thèse bactéries du sable de merzouga

Universit Aix-Marseille III e

Ecole Doctorale Sciences de lenvironnement

Bactries du sable de Merzouga e` THESEPrsente pour lobtention du titre de e e

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Docteur de lUniversit Paul Czanne Aix-Marseille III e eSpcialit : Gosciences de lenvironnement e e epar

Maxime GommeauxSoutenue publiquement devant la commission dexamen le 20 septembre 2005 au Cerege

Composition du jury Christian Jeanthon Pascal Philippot Thierry Heulin Franois Guyot c Philippe Gillet Jean-Yves Bottero Rapporteur Rapporteur Examinateur Examinateur Examinateur Examinateur Directeur de recherche, CNRS Station marine de Rosco Directeur de recherches, CNRS IPG Paris Directeur de Recherches, CNRS LEMiR Professeur, Universit Paris-VII e Professeur, Ecole normale suprieure de Lyon e Directeur de recherche, CNRS Cerege, Aix-en-Provence

Laboratoire dcologie microbienne de la rhizosph`re e eCE Cadarache 13115 St Paul-lez-Durance Cedex

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3 ` A Marie-Christine et Jacques

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RemerciementsJe tiens avant tout ` remercier Thierry, qui ma permis de mener cette a th`se dans son laboratoire avec la plus grande libert daction et de pense. e e e Tout pisodiques quaient t nos rencontres, Franois, elles furent e ee c loccasion des plus grandes avances de ce travail. La reconnaissance que je e te porte va bien au-del` de ta qualit de co-directeur de th`se, mme pas a e e e dclar ` ladministration ! e ea Je remercie vivement les membres du jury qui ont accept dvaluer e e ce travail, remplissant encore un peu plus des agendas dj` chargs. ea e Toutes les personnes dont les noms apparaissent clairsems dans ce e manuscript (une sorte de cache-cache ?) sont ici remercies. Ce fut un plaisir e que de travailler avec vous tous, ` Cadarache, Lyon, Paris, Angers ou a ailleurs. Que notre collaboration ait t phm`re ou plus durable, trouvez eee e e ici lexpression de toute ma gratitude. Je tiens aussi ` remercier toute lquipe du LEMiR et ` fliciter tous a e a e ceux qui nont jamais perdu patience devant mes incessantes questions. Delphine et Camille, qui se sont relayes ` me supporter dans leur bureau, e a ont notamment su rester dune srnit exemplaire. ee e Je remercie aussi les jeunes du mardi matin pour le dlicieux bouillon e de culture servi ` cette runion (` laquelle je ne suis pas un mod`le a e a e dassiduit), ainsi que toute lquipe administrative du DEVM, dune e e ecacit redoutable pour aronter les petites tracasseries non-scientiques e qui pars`ment la th`se. e e Je remercie enn Marine ; sans toi tout ne serait pas vraiment pareil.

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Table des mati`res eIntroduction 9

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I

Diversit minralogique du site de Merzouga e e. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .

1921 21 24 24 24 26 29 29 31 33 33 35 35 41

1 Prsentation du site de Merzouga e 1.1 Localisation . . . . . . . . . . . . 1.2 Climat . . . . . . . . . . . . . . . 1.2.1 Donnes mto rsumes . e ee e e 1.2.2 Dsert ? . . . . . . . . . . e 1.3 Contexte gologique de Merzouga e 2 Caractrisations globales du sable e 2.1 Analyses pdologiques . . . . . . e 2.2 Tri magntique du sable . . . . . e 2.3 Granulomtrie du sable . . . . . . e 2.4 Composition chimique du sable . 2.5 Diraction des rayons X . . . . . 2.6 Spectroscopie Mssbauer . . . . . o 2.7 Conclusion des analyses globales .

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3 Analyses grain-par-grain 43 3.1 Observation de lames minces au MEB-EDX . . . . . . . . . . 43 3.2 Spectroscopie micro-Raman . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 45

II

Diversit bactrienne dans le sable e ele sable . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 7

5153 53 58 84

4 Diversit des bactries dans e e 4.1 Mthodes . . . . . . . . . e 4.2 Article . . . . . . . . . . . 4.3 Statistiques cologiques . . e

8 4.3.1 4.3.2 4.3.3 4.3.4

` TABLE DES MATIERES Outils : courbe de rarfaction, communauts thoriques e e e et estimateur ACE . . . . . . . . . . . . . . . . . . . Mod`le : construction des courbes de rarfaction . . . e e Rsultats des simulations . . . . . . . . . . . . . . . . e Diversit bactrienne ` Merzouga . . . . . . . . . . . e e a

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84 87 89 89

5 Diversit grain-par-grain e 95 5.1 Article . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 96 5.2 Comparaison des diversits par AFC . . . . . . . . . . . . . . 115 e

III Mtorologie e e et dsertiques simules e etel-00261542, version 1 - 7 Mar 20086 6.1

culture

en

conditions 119121 . 121 . . . . . . 122 122 122 122 128 128

6.2

Description mto . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . ee 6.1.1 Variations annuelle et diurne de la temprature et de e lhumidit . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . e 6.1.2 Variation corrle de la temprature et de lhumidit ee e e Culture en conditions dsertiques simules . . . . . . . . . . e e 6.2.1 Choix des conditions et dispositif exprimental . . . . e 6.2.2 Rsultats . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . e 6.2.3 Interprtation et discussion . . . . . . . . . . . . . . e

