-4-

trifluoromethylbenzoyl)-1,3-cyclohexanedione (NTBC) sur la chaine de biosynthèse des

alpha-tocophérols (Lindstedt et al., 1992 ; Ellis et al., 1995 ; Pronicka et al., 1996).

L’accumulation de la tyrosine et du 4-phenylhydroxypyruvate, notamment dans le plasma des

rats, a permis de montrer que le NTBC était également un puissant perturbateur du

catabolisme de la tyrosine en agissant, comme chez les plantes, en tant qu’inhibiteur de


59

l’enzyme 4-hydroxyphénylpyruvate dioxygénase (EC 1.13.11.27). Les travaux de Wu et al.

(2011) ont également confirmé le rôle d’inhibiteur compétitif de la sulcotrione vis-à-vis de

l’enzyme 4-pHPPD et ont mis en évidence certains troubles physiologiques associés à une

ingestion chronique de sulcotrione chez les rats.

La sulcotrione est utilisée en maïsiculture depuis l’interdiction de l’atrazine en 2003.

Elle est autorisée à la vente en France depuis février 1993 et commercialisée notamment sous

le nom de Mikado® dès 1994 par Syngenta puis, depuis 2001 par Bayer CropScience. Ce

produit est une suspension concentrée à 300 g.L-1 de sulcotrione.

Les doses d’application recommandées sont de l’ordre de 300 à 450 g.Ha-1 (Index

phytosanitaire, ACTA 2011 ; Mamy et Barriuso, 2005). La sulcotrione est utilisée pour le

désherbage en France, seule ou en association avec d’autres herbicides (bromoxynil,

isoxaflutole, acétochlore, mésotrione ou nicosulfuron) afin d’augmenter l’efficacité du

traitement tout en diminuant les doses d’application (Chaabane, 2005). Elle présente un large

spectre d’action et couvre donc une très large gamme d’adventices. L’action de la sulcotrione

sur certaines adventices monocotylédones et dicotylédones annuelles (famille des Poacées)

fréquemment rencontrées en maïsiculture (cf tableau II-1-2) a été étudiée.

Degré de sensibilité Dicotylédones Monocotylédones (famille des Poacées)

TS à S

Chenopodium album

Solanum nigrum

Polygonum persicaria

Stellaria media

Digitaria sanguinalis

Echinochloa crus galli

Panicum miliaceum

MS à MR

Amaranthus sp.

Mercurialis annua

Panicum dichotomiflorum

R

Calystegia sepium

Equisetum sp.

Setaria sp.

Cynodon dactylon

Tableau II-1-2 : Sensibilité des adventices à la sulcotrione pour un traitement en post-levée à 450 g.Ha-1. TS = très sensible, S = sensible, MS = moyennement sensible, MR = moyennement résistante, R = résistante (d’après Compagnon et Beraud, 1992).


60

4- Approches toxicologique et écotoxicologique 4-1- Vis-à-vis des mammifères

La sulcotrione est rapidement éliminée par voie urinaire, le métabolite majeur étant la

4-hydroxysulcotrione. La DL50 orale chez le rat est estimée supérieure à 5000 mg.kg-1. Peu

absorbé à travers la peau et peu irritant au niveau des yeux chez le lapin. Les cochons d’inde

ont cependant montré une forte sensibilité au niveau de l’épiderme. Chez le rat, la CL50 par

inhalation est > 1,6 mg.L-1.

La dose sans effet chez le rat a été estimée à 0,5 mg.kg-1 P.C par jour. La DJA a été évaluée à

0,005 mg.kg-1 PC.jour-1. Aucun effet tératogène n’a été noté chez les rats et les lapins. In vivo,

la sulcotrione n’a pas montré de propriétés génotoxiques.

4-2- Ecotoxicologie

Les données relatives à l’écotoxicologie de la sulcotrione sont reportées dans le

tableau II-1-3.

Espèce Test DL50 ou CL50

Oiseaux Toxicité aigüe par voie orale > 1350 mg.kg-1

Poissons (truite-arc-en-ciel) Toxicité aigüe par voie dermale > 4000 mg.kg-1

Abeilles Toxicité aigüe par contact

Toxicité aigüe par voie orale

> 200 µg/abeille

> 50 µg/abeille

Daphnie Toxicité aigüe après 48 heures

d’exposition

> 100 mg.L-1

Algues et plantes aquatiques Test de croissance CEBb50 = 3,5 mg.L-1

Tableau II-1-3 : Toxicité et écotoxicité de la sulcotrione non formulée (Pesticide Manual, 2006).

Des données plus exhaustives relatives à l’impact de la sulcotrione sur les organismes vivants,

extraites de la base de données Agritox, sont présentées dans l’annexe I

(http://www.dive.afssa.fr/agritox/php/sa.php?sa=1101).


61

5- Comportement dans les différents compartiments de l’environnement 5-1- Dans la matrice air

Très peu de données sont disponibles en ce qui concerne le comportement de la

substance active dans la matrice air. Néanmoins, la valeur de la pression de vapeur de la

sulcotrione (5,4 µPa à 25 °C) classe cet herbicide dans la famille des composés très peu

volatils.

5-2- Dans la matrice eau

L’hydrolyse de la sulcotrione a été largement décrite par Chaabane (2005). Les

données bibliographiques concernant cet herbicide faisaient état de deux voies de dégradation

hydrolytique (voies A et B) qu’elle a pu effectivement mettre en évidence. L’influence de

plusieurs paramètres a été étudiée (pH, température, durée, présence de Fe++,…). Le rôle du

pH de la solution aqueuse s’est avéré déterminant.

Un test préliminaire a été mené, selon les recommandations de la directive de l’OECD (2002),

à 50° C et sous conditions de pH fortement acide ou alcalin. Malgré la stabilité de la

substance active dans ces conditions relativement extrêmes, Chaabane a proposé un schéma

réactionnel d’hydrolyse contrôlé par le pH. A pH alcalin, la voie A (considérée comme

classique) a été prédominante, contrairement aux pH acides où la voie B a été décrite.

A pH neutre ou alcalin, la voie A, largement décrite dans la littérature (Rouchaud et al., 1996,

1998a, 1998b) est caractérisée par l’apparition de deux produits de dégradation principaux,

l’acide 2-chloro-4-méthylsulfonylbenzoïque (CMBA) ne présentant pas d’activité herbicide

(Rouchaud et al.,1998a ; Cherrier et al., 2004) et la 1,3-cyclohexanedione (CHD). Pour des

valeurs de pH < 7, la détection intermédiaire du dérivé d’acide heptanoïque indique

l’intervention d’une deuxième voie (voie B), au préalable décrite uniquement dans certains

sols (Rouchaud et al., 1996), avec cependant, pour résultat final, la présence du même

CMBA.

La figure II-1-6 décrit ces deux voies de dégradation.


62

Figure II-1-6 : Formules développées des principaux produits de dégradation de la sulcotrione, issus des voies A et B décrites dans la littérature. En milieu aqueux à 25°C, la sulcotrione s’est montrée chimiquement très stable. Le temps de

demi-vie a été estimé entre 200 et 400 jours selon le pH (Chaabane, 2005).

La substance active semble se dégrader plus rapidement en présence du cation Fe++, dont le

rôle de catalyseur métallique doit être confirmé.


63

La photolyse a également été étudiée au préalable au laboratoire (Chaabane, 2005 ;

Chaabane et al., 2007). La vitesse de cette photolyse a été nettement supérieure à celle de

l’hydrolyse, avec formation de photoproduits majoritairement comparables, laissant supposer

une hydrolyse photoassistée de la sulcotrione. Un schéma réactionnel général a été proposé (cf

figure II-1-7). La photolyse des photoproduits des herbicides tricétoniques (sulcotrione et

mésotrione) fait actuellement l’objet d’une nouvelle étude au LCBE.

Figure II-1-7 : Principaux photoproduits de la sulcotrione (Chaabane et al., 2007). (A) : (2-hydroxy-4-méthylsulfonyl)-1,3-cyclohexanedione, (B) : Acide 5,7-dicéto-7-(2-chloro-4-méthylsulfonylphényl) heptanoïque, (C) : Acide 5,7-dicéto-(2-hydroxy-4-méthylsulfonyl) heptanoïque, (D) : 1,3-cyclohexanedione, (E) : Acide 2-chloro-4-méthylsulfonylbenzoïque, (F) : Acide 2-hydroxy-4-méthylsulfonyl benzoïque.


64

5-3- Dans la matrice sol 5-3-1- Rétention et transfert de la sulcotrione et de ses produits de dégradation

Le processus de rétention a été largement décrit par Chaabane (2005) et Chaabane et

al. (2008), selon les directives de l’OCDE (2002) préconisant la méthode « Batch

equilibrium ». Les résultats expérimentaux ont montré une bonne concordance avec le modèle

mathématique de Freundlich, et notamment, une diminution des sites d’adsorption avec

l’augmentation de la concentration de l’herbicide dans la phase liquide.

La sulcotrione et son métabolite majeur (CMBA) montrent des capacités d’adsorption

modérées ainsi qu’une désorption relativement aisée à partir des sols étudiés lors de ces

travaux, choisis pour leur représentativité « culturale » (Perpignan, Landes, Belgique,

Martinique). La teneur en matière organique, le pH et la teneur en argiles du sol jouent un rôle

prépondérant dans ce cas. Ainsi, la persistance de la sulcotrione augmente avec la diminution

du pH mais aussi avec le contenu en matière organique (Rouchaud et al., 1998a, 1998b).

D’autres produits de dégradation (CHD, acide phénylheptanoïque) sont apparus plus

fortement adsorbés.

Le transfert de la sulcotrione (en plein champ et sur colonne de sol reconstitué) est

modéré dans le profil de sol 0-10 cm et fortement influencé par sa rétention et sa dégradation

dans le sol ainsi que par les conditions climatiques avant et après traitement.

5-3-2- Dégradation de la sulcotrione

Les travaux de Chaabane (2005) ont montré la prédominance de la voie de dégradation

biologique dans les sols étudiés, avec une cinétique de dégradation pouvant être généralement

décrite par une loi de premier ordre. Les temps de demi-vie observés en conditions de plein

champ sont comprises entre 16 et 122 jours (Rouchaud et al., 1996, 1998a et 1998b). Au

laboratoire, elles sont très variables, de 1 à 60 jours (Baer et Calvet, 1999 ; Cherrier et al.,

2004 ; Chaabane, 2005 ; Mamy et al., 2005 ; Chaabane et al., 2007 ; Doublet et al., 2009) et

sont sous l’influence de plusieurs paramètres :


65

La nature du sol : en accord avec les travaux de Cherrier et al. (2004), le temps de demi-vie

de la sulcotrione diminue avec l’augmentation de la teneur en matière organique du sol. Par

contre, la vitesse de dégradation semble peu influencée par la texture du sol (Rouchaud et al.,

1996).

Le taux d’humidité relative : la vitesse de dégradation augmente proportionnellement à la

teneur en eau (dans la limite 25-70 %), quel que soit le type de sol étudié. Cette activation a

été également décrite par Baer et Calvet (1999).

La température : Les expérimentations ont été menées par Chaabane (2005) à diverses

températures (25, 40 et 60° C). La figure II-1-8 présente les résultats obtenus sur le sol de

Belgique ; la non-linéarité de la courbe montre que le mécanisme de dégradation de la

sulcotrione dans le sol varie en fonction de la température. Ces travaux ont permis deux

hypothèses : i) la sulcotrione se dégrade majoritairement par voie biologique, l’activité

microbienne diminuant au-delà de 30 °C (1) ; ii) à température plus élevée (50-60°C), la

dégradation est contrôlée par la présence de bactéries themophiles (2).

Figure II-1-8 : Variation de Ln Kobs en fonction de 1/T pour la dégradation de la sulcotrione dans le sol de Belgique dans la gamme de températures 25, 40 et 60°C.


66

La stérilisation du sol : la dégradation est apparue très faible après stérilisation du sol à

l’autoclave (cet autoclavage pouvant cependant modifier sensiblement la modification de la

structure du sol, Cantier et al., 1986 ; Barrère et al., 1988).

La substance active sous forme de standard analytique ou formulée (Mikado®) : La

formulation joue un rôle au niveau de la vitesse de dégradation, nettement plus rapide avec le

produit formulé.

Ces résultats, obtenus au LCBE à l’issue d’un premier travail de doctorat et mettant en

exergue la prédominance de la voie de dégradation biologique, nous ont conduit à émettre

l’hypothèse d’une éventuelle biodégradation accélérée (consécutive à des traitements répétés)

et à mettre en évidence le rôle majeur d’une flore microbienne dégradante spécifique, à

l’origine de cette métabolisation. Dans ce but, le sol de la parcelle de l’IUT de Perpignan,

précédemment utilisé dans le cadre des travaux de Chaabane, a fait l’objet d’une nouvelle

campagne d’échantillonnage (cf paragraphe II-2-4 et II-2-5)

.

Deuxième partie – Chapitre 2 : Matrice dʼétude : le sol de Perpignan

67

Chapitre2‐Matriced’étude:lesoldePerpignan

1- Situation géographique de la parcelle La parcelle choisie pour cette étude a été mise à notre disposition par l’Institut

Universitaire de Technologie (IUT) de Perpignan, département Génie Biologique, Université

de Perpignan Via Domitia (UPVD). Ses coordonnées géographiques sexagésimales ont été

déterminées : 42° 40' 55" N, 2° 53' 49" E. Cette parcelle agricole (figure II-2-1), présumée

homogène, d’une surface globale voisine de 1500 m², a été préalablement subdivisée en cinq

zones convenablement matérialisées, dont deux (S1) et (S2), d’une surface équivalente (200

m² environ) ont été et exclusivement réservées à ce travail sur la sulcotrione. Des zones

« tampons » ont été délimitées, afin d’isoler chaque unité de traitement et de limiter, dans la

mesure du possible, les phénomènes de contamination (dérive, ruissellement, …). Une zone

contrôle (C) a également été réservée (environ 300 m²).

Figure II-2-1 : Plan de la parcelle expérimentale (IUT de Perpignan, UPVD).


68

2- Paramètres édaphiques du sol de Perpignan

Les analyses pédologiques et physico-chimiques du sol ont été effectuées par le

Laboratoire d’Analyses Agricoles de Perpignan, selon des protocoles standardisés; l’humidité

relative des échantillons a été déterminée au Laboratoire de Chimie des Biomolécules et de

l’Environnement (LCBE-UPVD), suivant la méthode publiée par Mathieu et Pieltain (2003),

basée sur le calcul de la perte de poids après séchage de l’échantillon à l’étuve à 100°C

pendant 24 h. Les résultats sont présentés dans le tableau II-2-1.

Figure II-2-2 : Parcelle expérimentale (avant traitement phytosanitaire) située sur le site de l’IUT de Perpignan, Université de Perpignan Via Domitia (Pyrénées Orientales).


69

Sable

(%)

Limon

(%)

Argile

(%)

Humidité

Relative (%)

Carbone

Orga. (%)

Azote

Orga. (g kg-1)

Matière

Orga. (%)

C/N CEC

(meq 100 g-1)

pH

25.6 60.5 13.9 24 0,9 0,98 1,55 9,64 15,5 8,1

Tableau II-2-1 : Propriétés pédologiques et physico-chimiques du sol de la parcelle de l’Institut Universitaire de Technologie (IUT) de Perpignan, déterminées par les protocoles standardisés (Laboratoire d’Analyses Agricoles de Perpignan et LCBE –UPVD).

Selon la classification FAO, le sol de l’IUT est rangé parmi les sols limono-sablo-argileux

dans le triangle des textures.

3- Historique cultural

La parcelle, mise à notre disposition à l’IUT, avait servi de système cultural en

agriculture biologique avant d’être laissée en friche agricole jusqu’en 2005. A compter de

cette date, les zones (S1) et (S2) ont reçu 4 traitements successifs à la dose agronomique

recommandée de 300 g de sulcotrione.Ha-1 par pulvérisation manuelle d’une préparation à

base de Mikado®, suspension concentrée titrant 300 g.L-1 de substance active

(BayerCropScience).

Ces traitements phytosanitaires ont été effectués selon le calendrier suivant : traitement 1 :

21 avril 2006 ; traitement 2 : 22 mai 2006 : traitement 3 : 22 juin 2006 ; traitement 4 : 21

juillet 2006.

Parallèlement, dans le contexte de notre première étude sur ces herbicides tricétones réalisée

dans le cadre d’un stage de Master (O. Moutugou Mouanda), les zones (M1) et (M2) ont été

traitées, de manière comparable, à l’aide d’une préparation à base de Callisto®, formulation

renfermant 100g.L-1 de mésotrione, substance active voisine de la sulcotrione ne différant que

par la nature du substituant en position 2 sur le noyau benzénique (substituant –NO2 au lieu de

–Cl). Par la suite, aucun autre traitement phytosanitaire n’a été appliqué sur la parcelle.

4- Stratégie d’échantillonnage

Les zones de prélèvement (S1) et (S2), présumées homogènes, ont été divisées de

manière aléatoire, en unités d’échantillonnage, chaque unité faisant l’objet d’un prélèvement


70

élémentaire, effectué à l’aide d’une tarière dans une couche de profondeur déterminée (0-8

cm). Les prélèvements élémentaires (environ 200g de sol/prélèvement), ont été réunis et

homogénéisés pour constituer un échantillon global (4S) qui a été tamisé (≤ 2 mm) puis réduit

par quartages successifs (Mathieu et Pieltain, 2003) avant conservation au laboratoire (+ 4°C

ou - 20°C). Cet échantillon (4S) correspond donc à un sol ayant reçu 4 traitements successifs

par la sulcotrione à dose agronomique. Parallèlement, la zone « contrôle » a été

échantillonnée dans les mêmes conditions pour constituer le sol (C).

5- Dispositif expérimental : les microcosmes

La mise en place de systèmes expérimentaux permet d’appréhender le comportement

des produits phytosanitaires dans le sol, et, plus particulièrement, l’action des communautés

microbiennes du sol sur leur persistance. Ces dispositifs, appelés microcosmes ou

mésocosmes en fonction de leur taille, de leur complexité ou de leur localisation, constituent

en ce sens des modèles relativement pertinents en écologie microbienne, reconstituant des

fractions d’écosystèmes en conditions contrôlées de laboratoire.

Les microcosmes ont été préparés à partir des échantillons de sols natifs (4S) et (C),

ainsi que des sols stériles (St4S) et (StC), obtenus par autoclavage (2 cycles à 121°C pendant

20 minutes avec 1 jour de repos entre chaque autoclavage) d’une fraction des sols (4S) et (C).

Un calendrier de prélèvement a été préalablement établi (Figure II-2-3), prévoyant 1, 2, 3 ou 4

traitements successifs par la sulcotrione. Chaque date de prélèvement prévue a nécessité la

préparation initiale de 2 microcosmes (étude en duplicat) selon le protocole opératoire

suivant : 10,0 g de sol sont placés dans des boites de Pétri stériles (diamètre interne 55 mm) et

surajoutés par 0,6 mL d’une solution aqueuse de sulcotrione préalablement stérilisée par

filtration (membrane filter Minisart® 0,20µm) et de concentration 22 mg.L-1, ajout

correspondant à environ 1,2 µg de sulcotrione par g de sol. Ces microcosmes ont été ensuite

pesés individuellement avant d’être placés à l’obscurité, afin de limiter la photodégradation de

l’herbicide, et en chambre thermostatée (24,0 ± 0,2°C).


71

Tout au long de l’expérimentation (Figure II-2-4), des pesées régulières nous ont permis de

conserver des teneurs en humidité relativement constantes, par ajout contrôlé d’eau stérile

sous hotte à flux laminaire.

Chacun des 4 sols (4S), (C), (St4S) et (StC) a nécessité la préparation de 40

microcosmes. Le premier traitement (TT1) par la sulcotrione a concerné la totalité de la

population des microcosmes. Des prélèvements ont été effectués (en duplicat) au cours du

premier mois, respectivement aux jours TT1-D0, TT1-D2, TT1-D7, TT1-D15 et TT1-D30. Un

deuxième traitement a alors été rajouté sur l’ensemble des microcosmes restants (en

conservant les mêmes conditions de température et d’humidité) et a été suivi de prélèvements

selon la même périodicité : TT2-D0, TT2-D2, TT2-D7, TT2-D15 et TT2-D30. Un troisième, puis

un quatrième traitement ont été conduits de la même manière avec les prélèvements

correspondants (TT3-D0, TT3-D2, TT3-D7, TT3-D15, TT3-D30 et TT4-D0, TT4-D2, TT4-D7, TT4-

D15, TT4-D30).

La teneur en sulcotrione extractible a été déterminée pour chacun des 160 microcosmes.

Figure II-2-3 : Synoptique du calendrier de traitements et de prélèvements des essais en microcosmes.


72

Figure II-2-4 : Préparation et mise en place des microcosmes

73

Troisième partie: Méthodologies de travail

Troisième partie – Chapitre 1 : Méthodologie de lʼanalyse chimique

74

Chapitre1‐Méthodologiedel’analysechimique

La dégradation de la sulcotrione a été suivie successivement sur le sol de Perpignan

puis dans le milieu de culture sélectionné (cf III-2-2-2-1-2). Sur cette dernière matrice, outre

le comportement de la substance active, nous avons recherché l’apparition concomitante des

métabolites principaux, identifiés au cours d’une étude précédente (Chaabane, 2005).

Ce programme analytique a été réalisé au Laboratoire de Chimie de l’Environnement et des

Biomolécules (LCBE), en fonction de la disponibilité des moyens analytiques et notamment

de l’acquisition – tardive pour notre travail – des couplages CLHP/SM et CPG/SM.

1- Analyse des échantillons de sols 1-1-Réactifs et Matériels 1-1-1-Standard analytique Sulcotrione, référence Pestanal® 46318, pureté 98,8 %, origine Fluka analytical, France.

Solutions « mères », préparées à 200 mg.L-1 dans le méthanol de qualité CLHP ; solutions

« filles » à 0,1 ; 0,2 ; 0,5 ; 1 et 2 mg.L-1.

1-1-2- Autres réactifs

a) Méthanol et acétonitrile, qualité CLHP, origine Carlo Erba.

b) Dichlorométhane, pour analyse de pesticides, origine Riedel De Haën GmbH.

c) Acide chlorhydrique 38%, origine Prolabo, France.

d) Eau CLHP.

e) Acide trifluoroacétique (TFA), origine Sigma-Aldrich (Réf. T6508 –25mL), France.

f) Cartouches SPE SupelClean™ ENVI-Chrom, copolymère styrène/divinylbenzène, 500mg,

6 mL, origine Supelco, France.

1-1-3- Matériel classique de laboratoire


75

Agitateurs mécaniques à pales, évaporateurs rotatifs, chambre d’extraction sous pression

réduite, ampoules à décanter…

1-1-4- Appareillage chromatographique et conditions d’analyses Le chromatographe liquide haute performance – détection Ultra-Violet (CLHP/UV) utilisé

était une « chaine » Shimadzu équipée de deux pompes LC10ADvp, une colonne ODS

Hypersil C18 (250 mm x 4,5mm d.i., 5 µm), une boucle d’injection de 20 µL et un détecteur

SPD-10Avp UV-Visible programmé à λ = 265 nm, avec logiciel d’acquisition AZUR version

4.5 (figure III-1-1).

La phase mobile consistait en un mélange (A) : Acétonitrile et (B) : eau CLHP + 0,3% TFA,

délivré, avec un débit de 1 mL/min, selon le gradient d’élution suivant : 0 min : 30 % (A) 70

% (B), évoluant jusqu’à 50% (A) et 50 % (B) à 8 min et maintenu pendant 10 min.

L’étalonnage de cet appareillage a été effectué par injections, en triplicat, de solutions étalons

méthanoliques de sulcotrione (gamme de concentration 0,1 -2 mg.L-1). L’équation de la droite

de régression a été déterminée y = 45,0 (± 1,0) x + 2,9 (± 1,3) avec r² = 0,997 (± 0,003), ce

qui a permis d’estimer une limite de détection voisine de 0,020 mg.L-1.

Figure III-1-1 : Appareillage CLHP/UV Shimadzu utilisé pour les analyses de la sulcotrione à partir de la matrice sol.


76

1-2- Protocole opératoire 1-2-1- Préparation des échantillons

L’extraction de la sulcotrione à partir des échantillons de sols a été réalisée à partir

d’une méthode adaptée par Chaabane (2005) ; Trois étapes d’extraction et de purifications

successives ont été menées afin d’optimiser l’extraction de la sulcotrione tout en limitant la

co-extraction de substances interférentes.

-Extraction par solvant : les échantillons de sol (10 g) ont été mis en suspension dans 60 mL

d’un mélange binaire acétonitrile/solution aqueuse d’HCL 0,1M (90/10, v/v), puis agités

pendant 30 minutes à l’aide d’un agitateur mécanique à tige verticale muni d’une pale

d’agitation. La solution est ensuite filtrée sur fritté et papier filtre Whatmann GF/A. Le sol

partiellement extrait a été remis en suspension dans 30 mL du même mélange binaire, puis re-

agité pendant 15 minutes et filtré dans les mêmes conditions. Les filtrats ont été réunis et

évaporés sous vide (évaporateur rotatif à 30°C), afin d’éliminer l’acétonitrile. La phase

aqueuse acide (Ext 1) a été ensuite purifiée.

-Purification par partage liquide/liquide : La solution aqueuse a été extraite à deux reprises

par un volume égal de dichlorométhane (DCM) dans une ampoule à décanter. Les phases

organiques ont été réunies et évaporées juste à sec. Le résidu a été repris par 1 mL de

méthanol qualité CLHP puis « noyé » dans 20 mL de solution aqueuse d’HCl 0,1 M (Ext2).

-Purification complémentaire sur phase solide : Une nouvelle étape de purification a été

nécessaire. Elle consistait en l’extraction, à l’aide d’un dispositif adapté (chambre

d’extraction sous pression réduite) de l’extrait Ext2 sur cartouche EnviChromP®,

préalablement conditionnée successivement par 2 mL d’un mélange eau distillée/méthanol

(50/50, v/v) et 2 mL d’eau distillée. Après passage de l’extrait Ext2 et séchage de la

cartouche, la sulcotrione (ainsi que ses métabolites, bien que non recherchés dans cette étude

uniquement « sol ») ont été éluées par 5 mL de méthanol qualité CLHP (Ext3).

1-2-2- Analyse chromatographique (cf III-1-1-4)


77

1-3- Performances de la méthode d’analyse et validation

Après extraction des substances d’intérêt, purification de l’extrait et analyse

chromatographique, les performances de la méthodologie ont été évaluées (tableau III-1-1),

notamment en termes de répétabilité, de limites de détection (l.d.), de quantification (l.q.) et,

dans ce cas, de pourcentage de récupération des analytes. Deux niveaux de fortification (0,1 et

2 µg de sulcotrione.g-1 de sol) ont été testés en triplicat.

Ajout de 0,1 µg de sulcotrione

par g de sol (triplicat)

Ajout de 2 µg de sulcotrione

par g de sol (triplicat)

Limite de

détection

(l .d. µg.g-1 de sol)

Limite de

quantification

(l.q.µg.g-1 de

sol) %

recouvrement

Coefficient de

variation

%

recouvrement

Coefficient de

variation

0,02 0,05 84 % 21 % 92 % 10 %

Tableau III-1-1: Performances de la méthodologie d’analyse de la sulcotrione dans le sol.

Après ajouts de sulcotrione, certes supérieurs à la limite de quantification, les résultats

présentés (coefficient de variation et taux de recouvrement) paraissent acceptables, ainsi que

l’incertitude au voisinage de cette limite de quantification (0,05 µg.g-1).

Les teneurs obtenues lors de l’étude de dégradation de l’herbicide (cf IV-1-1) intègrent ces

données (limite de quantification et taux de recouvrement).

2- Analyse des échantillons de milieux de culture 2-1-Réactifs et matériels 2-1-1- Standards analytiques

Analytes Origine Référence Pureté

Sulcotrione Fluka analytical, France Pestanal® 46318 98,8 %

Acide 2-chloro-4 methylsulfonyl

benzoïque (CMBA)

Acros Organics, France 425010010 95,0 %

1,3-cyclohexane dione (CHD) Fluka analytical, France 29059 97,0 %

Tableau III-1-2 : Références et puretés des standards analytiques utilisés lors de l’analyse chimique des milieux de culture.


78

Pour mener à bien notre travail, trois solutions « mères » méthanoliques de sulcotrione (200

mg.L-1), de CMBA (200 mg.L-1) et de CHD (500 mg.L-1) ont été réalisées à partir des

standards analytiques présentés dans le tableau III-1-2. Les solutions « filles » ont été

prépararées à 0,1 ; 0,2 ; 0,5 ; 1 et 2 mg.L-1.

L’acide 5,7-dicéto-7-(2-chloro-4-méthylsulfonylphényl) heptanoïque a été synthétisé au

LCBE (Chaabane, 2005). Une solution méthanolique (1 mg.L-1) a été utilisée (tr = 9,95 min)

comme contrôle de présence au cours de la dégradation de la sulcotrione dans le milieu de

culture.

2-1-2- Autres réactifs a) Méthanol et acétonitrile, qualité CLHP, origine Carlo Erba.

b) Dichlorométhane, pour analyse de pesticides, origine Riedel De Haën GmbH.

c) Acide chlorhydrique 38%, origine Prolabo, France.

d) Eau CLHP.

e) Acide trifluoroacétique (TFA), origine Sigma-Aldrich (Réf. T6508 –25mL), France.

6 mL, origine Supelco, France.

f) Trimethylsilyldiazométhane 2M, solution dans diéthylether, origine Sigma-Aldrich, France

(réf.527254-100mL).

2-1-3- Matériels classiques de laboratoire Centrifugeuses de laboratoire, évaporateurs sous flux d’azote, ampoules à décanter… 2-1-4- Spectrophotomètre UV/visible

La croissance de la biomasse microbienne a été suivie par la mesure de l’absorbance à λ =

600 nm à partir d’aliquotes des milieux de cultures ensemencées. L’appareil utilisé a été un

spectrophotomètre monofaisceau équipé d’un monochromateur à réseau holographique et

d’un détecteur au silicium (Secoman, Anthelie Advanced, France).

2-1-5- Appareillages chromatographiques et conditions d’analyses


79

2-1-5-1- CLHP/UV Les extraits ont été analysés à l’aide d’une « chaine » JASCO équipée de deux pompes (Jasco

880PU Intelligent HPLC pump), une colonne ODS Hypersil C18 (250 mm x 4,5mm d.i., 5

µm), une boucle d’injection de 20 µL et un détecteur Jasco-875-UV programmé à λ = 265

nm, avec logiciel d’acquisition Borwin 1.50

La phase mobile consistait en un mélange (A) : Acétonitrile et (B) : eau CLHP + 0,3% TFA,

délivré, avec un débit de 1 mL/min, selon le gradient d’élution suivant : 0 min : 30 % (A) 70

% (B) jusqu’à 4 min, évoluant jusqu’à 60% (A) et 40 % (B) à 7 min et maintenu pendant 15

min.

Un chromatogramme obtenu avec un mélange de solutions « étalons » est présenté figure III-

1-2. Ce chromatogramme correspond à l’injection d’un extrait obtenu à partir d’un échantillon

de milieu de culture surajouté avant extraction, par un mélange des trois solutions étalons

(sulcotrione, CMBA et CHD). Pour ces trois composés, la gamme de concentration a été de 2

à 30 mg.L-1. Les équations correspondantes sont présentées dans le tableau III-1-3.

Figure III-1-2 : Chromatogramme CLHP/UV de la sulcotrione et de ses principaux

métabolites (CHD et CMBA).


80

Tableau III-1-3 : Calibration de l’analyse sulcotrione et métabolites sur milieu de culture avec l’appareillage CLHP Jasco. 2-1-5-2- CLHP/SM

Les analyses relatives à la présence de 1,3-cyclohexanedione (CHD) par CLHP/SM

ont été effectuées à l’aide d’un appareillage LCQ-Fleet (Thermo Fisher Scientific), disponible

au LCBE depuis septembre 2010, équipé d’une source d’ionisation « Electrospray » (ESI) et

d’un analyseur « ion-trap » 3D. L’analyse de la CHD a été effectuée, entre les m/z 60 et 300,

en modes « full scan » positif (4 kV) et négatif (3,5 kV). Les conditions

chromatographiques étaient: HPLC Accela Thermo Fisher, avec pompe Accela 600, passeur

automatique d’échantillons (Accela autosampler) et détecteur à barrettes de diodes (Accela

PDA detector) ; colonne phénomenex Gemini C6-phényl (150 mm x 3,0 mm ; 5µm) ; phase

mobile : mélange (A) : acide formique 0,1 % dans acétonitrile et (B) : acide formique 0,1 %

dans eau CLHP, délivré, avec un débit de 0,4 mL/min, selon le gradient d’élution suivant : 0

min : 10 % (A) 90 % (B) jusqu’à 2 min, évoluant jusqu’à 90% (A) et 10 % (B) à 20 minutes.

Le temps de rétention, pour la 1,3 cyclohexanedione (CHD), a été de 4,51 minutes (PDA).

L’ion m/z 113, en mode positif, a été retenu pour confirmer ou infirmer la présence de la 1,3

CHD dans les extraits (figure III-1-3). Dans ces conditions - non encore optimisées- la limite

de quantification a été estimée à environ 0,5 mg.L-1.

Analyte (méthode

chromatographique)

Temps de

rétention (minutes)

Gamme de

concentrations (mg.L-1)

Droite de régression

Valeurs moyennes (écart-type)

Sulcotrione

11,08

2 - 30

y = 65504 (±1420) x -19214

(± 10045)

r² = 0,997 (± 0,002)

CMBA

5,15

2 - 30

y = 14537 (± 840) x - 7247

(± 810)

r² = 0,999 (± 0,001)

CHD

4,54

2 - 30

y = 61323 (± 3101) x - 34162

(± 19205)

r² = 0,995 (± 0,003)


81

Figure III-1-3 : (a) Spectre de masse (CLHP/SM-ESI) de la 1,3-cyclohexanedione (CHD) en mode positif. (b) Chromatogrammes du standard analytique (10 mg.L-1) par détection barrette de diodes et (c) détection SM par extraction du fragment m/z 113 en mode positif. 2-1-5-3- CPG/SM

L’appareillage CPG/SM (Thermo Fisher Scientific) a été également disponible au

LCBE à partir de septembre 2010. Il nous a notamment permis de confirmer qualitativement

et quantitativement la présence d’acide 2-chloro-4 methylsulfonyl benzoïque (CMBA) après

dérivation (cf paragraphe III-1-3-2-3-3). Le système consiste en un CPG Focus GC couplé à

un détecteur de spectrométrie de masse DSQ2 (Thermo Fisher Scientific) fonctionnant

(impact électronique 70eV), en mode full scan (m/z 100 – 350) avec extraction, à partir du

« scan », des fragments m/z 217, 248 et 250, caractéristiques du CMBA méthylé (figure III-1-

5). Les conditions chromatographiques étaient les suivantes : injection en mode « split »,

température de la ligne de transfert 300°C, colonne G-SQC GC (5 %

phénylméthylpolysiloxane, 15m x 0,25 mm, 0,25 µm), avec un gradient de température :

température initiale 80 C° (1 min), augmentation de 10°/min jusqu’à 260°C, maintenue


82

pendant 15 minutes ; gaz vecteur Hélium 6.0 (1 mL.min-1). Dans ces conditions opératoires, le

temps de rétention du CMBA-méthylé a été de 14,81 minutes.

L’étalonnage de l’appareillage a été réalisé à partir de solutions méthanoliques

« étalons » méthylées, de concentrations comprises entre 0,5 et 20 mg.L-1, en mode « full

scan », et extraction de l’ion m/z 217 (figure III-1-4). La droite de régression correspondante

est présentée sur la figure III-1-5. La limite de quantification a été évaluée à 0,20 mg.L-1. Une

optimisation de cette application chromatographique est en cours (injection splitless ; mode

d’acquisition SIM : fragments m/z 250, 248, 217 et 155).

Figure III-1-4: (a) Spectre de masse du dérivé méthyle de l’acide 2-chloro-4 methylsulfonyl benzoïque (CMBA), (standard analytique à 20 mg.L-1) obtenu en CPG/SM (mode positif, SM, impact électronique). (b) Chromatogramme montrant la présence du CMBA méthylé (fragments m/z, 217, 248 et 250) dans le milieu de culture (MS) supplémenté en sulcotrione de la souche 1OP après 27 jours d’incubation.


83

Figure III-1-5: Droite d’étalonnage de l’ester méthylique provenant du CMBA obtenu après dérivation et analyse en CPG/SM 2-2- Protocole opératoire 2-2-1- Péparation des échantillons

L’extraction des composés d’intérêt à partir des échantillons de milieux de culture a

été mise au point au laboratoire, après une étape préalable de centrifugation. Des échantillons

de milieu de culture vierge ont été surajoutées par des quantités connues et croissantes (2-30

mg.L-1) de substances à doser (cohorte chimique sulcotrione + CMBA + CHD). Une aliquote

(1 mL) de milieu de culture a été prélevée et centrifugée pendant 15 minutes à 4000 rpm à

température ambiante. Le surnageant a été ensuite récupéré et acidifié par 0,3 mL d’HCl (0,16

M), puis amené à un volume de 2,5 mL par apport d’eau milliQ. La solution est alors extraite

deux fois avec 2,5 mL de dichlorométhane (DCM). L’extrait DCM est évaporé juste à sec

sous flux d’azote et le résidu repris par 1,0 mL de méthanol de qualité CLHP (ExtMC) avant

analyse chromatographique.


84

2-2-2- Analyse chromatographique

Initialement les extraits milieux de culture ont été analysés par CLHP/UV. Les

résultats obtenus ont pu être ensuite confirmés, pour la CHD, par CLHP/SM et pour le

CMBA, par CPG/SM après méthylation.

2-3- Performances de la méthode d’analyse et validation

Des échantillons non ensemencés du milieu de culture (MS) ont été supplémentés par

des quantités connues et croissantes (2-30 mg.L-1) de substances à doser (cohorte chimique

sulcotrione + CMBA + CHD), afin de déterminer les performances de la méthode d’analyse.

La méthode validée a été ensuite appliquée aux échantillons des essais de biodégradation,

obtenus après ensemencement par des souches susceptibles de dégrader la sulcotrione ajoutée

au milieu de culture (MS).

2-3-1- CLHP/UV

La droite de régression linéaire de la méthode complète, obtenue après analyse en

triplicat des échantillons témoins surajoutés, est présentée figure III-1-6.

Figure III-1-6: Droite d’étalonnage de la sulcotrione surajoutée à concentrations croissantes dans le milieu de culture (MS), après extraction et analyses CLHP/UV.


85

L’équation correspondante a été déterminée : y = 47154 (± 1650) x – 13276 (± 11974)

avec r² voisin de 0,9967 (± 0,0003). La limite de quantification a été estimée à 0,5 mg.L-1. Le

coefficient de détermination supérieur à 0,996 et le coefficient de variation sur la pente de la

droite inférieur à 4% nous permettent de considérer ce protocole analytique comme tout à fait

acceptable et utilisable pour l’étude de biodégradation de la sulcotrione dans ce milieu de

culture. Les échantillons provenant de l’étude de dégradation ont été ensuite quantifiés par

rapport à cet étalonnage.