Conclusion gnrale e eA Cycle cellulaire de Ramlibacter

137139

IntroductionLa ralisation, ` lchelle globale, de bilans de quantication des grands e a e cycles biogochimiques requiert une connaissance approfondie de tous les ene vironnements dans lesquels la vie se dveloppe. La recherche de vie dans les e habitats terrestres extrmes occupe aussi une place centrale dans les intere rogations sur les origines de la vie et sur la possibilit de vie extra-terrestre. e Dans les scnarios dexobiologie, on consid`re que leau liquide est ncessaire e e e a ` l habitabilit des plan`tes et ` la vie en gnral. Au cours des derni`res e e a e e e dcennies, la gamme connue denvironnements habits sest tr`s largement e e e tendue, y compris ` des environnements dpourvus deau liquide. Une des e a e plus surprenantes dcouvertes a t celle, en 1977, des cosyst`mes ocaniques e ee e e e profonds associs aux sources hydrothermales, premier cosyst`me connu toe e e talement bas sur la production primaire de bactries chmosynthtiques e e e e e e (Prieur et al., [70]). Lendroit le plus aride de la plan`te, le dsert dAtacama au Chili, est le seul environnement naturel probablement strile ` la surface e a de la Terre (Navarro-Gonzalez et al., [65]). Marion et al., [59], donnent les caractristiques extrmes des environnements dans lesquels la vie existe de e e faon certaine : c 1. la gamme de temprature stend de 253 ` 394 K(soit -20 ` 121 C) ; e e a a 2. la gamme de salinit, mesure en termes dactivit de leau, va de 0,6 e e e a ` 1; 3. le pH va de 0 ` 13 ; a 4. la pression (hydrostatique) va de 0 (vide pouss) ` 1100 bar. e a Les extrmophiles, organismes orissant dans des habitats o` la e u temprature, le pH, la salinit ou la pression sont extrmes (Ciaramella et e e e al., [21]), sont regroups en catgories selon le stress auquel ils sont adapts : e e e les thermophiles et psychrophiles sont respectivement adapts aux e hautes et basses tempratures, des plus chaudes sources hydrothermales e (par exemple Deming, [23]) jusquau permafrost sibrien (Bakermans e et al., [7]) ; 9

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CHAPITRE 0. INTRODUCTION les pizophiles ou barophiles sont adapts aux fortes pressions1 , comme e e celles des grands fonds ocaniques (Margesin, [57]) ; e les acidophiles, alcali(no)philes et halophiles sont adapts ` lacidit, e a e la basicit ou la forte salinit du milieu (comme les bassins hypersae e lins et anoxiques au fond de la mer Mditerrane, qui rsultent de la e e e dissolution de dpts de sel du Mioc`ne, van der Wielen et al., [91]) ; e o e les arophiles rsistent ` un transport atmosphrique et sont frquents e e a e e dans les arosols, y compris au-dessus des dserts (Lighthart et Shaer, e e [53]). . .

Le dveloppement des activits humaines largit encore la gamme de condie e e tions extrmes . Lindustrialisation et les pollutions associes, notamment e e chimique, organique et radiologique, crent des environnements articiels qui e sont aussi en quasi-totalit coloniss par des micro-organismes adapts (voir e e e par exemple Backman et Jansson, [4]). Mme lexploration spatiale a permis e disoler des bactries, contaminant les syst`mes deau de la station spatiale e e internationale, tolrant la micro-gravit (Baker et Le, [6]) ou capables, sur e e une courte dure, de survivre au vide (et donc ` la dessication) et aux radiae a ae tions UV intenses du milieu spatial (Saary et al., [78]). Cherchant ` tayer lhypoth`se de la panspermie, des tests ballistiques sont mens, qui visent ` e e a reproduire le choc de la chute dune mtorite et ` prouver que des spores ee a portes par la mtorite pourraient y survivre (Benardini et al., [9]) ! e ee Les organismes capables de vivre dans les environnements pollus, e en dgradant les composs polluants, ont un intrt vident mme si e e ee e e les connaissances ncessaires ` llaboration de procds de dpollution e a e e e e ecaces sont tr`s importantes (Lovley, [54]). Les utilisations technologiques e des organismes extrmophiles dpassent tr`s largement la biormdiation. e e e e e De nombreuses protines thermostables, maintenant indispensables en e recherche et en industrie, ont t isoles ` partir de bactries du genre ee e a e Thermus. Esprant reproduire le succ`s (plantaire) de la Taq, les chercheurs e e e exploitent maintenant les donnes issus du squenage intgral du gnme e e c e e o dorganismes extrmophiles comme Thermus thermophilus (Henne et al., e [38]). Par rapport aux environnements cits plus haut, il appara ncessaire e t e de distinguer la facult des organismes de survivre ` lapplication dun e a stress (ponctuelle ou plus frquente ou prolonge), de la facult davoir e e e une activit mtabolique normale ou quasi-normale en prsence de ce e e e stress. Les dserts chauds se caractrisent par le caract`re intermittent des e e e1

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Nous ne connaissons pas dadjectif qualiant les organismes rsistant au vide. e

11 extrmes, de temprature et dhumidit. La condition extrme, la chaleur e e e e dapr`s-midi associe ` une tr`s forte dessication (activit de leau infrieure e e a e e e a ` 0,2, soit 20% dhumidit relative), ne permet aucune activit microbienne. e e Par contre, les organismes qui y survivent, ` ltat dormant, protent a e des priodes de conditions plus clmentes. Ces organismes sont qualis e e e d anhydrobiotiques . Antoni van Leeuwenhoek a dcrit il y a plus de trois e cents ans la reviviscence des animalcules (Rotif`res), initialement schs, e e e lors de leur rhydratation. e Le cas le plus tudi actuellement est celui des crotes microbiennes des e e u e e dserts. Garcia-Pichel et Pringault, [32], ont tudi les bad-lands dEspagne e et ont montr que les cyanobactries se dplacent activement verticalement e e e en rponse ` lhumidication ou ` lass`chement de la surface du sol. Ceci e a a e permet dassurer au mieux la production primaire, photosynthtique, quand e les conditions sont favorables, tout en vitant la scheresse de couches les e e e plus supercielles du sol quand leau dispara Br et al., [15], ont tabli un t. a mod`le mathmatique de la dormance. Dapr`s leur tude, la dormance nest e e e e potentiellement avantageuse que si la mortalit des bactries dormantes est e e nettement infrieure ` celle des bactries non-dormantes. Ceci est ralis dans e a e e e le cas dun stress intermittent appliqu au syst`me, comme des vnements de e e e e pluie brefs et intenses spars par des priodes de scheresse. Dans le cas dun e e e e apport deau constant (mme extrmement faible), la dormance ne constie e tue pas un avantage. Toutefois, les perturbations de lcosyst`me, comme e e le pitinement par le btail, augmentent la mortalit des bactries, quelles e e e e soient dormantes ou non. La dormance ntant potentiellement avantageuse e que si la mortalit des bactries dormantes est nettement infrieure ` celle e e e a des bactries non-dormantes, lavantage dispara en cas de telles perturbae t e u tions. Cable et Huxman, [17], ont mesur la part des crotes microbiennes dans la respiration du sol du dsert de Sonora en fonction de lintensit e e des pulses exprimentaux de prcipitations. Lors des vnements les plus ine e e e tenses, les plantes et bactries du sol contribuent ` la quasi-totalit du ux de e a e CO2 . Lors des vnements de faible intensit, qui constituent lessentiel des e e e prcipitations en Arizona, le rveil des organismes des crotes participe e e u a ` hauteur de 80% ` la production de CO2 par le sol. Les crotes contribuent a u donc frquemment ` la production de lcosyst`me. e a e e Billi et Potts, [11], posent les questions fondamentales de ltude des e mcanismes de tolrance ` la dessication. Quel est le contenu en eau dune e e a cellule anhydrobiotique ? Comment certaines esp`ces bactriennes font-elles e e face au dcit en eau alors que dautres ne le peuvent pas ? Combien de e temps les cellules dessches restent-elles viables ? Deux processus entra e e nent un eux de leau des cellules, le dess`chement par lair et le stress hypertoe nique. Mais mme chez les plus extrmes des bactries halophiles, la perte e e e

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CHAPITRE 0. INTRODUCTION

deau reste tr`s infrieure ` celle des cellules anhydrobiotiques. Chez cese e a derni`res, le contenu rsiduel est souvent moins de 0,1 g/g poids sec (et cette e e eau ne sut mme pas ` maintenir une monocouche deau autour des macroe a molcules, rendant notamment impossible toute raction enzymatique). On e e consid`re que les bactries sensibles ` la dessication sont celles qui meurent e e a quand leur contenu en eau est rduit ` 0,3 g/g poids sec. Les premiers stades e a du dess`chement entra e nent un stress osmotique, dont les micro-organismes se prmunissent principalement par laccumulation intracellulaire de soluts. e e Les soluts organiques accumuls, comme le trhalose (un disaccharide), e e e la proline (un acide amin) et la glycine-bta (carboxymthyl-trimthyle e ne e e ammonium) sont dits compatibles car ils ne perturbent pas le fonctionnement des macromolcules et le mtabolisme cellulaire (Kempf et Bremer, e e e [48]). Une telle contrainte de compatibilit explique sans doute le fait que ces soluts sont les mmes chez les bactries, les arches et les eucaryotes. e e e e La cellule maintient une activit plus ou moins normale tant que laccue mulation des soluts vite des pertes deau trop importantes. Surviennent e e ensuite les dommages lis ` la dessication. Les changements de conformae a tion des protines entra e nent un mauvais fonctionnement des enzymes, des cha nes de transport dlectrons. Le stress oxydant peut alors entra e ner des dommages chimiques aux molcules biologiques, notamment ` lADN. Le e a manque deau perturbe aussi la structure des membranes, car les interactions lectrostatiques et hydrophile-hydrophobe qui maintiennent normalement en e place les lipides membranaires sont perturbes. e Inversement, certains organismes poss`dent des syst`mes qui minimisent e e ` la dirence des spores, qui sont presque totalement les pertes deau. A e deshydrates, les kystes ont une teneur en eau comparable ` celle des cellules e a vgtatives. Le processus denkystement inclut la formation dune paroi e e cellulaire plus ou moins paisse qui limite les changes avec lextrieur e e e (Singleton et Sainsbury, [80]). Les kystes, dont Azotobacter est lexemple le plus connu, sont gnralement mtaboliquement dormants et incapables e e e de se diviser. Cette distinction renvoie ` la dirence entre les notions a e dvitement (avoidance) et de tolrance (tolerance). Lvitement regroupe e e e tous les processus qui maintiennent la cellule ou lorganisme en dsquilibre ee thermodynamique avec son milieu, par ltablissement de barri`res phye e siques qui isolent lindividu ou par une exclusion constante du stress par une barri`re chimique ou mtabolique. La tolrance est la capacit pour e e e e lorganisme, ` lquilibre thermodynamique avec le stress, de ne pas en a e sourir en prvenant, diminuant ou rparant les dommages causs par le e e e stress. La rsistance de certains organismes implique ` la fois des mcanismes e a e de tolrance et dvitement (Sugiyama et Nikara, [84]), dont les contributions e e respectives sont dlicates ` estimer. e a