Parallèlement, une étude comparable a été menée à partir d’échantillons de milieu minimum

MS, surajoutés par les métabolites principaux (CMBA et CHD). Les équations

correspondantes ont été déterminées :

Pour le CMBA

y = 10537 (± 1210) x -4224 (± 2009) avec r² = 0,9973 (± 0 ,0010)

Limite de quantification : 1mg.L-1.

Pour la 1,3-CHD

y = 34500 (± 3121) x -7240 (± 5421) avec r² = 0,9960 (± 0,0006)

Limite de quantification : 1mg.L-1.

Cette méthode s’est avérée applicable au dérivé « acide heptanoïque », initialement rajouté à

la concentration de 2 mg.L-1 (tr = 9,95 min).

2-3-2- CLHP/SM

Les échantillons de milieux de culture obtenus lors de l’étude de biodégradation de la

sulcotrione et, de manière concomitante, de l’apparition éventuelle de métabolites, ont été

conservés par congélation du fait de la non-disponibilité du couplage CLHP/SM au moment

de l’expérimentation. Dès la mise en service de cet appareillage (octobre 2010), nous avons

souhaité confirmer l’absence de résidus de CHD (du moins au-delà de la limite de

quantification) par infusion et par couplage avec la chromatographie liquide.


86

2-3-4- CPG/SM

En chromatographie gazeuse, l’analyse du CMBA, dérivé de l’acide benzoïque, n’est

possible qu’après une réaction de méthylation appropriée. Mashimoto et al. (1981) ont décrit

un protocole de méthylation particulièrement adapté au dosage des acides carboxyliques. Ces

auteurs indiquent que le triméthylsilyldiazométhane (TMSCHN2) réagit rapidement, à

température ambiante, en présence de méthanol et avec de bons rendements, sur des acides

carboxyliques pour donner des esters méthyliques (Figure III-1-7). Le TMSCHN2 constitue

donc une alternative intéressante au diazométhane pour l’analyse de ces acides par

chromatographie gazeuse.

25 µL de solution de TMSCHN2 2,0 M dans l’éther diéthylique et 0,5 mL de méthanol de

qualité CLHP sont ajoutés à 0,5 mL d’extrait de milieu de culture (ExtMC). L’ensemble est

ensuite agité à température ambiante pendant 2 heures.

L’estérification se produit rapidement et quantitativement en présence d’un excès

de TMSCHN2, la réaction pouvant être suivie par la disparition progressive de la couleur

jaune. L’extrait méthylé est alors analysé par CPG/SM dans les conditions décrites

précédemment. Le rendement de la méthode, après ajout d’une quantité connue de CMBA à

une aliquote du milieu de culture (MS), extraction et méthylation, a été estimé à 70%

(comparativement à une solution étalon méthanolique méthylée de concentration connue).

Cette méthode nous a permis, malgré la disponibilité tardive de l’appareillage, de confirmer la

présence et les teneurs de CMBA dans les extraits de milieux de culture après biodégradation.

Figure III-1-7: Principe de la réaction de dérivation de l’acide 2-chloro-4 methylsulfonyl benzoïque (CMBA), en présence d’un excès de triméthylsilyldiazométhane (TMSCHN2) et de méthanol conduisant à la formation de l’ester méthylique correspondant.

Troisième partie – Chapitre 2 : Méthodologie de lʼanalyse biologique

87

Chapitre2‐Méthodologiedel’analysebiologique

1- Cadre de l’étude : organisation des travaux

Au cours de notre étude, les analyses microbiologiques se sont déroulées en trois

étapes successives.

En premier lieu, il a été nécessaire de développer une approche cultivable originale et

efficace, en optimisant les conditions de cultures sur milieu synthétique (intégration de l’effet

matrice de l’écosystème sol sur les conditions de cultures au laboratoire, source de carbone,

source d’azote, richesse nutritive et oxygénation), afin de favoriser, autant que possible,

l’isolement et la sélection de souches bactériennes telluriques capables de pousser sur un

milieu synthétique, en présence de sulcotrione.

Dans une deuxième étape, les isolats bactériens ont été testés, séparément, sur leurs

capacités potentielles à utiliser la sulcotrione avec plus ou moins d’efficacité, comme seule

source de carbone et d’énergie à l’aide d’essais de biodégradation en cultures liquides.

La troisième étape a consisté à identifier les isolats bactériens d’intérêt par une

méthodologie de travail s’appuyant sur une approche phylogénétique et fonctionnelle.

L’objectif était dans un premier temps de pouvoir caractériser les souches dégradantes en

comparaison de souches non dégradantes prises comme contrôles, puis dans un deuxième

temps, d’identifier formellement les isolats par un séquençage de leur ADN ribosomal 16S

(ADNr 16S), complété par une caractérisation fonctionnelle.

2- Approche cultivable : essai d’isolement de souches bactériennes dégradant la sulcotrione 2-1- Principe et stratégie de travail

Au cours de cette étude, trois types de milieux de culture ont été nécessaires pour

développer une approche cultivable efficace afin d’essayer de s’affranchir, du moins en partie,

des effets du phénomène du « Great Plate Count Anomaly » (Staley et Konopka, 1985), bien

connu des microbiologistes du sol. En effet, une grande difficulté dans l’étude de la flore


88

microbienne du sol réside dans l’isolement et la culture de souches microbiennes sur des

milieux de culture synthétiques conventionnels.

En premier lieu, afin de pouvoir isoler avec succès des souches bactériennes

telluriques, nous avons donc élaboré un milieu synthétique le plus voisin possible de leur

microhabitat d’origine, en incorporant l’échantillon environnemental « sol » au milieu de

culture approprié. L’objectif était double : (i) réussir à cultiver des souches au laboratoire

issues d’un échantillon de sol et (ii) sélectionner des isolats bactériens capables de se

développer en présence d’une forte concentration d’herbicide.

Un milieu complexe appelé (NS) (« nutrient source ») a donc été préparé directement à partir

d’un échantillon composite de sol provenant de la parcelle de l’IUT de Perpignan (sol C) et

supplémenté en sulcotrione (30 mg.L-1). L’ensemble sol + herbicide peut être considéré

comme la source nutritive de la microflore tellurique. En outre, le sol, présent en proportion

importante dans le milieu de culture (40 grammes), a également servi de matrice de support

aux colonies, permettant ainsi de s’affranchir en partie des effets délétères de l’agar sur la

croissance de certaines souches telluriques (Janssen et al., 2002). Cette technique cultivable a

été adaptée des travaux de Ferreira et al. (2009) qui ont étudié les effets de trois insecticides

(aldicarb, chlorpyrifos et deltaméthrine) et trois fongicides (tébuconazole, métalaxyl et

mancozebe) sur les communautés bactériennes cultivables de sols agricoles brésiliens.

Dans un deuxième temps, un milieu sélectif minimum (minéral) dans lequel

l’herbicide était la seule source de carbone et/ou d’énergie (sulcotrione 30 mg.L-1) a été

utilisé, selon une adaptation des travaux de Rousseaux et al. (2001). Ce milieu (MS) a permis

de réaliser des cultures liquides répétées, avec forte pression de sélection de l’herbicide, sur

les souches bactériennes précédemment isolées et purifiées. L’objectif était d’induire une

adaptation génétique des microorganismes présents dans le milieu au cours des cultures,

conduisant ainsi à l’apparition progressive d’une population apte à utiliser l’herbicide comme

seule source de carbone et/ou d’énergie. Par la suite, ce milieu minéral nous a également servi

à mener nos essais de dégradation en cultures liquides à partir des isolats provenant des

cultures répétées, avec pression de sélection de l’herbicide. Enfin, l’ajout d’agar dans le

milieu (MS) a également été nécessaire afin de tester la capacité de croissance des souches

isolées sur milieu gélosé en présence de l’herbicide.


89

Un milieu riche non différentiel - trypto caséine de soja (Triptic soy broth ou TS médium)

supplémenté en sulcotrione et contenant de l’agar, a été utilisé pour réaliser les isolements sur

milieux gélosés nécessaires à l’obtention de souches pures à partir de nos isolats. Ce bouillon

de soja tryptique est un milieu liquide polyvalent préconisé dans des procédures

d’enrichissement et de culture de microorganismes aérobies non exigeants ou modérément

exigeants. Les produits issus de la digestion enzymatique de caséine et de semoule de soja,

présents dans ce milieu de culture, apportent les aminoacides et les composés azotés

complexes nécessaires à la croissance de ces microorganismes. Le glucose constitue une

source d’énergie, le chlorure de sodium assure l’équilibre osmotique et le phosphate

bipotassique (K2HPO4) permet de contrôler le pH.

Ce même milieu (TS) a également été utilisé sans ajout d’agar, afin d’obtenir par la

technique de culture en croissance discontinue ou en lot (« batch cultures»), une

concentration suffisante de biomasse microbienne en phase exponentielle de croissance. Cette

croissance a été suivie de façon régulière par la mesure de l’absorbance à λ = 600 nm à partir

d’aliquotes de cultures liquides, avant d’entreprendre les essais de biodégradation après une

étape de lavage à l’aide de tampon Knapp.

2-2- Milieux de culture et matériels utilisés 2-2-1- Préparation des milieux de culture 2-2-1-1- Milieu complexe « sol » ou nutrient soil medium (NS)

- réactifs

Sol (C) de la zone de contrôle C de la parcelle expérimentale de l’IUT de Perpignan

Agar technique en poudre AEB175006, AES Laboratoire, France

Solution de NaOH 0,16 M

Cycloheximide, minimum 94 %, référence C7698-5g, Sigma –Aldrich, France

Solution aqueuse de cycloheximide à 1g.L-1, stérilisée sur filtres stériles Acrodisc®

Sulcotrione, 98,8 %, Pestanal® 46318, Fluka analytical, France

Solution aqueuse de sulcotrione à 100 mg.L-1, stérilisée sur filtres stériles Acrodisc®

Filtres stériles Acrodisc® 32, Supor® 0,2 µm, GelmanSciences


90

Seringues stériles à usage unique Injekt (20 mL), référence 4606205V, Braun,

Germany.

- préparation

Le sol (C), prélevé sur la parcelle de l’IUT a été tamisé (tamis 2 mm) et séché trois

jours à l’étuve à 65°C. Le milieu (NS) est préparé à partir de 400 g de ce sol sec, 20 g d’agar

dans environ 350 mL d’eau distillée; le pH est mesuré et éventuellement amené à 8 (pH de la

solution de sol, cf tableau II-2-1) avec la solution de NaOH. Le mélange est autoclavé 1,5

heures à 120°C. Après ajout de 50 mL de solution aqueuse de cycloheximide (50 mg) et de

300 mL de solution aqueuse de sulcotrione (30mg), le volume est ajusté à 1000 mL avec de

l’eau distillée stérile.

Le mélange est homogénéisé et, avant prise en masse de l’agar, coulé dans des boites de Pétri

stériles (diamètre interne 8,6 cm).

2-2-1-2- Milieu minimum (MS)

La préparation de ce milieu de culture sélectif nécessite le mélange de plusieurs solutions

à préparer extemporanément (cf tableau III-2-1). Dans un premier temps, les solutions (A),

(B) et (C) et l’eau distillée (qsp 800 mL) sont mélangées et autoclavées 1h30 à 120°C. Les

solutions de vitamines et de sulcotrione sont ensuite rajoutées par filtration stérilisante. Le

milieu de culture (MS) liquide (en absence d’agar) a été ensuite utilisé dans des erlenmeyers

bafflés (500 mL), cotonnés et préalablement stérilisés. Après préparation, ce milieu doit être

conservé à + 4°C et utilisé rapidement.

Dans certains cas, 15 g d’agar ont pu être rajoutés, avant autoclavage, de manière à obtenir un

milieu gélosé, utilisable lors de certains tests de biodégradation sur boite de Pétri.

Le pH doit également être mesuré et éventuellement amené à 8.


91

Solutions à

préparer

Eléments

constitutifs

Concentration de la

solution à préparer

(g.L-1)

Volume de

cette

solution qsp

1000 mL de

milieu de

culture (mL)

Concentration de

l’élément dans le

milieu de culture

(mg.L-1)

K2HPO4 100 16 1600

KH2PO4 100 4 400

MgSO4, 7H2O 40 5 200

NaCl 10 10 100

CaCl2 20 1 20

Solution (A) :

Eléments

minéraux

FeSO4, 7H2O 5 1 5

2

1,8

0,2

0,8

0,25

Solution (B) :

Mélange

d’oligo-

éléments

H3BO3

MnSO4, H2O

ZnSO4

CuSO4

Na2MoO4, 2H2O

Co(NO3)2

2

1,80

0,20

0,80

0,25

traces

1

traces

Solution (C) :

Source d’azote

(NH4)2SO4

175

20

3,5

Eau purifiée H2O - qsp 800mL -

0,1

Solution (D) :

Mélange de

vitamines

Thiamine

Biotine

0,10

0,04

1

0,04

Solution de

sulcotrione

H2O

0,150

200

30

Agar (cas d’un

milieu solide)

-

-

15 g

-

Tableau III-2-1: Préparation du milieu de culture minimum (MS), pH 8.


92

2-2-1-3- Milieu complexe trypto - caséine de soja ou Triptic soy (TS) Le produit commercial (Bouillon Trypcase Soja, référence 51019) nous a été fourni par

BioMérieux, France. Sa composition est présentée dans le tableau III-2-2.

Elément Quantité (g)

Digestion pancréatique de caséine bovine 17,0 g

Digestion peptidique de semoule de soja 3,0 g

NaCl 5,0 g

K2HPO4 2,5 g

C6H12O6 (dextrose) 2,5 g

Tableau III-2-2: Composition du milieu de culture TS (pH 7,3 ± 0,2) pour 1 litre d’eau purifiée.

Ce milieu, a été préparé, selon les recommandations du fabricant, par l’ajout de 30 grammes

de préparation (forme pulvérulente) dans un litre d’eau purifiée. La suspension homogénéisée,

a été ensuite chauffée jusqu’à dissolution complète répartie, selon l’usage envisagé, dans des

erlenmeyers ou dans des tubes (20 x 200 mm), cotonnés et autoclavés 15 minutes à 120°C.

Dans certains cas, des milieux gélosés ont été préparés par ajout de 15 g.L-1 d’agar par litre de

milieu (TS), afin de purifier nos souches bactériennes par striages successifs sur boites de

Pétri lors de la procédure d’isolement.

Afin d’éliminer toute trace résiduelle de bouillon TS après l’étape de production de biomasse,

l’utilisation d’une solution de rinçage (Tampon Knapp) a été nécessaire avant d’entreprendre

les essais de biodégradation dans le milieu de culture (MS). La composition de ce tampon est

donnée dans le tableau III-2-3.


K2HPO4 1

KH2PO4 1

MgSO4, 7 H2O 0,04

FeCl3 0,004

Tableau III-2-3: Composition du tampon Knapp (pH 6,6) pour 1 litre d’eau purifiée.


93

2-2-2- Matériels utilisés dans le cadre de l’approche cultivable

L’ensemble des essais d’isolement et de culture des souches bactériennes telluriques

ont été menés dans les locaux de l’IUT de Perpignan, au sein du Département de Génie

Biologique. Nous avons pu disposer d’un environnement de travail bien adapté aux

techniques cultivables (figure III-2-1).

Figure III-2-1 : Exemples d’appareillages et de matériels utilisés en culture Pasteurienne lors de l’étude. IUT de Perpignan, Département Génie Biologique (UPVD).

2-3- Protocole opératoire 2-3-1- Isolement de souches bactériennes sulcotrione – résistantes

Plusieurs échantillons contenant 10 grammes de sol (4S) provenant de la surface (4S)

ayant été traitée par la sulcotrione (cf paragraphe II-2-4) ont été placés dans des erlenmeyers

stériles de 500 mL en présence de 90 mL d’eau physiologique (0,9 % NaCl) puis agités à 200

rpm pendant 30 minutes afin de constituer une suspension de sol homogène. Une aliquote de

cetet suspension (500 µL) a été ensuite étalée sur milieu gélosé (NS) contenant 30 mg.L-1 de

sulcotrione. Parallèlement, 1 mL de cette suspension de sol a été additionnée à 9 mL d’eau

physiologique stérile. Après homogénéisation au vortex, une série de dilutions décimales a été


94

réalisée (jusqu’à 10-4) et étalée sur le milieu (NS). Deux boites ont été réalisées pour chaque

dilution. Les boites de Pétri ont été ensuite placées à 28°C pendant 7 jours à l’obscurité et

observées régulièrement. Deux contrôles constitués d’aliquotes de 500 µL de suspension de

sol ont été étalés sur gélose (NS) sans sulcotrione et également incubés dans les mêmes

conditions. Les colonies observées sur gélose (NS) supplémentée en sulcotrione ont été

identifiées comme des souches bactériennes capables de pousser en supportant la présence de

l’herbicide concentration relativement forte dans le milieu de culture (30 mg.L-1). Après

observation et repérage de colonies bien distinctes sur la gélose, les isolats ont été purifiés.

Brièvement, chaque colonie a été prélevée à l’aide d’une anse de platine stérile, puis

ensemencée dans 100 mL de milieu liquide (TS) supplémenté en sulcotrione (30 mg.L-1)

pendant 24 heures sous agitation (200 rpm, 30°C). Plusieurs repiquages et étalements

successifs sur gélose (TS) contenant de la sulcotrione (30 mg.L-1) ont été nécessaires afin

d’obtenir des souches pures.

Cette première étape d’isolement est schématisée dans la figure III-2-2.

Figure III-2-2 : Protocole d’isolement de souches bactériennes telluriques sulcotrione-résistantes.

10 g de SOL (4S) +!90 mL H2Oavec !

0,9 % NaCl!

Agitation 30 minutes!

Aliquotes 500 μL!

Dilutions en série!

Etalement au râteau des dilutions !

Milieu (NS) + sulcotrione!

Milieu (NS) – sulcotrione!

Croissance à 28°C!à lʼobscurité!

Colonies sulcotrione-résistantes!

(TS) + sulcotrione!

Colonies ensemencées dans!bouillon (TS) + sulcotrione!

24 heures sous agitation à 30°C!Repiquages

successifs!Contrôle!

1! 2!

3!

4!

5!6!

Isolement par stries dʼépuisement!


95

2-3-2- Isolement de souches bactériennes dégradant la sulcotrione 2-3-2-1- Cultures liquides répétées des isolats bactériens avec pression de sélection de l’herbicide

Chaque isolat sulcotrione-résistant, caractérisé par sa capacité à pousser en présence

d’une forte concentration d’herbicide sur milieu (MS), a été mis en culture dans un milieu

liquide (MS) supplémenté en sulcotrione (30 mg.L-1). Brièvement, chaque isolat a été

ensemencé dans 100 mL de milieu (MS) supplémenté en herbicide dans des erlenmeyers

baflés (500 mL) et incubé à 28°C sous agitation (150 rpm) pendant 20 jours. Au bout de 20

jours de culture, une aliquote de 10 mL a été transférée dans un nouvel erlenmeyer stérile

(500 mL) contenant 90 mL de milieu (MS) supplémenté en herbicide et incubé à nouveau

dans les mêmes conditions. Cinq cycles de cultures répétés (C1C5) avec pression de

sélection de l’herbicide ont été ainsi conduits (cultures en triplicat) afin de provoquer une

adaptation physiologique des isolats aux conditions de culture. Au bout des cinq cycles, la

capacité de chaque isolat à pousser sur milieu gélosé (MS) supplémenté en sulcotrione (30

mg.L-1) a été testée par étalement d’aliquotes de culture (100 à 10-3) et striage sur gélose à

partir des dilutions décimales (duplicats par boite). Les milieux gélosés ont été incubés 5 jours

environ à l’obscurité à 28°C. Parallèlement, à des fins d’entrée en collection, 20 mL de

bouillon (TS) supplémenté en sulcotrione (30 mg.L-1) ont été ensemencés par une aliquote de

1 mL de chaque souche pure issue du cycle 5 et incubés 12 heures sous agitation à 28°C. La

culture a été ensuite centrifugée 10 minutes à 4000 rpm à 4°C, le surnageant jeté et le culot

bactérien resuspendu dans une solution stérile de milieu (TS) contenant 25 % de glycérol puis

congelé dans l’azote liquide et conservé à - 80°C.

La figure III-2-3 résume cette étape.


96

Figure III-2-3 : Cultures répétées des isolats sulcotrione-résistants avec pression de sélection de l’herbicide.

2-3-2-2- Estimation de la capacité de dégradation des isolats bactériens vis-à-vis de la sulcotrione

La technique de « batch » également dénommée culture en discontinu ou en lot a été

utilisée afin d’obtenir une biomasse microbienne concentrée en phase exponentielle de

croissance, nous permettant de suivre, dans de bonnes conditions opératoires, la dissipation de

l’herbicide dans le milieu de culture (cf figure III-2-4). Une aliquote de 1 mL de chaque isolat

provenant de C5 a été ensemencée dans 49 mL de bouillon (TS) supplémenté en sulcotrione

(30 mg.L-1). Les cellules ont été récoltées par centrifugation (15 minutes, 4000 rpm, 4°C)

pendant la phase exponentielle de croissance, après 15 heures de culture à 30°C sous agitation

(150 rpm). Le surnageant a été jeté, le culot bactérien lavé deux fois avec 20 mL de tampon

Knapp afin d’éliminer toute trace de milieu (TS) résiduel. Le culot a été immédiatement

resuspendu dans un milieu minimum (MS) supplémenté en sulcotrione comme unique source

PHASE DʼADAPTATION = 5 cycles de culture (C1 à C5)" 1 cycle = 20 jours sous agitation à 28°C"

Milieu (MS) + sulcotrione"Milieu (MS) + sulcotrione (90 mL)"

C1" C5"C…"

Milieu (MS) + sulcotrione"

Transfert de 10 mL de culture au bout de 20 jours dans milieu neuf" Transfert de 10 mL"Ensemencement à"

lʼanse"

ENTREE EN COLLECTION"-80°C"

Aliquote 1 mL"

Bouillon (TS) + sulcotrione "

12 heures de culture"


Etalement au râteau"

ESSAIS DE BIODEGRADATION " Mesure de la capacité de dégradation des isolats bactériens vis-à-vis de la

sulcotrione en cultures liquides"

1"

2"

3"4"


Stries sur boite"

Isolat purifié"

(TS) + sulcotrione"

Dilutions en série"


97

de carbone et/ou d’énergie afin d’obtenir une absorbance voisine de 0,3 (λ = 600 nm) dans le

milieu de culture. Les échantillons ont été ainsi cultivés à 30°C sous agitation (200 rpm) et à

l’obscurité afin de limiter la photodégradation de la sulcotrione. Une aliquote de 1 mL de

chaque culture a été régulièrement prélevée selon un calendrier pré-établi (0, 6, 15 et 27

jours), la mesure de l’absorbance (λ = 600 nm) a été effectuée et les échantillons ont été

extraits puis analysés par chromatographie (cf paragraphe III-2-2) afin d’établir les cinétiques

de dégradation de l’herbicide et d’apparition des métabolites principaux dans le milieu de

culture. Un milieu de culture (MS) supplémenté en sulcotrione (30 mg.L-1) non ensemencé et

un milieu (MS) ensemencé non supplémenté en sulcotrione ont servi de contrôles (triplicats)

au cours de nos essais.

Figure III-2-4 : Protocole de sélection de souches bactériennes sulcotrione-dégradantes après cinq cycles de cultures répétées.

Milieu (MS) + sulcotrione!

Bouillon (TS) + sulcotrione!

15 heures sous agitation à 30°C!

Aliquote de 1 mL !de culture!

Culture C5!

Milieu (MS) + sulcotrione!

BATCH CULTURES!

Centrifugation de la culture !Lavage du culot avec

TAMPON KNAPP pH 6,6!

Absorbance voisine de 0,3 !(λ = 600 nm).!

Croissance à 28°C!à lʼobscurité avec

agitation !

Milieu (MS)! Milieu (MS) !non ensemencé!

Contrôles!

RESUSPENSION DU CULOT BACTERIEN!DANS: !

Suivi de! lʼabsorbance!

Cinétiques de dégradation de!

la sulcotrione et dʼapparition de

métabolites éventuels!

1! 2!

3!

4!

5!Aliquote 1 mL!


98

2-3-3- Caractérisation morphologique et biochimique des isolats dégradants

L’observation macroscopique des isolats a été réalisée à partir des cultures sur milieux

gélosés (MS) et (TS) afin d’obtenir des informations sur l’aspect des colonies, c’est-à-dire sur

leur taille, leur couleur, leur forme (contour) leur coupe (de profil), leur consistance

(crémeuse, filante ou muqueuse), l’aspect de la surface (lisse ou rugueuse) et l’opacité

(opaque, translucide ou transparente).

L’observation microscopique des isolats s’est appuyée sur la réalisation d’états frais et de

colorations de Gram. Ces observations ont été effectuées à partir des cultures liquides (MS),

supplémentées en sulcotrione lors des essais de biodégradation, mais également à partir des

colonies isolées et purifiées ayant poussé sur milieu gélosé (MS) supplémenté avec

l’herbicide. Nous avons ainsi pu acquérir des informations sur la taille et la mobilité des

isolats dégradants.

Brièvement, pour la réalisation de l’état frais, une à deux gouttes de suspension cellulaire (à

partir des colonies sur gélose) ou de milieu de culture ont été placé au centre d’une lame de

verre (Marienfeld, Germany) à l’aide d’une pipette Pasteur stérile puis recouvertes d’une

lamelle de verre (ESCO, USA). Le lutage a été effectué à l’aide de paraffine. L’observation

des isolats a été réalisée sur fond clair au microscope optique avec l’objectif X40 (Leica

CME, Leica Microsystems, France) puis avec l’objectif X100 après ajout d’une goutte d’huile

d’immersion (réactifs RAL, France) sur la lamelle.

Afin de caractériser la morphologie de la paroi de nos isolats dégradants (Gram+ ou Gram-),

des frottis ont été préparés par dépôt d’une goutte de culture sur lame (Marienfeld, Germany),

étalés sur 1cm2 environ avec l’anse de platine stérilisée puis séchés. La préparation a été fixée

par ajout d’une goutte d’éthanol puis flambée au bec bunsen. La coloration primaire a été

effectuée par trempage des lames 45 secondes dans le violet de gentiane phénique (Réactifs

RAL, France) puis rinçage à l’eau distillée. L’ajout du mordant a été réalisé par trempage des

préparations 45 secondes dans le lugol. Les lames ont été rapidement lavées avec le mélange

alcool éthylique - acétone (4/1, v/v) puis rincées à l’eau distillée lors de la décoloration. La

coloration secondaire a été réalisée par trempage pendant 45 secondes dans la safranine des

échantillons, qui sont ensuite rincés à l’eau distillée et délicatement tamponnés avec du papier

filtre. L’observation au microscope a été réalisée comme précédemment décrit pour les états

frais.


99

L’observation d’un critère biochimique a été réalisée par l’utilisation de tests catalase, très

simples à mettre en place sur le plan pratique, afin de mettre en évidence la possible

accumulation de péroxyde d’hydrogène (H2O2) chez nos isolats dans le cas d’un métabolisme

aérobie. Après avoir déposé une goutte d’H2O2 sur une lame de verre, nous avons prélevé une

colonie à l’aide d’une pipette Pasteur boulée. L’ensemble a été délicatement mélangé. Dans le

cas d’une réaction positive, le dégagement gazeux est immédiat (bulles d’oxygène). Il traduit

la présence de l’enzyme qui catalyse la réaction suivante : 2 H2O2 → O2 + 2 H2O.

3- Approche moléculaire : caractérisation des isolats bactériens dégradant la sulcotrione vs isolats non dégradants 3-1- Principe et stratégie de travail

L’ADN total bactérien a été extrait à partir des souches cultivées en milieu liquide

(MS) supplémenté en sulcotrione (30 mg.L-1), afin de l’utiliser comme matrice pour les

différentes amplifications géniques envisagées lors de l’étude. Cette approche moléculaire a

consisté à caractériser les souches bactériennes isolées d’un point de vue phylogénétique et

fonctionnel.

3-2- Protocole opératoire

La totalité des travaux de biologie moléculaire sur les souches telluriques précédemment

isolées a été effectuée dans les locaux du Laboratoire Génome et Développement des Plantes

(LGDP) de l’Université de Perpignan Via Domitia (UPVD).

3-2-1- Extraction et purification de l’ADN génomique

L’ADN génomique des isolats bactériens d’intérêts a directement été extrait lors de nos

essais de biodégradation, à partir d’une aliquote de 100 µL de milieu de culture minimum

(MS) après 27 jours d’incubation (absorbance voisine de 0,7 à λ= 600 nm). Cette

méthodologie d’extraction avait déjà été décrite et utilisée avec succès par Chèneby et al.

(2004) au cours de leur étude sur la diversité des bactéries dénitrifiantes et leur activité

réductrice de l’azote au sein de la zone rhizosphérique du maïs.

L’échantillon, prélevé dans un tube Eppendorf stérile de 1,5 mL, a été centrifugé à 13 000 g

pendant 10 minutes à +4°C puis le culot a été lavé deux fois à l’aide d’eau ultra-pure stérilisée


100

et resuspendu dans 100 µL d’une solution stérile de Tris-Cl (5mM, pH 8,3). Les cellules

bactériennes ont ensuite été incubées avec 6,5 µL d’une solution de protéinase K (1 mg.mL-1)

pendant deux heures au bain-marie (+55°C). Afin de favoriser la lyse cellulaire et d’inactiver

la protéinase K, l’échantillon a été placé, successivement, à + 80°C pendant 10 minutes puis

immédiatement incubé 15 minutes dans la glace. Cette opération a été effectuée à trois

reprises. La solution a été centrifugée pendant 10 minutes (13 000 g, +4°C) et le surnageant a

été purifié par le kit GENECLEAN® Turbo Kit (MP Biomedicals, Europe) selon la procédure

préconisée par le fournisseur. Brièvement, après mesure du volume du surnageant

précédemment obtenu, les différents échantillons ont été placés dans des tubes stériles (1,5

mL) et 85 µL de GENECLEAN® Turbo Gnomic Salt Solution ont été ajoutés. L’ensemble a

légèrement été vortexé puis transféré (volume < 600 µL) sur une colonne de purification

(GENECLEAN® Turbo Cartdrige) et centrifugé 5 secondes à 14000 g à température ambiante.

Après ajout de 500 µL de GENECLEAN® Turbo Wash Solution, les colonnes ont été

centrifugées une première fois, 5 secondes à 14000 g (température ambiante), puis une

deuxième fois 4 minutes à 14000 g. Les échantillons ont été incubés 5 minutes à température

ambiante après ajout de 30 µL de GENECLEAN® Turbo Elution Solution. Les colonnes ont

été éluées par centrifugation 1 minute à 13000 g (température ambiante). Les échantillons ont

été stockés à -20°C pour analyses ultérieures.

3-2-2- Quantification et contrôle de la qualité de l’ADN génomique

L’ADN génomique des isolats bactériens précédemment extrait et purifié à été quantifié

par spectrophotométrie à λ = 260 nm à l’aide du Nanodrop® 2000 (ThermoFisherScientific)

disponible au laboratoire (cf figure III-2-5). Sa qualité a été vérifiée par le calcul des ratio

A260/A280 et A260/A230 ainsi que par une séparation électrophorétique sur gel d’agarose

1% (agarose molecular biology grade, Eurogentec France) après coloration par une solution

de GelRed™ 3X (Nucleic Acid Gel Stain, Biotum). Le gel a été révélé sous UV. Les

photographies ont été enregistrées sur l’imageur de gel autonome (système UGenius,

SynGene).


101

Figure III-2-5 : Spectrophotomètre Nanodrop (ThermoFisherScientific) utilisé pour la quantification des échantillons d’ADN génomique issus des isolats bactériens.

3-2-3- Caractérisation phylogénétique des isolats bactériens 3-2-3-1- Analyse des profils de restriction des ADNr 16S (ARDRA)

En vue d’une première approche globale de caractérisation taxonomique de nos

différents isolats bactériens, nous avons donc choisi d’utiliser cette méthode de travail. Nous

avons amplifié une portion de l’ADNr 16S de chacun de nos isolats en utilisant les amorces

universelles 27f (5’-AGA GTT TGA TCH TGG CTG CTC AG-3’) et 1492r (5’-TAC GGH

TAC CTT GTT ACG ACT T-3’) (Gurtler et Stanisich, 1996). La réaction d’amplification a

été réalisée dans un volume final de 25 µ L, contenant 2,5 µ L de tampon 5X GoTaq

Polymérase (Promega, USA), 200 µM de chaque dNTP (Promega, USA), 1 µM de chaque

amorce, 2,5 U de GoTaq DNA polymérase (Promega, USA) et 25 ng d’ADN matrice. La

réaction de PCR a été réalisée à l’aide d’un thermocycleur PTC 200 Gradient Cycler (MJ

Research, Waltham) avec le programme d’amplification suivant : 1 cycle de 4 minutes à

94°C ; 34 cycles de 1 minute à 94°C, 1 minute à 55°C, 2 minutes à 72°C et un cycle final de

15 minutes à 72°C. Afin de vérifier la qualité de la réaction d’amplification, 3 µL de produits


102

PCR ont été séparés par électrophorèse sur gel d’agarose à 1 % (Molecular Biology Grade

agarose, Eurogentec, Europe), placé à 100 V pendant 20 minutes dans une solution de TBE

1X. Le marqueur de taille moléculaire 1Kb Plus DNA Lader (Invitrogen) a été utilisé. Le gel

a été ensuite coloré par une solution de GelRed™ (Nucleic Acid Gel Stain, Biotum) et révélé

sous UV. Les photographies ont été enregistrées sur l’imageur de gel autonome (système

UGenius, SynGene). Une photographie des appareillages utilisés est présentée figure III-2-6.

Les produits PCR ont été finalement purifiés par le kit GENECLEAN® Turbo Kit (MP

Biomedicals, Europe) selon la procédure précédemment décrite. Le polymorphisme de

longueur de l’ADNr 16S a été révélé après digestion des produits PCR à l’aide des enzymes

de restriction Alu I et Hae III (New England Biolabs®). Deux mélanges réactionnels d’un

volume final de 20 µL ont été préparés, composés par 2 µL de tampon réactionnel 10X (New

England, Biolabs®) spécifique de l’enzyme de restriction utilisée, 1 U d’enzyme, 12 µL

d’H2O milliQ stérile et 5 µL de produits PCR. Un troisième mélange réactionnel d’un volume

final de 20 µL, contenant les deux enzymes de restriction précédentes Alu I et Hae III a

également été préparé avec 2 µL de tampon réactionnel 10X (New England, Biolabs®), 0,5

µL de chaque enzyme, 12 µ L d’H2O milliQ stérile et 5 µ L de produits PCR. Les trois

mélanges réactionnels ont ensuite été incubés à 37°C pendant 12 heures. Les fragments de

restriction obtenus après digestion enzymatique ont été séparés par électrophorèse sur un gel

d’agarose haute résolution à 2 % (MetaPhor®, Gentaur), placé à 80 V pendant 3,5 heures dans

du tampon TBE 1X. Le marqueur de taille moléculaire 1Kb Plus DNA Lader (Invitrogen) a

été utilisé. Après coloration par une solution de GelRed™ 3X (Nucleic Acid Gel Stain,

Biotum) le gel a été révélé sous UV. Les photographies ont été enregistrées sur l’imageur de

gel autonome (système UGenius, SynGene). Les profils de bandes caractéristiques ainsi

obtenus ont été comparés entre eux afin d’essayer de distinguer, d’un point de vue

taxonomique, les différentes souches bactériennes d’intérêt isolées lors de l’approche

cultivable.


103

Figure III-2-6 : (a) Imageur de gel autonome (système UGenius, SynGene), (b) Système compact d’électrophorèse, (c) Thermocycleurs PTC 200 Gradient Cycler (Bio-Rad et MJ Research), disponibles au LGDP (UPVD). 3-2-3-2- Analyse des isolats bactériens par REP-PCR

Dans le cadre de notre étude phylogénétique, cette technique s’est avérée nécessaire afin

de pouvoir, dans la mesure du possible, différencier les profils génotypiques des souches

bactériennes précédemment isolées, comparant les différents profils REP-PCR obtenus pour

les isolats dégradants ou non dégradants. Cette stratégie de travail avait également pour but de

confirmer ou d’infirmer les premiers résultats comparatifs déjà obtenus par la technique de

l’ARDRA.

La réaction REP-PCR a été conduite en utilisant le couple d’amorce REP1R-I (5’-III ICG

ICG ICA TCI GGC-3’) et REP2-1 (5’-ICG ICT TAT CIG GCC TAC-3’) présentant des

inosines inclues dans la séquence oligonucléotidique. Ce couple d’amorces, utilisé par

Versalovic et al. (1991) lors de l’étude de la répartition des séquences REP chez les


104

Eubactéries, s’est avéré très efficace pour obtenir des empreintes génomiques très distinctes

chez Echerichia coli (souche W310), en comparaison à d’autres couples de séquences

oligonucléotidiques également testés. Leur utilisation dans l’étude du transfert génétique

horizontal des gènes cataboliques de l’atrazine chez Agrobacterium tumefaciens, par Devers

et al. (2005), a également confirmé leur capacité à donner de bons résultats.

La réaction d’amplification a été réalisée dans un volume final de 25 µL contenant 5 µL de

tampon 5X Giescher (cf composition tableau III-2-4), 0,16 mg.mL-1 de serum d’albumine

bovine (BSA, New England Biolabs®), 1,25 mM de chaque dNTP (Promega, USA), 0,1 µL.

mL-1 de dimethyl sulfoxide (Sigma Aldrich, France), 2 µM de de chaque amorce (REP1R-I et

REP2-1), 1 U de GoTaq DNA polymerase (Promega, USA) et 25 ng d’ADN matrice. La

réaction de PCR a été réalisée à l’aide d’un thermocycleur PTC 200 Gradient Cycler (MJ

Research, Waltham) avec le programme d’amplification suivant : 1 cycle de 6 minutes à

95°C ; 30 cycles de 1 minute à 94°C, 1 minute à 40°C, 4 minutes à 65°C et un cycle final de

16 minutes à 65°C. Les amplicons obtenus ont été séparés par électrophorèse sur un gel

d’agarose à 1 % placé à 100 V pendant 20 minutes dans du tampon TBE 1X. Le marqueur de

taille moléculaire 1Kb Plus DNA Lader (Invitrogen) a été utilisé. Après coloration par une

solution de GelRed™ 3X (Nucleic Acid Gel Stain, Biotum), le gel a été révélé sous UV. Les

photographies ont été enregistrées sur l’imageur de gel autonome (système UGenius,

SynGene). Des duplicats indépendants des différents échantillons d’ADN extraits à partir des

isolats bactériens ont été utilisés afin de s’assurer de la répétabilité de la méthode.