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Les bactries quil est possible de mettre en culture ` partir du sable e a de Merzouga sont, par dnition, rsistantes aux stress de lenvironnement e e dsertique. Le but de cette th`se nest pas de dterminer quels sont les e e e mcanismes physiologiques de cette rsistance mais destimer limportance e e du substrat minral pour la communaut bactrienne. En eet, en labsence e e e de phase liquide, la situation du sable est fondalement dirente de celle e dun sol tempr. Les bactries sont en relation directe avec les particules ee e minrales, ou avec les rares particules riches en mati`re organique. Dans e e les syst`mes naturels (les poussi`res atmosphriques tudies par Tong et e e e e e e e e Lighthart, [87]) ou articiels (les rseaux de distribution deau tudis par Wu et al., [93]), les particules minrales prot`gent les bactries associes des e e e e eets dlt`res des radiations solaires ou des UV utiliss pour la dsinfection. ee e e e De mme, les associations avec les particules dcrites par Lunsdorf et al., e e e e [55], crent des micro-habitats aux conditions physico-chimiques direntes (et plus favorables) de celles du sol moyen . Ltude des interactions e entre les bactries et les minraux dans les environnements arides poss`de e e e donc un double intrt. Outre les quantications des activits mtaboliques ee e e gochimiquement pertinentes, ltude de la participation des minraux aux e e e mcanismes de rsistance des bactries aux stress de lenvironnement prend e e e dans les dserts tout son sens. e Ltude de la diversit dune communaut bactrienne est ncessaire avant e e e e e les tudes fonctionnelles ou physiologiques. La diversit dune communaut e e e repose sur trois points (Dunbar et al., [24]). La composition est linventaire des types bactriens prsents (au niveau taxonomique choisi), la richesse est e e le nombre de types et la structure est labondance relative des dirents types. e Les mthodes molculaires bases sur les squences dADNr-16S permettent e e e e de mieux apprhender chacun de ces trois points (Amann et al., [3]) et de safe franchir des lacunes des mthodes bases uniquement sur les cultures pures. e e Quelle que soit la complexit du syst`me tudi, il est possible dobtenir e e e e les squences des bactries majoritaires. Les mthodes dhybridation in situ e e e par des sondes oligonuclotides, bases sur les squences des bactries supe e e e poses majoritaires, permettent destimer leurs eectifs et donc de raliser e e une estimation de la structure de la communaut. La structure peut tre e e apprhende de plus en plus prcisment par lemploi successif de sondes de e e e e spcicit croissante (approche top-bottom). Dans certains cas, ces mthodes e e e dhybridation permettent mme dobtenir des informations morphologiques e ou physiologiques (comme le contenu cellulaire en ARN, qui renseigne sur le taux de croissance et lactivit des bactries). Les approches bases sur la e e e mise en culture des micro-organismes, malgr les limites voques plus haut, e e e e conservent un fort intrt cologique. Garland et al., [33], consid`rent que les ee e