Solution de tampon Giescher 5X (mélange après auto-clavage

des solutions stock suivantes)

Concentration finale (mM)

16,6 mL d’une solution de (NH4)2SO4 1M 83

67,7 mL d’une solution de Tris-HCl 1M pH 8,8 335

1,3 mL d’une solution de MgCl2 1M 6,5

1,3 mL d’une solution d’EDTA 0,5 mM 0,0335

2,08 mL d’une solution commerciale de ß C2H6OS 14, 4 M 150

H2O milliQ qsp 200 mL

Répartir la solution de tampon Giescher 5X dans des tubes Eppendorf stériles (1,5 mL).

Stockage à -20°C pendant plusieurs mois.

Tableau III-2-4 : Préparation, composition et stockage du tampon Giescher 5X.


105

3-2-3-3- Séquençage des ADNr 16S

Nous avons ensuite entrepris de séquencer certains des isolats bactériens issus du sol de

Perpignan à partir des ADNr 16S disponibles après étape préliminaire d’amplification par

PCR à l’aide des amorces universelles 27f (5’-AGA GTT TGA TCH TGG CTG CTC AG-3’)

et 1492r (5’-TAC GGH TAC CTT GTT ACG ACT T-3’). Afin de vérifier la qualité de la

réaction d’amplification, 3 µL de produits PCR ont été séparés par électrophorèse sur gel

d’agarose à 1 % (Molecular Biology Grade agarose, Eurogentec, Europe), et placés sous 100

V pendant 20 minutes dans une solution de TBE 1X. Le marqueur de taille moléculaire 1Kb

Plus DNA Lader (Invitrogen) a été utilisé. Le gel a été ensuite coloré par une solution de

GelRed™ (Nucleic Acid Gel Stain, Biotum) et révélé sous UV. Les photographies ont été

enregistrées sur l’imageur de gel autonome (système UGenius, SynGene). Les produits PCR

ont été purifiés par le kit GENECLEAN® Turbo Kit (MP Biomedicals, Europe) et quantifiés

au spectrophotomètre selon les procédures déjà décrites.

3-2-3-3-1- Ligation des produits PCR de l’ADNr 16S dans un vecteur de clonage

Les produit PCR de l’ADNr 16S générés à partir de chaque isolat bactérien d’intérêt

ont été raboutés au plasmide pGEM®-T easy (cf figure III-2-7). La réaction de ligation a

consisté à mélanger 1 µL de vecteur pGEM®-T Easy (50 ng. µL-1) avec 5 µL de tampon 2X

(Rapid Ligation buffer, T4DNA Ligase) pour l’enzyme, 1 µL de T4 DNA ligase (3 U. µL-1)

ainsi que 3 µL de produits PCR. Le mélange a été incubé pendant une nuit à 4°C.


106

Figure III-2-7 : Carte du vecteur de clonage utilisé lors de l’étape de ligation des produits PCR, délimitant la position de l’insert d’intérêt (insert cloned) situé entre les deux promoteurs T7 et SP6 nécessaire à la transcription (plasmide pGEM®-T Easy Vector Ligation kit, Promega, Madison, USA). 3-2-3-3-2- Transformation des cellules compétentes avec le vecteur de clonage

Les plasmides obtenus lors de l’étape précédente sont introduits par transformation à

l’aide d’un choc thermique dans des cellules bactériennes ultra-compétentes Escherichia coli

DH5α™ (Invitrogen) selon le protocole suivant : Des aliquotes de 100 µ L de cellules

compétentes préalablement conservées à -80°C et placées dans des tubes Eppendorf (1,5 mL)

ont été incubées 10 minutes dans la glace puis 10 µL de produit de ligation ont été rajoutés et

l’ensemble a alors été placé 30 minutes dans la glace. Le mélange a été ensuite laissé 45

secondes au bain-marie à 42°C puis replacé à nouveau 2 minutes dans la glace. Enfin, 900 µL

de milieu Luria Bertani (LB) ont été rajoutés (cf tableau III-2-5) et les cellules transformées

ont été cultivées à 37°C sous agitation (150 rpm) pendant 1 heure. Des aliquotes de 80 et 20


107

µL de chaque culture ont alors été respectivement étalées sur du milieu LB gélosé contenant

de l’ampicilline (20 µg. mL-1), du X-Gal (40 µg. mL-) et de l’IPTG (32 µg.mL-1). Les boites

ont finalement été placées une nuit à l’étuve à 37°C.

Le plasmide pGEM®-T easy porte le gène de résistance à l’ampicilline et va donc servir de

crible de sélection pour les cellules bactériennes qui ont été transformées, c’est à dire qui ont

intégré le plasmide. De plus, ce vecteur porte également un gène codant pour l’enzyme ß

galactosidase à l’intérieur duquel se situe le site de clonage (compris entre les deux

promoteurs SP6 et T7), où peut venir se positionner l’insert d’intérêt. La présence ou

l’absence de l’insert d’intérêt dans cette zone permet ou non de sélectionner les bactéries

recombinantes en imposant un crible de sélection supplémentaire. En effet, le raboutage d’un

produit PCR au site de clonage cause dans ce cas la disruption du gène codant pour l’enzyme

ß galactosidase, entrainant nécessairement la perte de capacité de la souche recombinante à

dégrader le X-Gal et conduisant à la coloration bleue de la colonie. In fine, les colonies

bactériennes se développant sur milieu LB contenant de l’ampicilline ont donc bien intégré le

plasmide pGEM®-T easy, et parmi ces colonies, seules celles qui apparaissent blanches

possèdent un plasmide recombinant (cf figure III-2-8). Pour chaque isolat bactérien, 20

colonies blanches ont été sélectionnées à partir des boites gélosées de milieu LB +

Ampicilline, placées dans 100 µ L d’eau ultra-pure préalablement filtrée (filtres stériles

Acrodisc® 32, Supor® 0,2 µ m, GelmanSciences) et également repiquées sur boite LB +

ampicilline en vue de leur conservation (12 heures à 37°C puis placées à 4°C).

Tableau III-2-5 : Préparation et composition du milieu Luria Bertani (LB) nécessaire à la sélection des cellules bactériennes transformées par le plasmide pGEM®-T easy.


Bacto-tryptone (1 %) 10

Extrait de levure (0,5 %) 5

NaCl (0,5 %) 5

Agar (1,5%) si milieu gélosé 16

H2O purifiée qsp 1 litre

Après autoclave, ajouter pour 1 litre ampicilline (20 µg.mL-1 final) 400 µL

Ajouter extemporanément (par boite, environ 20 mL) :

IPTG (32 µg.mL-1 final)

X-Gal (32 µg.mL-1 final)

3,5

40 µL


108

Figure III-2-8 : Croissance des colonies après étalement de 20 µL (gauche) et de 80 µL (droite) de cellules compétentes Escherichia coli DH5α™ ayant intégré le vecteur de clonage pGEM®-T easy sur milieu LB + ampicilline (20 µg.mL-1).

3-2-3-3-3- Test PCR sur colonies des clones recombinants

Ce test a consisté à confirmer par PCR, que les colonies blanches sélectionnées lors de

l’étape précédente, présentent bien le plasmide pGEM®-T easy contenant l’insert d’intérêt

(ADNr 16S des isolats bactériens) et à éviter de sélectionner des « faux positifs » avant

l’étape de séquençage des clones recombinants.

Une amplification PCR a donc été réalisée à partir des colonies blanches sélectionnées en

utilisant des amorces situées de part de d’autre du site d’insertion et composées par les

séquences des deux promoteurs SP6 et T7 du plasmide. Le mélange réactionnel a été effectué

dans un volume total de 25 µL et composé par 2,5 µL de tampon 5X GoTaq Polymérase

(Promega, USA), 200 µM de dNTP, 0,5 µM de chaque amorce (SP6 et T7), 2,5 U de GoTaq

DNA polymerase (Promega, USA) et 2,5 µL de suspension bactérienne. La réaction a été

réalisée dans un thermocycleur PTC 200 Gradient Cycler (MJ Research, Waltham) avec le

programme d’amplification suivant: 3 minutes à 94°C ; suivi de 30 cycles de 30 secondes à

94°C, 45 secondes à 55°C, 2 minutes à 72°C, et enfin un cycle d’élongation de 5 minutes à

72°C. Les amplicons obtenus ont été séparés et révélés comme décrit précédemment.


109

Les colonies blanches sélectionnées ayant donné, après migration électrophorétique, des

fragments de taille supérieure à 3000 paires de bases (taille du plasmide pGEM®-T easy de

3015 pb) ont finalement été retenues et sélectionnées comme étant des clones recombinant

présentant le plasmide avec l’insert d’intérêt.

En vue de la préparation ultérieure des échantillons pour la réaction de séquençage, les

colonies correspondantes ont été ensemencées à partir de 6 mL de milieu liquide LB

complémenté en ampicilline (20 µg. mL-1) pendant une nuit à 37°C.

3-2-3-3-4- Préparation de l’ADN plasmidique (MiniPrep)

Une extraction de l’ADN plasmidique des clones recombinants ayant poussé pendant

une nuit à 37°C sur milieu LB complémenté d’ampicilline (colonies blanches positives après

la réaction de PCR avec les amorces T7 et SP6) a été réalisée à l’aide du kit commercial

Wizard® Plus Minipreps DNA Purification System (Promega, USA). Les cultures

ensemencées ont été placées dans des tubes Falcon stériles (10 mL) numérotés et centrifugées

en salle de culture P2 à 3000 rpm pendant 10 minutes à 4°C. Le surnageant obtenu a été

éliminé et le culot repris par 250 µL de solution de resuspension (E1) fournie par le kit. 250

µL de solution de lyse (E2) ont été rajoutés et les tubes ont été mélangés par inversion (4

fois), puis 10 µL de solution de protéase alkaline (E3) ont été rajoutés et les échantillons ont

été homogénéisés et laissés 5 minutes à température ambiante. 350 µ L de solution de

neutralisation (E4) ont été finalement été rajoutés, les échantillons homogénéisés (inversion 4

fois) et centrifugés à 13 000 rpm pendant 10 minutes à température ambiante. La totalité du

surnageant de chaque échantillon a été déposée sur spin colonne (Kit) et centrifugé à 13 000

rpm pendant 1 minute à température ambiante. Les colonnes ont été lavées deux fois (solution

E5, ajout de 750 µL puis de 250 µL) et centrifugées à nouveau à 13 000 rpm pendant 2

minutes. Les colonnes ont finalement été éluées par ajout de 50 µ L d’H2O ultra-pure

(solution E6) et centrifugation à 13000 rpm pendant 1 minute. L’ADN plasmidique ainsi

obtenu a été quantifié et sa qualité a été vérifiée comme précédemment décrit.

3-2-3-3-5- Réaction de séquençage

Les amplifiats de PCR SP6/T7, issus de la préparation plasmidique précédente, ont été utilisés

pour réaliser les réactions de séquençage. Cela consiste à réaliser l’élongation de l’insert cloné


110

par une PCR linéaire à l’aide d’une seule des deux amorces SP6 ou T7, en présence d’un

mélange des 4 di-désoxy nucléotides triphosphates (ddNTPs) marqués par un colorant

spécifique à chaque base. Dans le cadre de notre étude, chaque amplifiat provenant des

différents clones recombinants sélectionnés a été systématiquement amplifié en utilisant les

deux amorces séparément, en utilisant soit SP6, soit T7 dans le mélange réactionnel. Les

échantillons ont été préparés dans un volume final de 10 µL composé de 1 µL d’une des

amorces SP6 ou T7 (concentration initiale des amorces 10 pmole. µL-1), et d’un volume de

produit PCR de façon à obtenir 100 ng d’ADN dans le mélange réactionnel complété par

ajout d’eau ultra-pure (qsp 10 µL). Les échantillons ont été placés dans un thermocycleur

PTC 200 Gradient Cycler (MJ Research, Waltham) afin d’être déshydratés par chauffage à

80°C pendant 30 minutes puis repris par 20 µL de solution de ddNTPs BigDye® Terminator

v3.1 Cycle Sequencing Kits (Applied Biosystem, Fostercity, USA). Le programme

d’amplification suivant a été conduit : 5 minutes à 92°C puis 35 cycles de 30 secondes à

92°C, 20 secondes à 50°C (diminution de 1°C.seconde-1) et 4 minutes à 60°C (augmentation

de 1°C.seconde-1). La réaction d’amplification a été arrêtée par l’ajout de 75 µ L d’une

solution d’arrêt (2 mL d’acétate de sodium 3 M pH 4,5 + 48 mL d’éthanol à 95°, qsp 50 mL).

Les échantillons ont été agités au vortex et centrifugés à 3250 rpm pendant 40 minutes à 4°C.

Le surnageant a été éliminé et le culot d’ADN délicatement séché (centrifugation à 3250 rpm

pendant 30 secondes à 4°C puis égouttage). Le culot a été lavé deux fois avec 70 µL d’éthanol

à 70 % préalablement placé à -20°C puis l’ensemble est centrifugé à 3250 rpm pendant 15

minutes à 4°C. Le surnageant a été éliminé et le culot a été séché sur la paillasse puis remis en

suspension dans 20 µL d’H2O ultra-pure. Les échantillons ont été chargés dans une plaque 96

puits et analysés par un séquenceur à 16 capillaires de type Applied Biosystems Hitachi

3130xl Genetic Analyzers (cf figure III-2-9). Les données brutes générées par le séquenceur

ont été traitées à l’aide du logiciel Data Collection Software (V 3.0, Applied Biosystems,

USA) qui permet de générer un spectre de séquençage et d’aboutir à la détermination de la

séquence nucléotidique de la matrice ADN étudiée.


111

Figure III-2-9 : Séquenceur Applied Biosystems Hitachi 3130xl Genetic Analyzers.

3-2-3-3-6- Traitement et analyse des séquences

Les séquences nucléotidiques d’ADNr 16S obtenues ont été éditées par le logiciel

4PEAKS V1.7 (http://www.mekentosj.com/science/4peaks). L’inversion des séquences

complémentaires a été réalisée à l’aide du logiciel Reverse Complement

(http://www.bioinformatics.org/sms/rev_comp.html). Des séquences consensus ont été ensuite

générées grâce au logiciel SeqManNGen® (DNASTAR, USA) à partir de nos données et

comparées aux séquences d’ADNr 16S connues et disponibles dans la banque GenBank

(http://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi) par le programme BlastN (Altschul et al., 1990).

L’alignement multiple des séquences consensus d’ADNr 16S des clones et des séquences

sélectionnées dans GenBank (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/genbank/) a été réalisé avec le

logiciel ClustalX (http://www-igbmc.u-strasbg.fr/BioInfo/; Thompson et al., 1997). La

matrice de similitude générée a été traitée par le logiciel NJPlot (ftp:://pbil.univ-


112

lyon1.fr/pub/mol_phylogeny/njplot; Perrière et Gouy, 1996) afin de reconstruire l’arbre

phylogénétique correspondant par la méthode du Neighbor-Joining (Saitou et Nei, 1987)

assignée de la correction de Jukes et Cantor (1969). Une analyse par boostrap (Felsentein,

1985 ; Felsentein et Kishino, 1993) a été menée pour tester la robustesse de notre arbre.

3-2-4- Caractérisation fonctionnelle des isolats bactériens : 3-2-4-1- Contexte

Nous avons voulu compléter l’identification phylogénétique de nos isolats par la

détection de deux familles de gènes impliqués dans la dégradation de xénobiotiques

aromatiques par action de métalloenzymes dioxygénases bactériennes. L’importance du

carrefour métabolique que semble constituer la voie des catéchols ou protocatéchuates laisse à

penser que les populations bactériennes ont progressivement développé des enzymes capables

de reconnaître des gammes étendues de substrat, afin de pouvoir transformer des composés

aromatiques de familles différentes en métabolites de nature catécholique (Dagley, 1986 ;

Vaillancourt et al., 2006 ; Zeyaullah et al., 2009 ; Lillis et al., 2010).

Les dioxygénases catalysent deux réactions fondamentales: en premier lieu,

l’hydroxylation du composé aromatique, puis dans une deuxième étape, l’ouverture du noyau

(Williams and Sayers, 1994 ; Hatta et al., 2003 ; Costas et al., 2004 ; Prathibba et Sumathi,

2007). Ces enzymes sont classées selon le mode d’ouverture du noyau aromatique qu’elles

catalysent : l’intradiol dioxygénase ou catéchol 1,2-dioxygénase (C12O) lorsque le clivage se

fait en position ortho (clivage entre les carbones porteurs des groupements hydroxyles) ou

l’extradiol dioxygénase ou catéchol 2,3-dioxygénase (C23O) pour clivage en position méta

(clivage entre les deux carbones adjacents au diol). Ces deux types d’enzymes constituent

deux familles distinctes et différent notamment par la valence de l’atome de fer situé au site

actif : les intradiol dioxygénases présentent un fer ferrique alors que les extradiol

dioxygénases possèdent un fer ferreux (Harayama et Rekik, 1989). La figure III-2-10

représente le mécanisme général de ces deux types d’enzymes.


113

Figure III-2-10 : Voies de clivage du noyau aromatique du catéchol (voies ortho et méta) catalysées par les catéchol dioxygénases.

La première dioxygénase de ce type à avoir été séquencée est la catéchol 2,3-

dioxygénase, codée par le gène xylE sur le plasmide TOL (Nakai et al., 1983). Cette enzyme

catalyse l’oxydation du catéchol en acide 2-hydroxymuconique semialdéhyde. Les gènes XylE

sont constitués d’environ 923 pb correspondantes à la totalité du cadre de lecture ouvert du

gène de la catéchol-2,3-dioxygénase qui est très largement répandue dans le monde microbien

et se trouve impliquée dans des métabolismes variés (Eltis et Bolin, 1996).

Ces gènes sont potentiellement d’excellentes cibles moléculaires pour caractériser et typer la

microflore du sol impliquée dans la dégradation des composés xénobiotiques aromatiques

(Wikström et al., 1996). Ils sont généralement portés par un plasmide catabolique conjugatif,

le plasmide TOL pWW0 d’environ 117 kb (Nakai et al., 1983), organisés en opéron et se

localisent à l’intérieur d’éléments transposables (Assinder et Williams, 1990). Nous avons

recherché leur présence chez nos isolats.

Nous avons également recherché la présence des gènes codant l’enzyme catéchol-1,2-

dioxygénase (C12O) dans nos isolats. Même si la nature chimique de la sulcotrione semble

certainement incompatible avec un mécanisme de type ortho clivage, il était tout de même

important d’avoir une vision fonctionnelle élargie de nos isolats vis-à-vis de ces deux

enzymes clefs du métabolisme bactérien. Les gènes C12O sont composés d’environ 920 pb et

codent l’enzyme catéchol-1,2-dioxygénase (C12O) qui intervient également dans des

métabolismes impliquant des composés aromatiques variés (Strachan et al., 1998 ; Giedraityte

et Kalediene 2009).

114

3-2-4-2- Détection par PCR des gènes XylE codant l’enzyme catéchol 2,3-dioxygénase

Nous avons appliqué la procédure décrite par Jussila et al. (2007). Ces auteurs ont développé

une méthode de détection gène-spécifique du plasmide TOL par amplification PCR d’environ

731 pb des gènes XylE (cf tableau III-2-6) à partir des amorces consensus XylEaf (5’-TCG

AGT TGC TGG GCC TGA TCG-3’) et XylEar (5’- CCC GCA GAA CAC TTC GTT GCG-

3’). La réaction d’amplification a été réalisée dans un volume final de 25 µL, contenant 2,5

µL de tampon 5X GoTaq Polymérase (Promega, USA), 200 µM de chaque dNTP (Promega,

USA), 1 µM de chaque amorce, 2,5 U de GoTaq DNA polymérase (Promega, USA) et 25 ng

d’ADN matrice. Les amplifications ont été réalisées à partir d’ADN génomique de nos isolats.

Les deux contrôles utilisés ont été de l’ADN génomique d’Escherichia coli souche DH5α

[génotype F- φ80lacZ∆M15 ∆(lacZYA-argF)U169 deoR recA1 endA1 hsdR17(rk-, mk

+)

phoA supE44 thi-1 gyrA96 relA1 λ-] obtenu après culture de 100 µ L de suspension

bactérienne sur milieu LB (12 heures à 37°C) et extraction-purification à l’aide du kit

Wizard® Genomic DNA Purification kit (Promega, USA) ainsi que le plasmide pCambia

3300 (taille 9kb, Flag-HA /3300 : CTZ, création juin 2010, source LGDP, Equipe Nouveaux

Systèmes Transcriptionnels chez Arabidopsis thaliana). La réaction de PCR a été réalisée à

l’aide d’un thermocycleur PTC 200 Gradient Cycler (MJ Research, Waltham) avec le

programme d’amplification suivant : 1 cycle de 10 minutes à 94°C ; 30 cycles de 30 secondes

à 94°C, 1 minute à 70°C, 1 minute à 72°C et un cycle final de 3 minutes à 72°C. 8 µL de

produit PCR ont été déposés sur gel d’agarose à 1,2 % (Molecular Biology Grade agarose,

Eurogentec, Europe) et séparés par électrophorèse à 80 V pendant 35 minutes dans une

solution de TBE 1X. Le marqueur de taille moléculaire 1Kb Plus DNA Lader (Invitrogen) a

été utilisé. Le gel a été ensuite coloré par une solution de GelRed™ (Nucleic Acid Gel Stain,

Biotum) et révélé comme décrit précédemment. Les bandes obtenues ont été excisées sous

UV et purifiées par le kit GENECLEAN® Turbo Kit (MP Biomedicals, Europe) selon la

procédure précédemment décrite. 3 µL de chaque échantillon d’ADN ont été quantifiés sur

gel d’agarose 1 % (Molecular Biology Grade agarose, Eurogentec, Europe) avec 1, 2 et 5 µL

de solution de marqueur de taille moléculaire 1Kb Plus DNA Lader (Invitrogen). Les

échantillons ont également été dosés par spectrophotométrie à λ = 260 nm à l’aide du

Nanodrop® 2000 (ThermoFisherScientific) et leur qualité a été évaluée (rapports A 260/280 et

A 260/230). Les échantillons ont été conservés à -20°C pour analyses ultérieures.

115

Amorce Direction Long. (nt)

Temp. (°C)

G + C (%)

Position 5’de la séquence codante

Séquence Gène amplifié

Taille du fragment attendu

(pb)

Références

XylEaf

Foward

21

70,1

62

127

5’- TCG AGT TGC TGG GCC TGA TCG -3’

XylEar

Reverse

21

70,3

62

857

5’- CCC GCA GAA CAC TTC GTT GCG-3’

C23O 731

Jussila et al. (2007)

Nakai et al. (1983)

C12Of Foward

20 -

65

-

5’- GCC AAC GTC GAC

GTC TGG CA-3’

C12Or Reverse 25 - 52 -

5’- CGC CTT CAA AGT TGA ATC TGC GTG

GT-3’

C12O 282

Sei et al. (1999)

Guzik et al. (2011)

Tableau III-2-6 : Caractéristiques des amorces utilisées pour la détection des gènes codant la catéchol 2,3-dioxygénase (C23O) et la catéchol 1,2-dioxygénase (C12O) par amplification PCR.


116

3-2-4-3- Détection par PCR des gènes C12O codant l’enzyme catéchol 1,2-dioxygénase

Nous avons appliqué la procédure décrite par Sei et al. (1999) et reprise par Guzik et

al. (2011). Ces auteurs ont dessiné des amorces spécifiques (cf tableau III-2-6) à partir de 11

régions fortement homologues des gènes C12O par alignement multiple des séquences des

gènes C12O disponibles dans GenBank. Leur objectif était de pouvoir amplifier une large

gamme de gènes codant les catéchol 1,2-dioxygénases des genres bactériens suivants :

Pseudomonas, Acinetobacter, Alcaligenes et Arthrobacter. Les amorces C12Of (5’-GCC

AAC GTC GAC GTC TGG CA-3’) et C12Or (5’- CGC CTT CAA AGT TGA TCT GCG

TGG T-3’) amplifient environ 300 pb du gène C12O.

La réaction d’amplification a été réalisée dans un volume final de 25 µL, contenant 2,5 µL de

tampon 5X GoTaq Polymérase (Promega, USA), 200 µM de chaque dNTP (Promega, USA),

1 µM de chaque amorce, 2,5 U de GoTaq DNA polymérase (Promega, USA) et 25 ng d’ADN

matrice. Les amplifications ont été réalisées à partir d’ADN génomique de nos isolats. Les

deux contrôles utilisés ont été de l’ADN génomique d’Escherichia coli souche DH5α et le

plasmide pCambia 3300 décrits précédemment. La réaction PCR a été réalisée à l’aide d’un

thermocycleur PTC 200 Gradient Cycler (MJ Research, Waltham) avec le programme

d’amplification suivant : 1 cycle de 3 minutes à 94°C ; 10 cycles de 1 minute à 94°C, 30

secondes à 61°C, 30 secondes à 72°C, 15 cycles de 1 minute à 94°C, 30 secondes à 59°C, 30

secondes à 72°C, 15 cycles de 1 minute à 94°C, 30 secondes à 57°C, 30 secondes à 72°C et

un cycle final de 30 secondes à 72°C. 10 µL de produit PCR ont été déposés sur gel d’agarose

à 1% (Molecular Biology Grade agarose, Eurogentec, Europe) et séparés par électrophorèse à

80 V pendant 35 minutes dans une solution de TBE 1X. Le marqueur de taille moléculaire

1Kb Plus DNA Lader (Invitrogen) a été utilisé. Le gel a été ensuite coloré par une solution de

GelRed™ (Nucleic Acid Gel Stain, Biotum) et révélé comme décrit précédemment. Les

bandes obtenues ont été excisées sous UV et purifiées par le kit GENECLEAN® Turbo Kit

(MP Biomedicals, Europe) selon la procédure précédemment décrite. 3 µ L de chaque

échantillon d’ADN ont été quantifiés sur gel d’agarose 1 % (Molecular Biology Grade

agarose, Eurogentec, Europe) avec 1, 2 et 5 µL de solution de marqueur de taille moléculaire

1Kb Plus DNA Lader (Invitrogen). Les échantillons ont également été dosés par

spectrophotométrie à λ = 260 nm à l’aide du Nanodrop® 2000 (ThermoFisherScientific) et


117

leur qualité a été évaluée (rapports A 260/280 et A 260/230). Les échantillons ont été

conservés à -20°C pour analyses ultérieures.

3-2-4-4- Séquençage des produits PCR

Les échantillons ont été préparés afin de séquencer les fragments d’ADN dans les

deux sens (5’3’ et 3’5’). Ils ont été composés d’un volume final de 8 µL comprenant 1

µL d’amorces XylEaf ou XylEar (séquençage du gène XylE), soit 1 µL de d’amorces C12Of

ou C12Or (séquençage du gène C12O) de concentration de 10 pmol. µL-1 et d’un volume

d’ADN matrice variable selon la taille des fragments considérés (cf tableau III-2-7). Le

volume final a été complété par ajout d’eau ultra-pure (qsp 8 µL). La réaction de séquençage

s’est déroulée dans les conditions décrites précédemment.

Taille des fragments d’ADN

(pb)

Quantité d’ADN par réaction de séquençage

(ng)

300 7 à 14

500 à 700 9 à 18

1000 16 à 32

2000 28 à 56

Tableau III-2-7 : Quantité d’ADN (en ng) nécessaire par réaction de séquençage pour les fragments PCR. Etalonnage du séquenceur Applied Biosystems Hitachi 3130xl Genetic Analyzers.

3-2-4-5- Traitement et analyse des séquences

Les séquences nucléotidiques d’ADN obtenues ont été éditées par le logiciel FinchTV

version 1.4 (http://www.geospiza.com/Products/finchtv.shtml). L’alignement multiple entre

les séquences éditées et les séquences des gènes XylE et C12O disponibles dans GenBank

(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/genbank/) été réalisé avec le logiciel ClustalX (http://www-

igbmc.u-strasbg.fr/BioInfo/; Thompson et al., 1997).


118

3-2-5- Caractérisation physiologique des isolats

En complément de l’étude moléculaire des souches bactériennes isolées, leur aptitude

à dégrader la sulcotrione a été évaluée. Cette partie de notre travail a été décrite

précédemment.

119

Quatrième partie: Résultats et discussion

Quatrième partie – Chapitre 1 : Confirmation du pouvoir biodégradant du sol de Perpignan et recherche dʼune éventuelle biodégradation accélérée (BDA)

120

Chapitre1‐ConfirmationdupouvoirbiodégradantdusoldePerpignanetrecherched’uneéventuellebiodégradation

accélérée(BDA)

1- Réactivité biologique du sol de Perpignan Les travaux précédemment réalisés au L.C.B.E par Chaabane (2005) et Chaabane et

al. (2005, 2008) ont permis de mettre en évidence la dégradation des herbicides tricétones (et

notamment la sulcotrione) dans les quatre sols étudiés (Belgique, Martinique, Landes et

Perpignan). Outre une dégradation effective par voie abiotique (hydrolyse et photolyse), cet

auteur a montré le rôle prépondérant de la dégradation biologique. Ces résultats ainsi que la

disponibilité du sol de Perpignan et les traitements qu’il avait reçus au préalable nous ont

amené à définir de nouveaux objectifs de travail : (i) confirmer le pouvoir biodégradant de ce

sol de Perpignan; (ii) rechercher une éventuelle biodégradation accélérée (BDA) de la

sulcotrione, en confrontant nos résultats aux données bibliographiques relatives à d’autres

substances actives (atrazine, isoproturon, 2,4-D,…); (iii) isoler puis caractériser des souches

bactériennes, présentes dans le sol de Perpignan et impliquées dans le processus de

dégradation biologique.

Lors des précédents travaux de H. Chaabane, la microflore du sol de Perpignan avait

montré une capacité à transformer la sulcotrione en deux métabolites majeurs, la 1,3-

cyclohexanedione (CHD) et l’acide 2-chloro-4-mésylbenzoïque (CMBA) par clivage entre la

partie CHD et le noyau benzénique. Nous avons souhaité confirmer cette potentialité

biodégradante en conditions contrôlées par l’utilisation de microcosmes.

Deux types de sols issus de la parcelle ont permis de préparer les différents microcosmes : un

sol (4S), ayant déjà subi quatre traitements au champ, deux ans plus tôt et un sol « contrôle »

(C) exempt de tout traitement préalable par la sulcotrione. Parallèlement, des essais similaires

ont été menés sur ces sols (4S) et (C) préalablement stérilisés (St4S) et (StC) (cf paragraphe

II-2-4).


121

Un premier « traitement » a été effectué sur l’ensemble des microcosmes (boites de Pétri

contenant 10 grammes de sol) par ajout de 0,6 mL de solution aqueuse de sulcotrione à 22

mg.L-1, se rapprochant ainsi de la teneur prévisible dans le sol (en µg.g -1 de sol dans les

premiers centimètres) après application aux doses homologuées lors des itinéraires techniques

maïsicoles (300-450 g.Ha-1).

Les cinétiques de dégradation ont été établies pour les quatre sols étudiés (4S), (C), (St4S) et

(StC) après 30 jours d’incubation dans une chambre thermostatée à 24°C (± 0,2). Les résultats

sont présentés dans le tableau IV-1-1 et les figures IV-1-1, IV-1-2). La biodégradation de la

sulcotrione est donc confirmée sur les sols (4S) et (C) conformément aux travaux présentés

par H. Chaabane (2005). Le sol de Perpignan présente une cinétique de dégradation qui peut

raisonnablement être décrite par une loi de premier-ordre avec un coefficient de détermination

r² voisin de 0,9 dans les deux cas:

Ln C = - kt + Ln C0

Avec C : concentration de pesticide restante en µg.g-1 de sol,

C0 : concentration initiale de pesticide présente dans le milieu en début d’incubation en

µg.g-1 de sol,

k : constante de cinétique de premier-ordre.

Le temps de demi-vie (t1/2), ou encore temps nécessaire pour qu’il y ait disparition de la

moitié de la quantité initiale de pesticide est calculé à partir de la relation précédente:

t1/2 = Ln 2 / k


122

Tableau IV-1-1 : Constantes cinétiques (k), temps de demi-vie (t1/2) et coefficients de détermination (r2) relatifs à la cinétique de dégradation de la sulcotrione en conditions de microcosmes pour le sol de Perpignan.

Figure IV-1-1 : Suivi de la dissipation de la sulcotrione dans les microcosmes de sol (4S) vs (St4S) après un, deux, trois ou quatre traitements successifs.

k (jours-1)

t1/2 (jours)

r2

Sol (C)

Traitement 1 (T1D0)

0,083

8

0.894

Sol (4S)

Traitement 1 (T1D0)

0,088

8

0.872

Sol (StC)

Traitement 1 (T1D0)

0,0004

-

-

Sol (St4S)

Traitement 1 (T1D0)

0,0004

-

-


123

Figure IV-1-2 : Suivi de la dissipation de la sulcotrione dans les microcosmes de sol (C) vs (StC) après un, deux, trois et quatre traitements successifs.

Après 30 jours d’incubation, environ 90 % de la sulcotrione initiale a été dégradée aussi bien

pour le sol (4S) que pour le sol (C).

Les constantes de dégradation (k ≈ 0,085) ont été voisines pour les deux sols, permettant

d’estimer des temps de demi-vie voisins de 8-10 jours, sensiblement plus courts que ceux

présentés par H. Chaabane (2005 ; Chaabane et al., 2007), mais compris dans « la fourchette »

de quelques jours à environ 60 jours, retrouvée dans d’autres données bibliographiques

(Rouchaud et al., 1996 ; 1998a, 1998b ; Cherrier et al., 2004 ; Mamy, 2005).

Aucune différence notable n’est donc apparue entre les sols (4S) et (C), malgré leur historique

de traitement volontairement différent. Ce résultat n’autorise donc pas à évoquer, à l’issue de

cette première étape, un possible « effet mémoire » sur le potentiel de dégradation du sol (4S),

lié à la répétition antérieure (36 mois auparavant) des traitements en plein champ,.

De plus, pour les deux sols, aucune phase de latence n’a été observée lors de la cinétique de

disparition, élément permettant de suggérer l’intervention d’un processus de co-métabolisme

dans la dégradation de la sulcotrione.


124

Les résultats relatifs à l’étude menée à partir des sols stérilisés (St4S) et (StC) sont également

présentés dans le tableau VI-1-1. La dégradation a été pratiquement négligeable, aussi bien

pour le sol (St4S) que pour le sol (StC), dans les conditions de stérilisation retenues.

Ces données confirment donc que la voie biologique est largement prépondérante dans le cas

de la sulcotrione dans le sol de Perpignan en accord avec les précédents résultats décrits par

H. Chaabane.

2- Recherche d’une éventuelle biodégradation accélérée (BDA)

Consécutivement à l’utilisation répétée de produits phytosanitaires sur de longues

périodes, une baisse progressive de l’efficacité de la substance active a été souvent décrite

dans la littérature, généralement associée à une adaptation de la microflore tellurique

impliquée dans la dissipation du pesticide dans le sol. Mise en évidence par Audus à partir des

années 50 avec le 2,4 D (Audus, 1964), la BDA est sans conséquence sur les produits à

application foliaire. Certaines familles de pesticides apparaissent plus concernées que d’autres

par ce phénomène. C’est notamment le cas des carbamates, qu’il s’agisse d’insecticides

comme le carbofuran (Felsot et al., 1981), le bendicarb et la carbaryl (Racke et Coats, 1988a)

ou d’herbicides comme le butylate et le vernolate (Gray et Joo, 1985). Une BDA a été

également observée pour certains insecticides organophosphorés comme l’isofenphos, le

fonofos et le fénamiphos par exemple (Chung et Ou, 1996) et des fongicides comme

l’iprodione et la vinchlozoline (Walker et al., 1986). Gray et Joo (1985) ont également montré

l’apparition de ce mécanisme chez les amides (napropamide), les dérivés amides (alachlore),

les benzamides (propizamide) et chez certains acides halogénés comme le dalapon. Bien sûr

dans les familles d’herbicides comme les s-triazines, ce phénomène a été largementt mis en

évidence (Barriuso et Houot , 1996 ; Pussemier et al., 1997 ; Yassir et al., 1999). Dans le cas

des urées substituées, il intéressant de voir que la BDA n’est pas systématique pour tous les

composés d’une même famille : ainsi l’isoproturon, le linuron et le chlortoluron peuvent être

sujets à la BDA alors que le diuron présente par exemple une BDA « plus modérée » malgré

une nombre de traitements importants pendant plusieurs années (Rouchaud et al., 2000).

Ainsi, l’importance de la structure chimique du composé phytosanitaire semble jouer un rôle

sur le développement d’une BDA au sein d’une parcelle agricole. En outre, ces processus


125

adaptatifs ont été généralement décrits pour des composés phytosanitaires, le plus souvent

herbicides, utilisés depuis plusieurs décennies à des doses d’application supérieures à celles

homologuées pour la sulcotrione, notamment en maïsiculture.

Aussi, il nous a semblé intéressant de rechercher l’existence d’un tel phénomène de BDA

dans le cas de la sulcotrione, en raison (i) de son « avenir agronomique » au sein des

itinéraires techniques en remplacement de l’atrazine, interdite au début des années 2000, (ii)

de sa structure chimique présentant un substituant halogéné (généralement décrits comme des

composés chimiques plutôt récalcitrants), (iii) des doses d’application relativement modérées.

A l’issue du premier traitement en microcosme, la probabilité d’apparition d’une BDA est

apparue relativement faible au vu des résultats relatifs aux cinétiques de dégradation,

comparables entre les sols (4S) et (C). En raison de la réactivité de ces sols, nous avons

cependant souhaité poursuivre cette étude par des traitements supplémentaires au niveau des

mêmes microcosmes. Un calendrier a été établi (cf paragraphe II-2-5). Il prévoyait un

deuxième traitement 30 jours après le premier et des prélèvements consécutifs au cours du

mois suivant. Deux traitements supplémentaires, espacés chacun de 30 jours et réalisés dans

les mêmes conditions, ont complété cette étude.

Les résultats sont présentés dans le tableau IV-1-2 ainsi que dans les figures IV-1-1 et IV-1-2.

L’examen de ces résultats, obtenus après répétition des traitements suscite plusieurs

commentaires :

(i) Les résultats des cinétiques de dissipation de l’herbicide ont été similaires sur les sols (4S)

et (C), ce qui confirme bien l’absence d’effet mémoire entre ces sols, différents au niveau de

l’historique phytosanitaire, absence déjà entrevue lors du premier traitement.

(ii) L’examen statistique (moyenne ± écart-type) des valeurs de k obtenues à l’issue de chaque

épisode (traitement et prélèvements au cours du mois d’incubation) montre une valeur

moyenne voisine de 0,085 (avec un coefficient de variation acceptable, voisin de 20 %), tout à

fait comparable à celle obtenue après le premier traitement. Le temps de demi-vie (t1/2), invariable, reste au voisinage de 8-10 jours. La répétition des traitements n’affecte donc pas la

vitesse de dégradation de la sulcotrione dans le sol de Perpignan : la vitesse n’augmente pas


126

au cours du temps, caractéristique cinétique essentielle du processus de dégradation par co-

métabolisme. De plus, après le premier traitement, et quels que soient les traitements

successifs (T2, T3 et T4) et le type de sol considérés, les courbes de dissipation de l’herbicide

ne font pas apparaître de temps de latence. Au contraire, la cinétique s’apparente plutôt à une

transformation chimique catalysée ne présentant pas de point d’inflexion, signature d’une

dégradation biologique par co-métabolisme.