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bactries cultivables sont celles qui sont capables de coloniser rapidement e un milieu peu contraignant. La proportion de ces bactries opportunistes e dans la ore totale serait donc un bon indicateur de ltat, par rapport ` la e a succession cologique, des communauts. e e Malgr les avances rcentes permises par ces mthodes, la diversit abe e e e e solue des bactries est inconnue et souvent considre comme hors de porte e ee e e (Curtis et al., [22], Cases et Lorenzo, [18]), et ce quelle que soit lchelle ou lenvironnement. Il est gnralement impossible de raliser un inventaire e e e exhaustif des types bactriens prsents, mais les mthodes statistiques utie e e lisant des mod`les de structure de communaut permettent dextrapoler les e e abondances des types majoritaires pour estimer le nombre de taxa prsents. e Les tudes synthtises par Torsvik et al., [90], ont t menes dans des e e e ee e environnements tr`s divers, autant naturels (temprs comme les sols e ee forestiers, sdiments marins ou extrmes comme des bassins saumtres sae e a turs en sel) que perturbs par les activits humaines (sols agricoles, ou zones e e e marines ` forte pollution organique). En analysant lhybridation des ADN exa traits (et posant une dnition de lesp`ce bactrienne ` 70% dhomologie), e e e a les estimations de la complexit gntique des communauts bactriennes e e e e e tudies vont de 7 ` plus de 10000 quivalents-gnmes par cm3 . Curtis et e e a e e o e e e al., [22], tudiant les relations entre la diversit locale et la diversit globale, mettent aussi lhypoth`se que la diversit bactrienne globale est constitue e e e e e dun nombre relativement faible de taxa ubiquitaires. Une estimation quelque peu prcise de labondance des deux ou trois taxa majoritaires amliorerait e e signicativement notre connaissance de la diversit globale. Elle fournirait e aussi un test tr`s intressant de lhypoth`se log-normale de distribution des e e e esp`ces bactriennes, qui constitue la base de la plupart des modlisations e e e mathmatiques en cologie microbienne. Dcoulant dhypoth`ses robustes sur e e e e les mcanismes qui rgulent la densit des esp`ces (Engen et Lande, [25]), e e e e le mod`le log-normal est la meilleure approximation disponible pour la plue part des cosyst`mes. Cette hypoth`se semble toutefois mise en dfaut dans e e e e certains environnements. Zhou et al., [97], ont tudi dirents sols et leurs e e e horizons contenant direntes teneurs en eau et en mati`re organique. Un sol e e de surface, non satur en eau et pauvre en carbone, a montr une commue e naut microbienne tr`s uniforme, au sein de laquelle toutes les esp`ces taient e e e e galement abondantes. Lhorizon infrieur du mme sol, lui aussi pauvre en e e e carbone mais satur en eau, montrait une distribution spcique plus clase e sique, domine par quelques taxa. On consid`re tr`s gnralement que la e e e e e dominance est le rsultat dinteractions comptitives. Zhou et al. proposent e e quatre facteurs susceptibles dentra ner la rpartition uniforme quils ont obe serve. Une grande abondance de ressources rduit la comptition, permete e e tant ltablissement dune grande diversit. Lexistence de la ressource sous e e

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15 direntes formes peut entra e ner une spcialisation des esp`ces, rduisant e e e la comptition. La sparation spatiale des ressources peut rsulter en une e e e sparation physique des populations, vitant encore la comptition. Des e e e conditions environnementales uctuantes peuvent enn entretenir une situation hors-quilibre avec des populations plus diverses. Zhou et al. proposent e aussi un mod`le mathmatique permettant de tester linuence de chacun de e e ces quatre param`tres sur la structure de la communaut bactrienne. e e e Les tudes de la diversit bactrienne dans les zones arides sont plus e e e frquemment menes dans des zones o` un couvert vgtal, mme tr`s claire e u e e e e sem, existe, que dans des zones vritablement dpourvues de vgtation. e e e e e Elles comparent souvent les caractristiques de la communaut microbienne e e e e du sol pr`s ou loin des plantes. Kuske et al., [52], ont compar les rhizosph`res e de trois plantes du plateau aride du Colorado et les espaces sans vgtation e e mais portant une crote microbienne (` trois profondeurs direntes, de la u a e surface du sol ` 30 cm). Deux plantes taient autochtones typiques et la a e troisi`me tait une esp`ce invasive. La quantit dADN extraite des sols rhie e e e zosphriques, et donc la biomasse bactrienne, tait suprieure ` celle des e e e e a espaces inter-plantes. Le concept d lots de fertilit correspond dans les e environnements arides, o` les nutriments sont peu abondants et rpartis u e ingalement, ` la plus nombreuse population microbienne dans la rhizosph`re e a e des plantes. Les microorganismes favorisent la croissance des plantes en xant lazote, limitant des pathog`nes et favorisant la dissolution des minraux. e e Mais la notion souvent admise d lots de fertilit tait inrme dans e e e ltude de Kuske et al. par des quantits de carbone organique du sol et e e un nombre de bactries htrotrophes cultivables partout similaires. Toutee ee fois, les structures des quatre communauts bactriennes taient notablement e e e direntes. Ltude plus prcise du groupe des Acidobacteria, tr`s divers et e e e e connus dans de nombreux types de sols et environnements dans le monde entier, rvlait des dirences plus marques encore. Le rle fonctionnel de e e e e o ces bactries dans les sols nest pas connu, mais cette tude a dmontr que e e e e dirents membres de cette division occupent direntes niches cologiques e e e et seraient donc tr`s intressants ` suivre dans la perspective de changements e e a de type de couvert vgtal lis aux modications de lenvironnement. e e e Aguilera et al., [1], ont ajout ` ce type de comparaison entre le sol e a rhizosphrique et et le sol loin des plantes, une tude de la variabilit ane e e nuelle. Le dsert ctier du Chili a connu une scheresse de huit mois jusqu` e o e a lautomne 1997 (en avril) et des pluies tr`s intenses au printemps suivant e (octobre 1997), quatre fois plus importantes que la moyenne saisonni`re et e lies au phnom`ne El Nio. Si les micro-organismes des deux types de sol e e e n taient environ deux ordres de grandeur plus nombreux au printemps quen e automne, les param`tres chimiques des sols (mati`re organique, azote, phose e