(iii) L’examen des courbes de dissipation ainsi que les coefficients de détermination souvent

supérieurs à 0,9 corroborent le caractère de cinétique de premier-ordre, quel que soit le

nombre de traitements.

Tableau IV-1-2 : Paramètres cinétiques relatifs aux différents traitements successifs effectués

en microcosmes sur les sols (4S), (St4S), (C) et (StC).

k (jours-1) t1/2 (jours) r2

Traitement 1 (T1D0)

0,083

8

0,894 Traitement 2 (T2D30) 0,060 11,5 0,955

Sol(C) Traitement 3 (T3D60) 0,100 7 0,989 Traitement 4 (T4D90) 0,100 7 0,962

Moyenne

0,085 ± 0,020

8 ± 2,5

-

Traitement 1 (T1D0)

0,088

8

0,872

Traitement 2 (T2D30) 0,093 7 0,936 Sol (4S) Traitement 3 (T3D60) 0,068 10 0,955

Traitement 4 (T4D90) 0,089 8 0,828

Moyenne

0,084 ± 0.012

8 ± 2,0

-

Sol (StC)

Traitement 1 (T1D0)

0,0004

-

-

Sol (St4S)

Traitement 1 (T1D0)

0,0004

-

-


127

3- Conclusion

Le sol de Perpignan présente bien une réactivité biologique importante vis-à-vis de la

sulcotrione, et ces résultats confirment le rôle majeur des communautés microbiennes dans la

dégradation de la substance active. Cette réactivité se caractérise, dans ce cas, par un potentiel

de dégradation notable puisque 50 % de la substance active est dégradée après seulement 7

jours d’incubation en microcosmes. Les profils cinétiques observés traduisent une

prépondérance du processus de co-métabolisme dans la dégradation de cet herbicide dans le

sol. L’enchaînement de quatre cycles de traitement successifs, de 30 jours chacun, n’a pas été

à l’origine de réponses différentes des communautés microbiennes, et cela, autant pour les

microcosmes de sol (4S) et que ceux de sol (C), opposés pourtant, par des historiques de

traitement volontairement différents. La diminution de la demi-vie de la molécule active,

évènement signature de la mise en place du phénomène de biodégradation accélérée (Topp et

al. 2003) n’a donc pas été observée. L’adaptation de la microflore tellurique n’a, à priori, pas

été suffisamment importante pour générer une biodégradation accélérée (BDA) en conditions

contrôlées (microcosmes).

Ces résultats peuvent être expliqués par un nombre de traitement peut-être insuffisant. Cette

conclusion va dans le sens de F. Martin-Laurent (communication personnelle), la

biodégradation accélérée d’un produit phytosanitaire ne pouvant être valablement mise en

évidence qu’à partir de traitements s’étalant sur des durées beaucoup plus longues (plusieurs

décennies ?).

D’autre part, comparativement aux doses généralement utilisées pour les pesticides ayant

généré des processus de biodégradation accélérée, la dose d’application de la sulcotrione

(300-450 g.Ha-1 en maïsiculture) apparaît sensiblement inférieure, ce qui pourrait limiter ou

retarder l’apparition des phénomènes d’adaptation biologique. Cette problématique avait déjà

été abordée par El Sebaï (2004), qui rapportait que la majorité des BDA avaient été observées

pour des produits phytopharmaceutiques dont les doses utilisées étaient généralement égales

ou supérieures à 1000 g.Ha-1. Il s’était notamment interrogé sur les effets imputés à

l’utilisation de ces composés sur la flore microbienne tellurique: (i) Des doses inférieures à

1000 g.Ha-1 sont-elles susceptibles de générer une pression environnementale suffisante sur

les communautés microbiennes pour provoquer des phénomènes adaptatifs ? (ii) La quantité

de carbone disponible issue du pesticide est-elle, dans ce cas, suffisante pour générer des


128

effectifs microbiens en nombre important afin d’observer une BDA à l’échelle d’une parcelle

agricole ?

Au début de cette étude, nous avions fait l’hypothèse que le sol de Perpignan pourrait

éventuellement présenter une aptitude « naturelle » à la BDA de la sulcotrione, facilement

observable dans des conditions de microcosmes, en réponse à des cycles de traitements

répétés traduisant une stimulation de la biomasse dégradante en taille et/ou en activité. Cela

n’a pas été le cas. Néanmoins, le potentiel de dégradation de ce sol a été confirmé et laisse

entrevoir tout de même, la possibilité d’y trouver des microorganismes dotés de capacités

génétiques à dégrader ce pesticide. Au regard de ces résultats et conscient des difficultés

expérimentales inhérentes à la culture des microorganismes telluriques sur milieux

synthétiques, nous avons toutefois tenté d’isoler à partir du sol (4S) des souches bactériennes

susceptibles de biodégrader l’herbicide sulcotrione.

Quatrième partie – Chapitre 2 : Isolement de souches bactériennes potentiellement dégradantes de la sulcotrione

129

Chapitre2‐Isolementdesouchesbactériennespotentiellementdégradantesdelasulcotrione

1- Recherche de souches sulcotrione-résistantes

La première étape de notre travail a consisté à développer une méthode de culture

utilisant les échantillons environnementaux de sol (4S) et (C) sous forme de suspensions dans

du sérum physiologique, avant étalement, à diverses dilutions (100 à 10-4) sur le milieu (NS),

constitué de sol (C) stérilisé, d’agar et supplémenté en sulcotrione (30 mg.L-1) et

cycloheximide (cf figure III-2-2). Sur ce milieu, synthétique mais se rapprochant du micro-

habitat initial des souches telluriques, nous avons pu faire certaines observations :

- seule la dilution 100 (direct) a permis une croissance exploitable de micro-organismes après

sept jours d’incubation à l’obscurité;

- dans ces conditions, de nombreuses colonies bactériennes ont poussé, sans contamination

fongique ; divers morphotypes ont été observés ;

- un morphotype dominant a été retenu, caractérisé par des colonies blanches de petite taille et

de consistance visqueuse ; ces isolats ont montré une morphologie comparable, formant des

colonies « lisses », plus ou moins opaques, convexes, de forme circulaires et de diamètre

voisin de 2,5 mm.

- présence d’un nombre de colonies plus élevé pour le contrôle [milieu (MS) non supplémenté

en sulcotrione] que pour les géloses supplémentées avec l’herbicide ;

- huit colonies bactériennes ont été isolées après purification par étalements successifs sur

milieu gélosé à partir de ce morphotype ;

- la croissance de ces colonies est possible malgré par la présence de sulcotrione à des teneurs

importantes dans le milieu de culture (30 mg.L-1) ;

Cette méthode « hybride », a permis de cultiver, à partir d’un échantillon environnemental de

sol (milieu complexe naturel), des souches bactériennes difficilement cultivables sur milieux

synthétiques conventionnels, avec un temps d’incubation relativement court et en l’absence de

toute contamination mycélienne. Elle est directement adaptée des travaux de Ferreira et al.

(2009) ; son originalité réside dans l’utilisation simultanée de sol initial stérilisé et de gélose,


130

à des concentrations respectives optimisées, limitant ainsi les effets potentiellement délétères

de l’agar sur certaines colonies bactériennes et se rapprochant des conditions naturelles

propres aux communautés microbiennes du sol (4S). Ainsi, en jouant de façon synergique sur

divers paramètres contrôlant les étapes du protocole d’isolement, comme l’avaient déjà décrit

Zengler et al. (2002), il semblerait que les conditions physiologiques de culture développées

dans notre approche soient favorables à la croissance d’espèces bactériennes du sol. Ces

résultats vont dans le sens des travaux déjà développés par Janssen et al. (2002), qui ont pu

isoler du sol de nouvelles souches bactériennes décrites jusqu’alors comme non cultivables et

caractérisables uniquement que par des techniques moléculaires.

La comparaison du nombre de colonies obtenues à partir des géloses additionnées d’herbicide

et celles obtenues à partir du contrôle (sans sulcotrione) révèle que l’ajout d’herbicide dans le

milieu de culture a un impact sur la croissance des colonies cultivables. Malgré ce stress

« environnemental », une croissance des colonies, issue du morphotype dominant est tout de

même observée, ce qui nous autorise à qualifier ces isolats de souches résistantes à la

sulcotrione.

L’obtention de ces huit souches nous a fourni le support favorable à la poursuite de notre

travail.

2- Isolement de souches bactériennes métabolisant la sulcotrione

Chacune de ces huit colonies résistantes, préalablement isolée et purifiée, a été

cultivée sur milieu liquide (MS) supplémenté en sulcotrione comme seule source de carbone

et/ou d’énergie. Cinq cycles de culture successifs de 20 jours ont été menés de façon à exercer

une importante pression de sélection sur la population microbienne issue de chaque isolat et à

induire des mécanismes génétiques adaptatifs (cf figure III-2-3). A l’issue de ces cinq cycles,

nous avons souhaité évaluer la capacité des isolats à utiliser la sulcotrione comme source de

carbone : la croissance de la biomasse microbienne a donc été suivie par méthode

spectrophotométrique (à 600 nm) et la dissipation de l’herbicide par méthodes

chromatographiques.


131

A ce stade, quelle qu’ait été la souche étudiée, l’augmentation de la biomasse a été très limitée

(faible vitesse de croissance), la dégradation de la substance active n’a été que peu

significative, le pourcentage de dégradation (calculé par rapport à la teneur initiale)

n’excédant pas 10 ± 4 % pour la souche la plus active. A la lumière de ces premiers résultats,

il est possible de considérer que le nombre de cycles de cultures avec pression de sélection de

l’herbicide, volontairement limité à cinq pour des raisons pratiques, ait été insuffisant.

Afin de mieux caractériser visuellement la croissance des colonies, nous avons ensuite

ensemencé des aliquotes des milieux de culture précédents sur milieu gélosé (MS)

supplémenté en sulcotrione, au niveau duquel la croissance est généralement plus nette.

Chacune des huit souches a plus ou moins poussé sur ce milieu solide (dilutions décimales

100 et 10-1 après étalement au râteau et striage direct sur gélose), semblant montrer, à ce stade,

une aptitude des diverses souches bactériennes à métaboliser la sulcotrione avec plus ou

moins d’efficacité. Cependant, l’agar peut, dans certains cas, représenter une source parasite

de carbone du fait de ses impuretés éventuelles et générer des biais expérimentaux. La figure

IV-2-1 représente des exemples de colonies cultivées dans ces conditions. La suite de notre

travail a donc consisté à mesurer la capacité de dégradation des isolats après ensemencement

dans des cultures liquides (MS) supplémentées en sulcotrione.

Nous avons donc préféré, à ce stade, utiliser, sur les huit souches isolées, la technique de

« batch » (cf figure III-2-4), méthodologie qui nous a permis d’augmenter, par concentration

préalable, la biomasse microbienne en phase exponentielle de croissance, au sein du milieu

liquide (MS) et, de façon concomitante, l’impact sur la dégradation de la substance active et

l’apparition de métabolites. Afin d’obtenir une biomasse importante sans pour autant perdre la

capacité dégradante vis-à-vis de l’herbicide, chaque souche a été cultivée pendant 15 heures

en milieu riche (bouillon TS supplémenté en sulcotrione) puis re-ensemencée par dilution en

milieu liquide (MS + sulcotrione) de façon à obtenir une absorbance voisine de 0,300 à 600

nanomètres.


132

Figure IV-2-1 : Colonies isolées sur milieu minimum (MS) supplémenté en sulcotrione comme seule source de carbone et/ou d’énergie après croissance à 24°C à l’obscurité.

Parmi les huit souches testées, seule la souche d’apparence opaque, dénommée 1OP, a

présenté une croissance notable visualisée par le suivi de l’absorbance. Sa cinétique a présenté

deux phases : une phase de latence d’environ six jours et une phase de croissance continue

atteignant une absorbance de 0,700, trente jours après l’ensemencement. Aucune

augmentation de l’absorbance, donc de la biomasse microbienne, n’a été observée au bout des

trente jours pour les 7 autres souches, incubées dans les mêmes conditions.

La figure IV-2-2 présente le suivi de l’absorbance pour la souche 1OP (dans le milieu MS

supplémenté en sulcotrione) vs la souche 1TRANS, choisie comme contrôle négatif de


133

croissance parmi les 7 souches n’ayant pas présenté de croissance suffisamment significative

lors de nos essais pour être retenues comme souches à potentiel de dégradation intéressant.

Figure IV-2-2 : Suivi de la croissance des souches 1OP vs 1TRANS dans le milieu de culture (MS) supplémenté en sulcotrione par mesure de l’absorbance à 600 nm.

Parallèlement, une expérimentation comparable (contrôles) mais menée en milieu liquide

(MS) non supplémenté en sulcotrione, à partir de ces deux mêmes souches 1OP et 1TRANS,

n’a montré aucune augmentation de l’absorbance, donc de la biomasse, à l’issue des 30 jours

de culture (cf figure IV-2-3).

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Temps d'incubation (jours)

Souche 1OP Souche 1TRANS


134

Figure IV-2-3 : Suivi de la croissance des souches 1OP vs 1TRANS dans le milieu de culture (MS) non supplémenté en sulcotrione par mesure de l’absorbance à 600 nm.

Ces résultats nous permettent de faire les remarques suivantes :

- Le milieu (MS) ne contient donc pas, a priori, de source nutritive carbonée assimilable par

ces deux souches.

- Les souches 1OP et 1TRANS ne présentent pas un caractère de croissance de type

autotrophe chimiolithotrophe.

- La sulcotrione semble constituer la seule source de carbone et/ou d’énergie du milieu (MS)

supplémenté pour la souche 1OP.

3- Etude du potentiel de dégradation des isolats dégradants : suivi de la dissipation de la sulcotrione dans le milieu de culture (MS)

L’augmentation significative de la biomasse pour la souche 1OP constitue un élément

important permettant de préjuger de son rôle biodégradant vis-à-vis de la sulcotrione.

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Souche 1OP Souche 1TRANS


135

Néanmoins, il était indispensable de confirmer la probable métabolisation de l’herbicide par

(i) le suivi de la concentration de la sulcotrione dans le milieu de culture (MS) supplémenté au

cours de ces 30 jours d’incubation ; (ii) la mise en évidence de l’apparition concomitante de

métabolites de l’herbicide.

Dans ce but, les méthodes chromatographiques (CLHP/UV), décrites au chapitre III-1, ont été

largement utilisées, après extraction d’aliquotes de milieu de culture par solvant organique.

La dissipation de l’herbicide a été très nettement mise en évidence dans le milieu (MS

supplémenté) consécutivement à son ensemencement avec la souche 1OP :

- Une phase de latence d’une durée d’environ 6 jours a été observée avant le début de la

dissipation effective de la sulcotrione. Ce résultat est en accord avec la phase de latence

observée, dans les mêmes conditions, lors du suivi de la croissance de la biomasse par mesure

de l’absorbance (cf figureIV-2-2). Ce délai peut s’expliquer par le temps nécessaire pour

induire l’expression des gènes dans le génome de la souche 1OP et la synthèse des enzymes

cataboliques impliquées dans la transformation de l’herbicide.

- A partir du 6ième jour d’incubation, la cinétique de dissipation de la sulcotrione peut

raisonnablement être décrite par une loi de premier-ordre :

Ln C = - 0,081 t + Ln 121

avec r² = 0,993 (n=3) et C représentant la concentration de l’herbicide en µmoles.L-1.

Le temps de demi-vie (t1/2) a pu être estimé à environ 15 jours après le début de l’incubation.

Dans ces conditions, le pourcentage de dégradation, lié à l’activité métabolique de la souche

1OP, a été estimé à 88 % au bout de 27 jours.

Lors de cette étude, deux « contrôles » ont été utilisés : un contrôle avec la souche 1TRANS

ensemencée et incubée dans les mêmes conditions, et un deuxième contrôle mené sur le

milieu (MS) supplémenté mais non ensemencé. L’ensemble de ces résultats est présenté dans

la figure IV-2-4.


136

Figure IV-2-4 : Suivi de la dissipation de la sulcotrione en fonction du temps dans le milieu de culture (MS) supplémenté : ensemencé par 1OP ; ensemencé par 1TRANS ; non ensemencé.

Au cours de l’incubation des 2 lots « contrôles », aucune dissipation significative de la

sulcotrione n’a été observée. Les équations relatives à la dégradation n’ont pas été établies.

L’absence d’évolution du « contrôle » non ensemencé comparativement à la souche 1OP

permet d’affirmer que la part de dégradation par voie chimique (hydrolyse principalement, les

incubations ayant été réalisées à l’obscurité) apparaît négligeable par rapport au processus

biologique.

Par ailleurs, ces résultats confirment une des données obtenues par spectrophotométrie visible

lors du suivi de la croissance bactérienne à 600 nm: le profil cinétique de la souche 1TRANS

étant similaire à celui du contrôle non ensemencé, cette souche ne présente donc pas

d’aptitude à métaboliser la substance active.


137

La capacité de la souche 1OP à utiliser la sulcotrione (88 % de dégradation), lorsque ce

composé constitue la seule source de carbone et/ou d’énergie du milieu, est donc confirmée,

résultat corroboré par l’augmentation importante de la biomasse déjà décrite (absorbance

variant de 0,300 à 0,700 au bout de 30 jours).

4- Recherche de métabolites de la sulcotrione dans le milieu de culture (MS)

La recherche de l’apparition concomitante des métabolites principaux : l’acide 2-

chloro-4 méthyl sulfonyl benzoïque (CMBA) et la 1,3-cyclohexane dione (CHD) a été

entreprise pour confirmer la métabolisation et acquérir, si possible, des informations relatives

aux voies métaboliques empruntées.

Ces deux métabolites ont été recherchés tout au long du processus d’incubation par méthode

de chromatographie liquide avec détection UV (λ = 265 nm). Les chromatogrammes

correspondants sont joints en annexe 2. La présence de CMBA a été formellement confirmée

pour l’isolat 1OP vs 1TRANS par CPG/SM (annexe 3) après méthylation de la fonction

carboxylique. L’acquisition récente d’un couplage CLHP/SM nous a permis de confirmer les

résultats concernant la CHD.

Les résultats sont présentés dans le tableau IV-2-1 et repris dans la figure IV-2-5 qui montre

clairement que le CMBA commence à se former dans le milieu de culture (MS) supplémenté

et ensemencé par la souche 1OP dès la fin de la phase de latence préalable à la dissipation

effective de la sulcotrione. Cette augmentation est constante entre 6 et 27 jours, le rapport

molarité en CMBA / molarité initiale en sulcotrione atteignant 44 % à l’issue de l’étude.

Le bilan molaire (teneur en sulcotrione non métabolisée + teneur CMBA formé x 100 / teneur

initiale en sulcotrione) fait état d’une diminution sensible entre le 15ième et le 27ième jour

d’incubation. A ce stade, nous ne pouvons qu’avancer l’hypothèse d’une possible dégradation

du CMBA lui-même par la souche 1OP, consécutivement à l’appauvrissement en sulcotrione

du milieu.


138

Figure IV-2-5 : Suivi de l’accumulation de l’acide 2-chloro-4 methylsulfonyl benzoïque (CMBA) et de la dissipation de la sulcotrione en fonction du temps dans le milieu de culture (MS) supplémenté et ensemencé par la souche 1OP.

La 1,3-cyclohexanedione (CHD), identifiée au cours du travail de H.Chaabane dans le sol de

Perpignan à des concentrations très faibles, n’a jamais été détectée par CLHP/UV (< l.d. : 0, 5

mg.L-1) dans les milieux de culture (MS) ensemencés par 1OP ou 1TRANS. Ce résultat

négatif concernant la 1,3-cyclohexanedione a été confirmé par SM et SM-SM (CLHP et

méthode « infusion »).

L’attaque de la partie cyclohexanedione de la molécule de sulcotrione et son utilisation

comme source de carbone et/ou d’énergie par la souche dégradante 1OP semblent donc

probables. A ce stade de nos travaux, et en se référant à des données de la littérature sur des

études ciblées relatives au métabolisme de diverses di- et tri-cétones, plusieurs hypothèses ont

pu être envisagées, concernant la voie métabolique empruntée ; nous en avons retenu trois,

sans exclure cependant d’autres possibilités :

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Concentration sulcotrione 1OP Concentration CMBA 1OP


139

- (a) une coupure hydrolytique au niveau du carbonyle en β entrainant la formation exclusive

de la CHD et du CMBA, suivie d’une attaque plus ou moins rapide de la CHD par des

systèmes enzymatiques adaptés (hydrolases ?). Dans notre cas, cette hypothèse semble

cependant peu probable du fait de la non-détection de la 1,3-cyclohexanedione dans les

prélèvements effectués à partir de ce milieu de culture, quel que soit le stade d’incubation.

- (b) le clivage de la molécule de sulcotrione par ouverture du noyau 1,3-cyclohexanedione,

aboutissant à un premier métabolite dérivé de l’acide heptanoïque : l’acide 5,7-dicéto-7-(2-

chloro-4-méthylsulfonylphényl) heptanoïque, déjà décrit dans certains sols par Rouchaud et

al. (1998a). Ce composé subit ensuite un clivage hydrolytique enzymatique aboutissant à un

composé aliphatique en C5 (acide glutarique) métabolisable via le cycle des acides

tricarboxyliques (TCA) et un dérivé de l’acétophénone (1-acétyl-2-chloro-4-méthylsulfonyl-

benzène) se transformant rapidement en CMBA. Le dérivé heptanoïque n’a jamais été

retrouvé au cours de notre étude.

- (c) le clivage de la sulcotrione par un mécanisme oxydatif, déjà décrit pour certaines

dicétones par Dangel et al. (1989) et par Grogan (2002, 2005), catalysé par des systèmes

enzymatiques de type catéchol-dioxygénases et aboutissant à une coupure de la liaison C-C au

niveau de la β-dicétone et à la formation d’un composé aliphatique empruntant également la

voie métabolique des TCA. Plusieurs auteurs (Rouchaud et al., 1996 ; Lin et al., 2000 ;

Huang et al., 2002 ; Wu et al., 2002 ; Szczecinski et al., 2008) ont décrit l’existence d’un

grand nombre de formes tautomères céto-énoliques dans la famille des benzoylcyclohexane-

1,3-diones. L’existence de formes tautomères de la partie 1,3 cyclohexanedione de la

sulcotrione, présentant une relative analogie structurale avec certains dérivés catécholiques,

soit directement, soit après intervention préalable sur le carbone 3 d’une monooxygénase

flavinique de type hydroxylase à large spécificité, pourrait expliquer, via l’intervention de la

catéchol 2,3-dioxygénase, une attaque enzymatique ciblée de la substance active par la souche

1OP. Une des caractéristiques essentielles de ce type d’enzyme est d’avoir une spécificité de

substrat généralement plus large que les catéchol 1,2-dioxygénases (Hirose et al., 1994). Le

fer à l’état réduit (Fe2+) permet l’interaction directe de l’oxygène diatomique avec le métal

(Kita et al., 1998). Au cours de la catalyse enzymatique lors de l’interaction avec le site actif


140

de l’enzyme, le substrat n’a pas forcément besoin de subir un changement d’orientation aussi

important et aussi précis que dans le cas d’une catéchol 1,2-dioxygénase (Arciero et

Lipscomb, 1986). Cette moins grande spécificité de substrat pourrait éventuellement

expliquer l’attaque de la partie 1,3-cyclohexanedione sous une des ses formes céto-énoliques.

A ce stade, il nous a semblé intéressant de rappeler que l’action herbicide de la sulcotrione

(Pallett et al., 2001 ; Dayan et al., 2007) s’exerce par inhibition compétitive de la 4-

hydroxyphénylpyruvate dioxygénase (HPPD, EC 1.13.11.27, EC 1.14.2.2), ce qui permet

d’envisager d’autres interactions possibles dioxygénase - sulcotrione.

Jours

Concentration en

sulcotrione

mg.L-1

(µM)

Concentration

en CMBA

mg.L-1

(µM)

Concentration

en CHD

mg.L-1

(µM)

Rapport molarité

CMBA/sulcotrione

initiale

(%)

Bilan

molaire

(%)

0 36 ± 3

(110 ± 10)

ND (< 0,5) ND (< 0,5) - -

6 37 ± 3

(114 ± 13)

ND (< 0,5) ND (< 0,5) - -

15 21 ± 2

(65 ± 7)

6 ± 0,5

(25 ± 2)

ND (< 0,5) 22 82

27 5 ± 1

(16 ± 3)

12 ± 1

(48 ± 3)

ND (< 0,5) 44 59

Tableau IV-2-1 : Evolution des concentrations en substance active et métabolites dans le milieu de culture (MS) supplémenté en sulcotrione et ensemencé par l’isolat bactérien 1OP (ND : non détecté).

A titre comparatif, dans le cas de la mésotrione, Durand et al. (2006b et 2010) et Batisson et

al. (2009) ont proposé un mécanisme de dégradation apparenté par clivage oxydatif de la

partie 1,3-cyclohexanedione catalysé par le genre Bacillus, via deux voies différenciées : une

voie métabolique majeure, dans laquelle l’herbicide est d’abord attaqué par une nitroréductase

au niveau du radical nitro en position 4 du noyau aromatique, donnant un dérivé


141

hydroxylamine intermédiaire, puis subit un clivage oxydatif de la partie 1,3-cyclohexanedione

pour donner l’acide glutarique et l’acide 2-amino-4-méthylsulfonylbenzoïque (AMBA). Dans

le cas de la voie métabolique mineure, le clivage oxydatif de la 1,3-cyclohexanedione semble

être la seule attaque enzymatique permettant de cliver la mésotrione en acide glutarique et en

acide 4-méthylsulfonyl-2-nitrobenzoïque (MNBA) donnant presque directement l’AMBA

après réduction du MNBA.

La connaissance précise du mécanisme de métabolisation de la sulcotrione par la souche 1OP

nécessiterait, à notre avis, une étude spécifique beaucoup plus approfondie.

A ce stade de notre étude, parmi les huit souches résistantes à la sulcotrione isolées sur milieu

(NS supplémenté) et purifiées, seule l’une d’entre elles (isolat 1OP) a montré une forte

aptitude à métaboliser la sulcotrione en l’utilisant comme source de carbone et /ou d’énergie

sur milieu (MS), avec une vitesse de dégradation élevée (temps de ½ vie de 15 jours et

pourcentage de dégradation voisin de 88 %). Néanmoins, ce potentiel biodégradant n’a pu

être caractérisé qu’à la suite d’une étape de concentration de la biomasse microbienne (batch

culture), ce qui permet d’évoquer la notion de seuil de population microbienne, nécessaire à

l’observation du processus métabolique.

La suite de ce travail a donc consisté : i) à identifier, d’un point de vue phylogénétique, cette

souche bactérienne efficace en l’opposant à la souche 1TRANS, choisie parmi les sept

souches à faible activité biodégradante et ii) à caractériser d’un point de vue fonctionnel ces

deux isolats par l’utilisation de cibles moléculaires adaptées.

Quatrième partie – Chapitre 3 : Caractérisation phylogénétique des isolats 1OP et 1TRANS

142

Chapitre3‐Caractérisationphylogénétiquedesisolats1OPet1TRANS

1- Vérification de la qualité de l’ADN matrice

Après extraction et purification de l’ADN génomique des isolats, nous avons effectué

une quantification et une évaluation de la qualité des échantillons par dosage au

spectrophotomètre à 260 et 280 nm. La qualité des ADN obtenus pour les souches 1OP et

1TRANS s’est avérée satisfaisante au regard des rapports d’absorbance (rapports A260/A280

et A260/A230 proches de 1,80 pour les deux isolats). Les résultats sont présentés dans le

tableau IV-3-1.

SOUCHE 1OP ADN génomique

SOUCHE 1TRANS ADN génomique

Concentration (ng.µL-1)

486 ± 51

371 ± 56

A260/A280

2,09 ± 0,01

2,06 ± 0,01

A260/A230

1,88 ± 0,19

1,70 ± 0,23

Tableau IV-3-1 : Quantification et évaluation de la qualité de l’ADN génomique des isolats bactériens 1OP et 1TRANS. 2- Analyse du polymorphisme de séquence des ADNr 16S amplifiés (ARDRA) des isolats Les empreintes moléculaires ont été obtenues après utilisation des deux enzymes de

restriction Alu I et Hae III, largement utilisées pour la caractérisation de communautés

bactériennes et/ou d’isolats bactériens issus de nombreux groupes (Pukall et al., 1998). Les

souches bactériennes 1OP et 1 TRANS ont montré des empreintes identiques après digestion

par Alu I, composées de quatre bandes majoritaires d’environ 70, 210, 380 et 550 paires de

bases. Dans le cas de la digestion avec Hae III, les profils ARDRA ont été également


143

identiques pour les deux isolats, mettant en évidence cinq bandes majoritaires d’environ 30,

120, 180, 210 et 300 paires de bases. Les résultats obtenus sont présentés dans les figures IV-

3-1 et IV-3-2.

Figure IV-3-1 : Empreintes ARDRA des isolats 1OP et 1TRANS générées après digestion des ADNr 16S par Alu I et migration sur gel d’agarose (1%). La taille des fragments est indiquée en paires de bases (pb).

Figure IV-3-2 : Empreintes ARDRA des isolats 1OP et 1TRANS générées après digestion des ADNr 16S par Hae III et migration sur gel d’agarose (1%). La taille des fragments est indiquée en paires de bases (pb).


144

Les profils de restriction obtenus après digestion des ADNr 16S des deux isolats 1OP et

1TRANS sont donc apparus identiques, et cela, quelle que soit l’endonucléase utilisée. En

outre, l’utilisation simultanée des deux enzymes de restriction Hae III et Alu I a également

généré des profils ARDRA identiques pour les deux isolats.

A ce stade, il nous a donc été impossible de différencier taxonomiquement les deux souches

bactériennes par l’utilisation de cette méthode moléculaire, l’analyse du polymorphisme de

longueur des séquences de l’ADNr 16S de l’opéron ribosomique bactérien n’ayant pas révélé

de différence entre 1OP et 1TRANS. Pourtant, cette technique de caractérisation moléculaire

a largement été décrite dans la littérature comme suffisamment fiable, robuste et

particulièrement adaptée comme outil d’approche taxonomique globale des microorganismes

cultivables et non-cultivables (Vaneechoutte et al., 1992 ; Martinez-Murcia et al., 1995). De

plus l’ARDRA permet généralement la discrimination de populations microbiennes jusqu’au

niveau du genre bactérien (Martin-Laurent et al., 2001).

A ce stade de notre travail, les résultats de l’ARDRA semblent donc indiquer que les deux

isolats 1OP et 1TRANS appartiennent donc au même genre bactérien. Afin d’améliorer la

discrimination taxonomique des deux isolats, nous avons souhaité utiliser une méthodologie

différente et plus résolutive que l’ARDRA, la REP-PCR.

3- Analyse des isolats bactériens par amplification des séquences répétitives (REP-PCR)

L’utilisation de la REP-PCR comme méthode d’étude taxonomique complémentaire a

été retenue pour deux raisons majeures : (i) cette méthode permet généralement de

différencier des souches bactériennes appartenant à des groupes phylogénétiquement très

proches (Versalovic et al., 1991 ; Schneider et de Bruijn, 1996 ), (ii) elle permet de réaliser

une analyse de la diversité génétique plus fine que la technique de l’ARDRA, pouvant dans

certain cas discriminer des souches microbiennes jusqu’au niveau de l’espèce (Frey et al.,

1996). Les profils REP-PCR des isolats 1OP et 1TRANS sont présentés figure IV-3-3.


145

Figure IV-3-3 : Profils REP-PCR des isolats 1OP et 1TRANS. Puits 1, 2, 5 et 6: REP PCR réalisée avec 1 ng.µL-1 d’ADN matrice. Puits 3, 4, 7 et 8: REP PCR réalisée avec 2 ng.µL-1 d’ADN matrice.

A l’issue de cette étape, les profils REP-PCR respectifs des isolats 1OP et 1TRANS se sont

avérés similaires, confirmant ainsi les premiers résultats obtenus par l’ARDRA. De plus, cinq

bandes majoritaires d’environ 550, 400, 270, 150 et 100 paires de bases ont été retrouvées

pour les deux isolats 1OP et 1TRANS.

Ces résultats suggèrent donc que les deux souches 1OP et 1TRANS appartiennent très

probablement à la même espèce bactérienne.

4- Séquençage de l’ADNr 16S des isolats 1OP et 1TRANS L’amplification, à partir de l’ADN génomique, d’une portion importante de l’ADNr 16S des

isolats 1OP et 1TRANS à l’aide des amorces universelles 27f et 1492r (Gurtler et Stanisich,

1996), a généré des amplicons de bonne qualité, de taille comprise entre 1000 et 1650 paires

de bases pour les deux souches bactériennes. Les résultats sont illustrés dans la figure IV-3-4

et le tableau IV-3-2.


146

Figure IV-3-4 : Migration sur gel d’agarose (1%) des ADNr 16S des isolats 1OP et 1TRANS après amplification PCR à l’aide des amorces universelles 27f et 1492r.

SOUCHE 1OP ADNr 16S

SOUCHE 1TRANS ADNr 16S

Concentration (ng.µL-1)

32,2 ± 1,2

40,0 ± 2,9

A260/A280

1,84 ± 0,03

1,92 ± 0,03

A260/A230

1,76 ± 0,06

1,79 ± 0,13

Tableau IV-3-2 : Quantification et évaluation de la qualité des ADNr 16S des isolats bactériens 1OP et 1TRANS, obtenus après amplification PCR et purification.

Deux réactions d’amplification PCR sur colonies (l’une pour les clones provenant de 1OP,

l’autre pour les clones provenant de 1TRANS), à l’aide des amorces T7 et SP6 et à partir de

20 colonies blanches bien distinctes, obtenues après transformation des souches Escherichia

coli DH5α™ (Invitrogen) ultra-compétentes, (1OP ou 1TRANS), ont été effectuées afin de ne

pas sélectionner de faux positifs avant le séquençage. Cela a permis de confirmer, de facto,

que les clones retenus pour le séquençage (couleur blanche des colonies) présentent bien le


147

vecteur de clonage contenant comme insert d’intérêt les ADNr 16S des isolats bactériens

respectifs. La figure IV-3-5 présente une photographie des deux banques de clones d’ADNr

16S-PCR-colonies positives utilisées pour le séquençage.

Figure IV-3-5 : Mise en culture des colonies recombinantes (colonies blanches T7-SP6-PCR positives) pour la préparation de l’ADN plasmidique (MiniPreps) destiné au séquençage, à partir des banques de clones d’ADNr 16S des isolats 1OP et 1TRANS (milieu gélosé LB + Ampicilline).

Nous avons obtenu 15 colonies blanches positives présentant l’insert d’intérêt à partir de la

banque d’ADNr 16S 1TRANS (les clones 5, 6, 11, 13 et 20 n’ayant pas été retenus) et 12

colonies positives en ce qui concerne la banque 1OP (les clones 27, 31, 32, 33, 36, 37, 38 et

39 n’ayant pas été retenus). Les figures IV-3-6 (a) et (b) présentent le résultat des deux

réactions d’amplification PCR sur colonies après migration sur gel d’agarose 1%.


148

Figure IV-3-6 (a) : Migration sur gel d’agarose (1% ) des amplicons après amplification PCR à partir des colonies blanches issues de la banque d’ADNr 16S de la souche 1OP.

Figure IV-3-6 (b) : Migration sur gel d’agarose (1% ) des amplicons après amplification PCR à partir des colonies blanches issues de la banque d’ADNr 16S de la souche 1TRANS.

Nous avons réalisé un séquençage systématique de 12 clones positifs extraits des banques

pour chaque isolat. Pour chaque séquence d’ADNr 16S, un séquençage a été effectué dans les


149

sens 5’→3’ et 3’→5’ à l’aide des amorces T7 ou SP6, afin de disposer d’un nombre suffisant

de données pour mener à bien notre analyse phylogénétique.

A l’issue du séquençage d’environ 1500 pb, soit la quasi-totalité de l’ADNr 16S de chaque

isolat, nous avons obtenu 24 séquences de très bonne qualité pour chaque isolat, douze dans

chacun des sens 5’→3’ et 3’→5’.

Le traitement des séquences provenant de 1OP et de 1TRANS par le logiciel SeqManNGen®

(DNASTAR, USA) a permis d’obtenir une séquence consensus d’ADNr 16S représentative

de chaque souche. L’alignement des deux séquences consensus a révélé une identité de

séquence voisine de 100 %. Le résultat de l’alignement est présenté figure IV-3-7.

Les séquences ont été déposées dans la base de données GenBank

(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/genbank/)sous les numéros d’accession JF303892 et JF303891

pour 1OP et 1TRANS respectivement.

A la lumière de ces résultats, nous pouvons donc conclure que les isolats 1OP et 1TRANS

sont deux souches appartenant à la même espèce bactérienne. Ce résultat est donc totalement

en accord avec les données obtenues lors de la caractérisation taxonomique, initiée par

l’analyse du polymorphisme de l’ADNr 16S (ARDRA), puis par REP PCR, ces deux

techniques n’ayant pas révélé de différence significative entre les deux isolats.

BIODE 1 AGAGTTTGATCMTGGCTCAGATTGAACGCTGGCGGCAGGCCTAACACATGCAAGTCGAGC 60 |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||| N-BIO 1 AGAGTTTGATCMTGGCTCAGATTGAACGCTGGCGGCAGGCCTAACACATGCAAGTCGAGC 60 BIODE 61 GGATGAYRGGAGCTTGCTCCTGGATTCAGCGGCGGACGGGTGAGTAATGCCTAGGAATCT 120 |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||| N-BIO 61 GGATGAYRGGAGCTTGCTCCTGGATTCAGCGGCGGACGGGTGAGTAATGCCTAGGAATCT 120 BIODE 121 GCCTGGTAGTGGGGGACAACGTTTCGAAAGGAACGCTAATACCGCATACGTCCTACGGGA 180 |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||| N-BIO 121 GCCTGGTAGTGGGGGACAACGTTTCGAAAGGAACGCTAATACCGCATACGTCCTACGGGA 180 BIODE 181 GAAAGCAGGGGACCTTCGGGCCTTGCGCTATCAGATGAGCCTAGGTCGGATTAGCTAGTT 240 |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||| N-BIO 181 GAAAGCAGGGGACCTTCGGGCCTTGCGCTATCAGATGAGCCTAGGTCGGATTAGCTAGTT 240 BIODE 241 GGTGGGGTAATGGCTCACCAAGGCGACGATCCGTAACTGGTCTGAGAGGATGATCAGTCA 300 |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||| N-BIO 241 GGTGGGGTAATGGCTCACCAAGGCGACGATCCGTAACTGGTCTGAGAGGATGATCAGTCA 300 BIODE 301 CACTGGAACTGAGACACGGTCCAGACTCCTACGGGAGGCAGCAGTGGGGAATATTGGACA 360 |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||| N-BIO 301 CACTGGAACTGAGACACGGTCCAGACTCCTACGGGAGGCAGCAGTGGGGAATATTGGACA 360 BIODE 361 ATGGGCGAAAGCCTGATCCAGCCATGCCGCGTGTGTGAAGAAGGTCTTCGGATTGTAAAG 420 |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||| N-BIO 361 ATGGGCGAAAGCCTGATCCAGCCATGCCGCGTGTGTGAAGAAGGTCTTCGGATTGTAAAG 420


150

BIODE 421 CACTTTAAGTTGGGAGGAAGGGCAGTAAGCGAATACCTTGCTGTTTTGACGTTACCGACA 480 |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||| N-BIO 421 CACTTTAAGTTGGGAGGAAGGGCAGTAAGCGAATACCTTGCTGTTTTGACGTTACCGACA 480 BIODE 481 GAATAAGCACCGGCTAACTCTGTGCCAGCAGCCGCGGTAATACAGAGGGTGCAAGCGTTA 540 |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||| N-BIO 481 GAATAAGCACCGGCTAACTCTGTGCCAGCAGCCGCGGTAATACAGAGGGTGCAAGCGTTA 540 BIODE 541 ATCGGAATTACTGGGCGTAAAGCGCGCGTAGGTGGTTCGTTAAGTTGGATGTGAAAGCCC 600 |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||| N-BIO 541 ATCGGAATTACTGGGCGTAAAGCGCGCGTAGGTGGTTCGTTAAGTTGGATGTGAAAGCCC 600 BIODE 601 CGGGCTCAACCTGGGAACTGCATCCAAAACTGGCGAGCTAGAGTATGGTAGAGGGTGGTG 660 |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||| N-BIO 601 CGGGCTCAACCTGGGAACTGCATCCAAAACTGGCGAGCTAGAGTATGGTAGAGGGTGGTG 660 BIODE 661 GAATTTCCTGTGTAGCGGTGAAATGCGTAGATATAGGAAGGAACACCAGTGGCGAAGGCG 720 |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||| N-BIO 661 GAATTTCCTGTGTAGCGGTGAAATGCGTAGATATAGGAAGGAACACCAGTGGCGAAGGCG 720 BIODE 721 ACCACCTGGACTGATACTGACACTGAGGTGCGAAAGCGTGGGGAGCAAACAGGATTAGAT 780 |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||| N-BIO 721 ACCACCTGGACTGATACTGACACTGAGGTGCGAAAGCGTGGGGAGCAAACAGGATTAGAT 780 BIODE 781 ACCCTGGTAGTCCACGCCGTAAACGATGTCAACTAGCCGTTGGAATCCTTGAGGTTTTAG 840 ||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||| |||||| N-BIO 781 ACCCTGGTAGTCCACGCCGTAAACGATGTCAACTAGCCGTTGGAATCCTTGAGRTTTTAG 840 BIODE 841 TGGCGCAGCTAACGCATTAAGTTGACCGCCTGGGGAGTACGGCCGCAAGGTTAAAACTCA 900 |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||| N-BIO 841 TGGCGCAGCTAACGCATTAAGTTGACCGCCTGGGGAGTACGGCCGCAAGGTTAAAACTCA 900 BIODE 901 AATGAATTGACGGGGGCCCGCACAAGCGGTGGAGCATGTGGTTTAATTCGAAGCAACGCG 960 |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||| N-BIO 901 AATGAATTGACGGGGGCCCGCACAAGCGGTGGAGCATGTGGTTTAATTCGAAGCAACGCG 960 BIODE 961 AAGAACCTTACCAGGCCTTGACATGCAGAGAACTTTCCAGAGATGGATTGGTGCCTTCGG 1020 |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||| N-BIO 961 AAGAACCTTACCAGGCCTTGACATGCAGAGAACTTTCCAGAGATGGATTGGTGCCTTCGG 1020 BIODE 1021 GAACTCTGACACAGGTGCTGCATGGCTGTCGTCAGCTCGTGTCGTGAGATGTTGGGTTAA 1080 |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||| N-BIO 1021 GAACTCTGACACAGGTGCTGCATGGCTGTCGTCAGCTCGTGTCGTGAGATGTTGGGTTAA 1080 BIODE 1081 GTCCCGTAACGAGCGCAACCCTTGTCCTTAGTTACCAGCACGTTATGGTGGGCACTCTAA 1140 |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||| N-BIO 1081 GTCCCGTAACGAGCGCAACCCTTGTCCTTAGTTACCAGCACGTTATGGTGGGCACTCTAA 1140 BIODE 1141 GGAGACTGCCGGTGACAAACCGGAGGAAGGTGGGGATGACGTCAAGTCATCATGGCCCTT 1200 |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||| N-BIO 1141 GGAGACTGCCGGTGACAAACCGGAGGAAGGTGGGGATGACGTCAAGTCATCATGGCCCTT 1200 BIODE 1201 ACGGCCTGGGCTACACACGTGCTACAATGGTCGGTACAGAGGGTTGCCAAGCCGCGAGGT 1260 |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||| N-BIO 1201 ACGGCCTGGGCTACACACGTGCTACAATGGTCGGTACAGAGGGTTGCCAAGCCGCGAGGT 1260 BIODE 1261 GGAGCTAATCTCACAAAACCGATCGTAGTCCGGATCGCAGTCTGCAACTCGACTGCGTGA 1320 |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||| N-BIO 1261 GGAGCTAATCTCACAAAACCGATCGTAGTCCGGATCGCAGTCTGCAACTCGACTGCGTGA 1320 BIODE 1321 AGTCGGAATCGCTAGTAATCGCGAATCAGAATGTCGCGGTGAATACGTTCCCGGGCCTTG 1380 |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||| N-BIO 1321 AGTCGGAATCGCTAGTAATCGCGAATCAGAATGTCGCGGTGAATACGTTCCCGGGCCTTG 1380 BIODE 1381 TACACACCGCCCGTCACACCATGGGAGTGGGTTGCACCAGAAGTAGCTAGTCTAACCTTC 1440 |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||| N-BIO 1381 TACACACCGCCCGTCACACCATGGGAGTGGGTTGCACCAGAAGTAGCTAGTCTAACCTTC 1440 BIODE 1441 GGGGGGACGGTTACCACGGTGTGATTCATGACTGGGGTGAAGTCGTAACAAGGTAWCCGT 1500 ||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||| |||| N-BIO 1441 GGGGGGACGGTTACCACGGTGTGATTCATGACTGGGGTGAAGTCGTAACAAGGTADCCGT 1500


151

BIODE 1501 A 1501 | N-BIO 1501 A 1501 Figure IV-3-7 : Alignement des séquences consensus des ADNr 16S des isolats 1OP et 1TRANS. BIODE : souche 1OP ; N-BIO : souche 1TRANS.

La comparaison des deux séquences consensus d’ADNr 16S avec les séquences disponibles

dans la base de données GenBank (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/genbank/) nous a permis de

conclure que les isolats 1OP et 1TRANS présentaient un haut niveau d’homologie (99 %)

avec le genre Pseudomonas de la classe des γ Protéobactéries.

Nous avons donc construit l’arbre phylogénétique à partir d’alignements multiples des

séquences de l’ADNr 16S de nos deux isolats et des séquences d’Eubactéries présentes dans

GenBank, correspondant aux souches bactériennes suivantes: Arthrobacter creatinolyticus

F75208 (HQ908759), Arthrobacter nicotianae HMF5 (GU220490), Streptomyces sp. SNI5

(GU320191), Rhizobium leguminosarum V-6 (GU306144), Agrobacterium tumefaciens

YQH34 (HQ143653), Methylopila sp. JZL-4 (FJ502233), Burkholderia cepacia RFW-8

(HQ650586), Comamonas testosteroni H18 (EU887829), Acidovorax sp. p4(HQ652596),

Pseudomonas putida A (HQ697262), Pseudomonas putida T2g (AB539810), Pseudomonas

aeruginosa P28 (HQ697285), Pseudomonas fluorescens C7R12 (AM229082), Pseudomonas

fluorescens (HQ880245), Pseudomonas sp. ADP (AM088478).

L’analyse phylogénétique nous a révélé que nos deux isolats 1OP et 1TRANS sont deux

souches bactériennes appartenant à l’espèce Pseudomonas putida.

Nous avons donc proposé de nommer nos deux isolats Pseudomonas sp. 1OP et Pseudomonas

sp. 1TRANS. Ces deux souches ont donc été classées comme Bacteries, phylum des

Proteobacteries, classe des γ protéobactéries, ordre des Pseudomonadales, famille

Pseudomonaceae, genre Pseudomonas.

L’observation macroscopique des isolats sur milieu gélosé nous a permis de mettre en

évidence que les deux souches présentaient des colonies de type S (smooth), c’est-à-dire à

surface lisse et à bords réguliers, bombées, de couleur blanche (légèrement plus opaque pour

l’isolat 1OP), de consistance plutôt crémeuse, de taille réduite et donnant des suspensions

homogènes.


152

L’observation microscopique de Pseudomonas sp. 1OP et Pseudomonas sp. 1TRANS a mis

en évidence des bactéries de type Gram- et non sporulantes. En milieu liquide, la lecture de

l’état frais nous a permis d’observer des cellules à mobilité importante de type polaire. Quel

que soit l’isolat observé, il s’agit de bacilles simples, de petite taille et de forme plutôt

allongée.

L’observation du critère biochimique par le test catalase a révélé un phénotype catalase+ pour

les deux isolats, cela étant en accord avec les données de la littérature concernant le

métabolisme de type aérobie de Pseudomonas sp.

L’arbre phylogénétique obtenu en utilisant la méthode du Neighbor-Joining est présenté

figure IV-3-8. La robustesse de l’arbre a été vérifiée par analyse par bootstraps. Les valeurs

supérieures à 90 % sont représentées par les cercles noirs sur la figure. La distance

phylogénétique est indiquée sur la barre d'échelle.

Page suivante, figure IV-3-8 : Analyse phylogénétique des ADNr 16S des isolats Pseudomonas sp. 1TRANS (NBD) et Pseudomonas sp. 1OP (BD). Les numéros d’accession GenBank des séquences d’ADNr16S utilisées pour l’analyse sont indiqués entre parenthèse dans la légende.


154

5- Conclusion Les résultats du séquençage nous permettent donc de dégager trois grandes réflexions:

(i) Nous avons pu identifier de façon formelle les deux souches bactériennes retenues à l’issue

de l’étude de biodégradation de la sulcotrione comme étant affiliées au genre Pseudomonas ;

(ii) les deux isolats obtenus lors de l’approche cultivable appartiennent au phylum des

Proteobacteria, un des quatre phyla dominants les plus fréquemment retrouvés dans les

banques d’ADNr 16S isolés à partir d’échantillons environnementaux (Dunbar et al., 1999 et

2002 ; Mc Garvey et al., 2004 ; Schloss et al., 2004 ; Acinas et al., 2005 ; Janssen, 2006 ;

Herrera et al., 2007),

(iii) Ce phylum appartient également au groupe des « big four » (Proteobacteria, Firmicutes,

Actinobacteria et Bacteroidete), décrit par Hugenholtz (2002) comme majoritaire dans les

collections de souches cultivables provenant d’échantillons environementaux (cf paragraphe

I-2-1);

(iiii) l’isolement des deux souches bactériennes Pseudomonas sp. 1OP et Pseudomonas sp.

1TRANS, appartenant à la même espèce mais présentant des phénotypes dégradants

différents, met en exergue le caractère versatile de cette capacité de biodégradation vis-à-vis

de la sulcotrione.

En ce qui concerne le phénotype dégradant de l’isolat Pseudomonas sp. 1OP, nos

résultats sont en accord avec les données de la littérature, à propos de la capacité du Genre

Pseudomonas à dégrader un nombre important de xénobiotiques présents dans

l’environnement, et notamment dans les sols. Diverses souches appartenant à ce genre

bactérien ont en effet été décrites comme capables de dégrader un certain nombre de produits

phytosanitaires issus de différentes familles. C’est notamment le cas de la souche

Pseudomonas sp. ADP, isolée à partir d'un site de stockage d'herbicides par Mandelbaum et


155

al. (1995), capable de métaboliser l'atrazine à des concentrations très élevées (80 % environ

de minéralisation à des concentrations > 1000 ppm).

Daugherty et Karel (1994) ont eux aussi isolé une souche de Pseudomonas cepacia DBO1

utilisant l’acide 2,4-dichlorophénoxyacétique comme source de carbone et/ou d’énergie.

Kamanavalli et Ninnekar (2000) ont également isolé du sol, par enrichissements successifs,

un Pseudomonas sp. dégradant le propoxur (2-isopropoxyphényl-N-méthylcarbamate). Cette

souche a été capable de se développer en utilisant ce composé comme seule source de carbone

et d'azote, à partir de concentrations relativement élevées du produit phytosanitaire (2 g.L-1) et

accumulant au cours du temps, le 2-isopropoxyphenol comme métabolite principal dans le

milieu de culture. Bajaj et al. (2010) ont également caractérisé un Pseudomonas sp. IITR01

capable de métaboliser l’α-endosulfan et l’endosulfan-sulfate. Fan et al. (2010) ont isolé puis

identifié par séquençage de l’ADNr 16S, un Pseudomonas sp. capable de dégrader un

fongicide, le carbendazime, avec un taux de dégradation voisin de 90 % au bout de 3 jours.

Ces auteurs ont proposé une voie de biodégradation dans laquelle le carbendazime est d'abord

converti en 2-aminobenzimidazole, puis transformé en 2-hydroxybenzimidazole, en 1,2-

diamino, en catéchol, et finalement en dioxyde de carbone.

A notre connaissance, il n’existait pas dans la littérature de données relatives à la dégradation

de la sulcotrione catalysée par des microorganismes isolés.

Dans le cas d’autres herbicides appartenant à la famille des tricétones, Durand et al. (2006a,

2006b et 2010) ont pu isoler, à partir d’eau de nuage, une souche bactérienne affiliée au genre

Bacillus, capable de dégrader la mésotrione en moins de 10 heures de culture et cela, pour une

large gamme de concentration en substance active (0,1 à 5 mmol.L-1). Ces auteurs ont

également pu mettre en évidence l’apparition de plusieurs métabolites différents au cours de

la période d’incubation et proposer deux voies métaboliques possibles. De même, Batisson et

al. (2009) ont isolé du sol une autre souche, également affiliée au genre Bacillus (isolat

Mes11), utilisant la mésotrione comme source de carbone et/ou d’énergie et dégradant

totalement la substance active en moins de 24 heures pour une concentration de 1 mmol.L-1.

Trois métabolites déjà identifiés par Durand et al. (2006a, 2006b et 2010) ont été retrouvés

dans le milieu de culture. Dans ce cas, il est intéressant de noter que les auteurs ont montré

que la souche tellurique Bacillus sp. Mes11 était incapable de dégrader la sulcotrione.


156

En conclusion, puisque les deux isolats 1OP et 1TRANS présentent deux phénotypes distincts

vis-à-vis du caractère dégradant mais sont deux souches appartenant à la même espèce, ce

résultat nous amène à proposer deux hypothèses pouvant probablement expliquer cette

différence phénotypique:

(i) la présence d’événements mutationnels pléiotropes chez les isolats sulcotrione-résistants,

selon un modèle aléatoire (Lederberg J. et E., 1952) ou non aléatoire, aurait sélectionné,

uniquement chez l’isolat 1OP, des cellules bactériennes aptes à se développer sur milieu

sélectif (MS) après cinq cycles de cultures liquides répétées avec pression de sélection de

l’herbicide (C1→C5);

(ii) l’intervention d’éléments génétiques mobiles (MGE), présents dans le génome de l’isolat

1OP et ayant été activés consécutivement aux conditions de cultures répétées, serait

responsable de l’apparition du phénotype dégradant.

La première hypothèse nous semble la moins probable, pour plusieurs raisons : en premier

lieu, la probabilité d’apparition de mutation est un phénomène rare (taux de mutation moyen

est de l'ordre de 10-6 à 10-7, le temps de génération constituant généralement l’unité de temps

retenue), n'affectant généralement qu'un faible pourcentage de cellules au sein d'une

population abondante. Dans le cas de nos cultures répétées (C1→C5), il semblerait que le

nombre de cycles soit insuffisant et le temps de génération trop long pour générer l’apparition

de phénotypes dégradants.

Nous préférons privilégier la deuxième hypothèse : en effet, l'implication des éléments

génétiques mobiles (MGE) tels que les bactériophages, plasmides, et transposons dans ces

processus cataboliques adaptatifs a été largement décrite dans la littérature comme des acteurs

fondamentaux du transfert génétique horizontal dans la matrice sol (Sikorski et al., 2002 ;

Thomas et Nielsen, 2005). Ces structures génétiques sont des éléments clés pour le transfert

de gènes entre bactéries (Wilkins, 1995 ; Davison, 1999 ; Nielsen et al., 2000 ; Jain et al.,

2002), contribuent directement à leur évolution, et, dans certains cas, jouent un rôle dans la

spéciation bactérienne (Majewski et Cohen, 1999 ; Bergstrom et al., 2000 ; Ochman et al.,


157

2000 ; Nielsen et van Elsas, 2001 ; Majewski et al., 2000). Dans le cas des biodégradations,

ces MGE sont de puissants outils adaptatifs pour le développement de métabolismes

alternatifs au sein des populations microbiennes (Ashelford et al., 1999, 2000 et 2003 ;

Ashelford et al., 2000 ; Top et Springael, 2003 ; Thomas et al., 2005 ; Frost et al., 2005).

L’intervention des MGE dans les biodégradations a été particulièrement décrit pour le genre

bactérien Pseudomonas, sur une gamme étendue de composés organiques (Kostal et al.,

1998 ; Chang et al., 2001; Top et al., 2002 ; Bandounas et al., 2011 ; Zhou et al., 2011 ; Zhao

et al., 2011 ; Chanika et al., 2011). De plus, de nombreuses études ont démontré que ce

potentiel métabolique modelable était souvent dû, au sein des MGE, à l’activité d’un ou

plusieurs plasmides cataboliques de type conjugatif, de taille comprise entre 50 à 220 kb

environ et /ou à la présence de gènes cataboliques à l’intérieur d’éléments transposables

(Lilley et Bailey 1997 ; Ogawa et al., 2004 ; Williams et al., 2004 ; Yano et al., 2007).

A ce stade de notre travail, nous proposons plusieurs possibilités à propos de la nature des

MGE responsables du phénotype dégradant, parmi lesquelles :

i) la présence d’un plasmide de type conjugatif, portant le ou les gènes cataboliques

impliqués ;

ii) la présence d’éléments transposables localisés sur le chromosome bactérien et

contenant le ou les gènes cataboliques ;

iii) la présence d’éléments transposables, eux-mêmes localisés sur un plasmide de type

conjugatif et contenant le ou les gènes cataboliques.

À partir de nos résultats, et en les confrontant aux schémas de dégradation classiquement

proposés pour Pseudomonas sp. il est possible d’envisager la présence simultanée de gènes

codant pour des dioxygénases à affinité et/ou activité accrues pour la sulcotrione,

responsables de l’attaque de la substance active au niveau de la partie 1,3-cyclohexanedione.

Nous avons souhaité vérifier cette hypothèse en essayant d’identifier et de localiser les gènes

cataboliques impliqués dans la dégradation de la sulcotrione chez l’isolat Pseudomonas sp.

1OP. Nous avons donc recherché la présence de gènes codant deux familles de dioxygénases

(catéchol 2,3-dioxygénase et catéchol 1,2-dioxygénase) chez Pseudomonas à l’aide d’amorces


158

hautement spécifiques, ayant déjà donné des résultats probants lors d’études similaires (Sei et

al., 1999 ; Jussila et al., 2006 ; Guzik et al., 2011).

Quatrième partie – Chapitre 4 : Caractérisation fonctionnelle des isolats 1OP et 1TRANS

159

Chapitre4‐Caractérisationfonctionnelledesisolats1OPet1TRANS

1- Préambule

Le rôle métabolique des intermédiaires catécholiques, impliqués dans les

biodégradations microbiennes en conditions aérobies et notamment chez Pseudomonas sp., a

largement été décrit depuis plusieurs décennies (Chatterjee et al., 1981 ; Chatterjee et

Chakrabarty, 1982 ; Hickey et Focht, 1990 ; Aemprapa et Williams, 1998 ; Nakai et al.,

1995 ; Lee et al., 1995 ; Wikström et al., 1996 ; Joshi et Walia, 1996a et 1996b ; Kitayama et

al., 1996a et 1996b ; Moiseeva et al., 2002 ; Otenio et al., 2005 ; Guzik et al., 2009). Le

catéchol (1,2-dihydroxybenzène) et par extension les catéchols substitués, constituent des

intermédiaires essentiels dans ces carrefours métaboliques microbiens, et, notamment, pour

des composés tels que les benzoates, naphtalènes, toluènes, salicylates, phénols et dérivés

chlorés et/ou méthylés (Dagley et Gibson, 1965; Dagley, 1986 ; Reineke et Knackmuss, 1988

; Jeenes et al., 1982). Un large éventail d'enzymes est élaboré par les microorganismes, afin

de convertir progressivement les composés aromatiques au cours d’étapes successives et de

les amener, jusqu’au stade ultime des intermédiaires catécholiques. Deux voies enzymatiques

parfaitement définies et spécifiques, la voie méta et/ou la voie ortho prennent en charge les

catéchols et leurs dérivés (cf paragraphe III-3-2-4). En ce qui concerne la voie méta, elle fut

tout d’abord mis en évidence chez des souches de Pseudomonas qui avaient la capacité de

métaboliser le phénol et également le crésol ou le méthylphénol (Dagley et Gibson, 1965).

Herrmann et al. (1995 et 1998) ont également montré que la souche Pseudomonas putida H

métabolisait le crésol grâce à la présence du gène phlH situé sur le plasmide PHE (220 kb) à

l’intérieur d’éléments transposables. Cette voie fonctionne également dans la dégradation de

phénols et de méthyl-phénols substitués pour un nombre important d'espèces de Pseudomonas

différentes (Kukor et Olsen, 1991; Shingler et al., 1989 ; Bartilson, 1990 ; Takenaka et al.,

1998). Au cours des dernières décennies, les données récoltées à propos de ces deux voies

métaboliques se sont depuis largement enrichies (Assinder et Williams, 1990 ; Loh et Chua,

2002 ; Cao et al., 2002 et 2009 ; Jimenez et al., 2002 ; Toyama et al., 2010).

Au regard de ces données, et en les confrontant à nos précédents résultats (étude du potentiel

de biodégradation et caractérisation phylogénétique des isolats), nous avons souhaité savoir si


160

nos deux souches Pseudomonas sp. 1OP et Pseudomonas sp. 1TRANS pouvaient

éventuellement exprimer ce potentiel génétique catécholique.

2- Détection des gènes XylE codant l’enzyme catéchol 2,3-dioxygénase

La catéchol 2,3-dioxygénase, codée par le gène XylE se trouvant sur le plasmide TOL pWW0

(117 kb environ), constitue une des enzymes clés de la voie catabolique méta, puisqu’elle

catalyse l’ouverture du cycle aromatique du catéchol (Kita et al., 1999). Les gènes Xyl se

trouvant sur le plasmide TOL sont organisés en opérons et sont situés à l’intérieur d’éléments

transposables (Assinder et Williams, 1994). Nous avons cherché à savoir si les gènes XylE

étaient présents dans le génome de nos deux isolats. Les résultats de l’amplification des gènes

XylE sont présentés dans la figure IV-4-1.

Figure IV-4-1 : Migration des produits PCR sur gel d’agarose (1,2%) après amplification de l’ADN génomique des deux isolats 1OP et 1TRANS, à l’aide des amorces XylEaf et XylEar. Contrôle 1 : ADN génomique E. coli DH5α ; contrôle 2 : ADN plasmidique pCambia 3300. La taille des fragments est indiquée en paires de bases (pb).

Les résultats obtenus entraînent plusieurs remarques :

(i) Le couple d’amorces XylEaf et XylEar (Jussila et al., 2007) nous a permis d’amplifier de

l’ADN génomique pour les deux isolats ;

Contrôle 1 Contrôle 2

1 Kb+

300

500

800

Isolat 1TRANS

Isolat 1OP


161

(ii) Nous avons obtenu plusieurs bandes, et cela quelle que soit la souche bactérienne

considérée ;

(iii) Les profils de migration sont différents entre les deux isolats : trois bandes d’ADN

majoritaires de 300, 500 et 800 pb environ sont observées pour l’isolat Pseudomonas sp.

1TRANS contre deux seulement (300 et de 800 pb) pour l’isolat Pseudomonas sp. 1OP ;

(iiii) La bande de taille approximative de 500 pb est retrouvée uniquement chez l’isolat

Pseudomonas sp. 1TRANS, contrairement aux bandes 300 et 800 pb environ communes aux

deux isolats,

Les deux contrôles négatifs constitués d’ADN génomique de la souche E. coli DH5α de

génotype F- (contrôle 1) et de l’ADN plasmidique (contrôle 2) n’ont donné aucun signal

d’amplification.

Jussila et al. (2007) ont montré que les amorces XylEaf et XylEar qu’ils ont dessinées,

amplifient de façon spécifique la région de 731 pb du gène XylE porté par le plasmide

archétypal TOL pWW0. Au cours de leurs travaux, ces auteurs ont également montré qu’une

température d’hybridation de 70°C lors de la PCR permettait de s’affranchir de l’obtention de

faux-positifs, consécutivement à une amplification possible des gènes nahH présentant des

séquences très comparables avec celles des gènes XylE déjà décrites par Ghosal et al. (1987).

Dans ces conditions, la bande de taille légèrement inférieure à 800 pb, retrouvée chez les deux

isolats, pourrait constituer le signal d’amplification attendu.

En revanche, l’obtention de deux bandes supplémentaires de 300 et 500 pb environ chez

l’isolat Pseudomonas sp. 1TRANS, et d’une seule bande supplémentaire de 300 pb chez

l’isolat Pseudomonas sp. 1OP, nous amène à nous interroger sur ce résultat.

A ce stade, nous avons envisagé deux hypothèses:

(i) des amplifications non spécifiques seraient responsables de la présence des fragments

additionnels de 300 et/ou de 500 pb,

(ii) l’amplification à l’aide du couple d’amorces XylEaf et XylEar est véritablement spécifique

des séquences du gène XylE, et ce résultat met donc en évidence une organisation génétique

différente de l’opéron Xyl pour les deux souches bactériennes étudiées. Dans ce cas, la


162

présence de réarrangements génétiques dans le génome des deux isolats est fortement

envisageable.

Dans la première hypothèse, il est possible que des hybridations non spécifiques soient

intervenues. Dans le cas de travaux similaires, à partir d’alignements multiples de 20

séquences de C23O extraites de GenBank, Sei et al. (1999) ont montré que l’analyse par PCR

de 12 souches bactériennes de référence exprimant la catéchol 2,3-dioxygénase, avait

également donné des fragments additionnels de différentes tailles pour quatre isolats, dont

trois souches de Pseudomonas putida (souche BH-pheB, Takeo et al., 1995 ; souche MT15-

cdo, Keil et al., 1985 ; souche mt2-pWW0 XylE, Nakai et al., 1983). Ces auteurs ont

également été confrontés au même phénomène en détectant des fragments non spécifiques

lors de « southerns » effectués sur les souches de références PCR-positives. En outre,

l’analyse par PCR de 106 isolats inconnus, présentant un phénotype dégradant vis-à-vis du

phénol et du benzoate, a également généré 35 % de fragments de taille non attendue (> 380

pb).

Jussila et al. (2007) ont dessiné les amorces XylEaf et XylEar à partir de la séquence du gène

XylE (GenBank V01161 ; Nakai et al., 1983) et par comparaison avec des séquences

homologues retrouvées dans GenBank. La spécificité de ces amorces a été ensuite testée avec

différentes températures d’hybridation (61 à 72°C), à partir d’ADN génomique purifié de 12

souches reconnues comme exprimant ou non la catéchol 2,3-dioxygénase. Ces auteurs ont

retenu une température d’hybridation de 70°C lors des cycles de PCR et ont décrit que, pour

des identités de séquences du gène XylE inférieures ou égales à 81%, des amplicons non

spécifiques avaient été obtenus avec un signal cependant très faible (souche Pseudomonas

putida HS1 avec le plasmide TOL/pDK1 ; Kunz et Chapman, 1981). Dans notre cas et quels

que soient les fragments considérés, nous avons obtenu un signal intense des bandes d’ADN,

et cela pour les deux isolats 1OP et 1TRANS.

En ce qui concerne la seconde hypothèse, plusieurs remarques sont à faire : certaines souches

de Pseudomonas sp. peuvent présenter plusieurs copies de l’opéron de la voie méta et/ou

plusieurs copies des gènes codant l’enzyme catéchol 2,3-dioxygénase. Pseudomonas putida

MT53 (DSMZ 4303) porte à la fois deux copies de l’opéron de la voie méta sur le plasmide

pWW53 et deux copies du gène codant la catéchol 2,3-dioxygénase, l’un se trouvant sur le


163

plasmide archétypal pWW0, l’autre sur le plasmide de type pDK1 (Keil et al., 1985a et

1985b ; Kok et al., 1999 ; Nojiri et al., 2004). Cette souche arbore donc trois plasmides

distincts codant pour des catéchol 2,3-dioxygénases présentant des spécificités de substrat

nettement différentes (Jussila et al., 2007). Chez Pseudomonas aeruginosa JI104, trois copies

homologues du gène XylE ont été caractérisées. Jussila et al. (2007) ont pu vérifier ces

données lors de leurs travaux avec l’utilisation du couple d’amorces XylEaf et XylEar.

La présence des gènes XylE, situés à l’intérieur d’éléments transposables sur le plasmide

archétypal TOL pWW0 (Assinder et Williams, 1990 ; Williams et al., 2004), pourrait

autoriser la mise en place d’événements génétiques de duplication/délétion, pouvant expliquer

la présence des deux fragments supplémentaires (300-500 pb). Dans ce cas, la différence de

signal obtenu entre l’isolat 1OP et l’isolat 1TRANS pourrait mettre en évidence un fort lien

de causalité entre phénotypes dégradant ou non dégradant et nombre de fragments obtenus.

Lors de la phase d’adaptation des isolats sulcotrione-resistants (développée au cours de notre

stratégie cultivable), les cultures répétées avec pression de sélection de l’herbicide auraient pu

provoquer des réarrangements génétiques par transposition et/ou recombinaison chez les

différents isolats. Jeenes et al. (1982) ont déjà décrit ce type d’évènements chez Pseudomonas

sp. Ces auteurs ont décrit des mutants présentant un nouveau phénotype dégradant vis-à-vis

de composés benzoïques halogénés, conféré par l’expression d’une catéchol 2,3-dioxygénase

non spécifique mais fonctionnelle, après une réorganisation structurale du plasmide pWW0

(délétions) et une mutation du gène XylE. A titre purement hypothétique, nous pourrions donc

envisager que les réarrangements génétiques opérés chez l’isolat Pseudomonas sp.1OP

auraient pu favoriser son potentiel dégradant vis-à-vis de la sulcotrione.

A l’issue de nos résultats, il semble intéressant d’approfondir ce ciblage des gènes codant la

catéchol 2,3 dioxygénase par l’optimisation des conditions analytiques, en testant nos deux

isolats avec d’autres couples d’amorces. Le couple 230f et C23Or, dessiné par Sei et al.

(1999) à partir d’alignements multiples de 20 séquences des gènes C23O extraites de

GenBank (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/genbank/), ciblant une région plus courte du gène

(380 pb), pourrait être testé à partir de l’ADN génomique des isolats 1OP et 1TRANS. Enfin,

l’utilisation de contrôles positifs avec des souches de référence affiliées au genre

Pseudomonas exprimant la catéchol 2,3-dioxygénase pourrait être envisagé.


164

Toutefois, afin d’identifier de façon formelle les séquences des fragments amplifiés, nous

avons souhaité séquencer l’ensemble des amplicons (300, 500 et 800 pb) pour les deux isolats

1OP et 1TRANS. Le résultat du séquençage nous permettra d’évaluer la qualité de notre

méthodologie de ciblage des gènes.

3- Détection des gènes C12O codant l’enzyme catéchol 1,2-dioxygénase

Le gène codant la catéchol 1,2-dioxygénase (C12O) a également été recherché chez nos deux

isolats Pseudomonas sp. 1OP et Pseudomonas sp. 1TRANS, selon la méthode décrite par Sei

et al. (1999), également utilisée par Guzik et al. (2011). Les résultats de l’amplification sont

présentés dans la figure IV-4-2.

Figure IV-4-2 : Migration des produits PCR sur gel d’agarose (1,2%) après amplification de l’ADN génomique des deux isolats 1OP et 1TRANS à l’aide des amorces C12Of et C12Or. La taille des fragments est indiquée en paires de bases (pb). Nous avons obtenu des produits PCR pour les deux souches bactériennes. Après migration

des amplicons, les deux isolats présentent une bande majoritaire de bonne qualité, de taille

approximative de 500 pb avec, toutefois, un signal d’intensité légèrement plus élevée pour

l’isolat 1OP. Un fragment de taille voisine de 100 pb, présentant un signal plus faible est

également retrouvé pour 1OP et 1TRANS. Toutefois, l’utilisation des amorces C12Of et

C12Or n’a pas généré, chez nos deux isolats, les amplicons de 282 pb que Sei et al. (1999)

avaient obtenus à partir de 9 souches bactériennes de référence (sur 11 au total) exprimant la


165

catéchol 1,2-dioxygénase, dont 7 souches affiliées au genre Pseudomonas. Les deux contrôles

négatifs (non présentés sur la figure IV-4-2), identiques à ceux utilisés lors de l’amplification

des gènes XylE, n’ont pas donné de réponse.

Plus récemment, avec les mêmes amorces, Guzik et al. (2011) ont également obtenu un

fragment d’amplification unique à partir de la souche Pseudomonas putida N6 (EF208895.1),

mais de taille légèrement supérieure à celui attendu (380 pb au lieu de 282 pb).

Nous avons donc effectué le séquençage de l’amplicon de 500 pb provenant de Pseudomonas

sp. 1OP et de Pseudomonas sp. 1TRANS, afin de savoir s’ils correspondaient bien à la

séquence codante du gène C12O.

4- Séquençage des amplicons XylE

Deux tentatives de séquençage des différents fragments d’ADN obtenus (800, 500 et 300 pb)

ont donné des chromatogrammes de trop mauvaise qualité pour qu’ils puissent être

correctement exploités. Un nouveau séquençage est actuellement en cours.

5- Séquençage des amplicons C12O

Nous avons séquencé la totalité des 500 paires de bases des fragments d’ADN obtenus après

amplification de l’ADN génomique des isolats 1OP et 1TRANS. Les alignements multiples,

effectués à l’aide du logiciel CLUSTALX, ont montré que ces séquences présentaient entre

elles un très fort pourcentage d’identité (supérieur à 90 %). Le résultat des alignements

multiples est présenté dans la figure IV-4-3.


166

Figure IV-4-3 : Alignements multiples des séquences provenant des fragments d’ADN (taille approximative 500 pb) obtenus lors du ciblage du gène C12O chez les isolats 1OP et 1TRANS, à l’aide du logiciel ClustalX V. 2.0.10 (Thompson et al., 1997).

Le résultat du BLAST effectué à l’aide du logiciel blastn, dans GenBank a montré que les

séquences obtenues ne correspondaient pas au gène C12O codant l’enzyme catéchol 1,2-

dioxygénase.

Toutefois, la séquence a présenté 89 % d’identité avec le gène codant l’enzyme 4-

diphosphocytidyl-2-C-méthyl-D-érythritol kinase (CMK) de Pseudomonas sp. Une analyse à

l’aide de blastx a bien confirmé que ces séquences nucléotidiques (500 pb) étaient

relativement proches de la séquence de la kinase (95 % de similarité).

Ces résultats constituent une première étape dans la caractérisation fonctionnelle des deux

isolats à propos des gènes C12O. Toutefois, il est nécessaire d’améliorer nos conditions

opératoires (PCR), puisque la détection des gènes codant l’enzyme catéchol 1,2-dioxygénase

chez 1OP et 1TRANS, à partir des conditions décrites par Sei et al. (1999), n’a pas été

possible.

167

Conclusion générale et perspectives


168

Le travail présenté a permis d’approfondir les connaissances relatives au

comportement d’un herbicide de la famille chimique des tricétones, la sulcotrione. Cette

substance active est notamment proposée dans les itinéraires techniques maïsicoles, avec des

doses d’application nettement inférieures à celles antérieurement préconisées pour des

herbicides plus anciens.

La littérature spécialisée et, plus particulièrement une étude précédemment réalisée au

Laboratoire de Chimie des Biomolécules et de l’Environnement, nous a fourni des données

importantes sur la phénoménologie comportementale de cet herbicide, que nous avons

cependant souhaité compléter par une approche « plus biologique » des processus de

biodégradation.

Grâce à des méthodes d’analyses chimiques validées et adaptées aux exigences de ce travail,

nous avons pu confirmer la réactivité biologique du sol de Perpignan vis-à-vis de la

sulcotrione. Ce sol se caractérise par un potentiel de dégradation important, puisque 90%

environ de la substance active initiale est dégradée après 30 jours, en conditions de laboratoire

(temps de ½ vie de 8 à 10 jours). Aucune différence n’a été observée entre des prélèvements

d’origine identique mais présentant des historiques de traitement différents. Parallèlement,

une étude comparable menée sur ces mêmes sols, préalablement stérilisés, a montré une

dégradation négligeable, confirmant le rôle prépondérant de la biodégradation.

Le précédent travail (H. Chaabane) faisait état, à titre de perspective, de l’éventualité de

l’installation d’un phénomène de biodégradation accélérée, lié à un processus adaptatif de la

microflore indigène consécutivement à des traitements répétés. Notre étude a donc consisté à

exposer les sols de Perpignan à quatre traitements successifs en microcosmes, afin de

caractériser d’éventuelles différences au niveau des profils cinétiques de dissipation de la

substance active. Quels qu’aient été le nombre de traitements et l’historique des sols non

stérilisés, ces profils cinétiques ont tous été très comparables. Dans nos conditions

opératoires, l’apparition d’une biodégradation accélérée de la sulcotrione n’a donc pas été

observée. Ce résultat va dans le sens de données bibliographiques qui font état de la nécessité

de traitements répétés sur des périodes beaucoup plus longues et/ou avec des doses

d’application nettement supérieures avant d’observer la mise en place d’une biodégradation

accélérée à l’échelle de la parcelle agricole. Par ailleurs, l’observation des profils de


169

dégradation, et notamment l’absence de délai de latence en début d’incubation, orientent vers

une approche co-métabolique du phénomène de biodégradation dans ce sol.