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phore, potassium) ne connaissaient pas deet saisonnier. Bird et al., [12], ont tudi des sols arides du Nouveau-Mexique, constitus de patches de e e e vgtation avec des espaces qui les sparent, mais nont pas observ de tee e e e neurs uniformes (rapportes par Kuske et al.) en mati`re organique dans le e e sol rhizosphrique et entre les plantes. Ils en ont dduit que la teneur en e e carbone, en t/ha est tr`s variable, tant ` lchelle du patch de vgtation e a e e e qu` lchelle du paysage. Cette conclusion est en accord avec lhypoth`se a e e des lots de fertilit . e e e e Dunbar et al., [24], ont tudi la rhizosph`re de pins pignons et les espaces entre les arbres sur deux sites dans une rgion aride boise du nord de lArie e zona, soit quatre chantillons. Le champ de cendres vieux de 900 ans dun e volcan teint constitue un des sites tudis. Lautre est un sol sableux typique e e e de la rgion. Les deux sites connaissent le mme rgime de prcipitations, e e e e mais le sol cendreux est plus grossier et mieux drain. De plus, sa couleur e tr`s sombre cre un environnement plus chaud que le sol sableux (scheresse e e e daphique, Kuske et al., [51]). Contrairement au sol sableux qui porte e quelques herbes, les espaces entre les arbres ne portent pas de vgtation e e sur le sol cendreux. Les auteurs ont compar la diversit bactrienne par e e e polymorphisme de longueur des fragments de restriction (RFLP) de lADNr16S et par squenage du mme g`ne, tant sur des isolats bactriens cultivs e c e e e e quapr`s extraction de lADN du sol et clonage. Tous les param`tres anae e lyss par les auteurs indiquent que les espaces entre les arbres sur le crat`re e e volcanique rec`lent une communaut nettement distincte des trois autres e e chantillons. Dans cet chantillon, les Acidobactries taient majoritaires chez e e e e les clones, qui comptaient aussi de nombreuses Protobactries et Verrucomie e crobiales. Au total, sept divisions bactriennes taient reprsentes (faibles e e e e nombres de bactries gram-positives, de Cytophaga-Flexibacter-Bacteroides, e Nitrospira et Planctomyctales). Parmi les isolats, seules trois divisions de e bactries taient reprsentes. Les bactries ` gram positif (surtout les Bae e e e e a cillus, qui se dveloppent tr`s rapidement sur bo e e te) taient majoritaires, e les Protobactries et Cytophaga-Flexibacter-Bacteroides tant minoritaires. e e e Cette tude souvent cite constitue une rfrence en cologie microbienne des e e ee e zones arides.

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La thmatique gomicrobiologique a dmarr au LEMiR ` la n des e e e e a annes 1990. Le principal objet dtude tait ` lpoque la mtorite de e e e a e ee Tataouine et les objets particuliers, de forme similaire ` des bactries, oba e servs ` la surface des fragments mtoritiques qui ont sjourn plus de e a ee e e

17 soixante ans dans le sable apr`s la chute (voir Gillet et al., [35]). Ltude e e de laltration des minraux en milieux arides est motive par le fait que de e e e tr`s nombreuses dcouvertes de mtorites ont lieu dans les dserts, chauds e e ee e ou froids. Ces dcouvertes ayant gnralement lieu longtemps apr`s la chute, e e e e laltration terrestre est susceptible de brouiller le message chimique port e e par les mtorites. ee Le programme Gomicrobiologie des milieux extrmes (Geomex) du e e CNRS a largi le cadre, gographique et scientique, des tudes. Les dserts e e e e chauds sont un des environnements tudis. De nombreux travaux sont en e e cours, qui visent ` dterminer les modes de rsistance des bactries aux stress a e e e de lenvironnement (notamment la dessication et les rayonnements solaires). La connaissance des conditions de vie des micro-organismes vise aussi ` esa timer la participation des dserts aux cycles gochimiques ` la surface de la e e a Terre. En eet, les dserts chauds reprsentent des surfaces considrables, il e e e ne para pas possible de considrer que la somme des activits mtaboliques t e e e des bactries y est nulle. e Mon travail de th`se a commenc par un inventaire des esp`ces minrales e e e e constituant le sable et des esp`ces bactriennes prsentes ` la surface e e e a des grains. Nous avons ensuite cherch ` dterminer comment ces esp`ces e a e e bactriennes se rpartissent sur les dirents grains, sil existe une relation e e e entre un type minral et une ou plusieurs esp`ces. Ce travail descriptif a t e e ee men dans le but douvrir des pistes sur le fonctionnement de lcosyst`me. e e e Par la ralisation de cultures en conditions dhumidit contrle, nous avons e e oe enn commenc ` dlimiter les conditions environnementales dans lesquelles ea e lactivit bactrienne est possible. e e Le plan de lexpos suit cette dmarche. La premi`re partie dcrit le e e e e site de Merzouga, dun point de vue gologique (climatique succinct et e minralogique) et le sable que nous avons tudi. Viennent ensuite la dese e e cription globale de la diversit bactrienne dans le sable et lestimation de la e e relation entre les types minralogiques de grains et les esp`ces de bactries e e e cultivables. La troisi`me partie rapporte lanalyse plus dtaille des condie e e tions climatiques de la dune de Merzouga et les expriences que nous avons e commenc ` mener pour dlimiter quelles conditions permettent une activit ea e e bactrienne. e Nous avons insr en annexe un article traitant du cycle cellulaire de ee dveloppement dune bactrie-mod`le isole dun sable tunisien. Nous pene e e e sons en eet que ce cycle particulier constitue un lment dadaptation au ee milieu aride.

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18 CHAPITRE 0. INTRODUCTION

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Premi`re partie e Diversit minralogique du site e e de Merzouga

19

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Chapitre 1 Prsentation du site de e Merzougatel-00261542, version 1 - 7 Mar 2008

Rsum du chapitre e eLerg Chebbi est situ pr`s du village de Merzouga, dans un large ensemble e e de valles temporaires, loued Ziz. Laridit due au climat est renforce par la e e e nature du sol . Lerg repose en discordance sur un tr`s large aeurement e de sdiments de l`re primaire. Le dsert ` proprement parler est situ plus e e e a e au sud et ` lest, en Algrie o` lon trouve les grands plateaux dsertiques a e u e (roc et graviers, ou regs), les Hamadas.

1.1

Localisation

Le site que nous avons tudi, lerg Chebbi, est un petit erg, ensemble de e e dunes de sable, situ ` la terminaison orientale de la cha de montagnes ea ne de lAnti-Atlas (qui porte de le nom de Jbel Sarhro), au sud du Haut-Atlas e e e e (voir la Figure 1.1). Il est situ dans la valle dune rivi`re endorique qui porte plus au sud, en Algrie, le nom de Douara, et dispara dans lHamada e t du Dra. En amont de Merzouga, au pied du Haut-Atlas pr`s dErrachidia, a e la rivi`re est amnage par deux barrages pour lirrigation, dont le grand e e e barrage Hassan-Addakhil (visible sur le bloc-diagramme de la Figure 1.6 ` p. 28). A la hauteur de Merzouga, plusieurs branches temporaires constituent lOued Ziz, qui coule essentiellement apr`s les pisodes de prcipitations. e e e Lerg Chebbi, dune longueur de 20 km (nord-sud) pour une largeur denviron 7 km (est-ouest), abrite les plus hautes dunes du Maroc. 21

22

CHAPITRE 1. PRESENTATION DU SITE DE MERZOUGA

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Fig. 1.1 Vue satellitaire du Maroc, obtenue sur le site internet visibleearth.nasa.gov. Le cercle donne la localisation de lerg Chebbi. Barre dchelle : 200 km. e

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1.1. LOCALISATION 23

` Fig. 1.2 Aggrandissement de la zone de lerg Chebbi. A lest de Merzouga, en Algrie, lHamada du Guir, grand e plateau dsertique (reg). Encore plus ` lest, le Grand erg occidental. Au sud de limage, qui appara rouge, lErg e a t Er Raoui. Barre dchelle : 100 km. e

24


1.21.2.1

ClimatDonnes mto rsumes e e e e e

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Nous avons obtenu lenregistrement mtorologique trihoraire pour la staee tion dErrachidia, la plus proche de Merzouga, pour lanne 2002. Les donnes e e ont t obtenues avec laide de Mlle Christel Icard de MtoFrance, en proee ee venance de lOce Mtorologique National du Maroc. Les donnes sont ee e e rsumes dans les diagrammes de la Figure 1.3. Elles seront discutes plus en e e dtail dans la partie 6.1. Les tempratures extrmes releves sont de -0,6 C e e e e le 8 janvier ` 9h00 et 41,7 C le 23 juillet vers 15h00 (voir Figure 1.3(b)). Les a tempratures moyennes mensuelles vont de 3 C en janvier ` 25 C en juillet e a pour les minimales et de 17 C ` 39 C les mmes mois pour les maximales a e (voir Figure 1.3(a)). La pluviomtrie totale est de 191 mm, dont 60 mm e reus en avril, mois le plus pluvieux (voir Figure 1.3(c)). Cinq mois nont c vu aucun jour de pluie (cest-`-dire aucun jour avec plus de 2,5 mm de a prcipitations), janvier, juin, juillet, octobre et dcembre. Le nombre total e e de jours de pluie en 2002 est de 16 (voir Figure 1.3(d)).

1.2.2

Dsert ? e

Lerg Chebbi est-il un dsert selon les crit`res classiques ? Il existe de e e nombreuses dnitions du dsert. La quantit annuelle de prcipitations est e e e e importante mais nest pas un crit`re susant. Les pertes deau, principae lement par vaporation, sont primordiales. Par exemple, la rgion dHillet e e Doleib, au Soudan, reoit plus de 75 cm deau par an. Mais la pluie tombe c surtout en t, quand les tempratures moyennes journali`res sont de plus ee e e de 26 C. Laridit est quivalente ` celle dautres endroits dAfrique du e e a ` Nord qui reoivent dix fois moins deau. A linverse, certains rgions de c e louest de lAustralie ne reoivent que 25 cm deau. Mais les prcipitations c e sont rguli`res au long de la saison la plus fra e e che, et susent ` la croisa sance de bonnes rcoltes de bl (Miller [63], in Warner [92]). Miller, [63], e e a tabli une dnition du dsert communment accepte, qui tient compte e e e e e de la temprature, qui inue sur lvaporation. Un dsert est une rgion e e e e o` P < T /5, o` P est la quantit annuelle de pluie, en pouces, et T la u u e temprature annuelle moyenne, en degrs Fahrenheit. T est la moyenne des e e tempratures moyennes journali`res, qui sont la moyenne des tempratures e e e minimale et maximale releves quotidiennement. La temprature moyenne e e annuelle ` Merzouga est T = 20, 6 C = 69 F. La quantit seuil de a e prcipitations est donc Rinf = 13, 8 = 350 mm. La rgion de Merzouga, e e qui na reu en 2002 que 191 mm de pluie correspond bien ` cette dnition c a e