La réactivité biologique intrinsèque des sols de Perpignan (4S) et (C) a suggéré la possibilité

d’y trouver des souches microbiennes dotées de capacités génétiques à dégrader plus ou

moins spécifiquement la sulcotrione. Afin de contourner les difficultés inhérentes à la

problématique d’isolement de souches telluriques sur milieu synthétique, nous avons donc

entrepris une approche cultivable originale, s’appuyant sur l’utilisation combinée de divers

milieux de culture, dans le but de sélectionner, à partir du sol (4S), des isolats potentiellement

biodégradants. Cette stratégie expérimentale nous a permis d’isoler huit souches sulcotrione-

résistantes, parmi lesquelles une seule s’est avérée capable de métaboliser la sulcotrione. A

notre connaissance, il s’agit de la première description d’une telle souche, cultivable en

laboratoire et utilisant cet herbicide comme source de carbone et/ou d’énergie. Cet isolat

bactérien, dénommé 1OP lors de nos essais, a été formellement identifié, après séquencage de

l’ADNr 16S, comme étant affilié au genre Pseudomonas, espèce putida. Cette souche, apte à

utiliser la sulcotrione en culture liquide, a présenté un potentiel de dégradation élevé : 88 %

de la sulcotrione initiale a été dégradé au bout de 30 jours de culture, le temps de ½ vie étant

estimé à environ 15 jours. Contrairement aux données relevées lors de l’étude en

microcosmes de sol, la dissipation de la substance active correspond dans ce cas à un

processus de métabolisme direct, une phase de latence (5-6 jours) ayant été clairement mise

en évidence lors de la dégradation de la sulcotrione, qui, par ailleurs, constitue la seule source

de carbone et d’énergie du milieu. Dès la fin de cette période de latence, la cinétique observée

montre l’apparition concomitante de l’acide 2-chloro-4-méthylsulfonyl benzoïque (CMBA),

un des métabolites majeurs connus. Son augmentation est constante entre 6 et 27 jours, le

rapport molarité en CMBA / molarité initiale en sulcotrione atteignant 44 % à l’issue de

l’étude.

En revanche, la 1,3-cyclohexanedione (CHD) n’a jamais été détectée au cours de la période

de culture. Le processus de dégradation peut, dès lors, être interprété comme une attaque

ciblée de la souche Pseudomonas sp. 1OP au niveau de la partie CHD de la molécule de

sulcotrione, avec utilisation de cette partie comme source de carbone et/ou d’énergie.


170

Les données recueillies au cours de notre travail vont dans le sens de la littérature,

relativement fournie, soulignant le large potentiel catabolique du genre Pseudomonas ainsi

que son rôle largement décrit dans le domaine des biodégradations. Cependant, des études

récentes ont mis en évidence l’intervention d’un autre genre bactérien (Bacillus) dans la

biodégradation de la mésotrione, herbicide également de la famille des tricétones ; cette

souche de Bacillus sp. s’est avérée incapable de métaboliser la sulcotrione. Ce travail entraine

également une réflexion sur la place de la souche Pseudomonas sp.1OP vis-à-vis de la

diversité des communautés microbiennes du sol étudié.

Notre étude confirme également la représentativité du Phylum des Proteobacteria au niveau

de l’ensemble des souches bactériennes telluriques cultivables présentes au sein de

l’écosystème sol.

Parmi les sept autres souches bactériennes isolées du sol et sulcotrione-résistantes, mais

incapables de dégrader la sulcotrione, l’isolat 1TRANS présentait un morphotype très

semblable à celui de 1OP sur milieu gélosé. Il a été retenu comme « contrôle » comparatif lors

de l’identification phylogénétique et a été identifié comme appartenant également au genre

Pseudomonas espèce putida.

La mise en évidence d’un phénotype dégradant la sulcotrione a mis en lumière

l’extraordinaire plasticité génétique d’une fraction de la microflore du sol génétiquement apte

à dégrader certains produits phytopharmaceutiques. De plus, la caractérisation de deux

souches appartenant à la même espèce, mais présentant des phénotypes différents en ce qui

concerne le caractère dégradant vis-à-vis de l’herbicide, souligne le caractère versatile de ce

potentiel de biodégradation. Ce résultat nous amène à proposer l’intervention d’éléments

génétiques mobiles régulant ces mécanismes moléculaires adaptatifs, via la présence de

plasmides conjugatifs et/ou d’éléments transposables (séquences d’insertion ou transposons)

codant les enzymes cataboliques chez Pseudomonas sp. 1OP, intervention déjà décrite pour

diverses souches dans le cas de l’atrazine. Cette perspective évolutive, en attente de

confirmation par séquençage, va cependant dans le sens des premières données recueillies lors

notre étude fonctionnelle, effectuée sur les isolats 1OP et 1TRANS, par ciblage des gènes

codant les enzymes impliquées dans le métabolisme de la voie catécholique. La mise en

évidence, au niveau génomique, d’une réponse différente entre l’isolat 1OP et l’isolat


171

1TRANS lors du ciblage du gène codant la catéchol 2,3 dioxygénase, pourrait étayer cette

hypothèse de travail. De plus, les gènes codant la voie de catabolisme catécholique méta sont

présents chez Pseudomonas sp. et sont, dans la majorité des cas, portés par des plasmides

conjugatifs de taille supérieure à 50 kb, eux-mêmes situés à l’intérieur d’éléments

transposables.

Perspectives de travail Ces résultats expérimentaux nous ont donc permis d’approfondir l’état des connaissances sur

la dégradation biologique de la sulcotrione dans un sol agricole, mais également d’ouvrir

certaines perspectives de travail, tant dans le domaine fondamental que dans un domaine plus

appliqué pouvant conduire à une valorisation technologique.

L’isolement des éléments génétiques mobiles intervenant dans le processus de biodégradation

constituerait une première étape incontournable avant de les identifier, de la façon la plus

formelle possible, et de caractériser les mécanismes moléculaires impliqués, par

l’intermédiaire d’une approche de génomique évolutive. L’évaluation de la mobilité de ces

gènes cataboliques et leur rôle potentiel au niveau du transfert génétique horizontal au sein de

la microflore tellurique constituerait une avancée capitale dans la valorisation de ce travail.

Notre étude n’a pu que proposer des hypothèses concernant les voies métaboliques impliquées

dans la biodégradation de la sulcotrione par Pseudomonas sp.1OP en culture liquide. Ce

travail pourrait être complété, dans ce sens, par la combinaison de l’exploitation des données

du séquençage des gènes codant la catéchol 2,3-dioxygénase et l’utilisation de techniques de

mutagénèse dirigée par transposons à partir de notre souche. L’étude parallèle des cinétiques

enzymatiques à partir des phénotypes mutants obtenus aiderait également à mieux

appréhender les voies de régulation métaboliques.


172

Sur un plan purement cultivable, le pouvoir dégradant de l’isolat 1OP pourrait être testé, dans

un premier temps, sur les métabolites identifiés de l’herbicide, mais également sur divers

composés plus ou moins proches chimiquement de la sulcotrione, et, à terme, sur certains

cocktails de xénobiotiques.

Une étape supplémentaire de valorisation serait l’exploitation « conditionnelle » de la souche

à des fins de dépollution environnementale.

173

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Valorisation des travaux de recherche


208

Publicationn°1(SOUSPRESSE)

Article soumis le 30 mars 2011 à la revue Pest Management Science, corrigé le 24 mai 2011, accepté le 24 juin 2011.

Isolation and Characterization of a Bacterial Strain Degrading the Herbicide Sulcotrione from an Agricultural Soil.

Christophe CALVAYRACa,b, Fabrice MARTIN-LAURENTc, Alexia FAVEAUXa, Nathalie

PICAULTb, Olivier PANAUDb, Camille-Michel COSTE a, Hanene CHAABANEd and Jean-

François COOPERa∗

a Laboratoire de Chimie des Biomolécules et de l’Environnement (LCBE, EA 4215),

Université de Perpignan Via Domitia (UPVD), 52 avenue Paul Alduy 66860 Perpignan,

France.

b Laboratoire Génome et Développement des Plantes (UMR, 5096 CNRS-UPVD), Université

de Perpignan Via Domitia (UPVD), 52 avenue Paul Alduy 66860 Perpignan, France.

c INRA, Université de Bourgogne, UMR1229 Microbiologie du Sol et de l'Environnement,

CMSE, 17 rue Sully, BP 86510, F-21065 Dijon, France.

d Unité de recherche Protection Intégrée des Cultures, Institut National Agronomique de

Tunisie

43, av Charles Nicolle, 1082 Tunis Mahrajène, Tunisie.

∗ Corresponding author. Tel: +33 (4) 68 66 20 81 Fax: +33 (4) 68 66 81 38; E-mail : [email protected]


209

Keywords: Sulcotrione, Biodegradation, Soil, Pseudomonas putida, Metabolites.

Running title : Biodegradation of sulcotrione in soil. Intervention of Pseudomonas sp.

1- Abstract

BACKGROUND: Dissipation kinetics of sulcotrione herbicide, previously four times sprayed

on a French soil, was studied using a laboratory microcosm approach. Then, advanced

cultivation-based approach was performed to isolate bacteria responsible for

biotransformation of sulcotrione. Chromatographic methods were used as complementary

tools to define its metabolic pathway.

RESULTS: Soil microflora was able to quickly biotransform the herbicide (DT50 ca 8 days).

2-chloro-4-mesylbenzoic acid, one of its main metabolites, was clearly detected. However, no

accelerated biodegradation process was observed. Eight pure sulcotrione-resistant strains were

isolated but only one (1OP) was capable to degrade this herbicide with a relative high

efficiency and to use it as sole carbon source and energy. In parallel, another sulcotrione-

resistant strain (1TRANS) was shown to be unable to degrade the herbicide. Amplified

ribosomal restriction analysis (ARDRA) and repetitive extragenic palendromic PCR genomic

(REP-PCR) fingerprintings of strains 1OP and 1TRANS gave indistinguishable profiles.

CONCLUSION: Sequencing and aligning analysis of 16S rDNA genes of each pure strain

revealed identical sequences and a close phylogenetic relationship (99 % sequence identity) to

Pseudomonas putida. Such physiological and genetic properties of 1OP to metabolize

sulcotrione were probably governed by mobile genetic elements in the genome of the bacteria.

1 INTRODUCTION

Sulcotrione [2-(2-chloro-4-methylsulfonylbenzoyl)-1,3-cyclohexanedione] is a triketone

herbicide applied at 300-450 g ha-1 on corn crop to control the development of a wide range

of annual and perennial broadleaf weeds.

A large proportion of this herbicide reaches the soil where both abiotic (i.e sorption, chemical

degradation) and biotic (biodegradation) processes control the fate and the activity of this


210

herbicide. 2-chloro-4-mesylbenzoic acid (CMBA) and 1,3-cyclohexanedione (CHD) have

been described as two biodegradation and hydrolysis transformation products.1-8 A derivative

of phenylheptanoic acid was also described under special conditions.6-7,9 Up to now, no report

showed the existence of accelerated biodegradation of sulcotrione as a result of repeated

applications. Soil microorganisms able to transform sulcotrione are not yet described,

contrarily to mesotrione, another herbicide belonging to the triketone family.10-14 In this

context, the aim of our work was to evaluate the response of an agricultural soil, regularly

treated with sulcotrione, possibly adapted to its biodegradation, in order to isolate novel and

efficient sulcotrione degraders. Sulcotrione transformation was monitored in the soil using

chromatographic methods. Sulcotrione-degrading bacterial strain was isolated by conducting

an adaptation culture to the sulcotrione. Isolate was characterized by ARDRA, REP-PCR and

by cloning/sequencing of partial 16S rDNA sequence. Its capacity to degrade aerobically

sulcotrione was estimated.

2 MATERIALS AND METHODS

2.1. Experimental design

2.1.1. Experimental field site

The experimental field site was set up at the University of Perpignan, France (42° 40' 55" N,

2° 53' 49" E). The field was divided in two plots of 184 m² each, separated by a buffer strip.

One plot (4S) was treated with 300 g ha-1 of sulcotrione (Mikado®) four times with one month

interval. After this, plot 4S was neither pesticide treated nor cultivated for 24 months. The

second plot (C), used as control, was never treated with sulcotrione. According to FAO

classification, the soil is a clayey sandy loam soil. Soil physicochemical characteristics were:

clay 13.9 %, silt 60.5%, sand 25.6 %, soil moisture 25 %, organic carbon 0.9 %, organic

nitrogen 0.98 g kg-1, C/N ratio 9.64, cation exchange capacity (CEC) 15.5 meq 100 g-1,

Ca2+/CEC 214 % and pH in water 8.1. Soil samples were collected from the surface layer (0-7

cm) of the experimental field. Composite samples were sieved to 2 mm and stored in the dark

at 4°C until used.


211

2.1.2 Sulcotrione biodegradation

The ability of the microflora of the soil samples collected on the experimental field (4S and

C) to degrade sulcotrione was tested under laboratory conditions. Each microcosm, prepared

with 10 g of moist soil placed in Petri dishes (5.5 cm i.d.), were treated with 550 µL sterile

aqueous sulcotrione solution at 22 mg L-1 (i.e. 1.2 µ g of sulcotrione per g of soil) and

homogeneized. Treatments were applied four times at day 0, 30, 60 and 90 (T1D0, T2D30,

T3D60 and T4D90), necessiting the preparation of forty microcosms for each soil type. All

analysis were made in duplicate. In addition, autoclaved controls were set up to estimate the

occurrence of abiotic biodegradation (St4S and StC). All samples were kept in the dark to

avoid photodegradation of the sulcotrione. Thorough the incubation period, soil moisture

content was kept at 25 % (moist weight), making it comparable to field moisture. After each

treatment, each entire soil aliquot (10 g) was regularly sampled (i.e. after 0, 2, 7, 15 and 30

days) to monitor sulcotrione dissipation.

2.2. Chemical Analysis

2.2.1. Reagents

Standard of sulcotrione (98.8 % purity) – a weak acidic herbicide, pKa value 2.87, MW

328.77 g mol-1 and water solubility 165 mg L-1 at 25°C - was purchased from Sigma-Aldrich,

France. Standards of 1,3-cyclohexanedione (CHD) (97.0% purity) and 2-chloro-4-

mesylbenzoic acid (CMBA) (95.0% purity) were purchased from Fluka and Acros Organics,

respectively.

Methanol and acetonitrile (HPLC quality) were purchased from Carlo Erba, dichloromethane

for pesticide analysis from Riedel-deHaën GmbH, trifluoroacetic acid (TFA) (99.0% purity)

from Aldrich, hydrochloric acid (38.0%) from Prolabo and water was Milli-Q quality.

(Trimethylsilyl) diazomethane 2.0 M in diethyl ether was supplied by Sigma-Aldrich.

Supelclean TM ENVI-Chrom P SPE cartridges were supplied by Supelco, France.

2.2.2. Analytical procedure

2.2.2.1. Degradation of sulcotrione in soil samples

Extraction step

Soil samples (10 g) were extracted twice with 60 and 30 mL of a mixture acetonitrile /0.1 M

HCl (90/10; v/v) over 30 and 15 min periods, then filtered on a Whatman filter GF/A. The


212

organic filtrate was evaporated at 30 °C and the acidic aqueous solution was then extracted

twice with 5.0 mL of dichloromethane. The organic phase was evaporated to dryness, and the

extract was solubilized in 0.10 M HCl. It was then purified on an EnviChrom P cartridge,

eluted with methanol (5 mL) and concentrated to 1 mL. The extract was finally analysed by

HPLC. One blank (sulcotrione-free soil) was systematically included and analysed under the

same conditions.

Chromatographic analysis

Soil extracts were analysed using Shimadzu HPLC apparatus equipped with a Supelco ODS

Hypersil C18 column (5 µm, 250 mm x 4.6) and a SPD-10 Avp UV/Vis detector set at 265 nm.

The mobile phase consisted of a mixture of water acidified by 0.3 % trifluoroacetic acid (AW)

and acetonitrile (ACN), delivered at a flow rate of 1 mL min-1 and using a gradient system

[70/30 (AW/ACN) at t = 0 min to 50/50 (AW/ACN) at 8 min, then maintained for 10 min].

Analytical performance

This analytical method was an adaptation of the procedure previously published by Chaabane

et al.9 Quantification limit was estimated to 0.05 µg g-1 for sulcotrione herbicide, with a mean

recovery rate of 87 % ± 10.

2.2.2.2. Degradation of sulcotrione by the bacterial culture

Extraction step

One mL aliquots of the bacterial culture (selected among sulcotrione-resistant ones) were

centrifuged (15 min, 1100 g) at room temperature. The supernatant was recovered, acidified

with 0.3 mL of 0.16 M HCl and brought to 2.5 mL with distilled water. Then, the acidic

aqueous solution was extracted twice with 2.5 mL dichloromethane. The organic phase was

evaporated to dryness, solubilized in 1 mL methanol before analysis. No adsorption of

sulcotrione was observed on centrifuge tubes.

High performance liquid chromatography (HPLC/UV) of sulcotrione and its main métabolites

Culture media extracts were analyzed using Jasco HPLC apparatus equipped with a Supelco

ODS Hypersil C18 column (5 µm, 250 mm x 4.6) and an UV/Visible Detector Jasco 875-UV

set at 265 nm. The mobile phase consisted of a mixture of water acidified by 0.3 %


213

trifluoroacetic acid (AW) and acetonitrile (ACN), delivered at a flow rate of 1 mL.min-1. To

improve the separation of the active ingredient and its metabolites during degradation

kinetics, a gradient system [70/30 (AW/ACN) from 0 to 4 min, evolving to 40/60 (AW/ACN)

at 7 min, then maintained for 15 min] was used. Detection of sulcotrione and its main

metabolites (1,3-cyclohexanedione and 2-chloro-4-mesylbenzoic acid) was done at 265 nm.

Retention times were estimated as follows: sulcotrione (11.1 min), CMBA (5.1 min) and

CHD (4.5 min).

High performance liquid chromatography/Mass spectrometry (HPLC/ESI/MS) analysis of

metabolite 1,3- cyclohexanedione (CHD)

LC/MS analysis was carried out on a LCQ-Fleet (Thermo Fisher Scientific) equipped with an

Electrospray Ionisation (ESI) source and a 3D ion-trap analyser. LC analysis was achieved

using an Accela Thermo Fisher chromatograph equipped with an Accela 600 pump, an Accela

Autosampler and a diode array detector (Accela PDA detector). Full scan spectra from m/z 60

to 300 in both positive (source voltage 4 kV) and negative (source voltage 3.5 kV) ion modes

were recorded. Separation was carried out at room temperature using a Phenomenex Gemini

C6-Phenyl column (150 x 3.0 mm; 5 µm). The mobile phase consisted of a mixture of 0.1 %

formic acid water (A-W) and 0.1 % formic acid acetonitrile (A-ACN) delivered at a flow rate

of 0.4 mL min-1, with a gradient system: 90/10 (A-W/A-ACN) from 0 to 2 min, evoluting to

10/90 (A-W/A-ACN) at 20 min. Under these conditions, retention time of 1,3 CHD was 4.51

min. Quantification limit was estimated in positive mode to 0.5 mg L-1.

Gas chromatography/mass spectrometry (GC/MS) analysis of metabolite 2-chloro-4-

mesylbenzoic acid (CMBA) after derivatization

In presence of methanol, trimethylsilyldiazomethane (TMS) gives methyl esters in good

yields at room temperature with various carboxylic acid including aromatic, heteroaromatic,

alicyclic and aliphatic ones. The esterification proceeds instantaneously and quantitatively

when an excess of TMS is used and the reaction can be easily monitored by the disappearance

of the yellow colour.15

Twenty five µL of TMS prepared in diethyl ether solution was added to 0.5 mL of culture

media extract mixed with 0.5 mL of methanol. After 2 hours reaction time, the extract was

analysed by GC/MS.


214

GC/MS analysis was carried out on a Focus GC connected to a mass spectrometric detector

DSQII (Thermo Fisher Scientific) equipped with a column G-SQC GC, 15 m x 0.25 mm x

0.25 µm (5% Phenyl Methylpolysiloxane), initial oven temperature 80 °C, for 1 min raised at

10°C min-1 to 260 °C for 15 min; carrier gas helium 6.0; electron impact mode 70 eV; full

scan mode; split injection mode; transfer line temperature 300 °C. Under such conditions,

retention time of methylated CMBA was 14.81 min and characteristic m/z ions were 155, 217

and 248 (Fig. 1). A calibration curve was established on m/z 217 for the range of

concentration 0.4 to 20 mg L-1 (y = 364 x – 62, r² = 0,996).

Analytical performances

Culture media samples were spiked with known amounts of analytical standards of

sulcotrione, CHD and CMBA (2 to 30 mg L-1). Calculations were made by HPLC/UV and/or

GC/MS, after analysis in duplicate, using calibration curves. The mean recoveries were

estimated at 75 ± 6 %, 55 ± 8 %, 75 ± 10 % for sulcotrione, CHD and CMBA, respectively.

The limits of quantification, defined as the sample concentration required giving a signal-to-

noise ratio of 5:1, were estimated to 0.5 to 1.0 mg L-1.

2.3. Isolation of sulcotrione degrader

2.3.1. Culture media and cells preparation

A culture medium (NS), where the nutrient source was the control soil C, was prepared and

used to promote the growth of bacteria previously described as hardly cultivable on the

conventional culture media.16 Briefly, soil was sieved through a 2 mm mesh, dried at 65 °C

for 3 days. The culture media was prepared by adding 40 g of soil and 2 g of agar in a final

volume of 100 mL of deionised water. After sterilization the medium was supplemented with

sterilized solutions of sulcotrione (30 mg L-1) and of cycloheximide (50 mg L-1) and poured

into Petri dishes to solidify.

A sterile mineral salt medium (MS), modified from Rousseaux et al.,17 was used for both the

adaptation culture and the biodegradation assays of sulcotrione-degrading strains. This

medium contained per litre: 1.6 g K2HPO4, 0.4 g KH2PO4, 0.2 g MgSO4.7H2O, 0.1 g NaCl,

0.002 g CaCl2, 3.5g (NH4)2SO4, 30 mg sulcotrione, 1 mL of salt stock solution, 1mL of

vitamin stock solution, 1mL of FeSO4.6H2O stock solution (5 g L-1). The salt stock solution

contained 2 g boric acid; 1.8 g MnSO4.H2O, 0.2 g ZnSO4, 0.1 g CuSO4, 0.25 g Na2MoO4 (per


215

litre). The vitamin stock solution contained 100 mg L-1 of thiamine-HCl and 40 mg L-1 of

biotin. 0.2 µm filter sterilized sulcotrione, FeSO4.6H2O, and vitamin stock solutions were

added to the medium after sterilization. pH was adjusted at 7.7 with aqueous 0.1 M NaOH

solution. A solid sulcotrione-MS medium obtained by adding 15 g L-1 agar (Biokar

Diagnostics, France) was used to test the capacity of the strains to growth on such solid

medium.

Triptic soy broth medium (TS) obtained by adding 15 g L-1 agar (Biokar Diagnostics, France)

supplemented with sulcotrione (30 mg L-1) was used to purify bacterial strains by successive

stricking. A sulcotrione-(TS) medium (BioMérieux, France) was also used to improve

microbial biomass culture during batch cultures for degradation assays. Microbial biomass

was harvested by centrifugation (15 min, 1600 g at 4°C) and the pellet was washed twice with

Knapp buffer (1 g KH2PO4 ; 1 g K2HPO4 ; 4 mg FeCl3 ; 40 mg MgSO4.7H2 , per litre of

deionized water, pH 6.6) as described earlier18 before being resuspended in sulcotrione-MS

medium to obtain an absorbance of ca 0.3 at 600 nm.

2.3.2. Adaptation cultures to the sulcotrione

Ten grams of soil 4S were suspended in 90 mL 0.9% NaCl and placed on orbitary shaker at

200 rpm for 30 min. Duplicates were carried out. Five hundred µL soil suspension aliquots

were plated on NS-sulcotrione or NS medium. Plates were incubated in the dark at 28°C for 7

days. Growing colonies identified as sulcotrione-resistant strains and/or possible degraders

were selected, grown in 100 mL of Triptic soy broth (TS) medium supplemented with

sulcotrione for 24 hours at 30°C under agitation. They were then plated on TS agar with

sulcotrione.

For each isolated bacterial strain, a selective adaptation step was then carried out by

performing five successive cultures (A1 to A5) in 100 mL sulcotrione MS medium at 28°C

under agitation at 150 rpm for 20 days. Subsequent studies were performed using A5

adaptation solutions.

2.3.3. Estimation of sulcotrione-degrading capabilitiy of the bacterial isolates

One mL of the A5 bacterial culture was grown in TS supplemented with sulcotrione. After 15

hours of culture, bacterial cells were harvested in the late-exponential-growth phase, by

centrifugation (15 min, 1100 g, 4 °C). The bacterial pellet was washed twice with Knapp


216

buffer and was resuspended in sulcotrione-MS medium to obtain an absorbance of ca 0.3 at

600 nm. They were then incubated at 28°C in the dark on an orbital shaker (200 rpm). One

mL aliquot of each bacterial suspension was then regularly sampled (0, 6, 15 and 27 days) and

analyzed to establish the kinetics of degradation of sulcotrione and of appearance of its main

metabolites. These degradation tests were realized in triplicate. One control without bacterial

inoculums was also included.

2.3.4. ARDRA, REP-PCR, partial 16S rRNA cloning and sequencing

The extraction of bacterial genomic DNA was done following the protocol previously

described by Cheneby et al.19 and purified using the GENECLEAN® Turbo Kit according to

the manufacturer’s instructions (MP Biomedicals, Europe). DNA quality was checked by 1%

(w/v) agarose gel 1x TBE buffer and quantified by spectrophotometry (NanoDrop® 2000,

Thermo Fisher Scientific).

Partial 16S rRNA sequences were amplified by PCR in 50 µL volume reaction containing 1

µM concentration of the universal primers 27f (5’-AGA GTT TGA TCM TGG CTC AG-3’)

and 1492r (5’-TAC GGH TAC CTT GTT ACG ACT T-3’), 200 µM of each dNTP (Promega,

USA), 2.5 U of GoTaq DNA polymerase (Promega, USA) and 25 ng of DNA.20 PCR

reactions were carried out in a PTC-200 gradient cycler (MJ Research) under the following

conditions: 5 min at 94°C, 35 cycles of 1 min at 94°C, 1 min at 55°C, and 2 min at 72°C, plus

an additional 15-min cycle at 72°C. PCR products were then separated by electrophoresis on a

1% agarose gel, purified using the GENECLEAN® Turbo Kit and quantified by

spectrophotometry.

ARDRA profiles were obtained by digesting 16S rRNA PCR fragments (7 µL) with the

restriction endonucleases Alu I and Hae III (New England Biolabs®) overnight at 37°C. The

obtained restriction fragments for each isolate were separated on a 2% (v/w) Metaphor

agarose gel in 1x TBE buffer (80 V for 3.5 h).

Repetitive extragenic palendromic PCR (REP-PCR) was carried out with REP1R-I and

REP2-1 primers which targets the conserved stem of each REP-like sequence in the

genome.21 DNA amplification was carried out in a 25 µL mixture using 50 ng of extracted

DNA as template in 5 µL of 5x Giescher buffer [83 mM (NH4)2SO4; 335 mM Tris HCl, pH

8.8; 150 mM β -mercaptoethanol; 33.5 µM EDTA, pH 8.8], 6.5 mM MgCl2, 0.16 mg mL-1

Bovine Serum Albumin (BSA, New England Biolabs®), 1.25 mM of each dNTP, 0.1 µL mL-1


217

dimethyl sulfoxide, 2 µM of each of the two primers (REP1R-I and REP2-1) and 1 U of

GoTaq DNA polymerase. Amplifications were carried out in a PTC-200 gradient cycler (MJ

Research): 1 cycle at 95 °C for 6 min, 30 cycles at 94°C for 1 min, 40°C for 1 min and 65°C

for 4 min, plus an extension cycle at 65°C for 16 min.17 Amplified DNA fragments were

separated by electrophoresis on 1% agarose gel. PCR reactions were performed independently

in duplicate to ensure the consistency of the REP-profiles obtained.

16S rRNA PCR products were cloned into the pGEM-T Easy vector according to provider’s

recommendation (Promega, USA). Recombinant plasmids of interest were then purified by

using Wizard® Plus Minipreps DNA Purification Systems kit (Promega). Both DNA strands

of the insert were sequenced with an Applied Biosystems Hitachi 3130xl Genetic Analyzers

by using SP6 and T7 primers. Sequences of recombinant clones from the degrading and the

non-degrading strains were treated by SeqManNGen® software (DNASTAR, USA) to provide

consensus sequences and then were compared to known sequences found in the GenBank

database using Blast.22 Sequences were deposited in GenBank under the accession numbers

JF303891 (1TRANS strain) and JF303892 (1OP strain). Multiple alignments were realised

using the ClustalX programme.23 Phylogenetic tree was elaborated using the NJ plot

programme.24

3 RESULTS AND DISCUSSION

3.1. Sulcotrione degradation kinetics in Perpignan soils

The microflora of the Perpignan soil was previously shown to transform sulcotrione to CHD

and CMBA by cleaving the bound between 1,3-cyclohexanedione (CHD) and the benzoic

ring.3 Here we report the transformation of sulcotrione observed only in 4S and C soils and

not in both sterilized soil (StC and St4S), further confirming that the predominace of the biotic

pathway for sulcotrione dissipation in the soil of Perpignan. Similar kinetics of dissipation

were observed in C and 4S soils which were differing by the herbicide treatment, the first

being never treated with it and the last having been treated four times at the agronomic dose

24 months ago. Indeed, after 30 days of incubation (treatment 1), almost 90 % of the applied

sulcotrione was dissipated with half-lives averaging 8 days, without significant differences

between C and 4S plots. For both soil no lag phase period was observed, which suggests that

co-metabolic process is responsible for sulcotrione dissipation. By fitting sulcotrione

dissipation kinetics with R² values close to 0.9, one could observe similar half life (DT50 ≈ 8


218

days) and dissipation rates (k ≈ 0.08 day-1) in C and 4S soils (Table 1). As compared to the

literature, sulcotrione dissipation recorded in the soil of Perpignan is rather rapid when

considering DT50 values.3,4,6-8,25 In addition, since the plots C and 4S showed similar capacity

to dissipate sulcotrione, beside different herbicide treatment, the possible accelerated

biodegradation (ABD) of sulcotrione seems unlikely. To further explore this possibility, C

and 4S soils were submitted to 3 additional sulcotrione treatments under laboratory conditions

(T2D30, T3D60 and T4D90). Similar kinetics of dissipation of sulcotrione and kinetics

parameters (k and DT50) were observed in these two plots differing by their scenario of

exposure to the sulcotrione (Table 1). In addition, no correlation could be found between the

rate of degradation (k) and the number of sulcotrione treatments. These results further confirm

that sulcotrione degradation is most likely resulting from co-metabolic process and that

accelerated biodegradation was not occurring in the soil of Perpignan. This feature was also

observed for several other herbicides belonging to s-triazine or substituted ureas families, for

which degradation was for a long period resulting from co-metabolic activity of the soil

microflora prior to the adaptation of the soil microflora to metabolic degradation relying on

specific catabolic pathways. The switch between co-metabolic and metabolic degradation of

these two classes of herbicides occurred after almost 30 years of repeated exposure to these

compounds of the agricultural fields. In order to get a better insight in the processes involved

in the dissipation of sulcotrione from the soil of Perpignan, adaptation cultures already shown

to be successful to isolate different pesticide degrading strains including atrazine, isoproturon,

carbofuran, mesotrione was established.10-11,26-29

3.2. Isolation of sulcotrione-degrading bacterial cultures

The first step of the isolation process relied on the use of a soil agar medium NS

supplemented with sulcotrione, adapted from Ferreira et al.,16 and which was shown to

promote the growth of pesticide-degrading bacterial strains known to be difficult to cultivate

on conventional media, like most of the soil microbes. Starting from soil suspensions plated

on NS-sulcotrione medium, numerous bacterial colonies showing different morphotypes

grew. Eight colonies of the dominant morphotype, forming little white colonies, showing

viscid consistency without mycelial growth were further purified by successive plating.

Excepted their opaque or translucent appearance, these isolates showed comparable

morphology, forming white colonies with a diameter of ca 2.5 mm and following


219

characteristics: smooth, circular form, convex elevation. Each of the eight colonies was then

cultivated repeatedly on MS-sulcotrione (A1 → A5) where they were able to grow.

Nevertheless, as agar can also represent a source of carbon, the aptitude of this bacterial

isolates to degrade sulcotrione was checked in MS-sulcotrione liquid medium.

3.3. Estimation of sulcotrione-degrading capacity of bacterial isolates

To get enough microbial biomass to set up a batch experiment to follow sulcotrione

transformation, each of the eight cultures were grown for 15 h in TS-herbicide medium. They

were then diluted to 0.3 OD at 600 nm in MS herbicide-supplemented medium. Dissipation of

herbicide and concomitant accumulation of CMBA and CHD in the culture medium was

monitored by high performance liquid chromatography. Among the eight isolates tested here,

only 1OP showed an increased OD from 0.3 to ca 0.7 after 30 days of incubation (Fig. 2),

reflecting a bacterial growth using sulcotrione as carbon source. 1TRANS, one of the seven

non growing strains was chosen as a non-degrading control. No significant growth was

measured neither for 1OP nor 1TRANS in MS sulcotrione-free medium under the same

incubation conditions. One could conclude that no interfering carbon sources are contained in

MS medium and, that sulcotrione most likely constitutes the sole carbon and energy source

for the growth of 1OP strain. HPLC/UV monitoring clearly showed the dissipation of

sulcotrione in 1OP culture and not in the two controls 1TRANS, the non-degrading isolate,

and the uninoculated MS-sulcotrione medium (Fig. 3). Sulcotrione dissipation was clearly

effective after six days lag phase which was in accordance with the lag phase observed for the

biomass development (Fig. 2). One could hypothesize that this lag phase is the time necessary

to induce the expression of the genes and the synthesis of the catabolic enzymes responsible

for sulcotrione transformation. From the seventh day of incubation, sulcotrione dissipation

kinetics could be reasonably described by a first-order kinetics (C = 121 e-0.081t, R² = 0,993, n

= 3). DT50 could be estimated to ca 15 days after the beginning of the incubation.

During the time course of sulcotrione transformation, one could observe the appearance of 2-

chloro-4-mesylbenzoic acid (CMBA), known as the main metabolite of sulcotrione herbicide

(Fig. 3). It has to be noticed that this metabolite was not observed in none of the two controls

1TRANS, the non-degrading isolate, and in the uninoculated MS-sulcotrione medium. CMBA

was detected from the sixth day of incubation which is in accordance with the lag phase

observed for the initiation of sulcotrione disappearance. After 1 month of incubation, the


220

concentration of CMBA reached 12 ± 1 mg L-1 (48 ± 3 µM) in the culture medium. This

result was confirmed by GC/MS analysis after derivatization of CMBA to give the

corresponding methyl ester. In addition, one could observe that molar recovery taking into

account sulcotrione and CMBA was slightly decreased between day 15 (0.065 ± 7 µmole L-1

+ 0.025 ± 2 µmole L-1, respectively) and day 27 (0.017 ± 2 µmole L-1 + 0.048 ± 3 µmole L-1,

respectively), suggesting a possible degradation of benzoic acid derivative CMBA by 1OP.

Finally, based on the results presented here, one could conclude that 1OP strain was capable

of using sulcotrione as a carbon source for its growth by degrading sulcotrione to CMBA.

1,3-cyclohexanedione (CHD), the other degradation product of sulcotrione, previously

identified at very low concentrations in the Perpignan soil3 was not detected (< 0.2 mg L-1) in

the culture media of strain 1OP neither by HPLC/UV nor by HPLC/MS/MS. One could

explain this discrepancy by chemical transformation by hydrolysis of CHD to 5-oxohexanoic

acid at pH>7, or by an oxidation mechanism catalysed by enzymatic cleavage of C-C bonds

in the β -diketone before entering the tricarboxylic acid cycle (TCA), as previously

reported.30,31-32 It is noteworthy that for mesotrione, another herbicide belonging to triketone

family but with a nitro radical, a minor metabolic route catalysed by a Bacillus sp. with a

comparable mechanism was reported.11-12

3.4. Characterization of sulcotrione degrading (1OP) and non-degrading (1TRANS) strains

by ARDRA, REP-PCR and 16S rDNA sequencing

The amplified ribosomal rDNA restriction analysis technique (ARDRA) has been reported as

a reliable and valuable tool for phylogenetic and taxonomic studies of large sets of cultured or

uncultured microorganisms from different habitats.33-36 In this study, 1OP and 1TRANS

isolates strains were characterized by ARDRA with AluI and HaeIII restriction

endonucleases. 1OP and 1TRANS bacterial strains showed similar ARDRA profiles made of

four major bands of approximately 550, 380, 210 and 70 bp in length. In order to get more

taxonomical information than the genus level offered by ARDRA fingerprinting 1OP and

1TRANS isolates were analysed by repetitive extragenic palindromic-PCR (REP-PCR) which

provides a rapid identification of bacterial isolates and are useful for the analysis of

prokaryotic genomes.18,21 Again 1OP and 1TRANS bacterial strains showed similar REP-

PCR profiles made of five major bands of approximately 550, 400, 270, 150 and 100 bp in

length (Fig. 4). This observation suggests that 1OP and 1TRANS belong to the same bacterial


221

species. 16S rRNA sequencing further revealed that these two isolates showed identical 16S

rRNA sequences. We conclude that these isolates were different strains from the same

species. Comparison of 16S rRNA sequence with those found in GenBank showed highest

level of similarity (99% of similarity) to Pseudomonas sp. Furthermore, multiple alignments

revealed that 1OP and 1TRANS 16S rRNA sequences were closely related to Pseudomonas

putida strains both for 1OP and 1TRANS (Fig. 5). Based on 16S rDNA phylogenetic data, we

suggest naming our sulcotrione-degrading isolate Pseudomonas sp. 1OP. It was classified as

Bacteria, phylum Proteobacteria, class Gammaproteobacteria, order Pseudomonadales,

family Pseudomonaceae and genus Pseudomonas, with the following characteristics: rod

shaped, Gram-negative, one or more flagella providing motility, positive catalase test and

non-spore forming bacteria. Several strains belonging to Pseudomonas genus able to degrade

various pesticides have been described earlier among which Pseudomonas sp. ADP degrading

atrazine,37Pseudomonas cepacia DBO1 degrading 2,4-dichlorophenoxyacetic,38 Pseudomonas

sp. degrading propoxur (2-isopropoxyphenyl-N-methylcarbamate).39 Interestingly, the

isolation of two strains identical from the taxonomical point of view but differing by their

sulcotrione-degrading capacity, highlights the versatility of the degrading character. One

could hypothesize that such versatility might be due to mobile genetic elements (MGE)

surrounding catabolic genes in the genome of 1OP. MGE as plasmids, transposons, integrons,

genomics islands and bacteriophages were acting as a powerful evolutionary engine and

regulator on microbial populations and were collectively referred as drivers or vectors of “the

horizontal gene pool”40,41. Such properties are known to be associated with various strains of

genus Pseudomonas and its relatives, and were often specified by large (> 50kb) catabolic

plasmids, though the catabolic genes could also be loaded on transposable elements.42-44

Further work will aim to differentially characterize the genetic determinants of the

sulcotrione-degrading ability of Pseudomonas sp. 1OP.

4 CONCLUSION

This work confirms the aptitude of the soil microflora of Perpignan to transform the

sulcotrione, although no enhanced biodegradation was observed after repeated exposure to

this herbicide. We report for the first time the isolation of a sulcotrione-degrading strain,

identified as Pseudomonas putida strain 1OP. This bacterial strain was shown to transform

sulcotrione to 2-chloro-4-mesylbenzoic acid (CMBA). Nevertheless, 1,3-cyclohexanedione


222

(CHD), another known sulcotrione metabolite was not detected. Based on the evolution of the

molar recovery of sulcotrione and CMBA during the time course of dissipation kinetics, we

hypothesized that Pseudomonas putida strain 1OP may start degrading the benzoic acid

derivative (CMBA) several days after its formation in the liquid medium.

ACKNOWLEDGEMENTS

The PhD work of Christophe Calvayrac was funded by Bayer Cropscience. The authors also

acknowledge the members of Laboratories of UPVD (LCBE, LGDP, IMAGE and IUT),

INSA Toulouse and INRA Dijon, France.

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227

Fig. 1: Electronic impact/mass spectrometry (EI/MS) spectrum of methylated CMBA

analytical standard

(20 mg L-1).

!


228

Fig. 2: Growth measurement of strain 1OP vs 1TRANS on mineral salt medium (MS)

supplemented with sulcotrione (100 µM).

!


229

Fig. 3: Dissipation of sulcotrione and accumulation of CMBA by strain 1OP vs control and

strain 1TRANS in liquid mineral salt medium MS supplemented with sulcotrione (100 µM).

Errors bars indicated standard deviation.

!


230

Fig. 4: REP PCR analysis of the isolates 1OP and 1TRANS. REP-PCR were performed in

duplicate for each isolate with 1 ng µL -1 or 2 ng µL -1 of DNA. Lane M represents the

molecular-weight marker 1 Kb Plus DNA Ladder (sizes indicated in base pairs). Lanes 1 and

2: 1TRANS (1 ng µL-1), lanes 3 and 4: 1TRANS (2 ng µL-1), lanes 5 and 6: 1OP (1 ng µL-1),

lanes 7 and 8: 1OP (2 ng µL-1).

!


231

Fig. 5 Neighbor-joining phylogenetic analysis resulting from the multiple alignment of 16S

rRNA gene sequences of Pseudomonas putida strains 1TRANS (NBD) and 1OP (BD) with

those retrieved from GenBank database Arthrobacter creatinolyticus strain F75208

(HQ908759), Arthrobacter nicotianae strain HMF5 (GU220490), Streptomyces sp. SNI5

(GU320191), Rhizobium leguminosarum strain V-6 (GU306144), Agrobacterium tumefaciens

strain YQH34 (HQ143653), Methylopila sp. JZL-4 (FJ502233), Burkholderia cepacia strain

RFW-8 (HQ650586), Comamonas testosteroni strain H18 (EU887829), Acidovorax sp.

p4(HQ652596), Pseudomonas putida strain A (HQ697262), Pseudomonas putida strain T2g

(AB539810), Pseudomonas aeruginosa strain P28 (HQ697285), Pseudomonas fluorescens

strain C7R12 (AM229082), Pseudomonas fluorescens strain (HQ880245), Pseudomonas sp.

strain ADP (AM088478). Bootstrap values greater than 90 % are marked as black circles. The

phylogenetic distance is shown on a scale bar.

!


232

Table 1: Degradation coefficients (k) and half-live (DT50) for all soils.

k (days-1) DT50 (days) R2

Treatment 1 (T1D0)

0.083

8

0.894 Treatment 2 (T2D30) 0.060 11.5 0.955

C Plot Treatment 3 (T3D60) 0.100 7 0.989 Treatment 4 (T4D90) 0.100 7 0.962

Mean value

0.085 ± 0.020

8 ± 2.5

-

Treatment 1 (T1D0)

0.088

8

0.872

Treatment 2 (T2D30) 0.093 7 0.936 4S Plot Treatment 3 (T3D60) 0.068 10 0.955

Treatment 4 (T4D90) 0.089 8 0.828

Mean value

0.084 ± 0.012

8 ± 2.0

-

StC Plot

Treatment 1 (T1D0)

0.0004

-

-

St4S Plot

Treatment 1 (T1D0)

0.0004

-

-


Publication n° 2

Pest Management Science Pest Manag Sci 64:86-93 (2008)

Behaviour of sulcotrione and mesotrione scí where sciencemeets business

in two soils www.sod.org

Hanene Chaabane, 1 Emmanuelle Vulliet,2 Christophe Calvayrac, 1

Camille-Michel Coste 1 and Jean-Franyois Cooper 1 * 1 Laboratoíre de Chímíe des Bíomo/écu/es et de /'Envíronnement, Centre de Phytopharmacíe, Uníversíté de Perpignan, 52 avenue Pau/

A/duy, 66860 Perpignan, France

2Service Central d'Analyses, CNRS, Chemin du Canal - BP 22- 69390 Vemaison, France

Abstract: The behaviour of sulcotrione, a recendy introduced triketone herbicide, in various soil types was studied under laboratory conditions. In particular, degradation and sorption processes were examined on Ghent and Perpignan soils. Kinetics showed that the degradation ofsulcotrione \vas influenced by biotic andlor abiotic factors. Half-lives ranged between 45 and 65 days. Among the degradation compounds identified were 1,3-cyc1ohexanedione (CHD) and 2-chloro-4-mesyl benzoic acid (CMBA) , previously described as hydrolysis products, and, under special conditions, a derivative ofphenylheptanoic acid (PHD). This new degradation product suggested that sulcotrione could follow two possible pathways in the soil, as in water. During the sorption study, a moderate retention of sulcotrione and CMBA relative to CHD and PHD, which were high1y adsorbed whatever the soil type, was reported. Experlments carrled out under the same conditions for sulcotrione and mesotrione, another triketone herbicide recommended in maize culture, made it possible to compare the two·triketones and to conclude that they exhibited relatively similar behaviour in the soil, Le. that their leaching potential needs to be proper1y addressed and risks evaluated. © 2007 Society of Chemical Industry

Keywords: sulcotrione; mesotrione; sol1; degradation; degradation products; sorption

1 INTROOUCTION Among the long list of pesticides used for weed contro 1 in maize, two triketone herbicides, sulcotrione [2-(2-chloro-4-mesylbenzoyl) cyclohexane-l ,3-dione] and mesotrione [2-( 4-mesyl-;2-nitrobenzoyl) cydohexane-1,3-dione] (Fig. 1), have proved their efficiency against a broad spectrum of weeds. 1,2 Their target enzyme is 4-hydroxyphenylpyruvate dioxygenase,3-5 the inhibition of which leads to disturbance of plastoquinone and a-tocophérol biosynthesis. Intermil symptoms are bleaching followed by necrosis and death oftreated plants. Sulcotrione and mesotrione are mainly recommended for post-emergence treatments, at respective application doses of 300 and 150 g ha -[ , lower than those of atrazine or pendimethaline.

After direct application andlor foliage wash-off, a large proportion of these triketone herbicides reaches the soil, which always plays a key role in their environmental fate. Soil sorption and degradation, the major processes controlling pesticide actlVlty, persistence and availability for transfer, are affected by soil properties such as pH, day and organic matter corrtents, tJ.~e nature of the chemical arra environmental conditions.

Literature concerning sulcotrione and mesotrione provides only a few reports about their behaviour in soil. Recent work has shown that sulcotrione exhibits

a moderate retention capacity, whatever the selected soil. 6 Comparable results have beeri t;eported for mesotrione.7

For the degradation process, half-lives calculated for sulcotrione and mesotrione have varied respectively between 2 and 144 days and between 4 and 32days.7-10

The aim of this work was to assess the degradation and sorption of sulcotrione and to compare these with the degradation and sorption of mesotrione under the same conditions. Their leaching potential towards water resources could then be evaluated according to their adsorption coefficients and half-lives.

2 MATERIALS ANO METHOOS 2.1 Chemicals Standards of sulcotrione (purity 99.2%, molecular mass 328 and water soIubility 165 mg L -1 at 25 oC) and mesotrione (99.6%, molecular mass 339 and water solubility 160 mg L -1 at 20 OC) were respectively purchased from RiedeI-deHaen Gmbh (Germany) and supplied by Syngenta (France). Both sulcotrione ana mesotrione are weak acidic herbicides, with pKa values of 2.87 and 3.12.

Standards of 1,3-cydohexanedione (CHD) (97.0%) and 2-chloro-4-mesylbenzoic acid (CMBA) (95.0%)

233


o o el

6:~ 1iSO'CH'

Sulcotrione Mesotrione

Figure 1. Molecular structures of sulcotrione and mesotrione.

were respective1y supplied by Fluka and Acros Organics. The phenylheptanoic acid derivative (PHD) was synthesised as previously described. 11

Methanol and acetonítrile (HPLC quality) were purchased from Carlo Erba, dichloromethane (for pesticide analysis) from Riede1-deHaen GmbH, trifluoroacetic acid (TFA) (99.0%) fromAldrich, hydroch10-ríe acid (38.0%) from Prolabo and water was Milli-Q quality. Stock solutions of each compound were prepared at 1000 mg L -1 in methanol. For retention studíes, working solutions (0.25, 0.5, 1, 2.5, 10, 20 and 30 mg L -1) were prepared by di1ution of each stock solution in distilled water, with the methano1 percentage never exceeding 3%.

Supe1clean™ EnviChrom P eartridges (3 mL, 0.25 g) were purchased from Supelco and used for solid-phase extraction of soil samples.

2.2 Soils Two soils, Perpignan (France) and Ghent (Be1gium), were se1eeted aecording to their physicoehemical properties (Tab1e 1). The Freneh soi1 (a clayey sandy loam soil, aeeording to FAO classificatíon) was free of any sulcotrione and/or mesotrione treatments, whereas the Be1gian one (a sandy 10am soíl) had been treated yearly with sulcotrione from 1992 until 2003. The two soi1 types were presieved to <2 mm and air dried at ambient temperature. Pedo10gica1 analyses were earried out by Laboratoire d' Ana1yses Agrieoles, Perpignan, Franee, and Laboratory of Herbology, Ghent Universíty, Belgium. Soíl moisture contents were determined in the authors' 1aboratory aecording to the method published by Mathieu and Pieltain 12 as 3.4 and 1.60% for the soil of Perpignan and Ghent respective1y.

2.3 Degradation process In order to assess the relative parts of the abiotic and biotic ways in the degradation proeess, the kinetics of degradation were determined using three protocols:

Table 1. Physicochemical properties of selected soils

CECb Clay (%)

Silt

(%) Sand OCa (meq Ca2+¡ (%) pH (%) 1009-1) CEC (%)

Perpignan 13.9 60.5 25.6 8.1 0.9 Ghent 23.0 41.4 35.6 6.6 2

a Organic Carbono b Cation Exchange Capacity.

Pest Manag Sci 64:86-93 (2008)

15.5 9.4

214.0

Behaviour of sulcotrione and mesotrione in soils

• Perpignan and Ghent unsterilised soi1s maintained at 25 oC (protoco1 1);

• Ghent unsterilised soil maintained at higher temperatures, 40 and 60 oC (protocol 2);

• Perpignan and Ghent soíls twice autoclaved at 120 oC over a period of 30 min, maintained at 25 oC (protocol 3).

Sulcotrione additions were earried out under a laminar flow hood.

For ea eh soíl and for the three protoco1s, seven soíl samp1es (10.0 g) were treated in glass petri dishes with a methanolic solution of sulcotrione (10.0 mg L -1) or mesotrione (5.0 mg L -1, on1y for protocol 1) to give 0.5 or 0.25!J,gg-l, which corresponds to the recommended application dose for each triketone. AH samples were kept in darkness to avoid photodegradation. Soil moisture content was fixed at 30% of dry weíght and maintained constant during the experimento At fixed dates (O, 3, 7, 14, 30, 60 and 120 days), one petri dish of eaeh soil (10.0 g) was taken, extraeted and analysed by high-performance liquid chromatography (HPLC) (see Section 2.5).

2.4 Batch sorption study Aecording to OECD guideline,13 a sorption kinetic study is needed to evaluate the agitation period required to reaeh the equilibrium state, corresponding to adsorption on the most accessible sites. For eaeh compound, 1.0 g of soil was introduced into a centrifugation glass tube contaíning 5.0 mL of working solution (initial concentration 30 mg L -1) and shaken mechanicaHy for 0.5, 1, 2, 4, 8 and 24 h. The soil/solution suspension was then centrifuged at 3500 x g for 10 min and the supematant was analysed by HPLC (Section 2.5). Calcu1ations were performed using an indirect method13 based on the difference between initia1 and equilibrium concentrations in the supernatant, and led to the establishment of distribution coefficient I~ from the following equation:

Kd = (A eq x Vo)/(100 - Aeq) x msoil (1)

where Aeq is the adsorption percentage at the equilibrium state, Va is the ¡ni tia! vo1ume of liquid phase and msoil is the mass of soiL

The agitation time (8 h for sulcotrione and 24 h for its degradation products and mesotrione) deduced from adsorption kinetic plots was used for determining the adsorption isot..1-}erms. Glass tubes containing 5.0 mL oí working solution and 1.0 g of soil were shaken mechanically during this agitation periodo Samples were then centrifuged at 3500 x g for 10 min and the supernatants were analysed by HPLC. Two blanks (soíl with aqueous solution free of chemicals and aqueous solution without soil) were performed under the same eonditions. Adsorption isotherms were obtained by plotting solid-phase concentration, Os (mg kg- 1

), versus liquid phase concentration at equilibrium

87

234


H Chaabane er al.

state, Ce,ads (mg L -1). The Freundlich model was used to describe experimental results according to the equation

(2)

where Kfa and linfa are empirical constants representing respectívely the Freundlích coefficient for adsorption and the slope of the isotherm which expresses its degree of non-linearity.

Desorptíon experiments were carried out on soil samples treated at the highest concentration in the adsorption process. After HPLC analysis, the supernatant was removed and replaced with the same volume of distilled water. The remainíng slurry was shaken for the same period (8 and 24 h) and centrifuged at 3500 x g for 10 min, and the supernatant was then removed and analysed. This desorption procedure was repeated 3 times consecutively. The amount of each chemical remaining adsorbed in the soíl after each desorption step, cs, was evaluated. Desorption isotherms were obtained by plotting Cs

against Ce (the concentration of the compound in the liquid phase after each desorption step). The fo11owing Freundlich relationship was used to characterise the desorption process:

where G so is the solid-phase concentration (mg kg- 1)

of the compound adsorbed on the soil at equilibrium status, Ceo is the compound concentration in the liquid phase at equilibrium after adsorption and Kfd

and 11 nfd are respectively the empirical coefficient for desorption and the slope of the curve which expresses the desorption intensity of the compound from the soil.

For both kínetic and isotherm studies, experiments were carried out in duplicate.

2.5 Analytical methodology 2.5. 1 Soil samples Extractíon step. In order to fo11ow triketone degradation, soil samples were extracted with 60 mL and then with 30 mL of acetonitrile + 0.1 M hydrochloric acid (90 + 10 by volume) over 30 and 15 min periods, then filtered on a Whatman filter GF/A. The organic filtrate was evaporated at 30 oC and the acidic aqueous solution was then extracted with dichloromethane (2 x 5.0 mL). The organic phase was evaporated to dryness, solubilised in 0.1 M hydrochloric acid, purified on preconditioned EnvíChrom P cartridge and fina11y eluted with methanol (5 mL). This final extract was analysed by HPLC. One blank (soíl with the

respective volume of methanol free from triketone) was analysed under the same conditions.

Ghromatographíc analysis. Soil extracts were analysed usíng a Shimadzu HPLC apparatus equipped with a Supelco ODS Hypersil C I8 column (5 11m, 250 mm x 4.6mm) and a SPD-I0 Avp UVNis detector set at 254 nm. The mobile phase consisted of a mixture of water acidified' with 0.3 % trifl uoroacetic acid (A W) and acetonitrile (ACN) delivered at a flowrate of 1 mL mín-l. A gradíent system [70/30 (AW/ACN) at t = O min to 50/50 (AW/ACN) at 8 min, maintained for 10 mín] was used to ímprove the separation of the active ingredient and its metabolites during degradatíon and adsorption kinetics.

Analytical performance. The analytical method (soíl extractíon and HPLC analysis) was based on the procedures previously published3,14 and performed for a11 soil/compound couples (Table 2).

2.5.2 Water samples Water samples (for batch sorption study) were directly analysed without any extraction concentratíon step. Chromatographíc analysis was performed under the same condítions as for soíl samples, using isocratic. mode when analysis concerned only one compound Cfor isotherm study, since no degradation was observed during adsorption kinetics). The proportions of mobile phase were respectively 80/20 (AW/ACN) for CHD, 70/30 for CMBA and 50/50 for PHD, sulcotrione and mesotrione. The detection limit was 0.05 mg L -1 for all compounds under our chromatographic conditions.

3 RESUL TS ANO OISCUSSION 3.1 Triketone degradation and soil properties The decline of sulcotrione concentration in soils was plotted against incubation period as presented in Figs 2a and b. Degradation rates, fo11owed over a period of 120 days in Perpignan and Ghent ~oils according to protocol 1, were represented reasonably by first-order kinetics

C = Co x e-kt (4)

(with r2 values higher than 0.9), from which halflife values were determined (these are reported in Table 3). In equation (4), Co is the initial concentration of the triketone, C is the concentration after each incubation period t (days) and k is the apparent kinetic constant.

The disappearance ofsulcotrione over an incubatíon period of 60 days was estimated as 55 and 45% of the initial application dose and half-lives as 45 and 65 days, respectively, on Ghent and Perpignan soils. .

Table 2. Analytical performance of the method used tor soil extraction and HPLC analysis

Oe!ection limi! (¡.¡.g g-1) Recovery rate (%)

88

Sulcotrione

0.05 90(± 10)

CHD

0.001 50 (± 10)

235

CMBA

0.05 80 (± 10)

PHO

0.05

70 (± 10)

Mesotrione

0.01

70 (± 10)

Pes! Manag Sci 64:86-93 (2008)


'1 + mesotrione sulcotrione

í \. 01 0:6: 01 .6 (,)

+ ;:1!

• o 50 100 150

(a) Incubation period (days)

'1 + mesotrione -'~ sulcotrione

~---- : tO.5'~> .. , ~

O+------J~--.-~--------._--~~----~

o 50 100

(b) Incubation period (days)

Figure 2. Rate of degradation of sulcotrione and mesotrione, according to protocol 1, in (a) Ghent and (b) Perpignan soil.

Table 3. Degradation coefficients, K, and half-lives, DTsQ , for all

soil/triketone couples

Sulcotrione Mesotrione

OT50 OT50

150

K(day-1) (days) (2 K(day-1) (days) (2

Ghent

Perpignan

0.015 0.006

45 0.99 65 0.91

0.02 0.13

34 0.95 5 0.92

During this monitoring, degradation produets oE sulcotrione were identified as CHD and CMBA and sometimes PHD, and quantified. Their levels are plotted against incubation period in Figs 3a and b. These degradation produets had previously been Eound during hydrolysis in aqueous media, where their presence was particularly pH dependent. 11 Whatever the soil type, analyses oE soil extracts showed the presence oE CHD and CMBA, but PHD was deteeted only in the Ghent soil which had a pH (6.6) slightly

·lower than that of the Perpignan soi1. Therefore, the two degradarion pathways already described in

,aqueous media can be found in the soi1, depending on ,pH value.

The firsr degradation pathway (A) consists oE a hydrolytic cleavage berween 1,3-cyclohexanedione and rhe benzoic ring, leading ro CHD and CMBA. In Perpignan soil, only rhis degradarion pathway occurred, since pH condirions were re1atively alkaline.

In Belgian soil, in parallel ro this firsr pathway, sulcotrione could Eollow another mechanism (B) leading to PHD which is larer rransformed into CMBA. In

Pest Mana!! Sci 64:86-93 (2008)


0.003 s CMBA X

i: 0.002 Si:

"O E ¿ (.) 0.001

o~: :

PHD :¡:: sulcotrione + CHD

:¡::

~----, O 50 100 150

(a) Incubation period (days)

0.003

• CHD R CMBA )K Sulcotrione

í 0.002 C1

"O E ¿

:tSK (.) 0.001 )K

ilIi ¡¡¡

i!I )K !I

O • • O 50 100

(b) Incubation period (days)

Figure 3. Formation of degradation products of sulcotrione in (a) Ghent and (b) Perpignan soil.

150

water and using a high initial sulcotrione concentration (30 mg L -1), during this last step, 1-(2-chloro-4-mesyl)ethanone was detected as an intermediary compound (lC) (Fig. 4), while it was nor Eound in the soil under the present experimental conditions.

However, although the pH role appears evident, it is suggested that biotic Eactors have a possible infiuence on the degradation proeess. In fact, experiments carried out in Perpignan soil after sterilisation (protocol 3) showed that such treatment seemed hardly to affeet sulcotrione degradation (Fig. 5b). However, the predominance of the biotic pathway over ehemical hydrolysis was les s evident in Ghent soil (Fig. 5a). These results suggest that sulcotrione can be degraded Eollowing both biotie and abiotic ways, depe~ding on soil origino This observation was confirmed at high temperatures (protocol 2, 40 and 60 oC), especial1y in Ghent soil, where sulcotrione appeared more stable at 40 oC (half-life not evaluated) than at 25 oC (45 days) and at 60 oC (32 days). An Arrhenius diagram, plottirtg In Kobs

against 1/ T (K) (Fig. 6), confirms that sulcotrione follows three types oE pathway: a biotic pathway at 25 oC, a predominant abiotic pathway at 40 oC (where microorganisms can be affected) and an abiotic pathway with a possible intervention oE thermophile bacteria at 60 oc.

Furthermore, an available comparison between the degradation oE sulcotrione and mesotrione was possible; using the same experimental conditions as described Eor prorocol l. The disappearance oE mesotrione 14 days aEter treatment was estimared as 65 and 90% oE the initial applied dose, against 16

89

236


H Chaabane et al.

Sulcotrione CHD

(a)

o O CI

~:~SO-2C-H-3----~ Sulcotrione

(b) CMBA

Figure 4. Degradation pathways (A and B) of sulco trio ne .

... Autoclaved soil • Unsterilised soil * Autoclaved soil • Unsterilised soil

0.8 0.8

0.6 0.6

• ::j~ • 0.2

O+----~-----,-------.

O 50 100 150 O 50 100 150

(a) Incubation period (days) (b) Incubation period (days)

Figure 5. Degradation rate of sulcotrione under sterilised conditions in (a) Ghent and (b) Perpignan soil (protoGol 3).

o 0.0 29 0.003 0.0031 0.0032 0.0033 0.0034

-1

-2

'" .c

'::t:.0

-3 E

-4 •• A

-5 A"

-6

Figure 6. Arrhenius diagram for degradation of sulcotrione at 25, 40 and 60 oc in Ghent soil.

90

and 33% for sulcotrione, respectively, on Ghent and Perpignan soils (Figs 2a and b). Whatever the soil type, mesotrione (with the highest apparent constant, k = 0.13 day-l) seemed to be more rapidly degraded than sulcotrione. Half-lives for the two soils varied between 5 and 34 days for mesotrione and between 45 and 65 days for sulcotrione (Table 3).

The present results suggested that physicochemical properties of each soil (pH and OC) (see Table 1) infiuenced the degradation process. Owing to their weak acidic nature, the two triketones dissociate from molecular to anionic form as the pH rises. Moreover, the authors reponed in earlier work11 that their anionic form was more resistant to hydrolysis and photolysis processes. However, in soil, the proportion ofionic and


237


molecular forms is often difficult ro evaluate exactly owing to the hard-to-foresee difference between the pH value on the soil surface and in the outer bulk soil solution. 7

Under these experimental conditions (25 oC, unsterilised soils and a soil moisture content of 30%), close to ~atural conditions, the relatively high stability of sulcotrione (under its anionic form) in Perpignan soil could be attributed ro the alkaline pH of this soil. For mesotrione, the present experimental results showed that it disappeared more rapidly than sulcotrione in Perpignan soil, whereas on the Ghent soil there was no important dífference between the degradation behaviour of the two compounds (45 and 34 days respectively for sulcotrione and mesotrione). This observation suggested the presence of other factors influencing the degradatíon process. The rapid disappearance of mesotrione in Perpígnan soil could

. be attributed to its possible reduction to the corresponding amino compound owing to the hypothetical presence of specific microflora.

With the exception of the half-life of mesotrione i in Perpignan soil (5 days), all other half-lives were , relatively high (34-65 days) and could be due ro the

presence of nitro and halogen moieties that did not , allow rapid mineralisation of the compounds. 15

3.2 Sorption behaviour of sulcotrione and mesotrione The sorption behaviour of sulcotrione, CHD and CMBA has been reported previously. 6 It was shown that sulcotrione and CMBA are moderately adsorbed whatever the soil type, whereas CHD presents the highest adsorption capacity. Values of adsorption coefficients are reported in Table 4.

As a consequence of identification of degradatíon pathway B, identification of PHD as a new metabolite led the authors to study ¡ts sorption characteristics under the same conditions. Using kinetic and isotherm

, studies, the distribution and sorption coefficients Kct , and K fa were determined for PHD. Kinetic results showed that PHD exhibits an adsorprion behaviour relatively close to that of CHD (Kd varied between

: 0.18 and 5.40 L kg- 1 for CHD and between 2.00 and • 5.00 L kg- I for PHD). This preliminary observation

was confirmed by an isotherm study, with K fa values of 1.6 and 25.0 respectively for Perpignan and Ghent soil. As with CHD, the metabolire PHD seemed ro be more adsorbed than CMBA and sulcorrione (Fig. 7). Perpignan soil had the iowest Kfa values. Even if it is difficult to classify soils using Kfa values when linfa is significantly different from 1, it seemed possible to consider Perpignan soil as having the lowest adsorption capacity. This soil is characterised by a low organic matrer content and a slightly alkaline pH (Table 1) compared with Ghent soil. The acidic character of sulcotrione and its degradation products allow possible repulsion between their anionic forms and negatively charged soil surfaces. This observation has al so be en



Table 4. Adsorption coefficients of sulcotrione, its degradation

products and mesotrione

Sorptlon coefficlent Ghent soll Perplgnan soll

Sulcotrlone Kfa 1.54 1.30a

1¡nfa 1.02 0.87a ·

Koc 74.0 144.0a

Kfd 0.026 n.d. Total desorptlon (TO%) 91.0 n.d.

CHO Kta 10.0 1.4

1/nfa 0.52 0.64

Koc 492.0 155.0

Ktd n.d. n.d. TO% 2.5 11.0

CMBA Kfa 0.39 0.35 1¡nfa 1.02 0.87 Koc 20.0 39.0

Kfd n.d. n.d. TD% n.d. 4.0

PHO Kfa 25.0 1.6 1¡nfa 0.91 0.85 Koc 1231.0 178.0

Kfd n.d. n.d. TO% 12.0 14.0

Mesotrlone Kfa 1.57 0.14 1¡nfa 0.55 1.43 K~c 78.0 16.0 Kfd 10.08 n.d.

TO% 30.00

a Adsorption coefficient only far low concentrations.

150 -*-sulcotrione --+-CHD ___ CMBA -lf- PHD

30

1501-*-sulcotrione --+-CHD ___ CMBA -lf- PHD

í 100 el el

~ ~ O· 50 I 0~.14~:)(

o 5 10 15 20 25 30

(b) Ce (mg L-1)

Figure 7. Adsorption isotherms of sulcatrione and its degradation products in (a) Ghent and (b) Perpignan soil.

reported for other weak acidic herbicides such as 2,4-D 16 and 1FT. 17

In parallel to sulcotrione and its degradation products, a sorption srudy of mesotrione was conducted under the same conditions. Kinetic results

91

238

-.0;,.., • .-.


H Chaabane et al.

150

í 100 el

~ O'" 50

__ Ghent ..... ~_. Perpignan

o -~..--' -,-----,--:_

(a)

I el

~

150

100

O"' 50

o 5 10 20 25 30

__ Ghent ~- Perpignan

O~~~~;!l'i- -.... _ ..... _ .. _"', ... =======-.. ~-+

O 5 10 15 20 25 30

(b)

Figure 8. Adsorption isotherms of (a) sulcotrione and (b) mesotrione on Ghent and Perpignan soils.

showed that Kd for mesotrione ranged from 0.22 to 0.44 L kg- 1• For sulcotrione, no adsorption was observed on Perpignan soil, but on Belgian soil Kd was 0.66 L kg- 1

• This moderate adsorption of the two triketones was verified by isotherm results. As shown in Fig. 8, according to the classification ofGiles et al., 18 adsorption isotherms are L-type, expressing a moderate affinity between soil and herbicide and a decrease in the availability of adsorption sites with increasing liquid concentration. Experimental data were well fitted by the Freundlich model [equation (2), r2 values ranging between 0.89 and 0.91], and a log-log transformation allowed us to estimate Kfa and linfa reported in Table 4. The adsorption coefficient normalised to the organic carbon content of the soil, K oc, is a useful indicator of the binding capacity of a chemical on organic matter of soil and allows a comparison between different compounds. According 10 K fa and Koc values, adsorption capacity was slightly more important on Ghent than on Perpignan soil, where K fa was established only for low concentrations as no adsorption was determined using high concentrations. Adsorption of the two triketones was slightly different, and this was probably due to their molecular structure, particularly the moiety in position 2 of the cyc1ic ring (Fig. 1). The N02 moiety could exercise more steric hindrance than CI to reaching adsorption sites.

As previously reported,6 sulcotrione adsorption in soils increased with c1ay content, while organic matter content and pH played a minor role, and this result seemed to be verified for mesotrione.

92

The Freundlich relationship was tried for al! compounds to evaluate desorption experimental results. For sulcotrione, the Kfd values and the total desorption percentage (70%) showed its relatively high desorption capacity. For the degradation products, the present results did not fit the Freuncilich equation well. However, the total desorption percentage ( < 15 %) (Table 4) showed their lower aptitude for desorption under the present experimental conditions. For mesotrione, the desorption percentage (30%) was lower than for sulcotrione, suggesting that the adsorption process was not totally reversible and led to the presence of a hysteresis phenomenon.

4 CONCLUSION This study, carried out on two soil types with different physicochemical properties, provides supplementary information about sulcotrione behaviour in soils. A comparison with mesotrione could be established as experiments were carried out under the same conditions. The two triketones exhibited moderate adsorption in both soil types tested. However, degradatíon processes depended on soil type and campound properties.

It was proposed to evaluate the potential for reaching water resources accordiilg to the sorption and degradation coefficients. Among the list of mathematical models, the groundwater ubiquity score (GUS)19 is the most simple model giving preliminary but available information about the leaching potential of the two triketones. According to the equatíon

GUS = 10g(tl/2soi') x [4 -log(Koc)] (5)

the GUS values are 3.5, 3.2, 3.3 and l.9 for the respecti~e couples sulcotrione or mesotrione/Ghent and sulcotrione or mesotrione/Perpignan. In both soil types, sulcotrione and mesotrione could be c1assified as substances for which the leaching potential must be addressed (with GUS values higher than 2.8), even if this potential seemed to be limited for mesotrione in Perpignan soil. In order ro refine the leaching patential, these results might be complemented with experimental values obtained using leaching soil column or lysimeter devices. However, a proper assessment of risk for leaching should be performed with data obtained from GLP studies (adsorption, laboratory degradation rate) and with calculations of predicted environmental concentrations under the scenarios developed by the European FOCUS group.20

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20 SANCO DocumenrJ32112000 rey. 2; FOCUS groundwater scenarios in the EU, Review of active substances, 202 pp. (2000).

93

240


241

Communicationscientifique

Actes du 37ème congrès du Groupe Français des Pesticides, Bordeaux (mai 2007)

Transfert de la Sulcotrione, Herbicide du Maïs, sur Mini-colonnes de Sol Reconstitué

Hanène Chaabane, Christophe Calvayrac et Jean-François Cooper

Laboratoire de Chimie des Biomolécules et de l’Environnement, Centre de Phytopharmacie,

Université de Perpignan, 52 avenue Paul Alduy, 66860 Perpignan, France

1- Introduction

Le devenir d’un produit phytopharmaceutique et de ses produits de dégradation, après

application au champ, est fortement conditionné par les processus de dégradation et de

rétention. Ces processus ont été étudiés dans le cas de la sulcotrione [2-(2-chloro-4-

methylsulfonylbenzoyl)-1,3-cyclohexanedione], substance active herbicide de la famille des

tricétones, aussi bien dans l’eau (avec ou sans irradiation) que dans le sol (Chaabane, 2005,

Chaabane et al., 2005, Chaabane et al., 2007a et b). Les mêmes produits de dégradation (1,3-

cyclohexanedione ou CHD, acide 2-chloro-4-méthylsulfonylbenzoïque ou CMBA, dérivés de

l’acétophénone et de l’acide phényl heptanoïque) ont été identifiés dans les deux cas

(Chaabane et al., 2007a et b).

Les processus de dégradation et d’adsorption-désorption participent au transfert horizontal

et/ou vertical de la substance active et des produits de dégradation. Le modèle empirique de

Gustafson (1989), qui met en relation le temps de demi-vie ainsi que les constantes

d’adsorption, nous a permis d’estimer le potentiel de lessivage de la sulcotrione (Chaabane,

2005): cette molécule pourrait être classée parmi les substances présentant un risque de

transfert relativement facile vers les eaux souterraines. Dans la littérature, certains résultats


242

corroborent notre estimation (Cherrier, 2003), d’autres indiquent l’absence de transfert de la

sulcotrione au delà de 20 cm de profondeur (Rouchaud et al., 1996 et 1998a et b, Baer et

Calvet, 1999). Cela nous a conduit à étudier le mécanisme de transfert de la sulcotrione à

l’aide d’un dispositif expérimental approprié.

En parallèle, un autre objectif de cette étude était de comparer le potentiel de lessivage de la

sulcotrione à celui de deux autres substances actives souvent détectées dans les ressources en

eau: l’atrazine et la bentazone, dont l’utilisation a été ou reste homologuée en maïsiculture.

2- Matériels et méthodes

2-1 Réactifs chimiques

- Standards analytiques: La sulcotrione (99,2%), l’atrazine [(2-chloro-4-ethylamino-6-

isopropylamino-S-triazine] et la bentazone [3-isopropyl-(1H)-Benzo-2,1,3-thiadiazin-4-(3H)-

one 2,2-dioxide] proviennent de Riedel-de Haën. Leurs propriétés physico-chimiques ainsi

que les doses agronomiques recommandées sont réunies dans le tableau 1. Une solution mère

de chaque substance active a été préparée dans le méthanol à 1000 mg.L-1 et conservée à

l’obscurité à 4°C. Les solutions de traitement ont été préparées à 100 mg.L-1 par dilution des

solutions mères dans l’eau distillée. La CHD (97,0%), le CMBA (95,0%) et la 1-(2-chloro-4-

methylsulfonyl) éthanone (96,6%) proviennent respectivement de Fluka Chemica, Acros

Organics et Bayer CropScience. L’acide 5,7-dicéto-7-(2-chloro-4-méthylsulfonylphényl)

heptanoïque (96,6%) a été synthétisé suivant la méthode publiée par Chaabane et al. (2007b).

- Autres réactifs : Les solvants organiques (Méthanol, acétonitrile sont de qualité

CLHP, le dichlorométhane est de qualité pour analyses de résidus de pesticides) sont fournis

par Carlo Erba, l’acide trifluoroacétique (TFA, 99,0%) de la part d’Aldrich, l’acide

chlorhydrique (HCl, 38%) de Prolabo et l’eau est de qualité milliQ.


243

Tableau 1 : Propriétés physico-chimiques de substances actives utilisées.

2-2 Sols

Deux types de sols, nommés Perpignan (sol limono-sablo argileux, pH= 8,1 et M.O= 1,7%)

et Belgique (Sol sablo-limoneux, pH= 6,6 et M.O= 3,5%) ont été sélectionnés, tamisés (<

2mm), séchés à l’air libre et conservés à +4°C jusqu’à leur utilisation.

2-3 Dispositif experimental

Des mini-colonnes de sol reconstitué (diamètre interne 8,0 cm et hauteur 15,0 cm, munies

d’un tamis et d’un entonnoir) ont été placées en plein champ ou sous serre. Dans chaque mini-

colonne a été placée une couche fine de bille en verre de 0,6 mm de diamètre puis 10,0 cm de

chaque type de sol correspondant respectivement à 550 g et 625 g (Perpignan et Belgique) en

tenant compte de la densité de chaque type de sol, respectivement 1,1 et 1,3.

Afin d’étudier l’effet de l’état initial du sol avant traitement, deux états hydriques des sols ont

été choisis correspondant aux sols "naturels" de Belgique et de Perpignan sans humidification

préalable : BN et PN et aux sols saturés BS et PS, préalablement saturés en eau, par un

passage régulier d’eau distillée durant un jour avant traitement.

Les sols (PN, PS, BN et BS) ont été traités au double de la dose recommandée pour la

sulcotrione (600 g.ha-1). Les mini-colonnes ont été placées sous serre et ont reçu un volume

Standard

analytique

Poids moléculaire

g.mol-1

pKa Hydrosolubilité

mg.L-1

Dose agronomique

recommandée g.ha-1

Sulcotrione 328 2,87 165 300-450

Atrazine 215 1,7 33 1100

Bentazone 240 3,3 570 1392


244

d’eau de 50 mL, tous les quatre jours environ, afin de se rapprocher des conditions naturelles.

Dans le cas des traitements avec l’atrazine, la bentazone et la sulcotrione, nous avons opté

pour des traitements simulant les doses agronomiques recommandées, soit 550, 696 et 150 µg

de substance active par mini-colonne de sol (tableau 1). L’expérimentation a été menée sous

serre seulement avec le sol de Perpignan initialement saturé en eau avant le traitement.

Parallèlement aux mini-colonnes traitées, deux blancs de chaque type de sol ont été conduits

dans les mêmes conditions pour vérifier l’absence d’interférence au niveau des

chromatogrammes des extraits de sol ou des percolats.

2-4 Méthodologie analytique

Afin de suivre l’évolution de la sulcotrione, de ses métabolites, de l’atrazine et de la

bentazone, les percolats ont été récupérés après chaque apport d’eau puis analysés sans

concentration préalable par Chromatographie Liquide Haute Performance (CLHP).

L’évolution de l’ensemble des molécules à travers le profil du sol a été suivie, aux dates

préfixées (0, 4, 7, 15, 30 et 60 jours après le traitement), en procédant à un fractionnement du

profil en trois horizons (h1=0-3, h2=3-6 et h3=6-10 cm). Chaque horizon a été par la suite

homogénéisé et un échantillon de 10 g a été extrait suivant la méthode précédemment publiée

(Chaabane et al., 2007a) puis analysé par CLHP. Le système chromatographique utilisé est

une chaîne CLHP Shimadzu équipée de deux pompes LC-10ADvp (débit 1mL.min-1, les

modes en gradient d’élution utilisés sont présentés dans le tableau 2), d’une colonne Supelco

ODS Hypersil C18 (5µm, 250 mm x 4,6 mm) et d’un détecteur UV/Visible SPD-10Avp fixé à

254 nm.


245

Molécule Phase mobile Gradient d’élution

Sulcotrione et ses

métabolites

Bentazone

A = acétonitrile

B = eau acidifiée par

le TFA à 0,3 %

30% à 50% (A) en 8 min, puis

maintien à 50% (A) pendant 10 min

Atrazine et ses

métabolites

A = acétonitrile

B = eau milliQ

30% (A) / 70% (B) : 1min

30% à 60% (A) en 6 min puis

maintien à 60% (A) pendant 8.50 min.

Tableau 2 : Conditions d’analyse chromatographique.

3- Résultats et discussion

3-1Transfert de la sulcotrione sur mini-colonnes de sol reconstitué, sous serre

3-1-1 Dynamique de lessivage de la sulcotrione : Analyse des percolats

L’évolution des volumes d’eau percolés ainsi que la concentration de la sulcotrione dans les

deux types de sols de Perpignan et de Belgique, quel que soit leur état avant traitement, sont

présentés dans les figures 1a et 1b. Au cumul des volumes d’eau percolés à la fin du suivi,

nous pouvons conclure que quel que soit l’état initial du sol, le sol de Belgique semble

montrer une rétention d’eau légèrement supérieure à celle du sol de Perpignan

(respectivement 339, 98, 415 et 141 mL sur BS, BN, PS et PN, figure 1). Ce comportement

hydrique, avec une différence significative suivant l’état du sol avant traitement, aura une

influence sur la dynamique de lessivage de la sulcotrione et éventuellement de ses

métabolites. En effet, les premiers résidus de sulcotrione ont été détectés dès le 3ème apport

d’eau (150 mL), ce qui correspondrait au volume de la macroporosité occupée par l’eau

mobile du sol saturé.


246

a) b)

Fig. 1 : Dynamique de lessivage de la sulcotrione dans les percolats a)- du sol de Perpignan et

b)- du sol de Belgique.

Les concentrations sont nettement supérieures dans les percolats du sol de Perpignan par

rapport à celles enregistrées sur le sol de Belgique (figure 1). Ce résultat laisse penser à un

mouvement de la sulcotrione (moyennement soluble et faiblement retenue sur ce type de sol

(Chaabane et al., 2005) en profondeur avec le flux d’eau à travers les macropores. Ces

concentrations tendent à diminuer malgré un apport d’eau régulier, expliquant soit une

dispersion de la substance active et formation de résidus liés, soit l’intervention d’une

dégradation biotique.

En résumé, les quantités exportées semblent fortement corrélées aux volumes d’eau drainés,

et montrent que malgré des concentrations sensiblement identiques dans le cas du sol de

Belgique, les quantités exportées sont trois fois plus importantes sur le sol saturé (2%) que sur

le sol naturel (0,85%). Ces quantités restent nettement inférieures à celles détectées sur le sol

de Perpignan avec un maximum de 18% sur le sol initialement saturé en eau (PS).


247

Concernant les métabolites détectés dans les percolats, nous avons identifié uniquement le

CMBA (précédemment décrit en conditions de laboratoire par Chaabane et al. (2005)) qui a

manifesté le même comportement de lessivage que la molécule mère. Dans les percolats du

sol de Belgique, aucun métabolite n’a été détecté à des teneurs supérieures à la limite de

détection de notre méthode d’analyse.

Au vue des quantités de sulcotrione et de ses métabolites exportées tout au long du suivi, nous

pouvons déduire que la sulcotrione est assez faiblement transférée au delà de 10 cm de

profondeur.

3-1-2 Dynamique de lessivage de la sulcotrione : Analyse des horizons de sol

Les teneurs en résidus de sulcotrione distribués dans les horizons des sols de Belgique et de

Perpignan sont présentées dans les figures 2a et 2b, aussi bien pour les sols naturels

qu’initialement saturés en eau. L’analyse des horizons de sols permet de confirmer les

résultats de l’analyse des percolats (2.1.1). Les concentrations de la sulcotrione détectées dans

le sol de Perpignan sont nettement plus faibles que dans les horizons du sol de Belgique.

a)- Sol de Perpignan b)- Sol de Belgique

Fig. 2 : Dynamique de lessivage de la sulcotrione à travers le profil du sol.

4J8J

32J61J

PNPS

4J8J

32J

BNBS

61J


248

Fig. 3: Comparaison des résidus de la sulcotrione par rapport à ceux de l’atrazine et de la

bentazone, dans les mini-colonnes de sol reconstitué.

Les propriétés physico-chimiques de ce type de sol, entraînant une rétention plus importante

de la sulcotrione comparativement au sol de Perpignan, pourraient expliquer ces teneurs

élevées et la persistance surtout sur sol "naturel". Ces résultats montrent : (i) une stabilisation

des résidus dans l’horizon superficiel (h1=0-3cm) jusqu’à 15 jours après le traitement sur le

sol de Belgique (ii) une distribution plus homogène sur le sol de Perpignan entre les horizons

h1 et h2 et (iii) une absence de résidus dans l’horizon h3 expliquant l’absence de sulcotrione

dans les percolats.

L’analyse des horizons de sols a révélé la présence des produits de dégradation identifiés,

notamment le CMBA (précédemment détecté dans les percolats) et la CHD sur le sol de

Perpignan (naturel et saturé) et en plus le dérivé de l’acide phényl heptanoïque sur le sol de

Belgique. Ce métabolite a été particulièrement identifié dans l’horizon superficiel (0-3cm) ce

qui pourrait être expliqué soit par sa forte rétention et donc sa stabilisation en surface ou

encore par son unique formation par voie biotique qui serait absente en profondeur.

3-2 Transfert de la sulcotrione sur mini-colonnes de sol reconstitué, en plein champ


249

En parallèle, le dispositif expérimental a été placé en plein champ en conditions naturelles de

température et de précipitations. Trois épisodes pluvieux ont été enregistrés tout au long du

suivi, dont seulement un survenu le 12/02/2005, qui était efficace. Les percolats analysés ont

révélés des quantités de sulcotrione exportées nettement supérieures à celles enregistrées en

conditions sous serre (particulièrement sur sol naturel BN et PN respectivement 5 et 3%).

L’analyse des horizons de sols montre également des teneurs plus importantes sur le sol de

Belgique, quel que soit l’état initial du sol dans les divers horizons jusqu’à 53 jours après

traitement. Ce résultat peut expliquer une certaine activité résiduelle de la sulcotrione dans le

sol, précédemment soulignée par Cools et al. (1997).

Par contre, trois mois après traitement, la sulcotrione n’a été détectée ni dans les percolats ni

dans les horizons de sol, à une profondeur de 10cm.

3-3 Comparaison du potentiel de lessivage de la sulcotrione, de la bentazone et de l’atrazine

Les résultats de l’analyse des percolats révèlent que les pourcentages d’exportation de la

sulcotrione et de l’atrazine (sensiblement identiques, respectivement 2 et 3%) restent

nettement inférieurs à celui de la bentazone (13% de la dose initiale appliquée).

L’évolution des résidus de chaque substance active dans la mini-colonne durant le suivi est

représentée par la figure 3.

Sur le sol de Perpignan (PS), les teneurs en sulcotrione n’excèdent pas 1% jusqu’à la fin du

suivi. Ces faibles teneurs par rapport aux résultats précédents seraient expliquées par des

conditions climatiques, notamment de température, différentes par rapport au premier suivi.

Dans le cas de l’atrazine, les teneurs, importantes au début du suivi, tendent à diminuer quel

que soit l’horizon de sol pour atteindre au total 10% de la dose initiale sur l’ensemble du

suivi. Malgré une dose d’application 5 fois plus importante que celle de la sulcotrione, les

teneurs restent faibles témoignant une dégradation rapide de cette substance active dans ce

type de sol. Un résultat similaire, sur des colonnes de sol non perturbé, a été précédemment

souligné par Cherrier (2003).


250

Dans le cas de la bentazone, nous avons enregistré une répartition plus homogène à travers le

profil du sol témoignant un déplacement rapide avec le mouvement de l’eau, lié à sa forte

hydrosolubilité. Au cours du temps, les teneurs en bentazone tendent à diminuer montrant le

mouvement de transfert avec le flux préférentiel et rappelant les fortes concentrations

enregistrées dans les percolats.

4- Conclusion

Les résultats de ce présent travail nous ont permis de modérer les prévisions établies d’après

les calculs moyennant le modèle GUS. L’état du sol sec avant traitement contribue à limiter le

transfert de la sulcotrione et favoriser sa stabilisation dans les horizons superficiels. Par

contre, elle semble facilement lessivée sur sol initialement saturé en eau malgré une

dégradation plus rapide. Les résultats en plein champ restent tributaires de la fréquence, du

volume et des débits des apports d’eau après traitement.

La comparaison du comportement de lessivage de la sulcotrione, de l’atrazine et de la

bentazone nous a permis de conclure que cet herbicide tricétone présenterait un risque de

transfert et de stabilisation limité par rapport à celui des deux autres substances actives.

5- Références

Baer, U. et Calvet, R. Fate of soil applied herbicides: experimental data and prediction of

dissipation kinetics. J. Environ. Qual. 1999, 28, 1765-1777.

Chaabane, H.; Cooper, J.F.; Azouzi, L. et Coste, C.M. Influence of soil properties on

adsorption-desorption of sulcotrione and its hydrolysis metabolites on various soils. J. Agric.

Food Chem. 2005, 53, 4091-4095.

Chaabane, H. Etude de la stabilité et du comportement de la sulcotrione dans l'environnement

: eaux et sols agricoles. Thèse de l'Université de Perpignan, 2005, 154 p.

Chaabane, H.; Vulliet, E.; Cooper, J.F.; Calvayrac, C. et Coste, C.M. Behaviour of sulcotrione

on various soils : comparison with another triketone herbicide. Pest Management Science

2007a, Sous press.


251

Chaabane, H.; Vulliet, E.; Joux, F., Lantoine, F.; Conan, P.; Cooper, J.F. et Coste C.M.

Photodegradation of sulcotrione in various aquatic environments and toxicity of its

photoproducts for some micro-organisms. Water Research 2007b, 41, 1781-1789.

Cherrier, R. Impact sur l'environnement de deux herbicides du maïs: la sulcotrione et

l'atrazine Influence du changement d'apports organiques. Thèse de l'INPL-Nancy, 2003, 175

p.

Cools, K.; Bulcke, R. et Callens, D. Response of replacement crops to soil-applied

sulcotrione. Med. Fac. Landbouww. Univ. Gent. 1997, 64, 721-726.

Gustafson, D. I. Groundwater Ubiquity Score : a simple method for assessing pesticide

leachability. Environmental Toxicology and Chemistry 1989, 8, 339-357.

Rouchaud, J.; Thirion, A.; Callens, D. et Bulcke, R. Soil dissipation of the Post-Emergence

Sulcotrione in maize crops treated with organic fertilisers. Bull. Environ. Contam. Toxicol

1996, 57, 398-405.

Rouchaud, J.; Neus, O.; Bulcke, R.; Cools, K. et Eelen,H. Sulcotrione soil metabolism in

summer corn crops. Bull. Environ. Contam. Toxicol 1998a, 61, 669-676.

Rouchaud, J.; Neus, O.; Callens, D. et Bulcke, R. Sulcotrione soil persistence and mobility in

summer maize and winter wheat crops. Weed Research 1998b, 38, 361-371.

Annexes

252

Table des annexes

Annexe 1 : Fiche AGRITOX sulcotrione. Annexe 2 : Chromatogrammes CLHP/UV du milieu de culture (MS) pour l’isolat bactérien 1OP. Annexe 3 : Chromatogrammes CPG/SM du milieu de culture (MS) pour les isolats bactériens 1OP et 1TRANS au bout de 27 jours d’incubation.

Annexes

253

ANNEXE1

AGRITOX - Base de données sur les substances actives

phytopharmaceutiques

FICHE SULCOTRIONE Dernière mise à jour de la fiche d'information le 05/11/2002

1 - IDENTITÉ Substance active : sulcotrione Source de l'information : union européenne Activité biologique principale : herbicide Famille chimique : tricétone Dénominations ISO : sulcotrione NOU : sulcotrione PRO : sulcotrione ANC : chlormesulone CAS : 99105-77-8 Noms chimiques CAS : 1,3-CYCLOHEXANEDIONE, 2-[2-CHLORO-4-(METHYLSULFONYL)BENZOYL]- CAS : 2-[2-chloro-4-(methylsulfonyl)benzoyl]-1,3-cyclohexanedione Formule brute : C14 H13 Cl O5 S IUPAC : 2-(2-chloro-4-mesylbenzoyl)cyclohexane-1,3-dione Poids moléculaire : 328.77 Formule plane :

2 - PROPRIÉTÉS PHYSIQUES ET CHIMIQUES 2.1 ETAT PHYSIQUE

• solide amorphe 2.2 PRESSION DE VAPEUR (TENSION DE VAPEUR)

• 5.39 µPa à 25 °C 2.3 CONSTANTE DE HENRY

Annexes

254

2.4 SOLUBILITÉS DANS L'EAU • 0.165 g/l

2.5 SOLUBILITÉS DANS LES SOLVANTS ORGANIQUES • acetone : 40 g/l • chlorobenzene : 10 g/l • ethanol : <6 g/l • xylene : <6 g/l

2.6 COEFFICIENT DE PARTAGE OCTANOL/EAU •

2.7 VITESSE D'HYDROLYSE (STABILITE) • temps de demi-vie : 100 jour(s) au pH de 7 - Méthode : EPA

2.8 VITESSE DE PHOTOLYSE DANS L'EAU 2.9 RENDEMENT QUANTIQUE de la phototransformation dans l'eau à lambda > 290 nanomètres 2.10 DISSOCIATION DANS l'EAU 3 - TOXICITÉ 3.1 ABSORPTION, DISTRIBUTION, ÉLIMINATION ET MÉTABOLISME 3.2 ABSORPTION DERMALE 3.3 TOXICITÉ AIGUË PAR VOIE ORALE

• DL50 rat : >5000 mg/kg - Sexe : MF - Souche : Sprague Dawley - Véhicule : en solution dans l'huile de mais - Méthode : EPA / OCDE

3.4 TOXICITÉ AIGUË PAR VOIE DERMALE • DL50 lapin : >4000 mg/kg - Sexe : MF - Souche : Stauffland - Méthode :

EPA / OCDE 3.5 TOXICITÉ AIGUË PAR INHALATION

• Toxicité aigue par inhalation, 4 heures, rat - Sexe : MF - Souche : Wistar derive CL50 : >=1.63 mg/l d'air

3.6 IRRITATION CUTANÉE • Test d'irritation cutanée, lapin : non irritant - Méthode : Draize

3.7 IRRITATION OCULAIRE • Test d'irritation oculaire, lapin : moderement irritant - Méthode : Draize

3.8 SENSIBILISATION CUTANÉE • Sensibilisation retardée par voie cutanée, cobaye : sensibilisant

Magnusson et Kligmann 3.9 GÉNOTOXICITÉ 3.10 TOXICITÉ À TERME ET CANCÉROGÉNÈSE

• Toxicité par voie orale et étude de la cancérogenèse, 18 mois , souris - Sexe : M - Souche : CD-1 DSE/CSE = 3000 ppm

• Toxicité par voie orale et étude de la cancérogenèse, 18 mois , souris - Sexe : F - Souche : CD-1 DSE/CSE = 350 ppm

• Toxicité par voie orale, 2 ans , rat - Sexe : M - Souche : CD DSE/CSE = 1 ppm

• Toxicité par voie orale, 2 ans , rat - Sexe : F - Souche : CD DSE/CSE = 20 ppm

3.11 TOXICITÉ SUR LA REPRODUCTION ET LE DÉVELOPPEMENT

Annexes

255

• Reproduction sur deux générations par voie orale, rat DSE parents = 0.05 mg/kg/j DSE descendance = 0.05 mg/kg/j DSE reproduction = 0.5 mg/kg/j toxicite generale

• Tératogenèse par voie orale, rat DSE foetus = 100 mg/kg/j

• Tératogenèse par voie orale, lapin DSE foetus = 300 mg/kg/j

3.12 NEUROTOXICITÉ 3.13 AUTRES ÉTUDES 3.14 DOSE JOURNALIÈRE ACCEPTABLE (DJA)

• DJA = 0.0004mg/kg/j DSE = 0.04 mg/kg p.c./j (2 ans, voie orale, rat ) (Décision de l'Union Européenne )

Observations : la DJA est basée sur une LOAEL mais le facteur de sécurité 100 est suffisant compte tenu de la pente de la courbe dose-réponse 3.15 DOSE DE RÉFÉRENCE AIGUË (DRfA ou ARfD) Observations : non pertinent 3.16 NIVEAU D'EXPOSITION ACCEPTABLE POUR L'OPÉRATEUR (NEAO ou AOEL)

• AOEL = 0.0006 DSE = 0.06 mg/kg p.c./j (Reproduction sur deux générations, rat ) (Décision de l'Union Européenne )

4 - COMPORTEMENT DANS L'ENVIRONNEMENT 4.1 COMPORTEMENT DANS LE SOL 4.1.1 VOIES DE DEGRADATION 4.1.2 VITESSE DE DEGRADATION 4.1.2.1 VITESSE DE DEGRADATION : EN LABORATOIRE, CONDITIONS AEROBIES

• Substance active DT50 (exprimé en jours) : 24 DT90 Temp : 25 °C Sol : limon fin - USA - Atterberry / Iowa - MO : 4.2 % - pH : 5.6

• Substance active DT50 (exprimé en jours) : 15 DT90 Temp : 25 °C Sol : sable - FRA - Toulouse - MO : 1.4 % - pH : 5.2

• Substance active DT50 (exprimé en jours) : 74 DT90 Temp : 25 °C Sol : limon sableux - USA - San Jose - MO : 0.3 % - pH : 7.3

4.1.2.2 VITESSE DE DEGRADATION : EN LABORATOIRE, CONDITIONS ANAEROBIES

Annexes

256

4.1.2.3 VITESSE DE DEGRADATION : AU CHAMP • Substance active

DT50 (exprimé en jours) - Min : 2 - Max : 6 DT90 Sol :

4.1.2.3 VITESSE DE DEGRADATION 4.1.2.4 PHOTODEGRADATION : EN LABORATOIRE, CONDITIONS AEROBIES 4.1.2.5 PHOTODEGRADATION : EN LABORATOIRE, CONDITIONS ANAEROBIES 4.1.2.5 PHOTODEGRADATION 4.1.3 MOBILITE DANS LE SOL : ADSORPTION

• Substance active Koc : 6.6 - Sol : sable - FRA - Toulouse - %MO : 1.4 % - pH : 5.2

• Substance active Koc : 5.3 - Sol : limon sableux - FRA - Velisy - %MO : 6.6 % - pH : 4.9

• Substance active Koc : 8.98 - Sol : limon sableux - USA - San Jose - %MO : 0.3 % - pH : 7.3

• Substance active Koc : 1.82 - Sol : limon fin - USA - Atterberry / Iowa - %MO : 4.2 % - pH : 5.6

• Substance active Koc : 1.08 - Sol : limon argileux - USA - Luling - %MO : 1.8 % - pH : 7.5

• Substance active Koc : 123 - Sol : limon sableux - USA - %MO : 2 %

• Substance active Koc : 160 - Sol : argile - X - %MO : 1.7 %

• Substance active Koc : 17 - Sol : limon - X - %MO : 2.1 %

• Substance active Koc Min : 1.08 - Max : 8.98 Sol :

4.1.4 MOBILITE DANS LE SOL 4.1.4.1 MOBILITE DANS LE SOL : AUTRES ETUDES AU LABORATOIRE 4.1.4.2 MOBILITE DANS LE SOL : AUTRES ETUDES AU CHAMP 4.2 COMPORTEMENT DANS L'EAU 4.2.1 PRODUITS D'HYDROLYSE 4.2.2 VITESSE D'HYDROLYSE

• temps de demi-vie : 100 jour(s) au pH de 7 - Méthode : EPA 4.2.3 PRODUITS DE PHOTOLYSE DANS L'EAU 4.2.4 VITESSE DE PHOTOLYSE DANS L'EAU 4.2.5 BIODEGRADATION FACILE

Annexes

257

4.2.6 VOIES DE DEGRADATION DANS LE SYSTEME EAU-SEDIMENT 4.2.7 VITESSE DE DISSIPATION DANS LE SYSTEME EAU-SEDIMENT 4.2.7.1 VITESSE DE DISSIPATION - CONDITIONS AEROBIES, OBSCURITE 4.2.7.2 VITESSE DE DISSIPATION - CONDITIONS AEROBIES, LUMIERE 4.2.7.3 VITESSE DE DISSIPATION - CONDITIONS ANAEROBIES, OBSCURITE 4.2.7.4 VITESSE DE DISSIPATION - CONDITIONS ANAEROBIES, LUMIERE 4.2.7.5 VITESSE DE DISSIPATION 4.3 COMPORTEMENT DANS L'AIR 4.3.1 PRESSION DE VAPEUR

• 5.39 µPa à 25 °C 4.3.2 CONSTANTE DE HENRY 4.3.3 VITESSE DE DEGRADATION DANS L'AIR

5 - ÉCOTOXICITÉ 5.1 EFFETS SUR LES OISEAUX ET SUR LES AUTRES VERTÉBRÉS TERRESTRES 5.1.1 TOXICITÉ ORALE AIGUË CHEZ LES OISEAUX

• Anas platyrhynchos - DL50 : >1350 mg/kg p.c. - Véhicule : en solution dans l'huile de mais - Méthode : EPA

• Colinus virginianus - DL50 : >2250 mg/kg p.c. - Véhicule : en solution dans l'huile de mais - Méthode : EPA

5.1.2 TOXICITÉ ALIMENTAIRE CHEZ LES OISEAUX • Anas platyrhynchos - CL50 : >5620 mg/kg aliment - Durée d'exposition : 5

jours - Véhicule : en solution dans l'huile de mais - Méthode : EPA • Colinus virginianus - CL50 : >5620 mg/kg aliment - Durée d'exposition : 5

jours - Véhicule : en solution dans l'huile de mais - Méthode : EPA 5.1.3 TOXICITÉ SUR LA REPRODUCTION CHEZ LES OISEAUX 5.1.4 TOXICITÉ ORALE AIGUË CHEZ LES AUTRES VERTÉBRÉS TERRESTRES 5.1.5 TOXICITÉ CHRONIQUE CHEZ LES AUTRES VERTÉBRÉS TERRESTRES 5.2 EFFETS SUR LES ORGANISMES AQUATIQUES 5.2.1 TOXICITÉ AIGUË CHEZ LES POISSONS

• Cyprinus carpio - CL50 : 240 mg/l - Durée d'exposition : 96 heures - Exposition statique

• Oncorhynchus mykiss (ex Salmo gairdneri) - CL50 : 227 mg/l - Durée d'exposition : 96 heures - Exposition statique

5.2.2 TOXICITÉ CHRONIQUE CHEZ LES POISSONS 5.2.3 BIOCONCENTRATION CHEZ LES POISSONS 5.2.4 TOXICITÉ AIGUË CHEZ LES INVERTÉBRÉS AQUATIQUES VIVANT DANS L'EAU OU LE SÉDIMENT

• Daphnia magna - CE50 : >100 mg/l - Durée d'exposition : 24 heures • Daphnia magna - CE50 : >100 mg/l - Durée d'exposition : 48 heures

5.2.5 TOXICITÉ CHRONIQUE CHEZ LES INVERTÉBRÉS AQUATIQUES VIVANT DANS L'EAU OU LE SÉDIMENT 5.2.6 EFFETS SUR LA CROISSANCE DES ALGUES ET SUR LES PLANTES AQUATIQUES

• algue - CEb50 : 3.5 mg/l

Annexes

258

5.2.7 AUTRES ÉTUDES AQUATIQUES - EFFETS SUR MICRO ET MÉSOCOSMES 5.2.8 CONCENTRATION SANS EFFET PREVISIBLE POUR LES ORGANISMES AQUATIQUES (PNEC)

• PNEC = 5.1 µg/L basée sur : étude : toxicité chez la plante aquatique (Lemna gibba) CE50 = 0.051 mg/L FS = 10 décision de AF le 30/03/10

5.3 EFFETS SUR LES ABEILLES 5.3.1 TOXICITÉ AIGUË

• Abeille - DL50 Contact : >200 µg/abeille - DL50 Orale : >50 µg/abeille 5.4 EFFETS SUR LES ARTHROPODES TERRESTRES AUTRES QUE LES ABEILLES 5.5 EFFETS SUR LES VERS DE TERRE ET AUTRES MACRO-ORGANISMES NON CIBLES DU SOL supposés être exposés à un risque 5.5.1 TOXICITÉ AIGUË 5.5.2 EFFETS SUR LA REPRODUCTION 5.6 EFFETS SUR MICRO-ORGANISMES NON CIBLES DU SOL 5.7 EFFETS SUR D'AUTRES ORGANISMES NON CIBLES (FLORE ET FAUNE) supposés être exposés à un risque 5.8 EFFETS SUR LES MÉTHODES BIOLOGIQUES DE TRAITEMENT DES EAUX USÉES 6 - VALEURS REGLEMENTAIRES CLASSEMENT TOXICOLOGIQUE selon les règles de la directive 67/548/CEE Décision de la Commission des Toxiques le 13/01/93 Xn R36 R40 R43 Classe(s) CMR : Substance cancérogène, troisième catégorie Nocif (Xn) R36 irritant pour les yeux R40 effet cancérogène suspecté - preuves insuffisantes R43 peut entraîner une sensibilisation par contact avec la peau

CLASSEMENT TOXICOLOGIQUE / ETIQUETAGE selon les règles du réglement (CE) N°1272/2008 Classement adapté par ANSES selon les règles de traduction du règlement CLP

Annexes

259

Pictogramme(s) de danger :

SGH07 SGH08 Mention avertissement : attention Cancérogénicité, catégorie 2 H351 Susceptible de provoquer le cancer Irritation oculaire, catégorie 2 H319 Provoque une sévère irritation des yeux Sensibilisation cutanée, catégorie 1 H317 Peut provoquer une allergie cutanée

Annexes

260

ANNEXE2Chromatogrammes CLHP/UV du milieu de culture (MS) pour l’isolat

bactérien 1OP

Figure 1 : 0 jour de culture

Figure 2 : 6 jours de culture

Annexes

261



Annexes

262

ANNEXE3

Chromatogrammes montrant (a) la présence de CMBA (extraction des fragments m/z, 110, 217, 248 et 250) dans le milieu (MS) supplémenté en sulcotrione, ensemencé par la souche 1OP au bout de 27 jours et (b) sa non détection avec 1TRANS.

263

Table des matières

REMERCIEMENTS 3

SOMMAIRE 6

TABLEDESILLUSTRATIONS 9

INTRODUCTION 18

PREMIEREPARTIE:REVUEBIBLIOGRAPHIQUE 22

Chapitre1Soletdiversitémicrobienne 231‐Contexte 232‐Composantemicrobiennedusol 243‐Diversitémicrobiennedusol 26

Chapitre2Méthodologiesnonmoléculairesappliquéesàl’étudedessouchesbactériennestelluriques 271‐Méthodescultivablestraditionnelles 272‐Méthodescultivablesinnovantes 29

Chapitre3Méthodologiesmoléculairesappliquéesàl’étudedessouchesbactériennestelluriques 311‐AnalysedesprofilsderestrictiondesADNr16Samplifiés(ARDRA) 312‐AmplificationPCRdesséquencesrépétitives(REP‐PCR) 333‐SéquençagedesADNr16SetAnalysephylogénétique 353‐1‐Principegénéral 353‐2‐Méthoded’alignement 363‐3‐Reconstructiondesarbresphylogénétiques 373‐4‐Estimationdelarobustessedesarbres 39

Chapitre4Dégradationbiologiquedesproduitsphytosanitairesdanslessols 411‐Dégradationbiologiqueetrécalcitrancemoléculaire 412‐Inductionsenzymatiquesetadaptionsmicrobiennes 423‐Aspectscinétiquesdeladégradationbiologique:Métabolismedirectetco‐métabolisme. 454‐Casparticulierdedégradationbiologique:labiodégradationaccélérée(BDA)despesticides 474‐1‐Contexteetdéfinition 474‐2‐Mécanismesresponsablesdelabiodégradationaccélérée 48

DEUXIEMEPARTIE:PRESENTATIONGENERALEDEL’ETUDE 51

Chapitre1Lafamilledesherbicidestricétones 521‐Contextehistorique 522‐Lasubstanceactive 542‐1‐Fiched’identité 542‐2‐Propriétésphysico‐chimiques 542‐3‐Lesformestautomériquesdelasulcotrione 55

3‐Moded’actiondelasubstanceactive 564‐Approchestoxicologiqueetécotoxicologique 604‐1‐Vis‐à‐visdesmammifères 60

264

4‐2‐Ecotoxicologie 605‐Comportementdanslesdifférentscompartimentsdel’environnement 615‐1‐Danslamatriceair 615‐2‐Danslamatriceeau 615‐3‐Danslamatricesol 645‐3‐1‐Rétentionettransfertdelasulcotrioneetdesesproduitsdedégradation 645‐3‐2‐Dégradationdelasulcotrione 64

Chapitre2Matriced’étude:lesoldePerpignan 671‐Situationgéographiquedelaparcelle 672‐ParamètresédaphiquesdusoldePerpignan 683‐Historiquecultural 694‐Stratégied’échantillonnage 695‐Dispositifexpérimental:lesmicrocosmes 70

TROISIEMEPARTIE:METHODOLOGIESDETRAVAIL 73

Chapitre1Méthodologiedel’analysechimique 741‐Analysedeséchantillonsdesols 741‐1‐RéactifsetMatériels 741‐1‐1‐Standardanalytique 741‐1‐2‐Autresréactifs 741‐1‐3‐Matérielclassiquedelaboratoire 741‐1‐4‐Appareillagechromatographiqueetconditionsd’analyses 75

1‐2‐Protocoleopératoire 761‐2‐1‐Préparationdeséchantillons 761‐2‐2‐Analysechromatographique 76

1‐3‐Performancesdelaméthoded’analyseetvalidation 772‐Analysedeséchantillonsdemilieuxdeculture 772‐1‐Réactifsetmatériels 772‐1‐1‐Standardsanalytiques 772‐1‐2‐Autresréactifs 782‐1‐3‐Matérielsclassiquesdelaboratoire 782‐1‐4‐SpectrophotomètreUV/visible 782‐1‐5‐Appareillageschromatographiquesetconditionsd’analyses 782‐1‐5‐1‐CLHP/UV 792‐1‐5‐2‐CLHP/SM 802‐1‐5‐3‐CPG/SM 81

2‐2‐Protocoleopératoire 832‐2‐1‐Péparationdeséchantillons 832‐2‐2‐Analysechromatographique 84

2‐3‐Performancesdelaméthoded’analyseetvalidation 842‐3‐1‐CLHP/UV 842‐3‐2‐CLHP/SM 852‐3‐4‐CPG/SM 86

Chapitre2Méthodologiedel’analysebiologique 871‐Cadredel’étude:organisationdestravaux 872‐Approchecultivable:essaid’isolementdesouchesbactériennesdégradantlasulcotrione 872‐1‐Principeetstratégiedetravail 872‐2‐Milieuxdecultureetmatérielsutilisés 892‐2‐1‐Préparationdesmilieuxdeculture 892‐2‐1‐1‐Milieucomplexe«sol»ounutrientsoilmedium(NS) 892‐2‐1‐2‐Milieuminimum(MS) 902‐2‐1‐3‐Milieucomplexetrypto‐caséinedesojaouTripticsoy(TS) 92

2‐2‐2‐Matérielsutilisésdanslecadredel’approchecultivable 932‐3‐Protocoleopératoire 932‐3‐1‐Isolementdesouchesbactériennessulcotrione–résistantes 93

265

2‐3‐2‐Isolementdesouchesbactériennesdégradantlasulcotrione 952‐3‐2‐1‐Culturesliquidesrépétéesdesisolatsbactériensavecpressiondesélectiondel’herbicide 952‐3‐2‐2‐Estimationdelacapacitédedégradationdesisolatsbactériensvis‐à‐visdelasulcotrione 96

2‐3‐3‐Caractérisationmorphologiqueetbiochimiquedesisolatsdégradants 983‐Approchemoléculaire:caractérisationdesisolatsbactériensdégradantlasulcotrionevsisolatsnondégradants 993‐1‐Principeetstratégiedetravail 993‐2‐Protocoleopératoire 993‐2‐1‐Extractionetpurificationdel’ADNgénomique 993‐2‐2‐Quantificationetcontrôledelaqualitédel’ADNgénomique 1003‐2‐3‐Caractérisationphylogénétiquedesisolatsbactériens 1013‐2‐3‐1‐AnalysedesprofilsderestrictiondesADNr16S(ARDRA) 1013‐2‐3‐2‐AnalysedesisolatsbactériensparREP‐PCR 1033‐2‐3‐3‐SéquençagedesADNr16S 1053‐2‐3‐3‐1‐LigationdesproduitsPCRdel’ADNr16Sdansunvecteurdeclonage 1053‐2‐3‐3‐2‐Transformationdescellulescompétentesaveclevecteurdeclonage 1063‐2‐3‐3‐3‐TestPCRsurcoloniesdesclonesrecombinants 1083‐2‐3‐3‐4‐Préparationdel’ADNplasmidique(MiniPrep) 1093‐2‐3‐3‐5‐Réactiondeséquençage 1093‐2‐3‐3‐6‐Traitementetanalysedesséquences 111

3‐2‐4‐Caractérisationfonctionnelledesisolatsbactériens: 1123‐2‐4‐1‐Contexte 1123‐2‐4‐2‐DétectionparPCRdesgènesXylEcodantl’enzymecatéchol2,3‐dioxygénase 1143‐2‐4‐3‐DétectionparPCRdesgènesC12Ocodantl’enzymecatéchol1,2‐dioxygénase 1163‐2‐4‐4‐SéquençagedesproduitsPCR 1173‐2‐4‐5‐Traitementetanalysedesséquences 117

3‐2‐5‐Caractérisationphysiologiquedesisolats 118

QUATRIEMEPARTIE:RESULTATSETDISCUSSION 119

Chapitre1ConfirmationdupouvoirbiodégradantdusoldePerpignanetrecherched’uneéventuellebiodégradationaccélérée(BDA) 1201‐RéactivitébiologiquedusoldePerpignan 1202‐Recherched’uneéventuellebiodégradationaccélérée(BDA) 1243‐Conclusion 127

Chapitre2Isolementdesouchesbactériennespotentiellementdégradantesdelasulcotrione 1291‐Recherchedesouchessulcotrione‐résistantes 1292‐Isolementdesouchesbactériennesmétabolisantlasulcotrione 1303‐Etudedupotentieldedégradationdesisolatsdégradants:suivideladissipationdelasulcotrionedanslemilieudeculture(MS) 1344‐Recherchedemétabolitesdelasulcotrionedanslemilieudeculture(MS) 137

Chapitre3Caractérisationphylogénétiquedesisolats1OPet1TRANS 1421‐Vérificationdelaqualitédel’ADNmatrice 1422‐AnalysedupolymorphismedeséquencedesADNr16Samplifiés(ARDRA)desisolats 1423‐Analysedesisolatsbactériensparamplificationdesséquencesrépétitives(REP‐PCR) 1444‐Séquençagedel’ADNr16Sdesisolats1OPet1TRANS 1455‐Conclusion 154

Chapitre4Caractérisationfonctionnelledesisolats1OPet1TRANS 1591‐Préambule 1592‐DétectiondesgènesXylEcodantl’enzymecatéchol2,3‐dioxygénase 1603‐DétectiondesgènesC12Ocodantl’enzymecatéchol1,2‐dioxygénase 1644‐SéquençagedesampliconsXylE 1655‐SéquençagedesampliconsC12O 165

266

CONCLUSIONGENERALEETPERSPECTIVES 167

REFERENCESBIBLIOGRAPHIQUES 173

VALORISATIONDESTRAVAUXDERECHERCHE 207

Publicationn°1(SOUSPRESSE) 208

Publicationn°2 233

Communicationscientifique 241

TABLEDESANNEXES 252

ANNEXE1 253

ANNEXE2 260

ANNEXE3 262

TABLEDESMATIERES 263

DEGRADATION BIOLOGIQUE DE LA SULCOTRIONE DANS UN SOL AGRICOLE : RECHERCHE D’UNE EVENTUELLE BIODEGRADATION

ACCELEREE ET CARACTERISATION DE SOUCHES BACTERIENNES POTENTIELLEMENT DEGRADANTES.

RESUME La dégradation des produits phytopharmaceutiques dans le sol conditionne fortement leur devenir et participe à la réduction des risques de pollution diffuse dans les divers milieux aquatiques, et notamment dans les eaux souterraines. Notre travail avait donc pour objectif d’enrichir les connaissances sur la dégradation biologique dans un sol agricole de la sulcotrione, herbicide largement utilisé dans les itinéraires techniques maïsicoles. Le potentiel dégradant du sol de Perpignan a été mis en évidence en conditions de microcosmes. En revanche, nos résultats ont montré l’absence de phénomène de biodégradation accélérée (BDA), malgré la répétition des traitements. La deuxième partie de l’étude a consisté à isoler et caractériser des microorganismes telluriques intervenant au niveau de la réactivité dégradante de ce sol. Après isolement sur milieux de culture synthétiques de huit souches bactériennes résistantes à la sulcotrione, une seule s’est avérée présenter un potentiel dégradant important, en utilisant l’herbicide comme source de carbone et/ou d’énergie. Après séquençage de l’ADNr 16S, cette souche a été identifiée comme appartenant au genre Pseudomonas espèce putida. Notre étude a permis de localiser le site d’attaque enzymatique au niveau de la partie 1,3-cyclohexanedione de la molécule de sulcotrione. Mots clés : sulcotrione, sol, biodégradation, biodégradation accélérée, Pseudomonas putida, séquençage ADNr 16S.

BIOLOGICAL DEGRADATION OF SULCOTRIONE IN AN AGRICULTURAL SOIL : RESEARCH OF A POSSIBLE ENHANCED

BIODEGRADATION PROCESS AND CHARACTERISATION OF DEGRADING BACTERIAL ISOLATES.

SUMMARY Degradation of pesticides in soil plays a large part in the limitation of risks towards aquifers. This study investigates the biological response of an agricultural soil of south of France after several treatments with sulcotrione, a maize herbicide belonging the triketones group. Although reactivity of the Perpignan soil was clearly confirmed, no enhanced biodegradation was observed after repeated herbicide treatments, under microcosms conditions. The second part of our work consisted on isolating and characterising bacterial strains showing a notable capability to intervene in this biodegradation process. Eight sulcotrione-resisting strains were isolated and tested in liquid culture with sulcotrione as sole carbone and/or energy source. Only one was able to efficiently degrade the herbicide. Partial 16S rDNA sequencing allows identification of this strain as Pseudomonas putida. The enzymatic catalysis occurred at the level of the 1,3-cyclohexanedione moiety of the sulcotrione molecule. Key words: sulcotrione, soil, biodegradation, enhanced biodegradation, Pseudomonas putida, 16S rDNA sequencing

thèse perpignan

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