1.2. CLIMAT

25

Tempratures moyennes45 40 35 30 25 45 40 35 30

Tempratures extrmes

TC

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20 15 10 5 0 -5 janv fv mars avril mai juin juil aot sept oct nov dc

TC

maxi mini

25 20 15 10 5 0 -5 janv fv mars avril mai juin juil aot sept oct nov dc

maxi mini

(a)Pluviomtrie90 80 70 60 3 4

(b)Jours de prcipitations > 2,5 mm

joursjanv fv mars avril mai juin juil aot sept oct nov dc

mm

50 40 30 20 10 0

2

1

0 janv fv mars avril mai juin juil aot sept oct nov dc

(c)

(d)

Fig. 1.3 Rsum des donnes mtorologiques de la station dErrachidia, e e e ee anne 2002. e

26


du dsert. La rgion autour de lerg compte une vgtation clairseme. Labe e e e e sence de vgtation sur lerg rsulte aussi de la nature du sol , qui retient e e e mal leau et est en permanence remobilis par le vent. On parle de scheresse e e daphique. e

1.3

Contexte gologique de Merzouga e

Dapr`s la carte gologique1 , la zone est constitue essentiellement de e e e roches sdimentaires, dont les ges stendent de l`re primaire pour le e a e e socle au quaternaire rcent pour les termes les plus superciels de la e couverture, dont les dunes (voir Figure 1.4). Le sous-sol de la valle du Ziz est constitu pour lessentiel de sdiments e e e de l`re primaire, du cambrien au carbonif`re. La srie primaire, plisse, come e e e prend en majorit des dpts terrig`nes, sdiments en domaine marin peu e e o e e e profond. Absents du cambrien (km), qui est grseux, des niveaux carboe nats apparaissent pisodiquement vers le sommet de lordovicien (OS). Le e e dvonien, infrieur et moyen, voit une inuence carbonate plus marque. e e e e Lordovicien suprieur et le silurien sont des schistes, avec des niveaux carboe nats pisodiques. Le carbonif`re constitue le substratum du village de Mere e e zouga et de lerg Chebbi. Le carbonif`re infrieur est constitu de schistes e e e argileux et dargilites et le carbonif`re suprieur dune succession de poue e dingues, de gr`s et de plites, et de roches biogniques comme les calcaires e e e rcifaux. Le permien naeure pratiquement pas dans cette zone. e La srie primaire repose en discordance sur un substratum prcambrien e e constitu de sries volcano-sdimentaires et volcaniques. Aecte par de e e e e faibles dformations, elle a enregistr une tectonique synsdimentaire case e e e sante (Montenat et al., [64]). Des accidents actifs pendant la sdimentation ont t repris ultrieurement, lors des dformations hercyniennes, la structuee e e ration hercynienne de la zone restant faible. On remarque des plis de grande longueur donde, ainsi que le rsultat du rejeu des failles synsdimentaires. e e Toute la srie primaire est recoupe par des intrusions de dykes et de sills e e de dolrite et de diorite. Les vnements volcaniques sont triasico-liasiques, e e e dats ` 181-187 Myr et lis ` louverture de locan Atlantique. e a e a e Discordant sur cette srie primaire, on trouve les roches principalement e calcaires du crtac (cm) et du tertiaire. Leurs termes en sont continentaux, e e lacustres. Les aeurements sont tr`s tabulaires, donnant notamment naise sance au paysage des Hamadas (dont lHamada du Guir ` 50km ` lest de a a Merzouga, visible sur la photo satellite Fig. 1.1). En prolongement de cetteCarte gologique du Maroc.- 1 :1 000 000.- Ed. du Service gologique du Maroc [Rabat], e e 1985.- (Notes et mmoires du Service Gologique ; 260) e e1

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1.3. CONTEXTE GEOLOGIQUE DE MERZOUGA

27

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Fig. 1.4 Carte gologique simplie de la rgion de Merzouga. Le village e e e de Merzouga est situ au bord ouest de lerg Chebbi, entour daeurements e e de carbonates du Carbonif`re. e

Fig. 1.5 Coupe de la rgion de Merzouga (gurs : voir texte) e e

28


srie, ou en discordance directement sur les terrains primaires, on trouve les e sdiments quaternaires, notamment un plistoc`ne reposant discordant sur e e e le visen ` proximit immdiate de Merzouga. e a e e e ` La Figure 1.5 synthtise ces observations sous la forme dune coupe a e e main leve. La Figure 1.6 prsente la structure de la rgion. e

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Fig. 1.6 Bloc-diagramme donnant la structure gologique de la rgion e e e e e (Jger, [45]). Lgende, premi`re ligne : Hamada du tertiaire rcent avec a des dpts uviatiles quaternaires ; Hamada tertiaire ; Hamada crayeuse ; e o Deuxi`me ligne : Calcaire jurassique ; Socle aect de failles ; Roches vole e caniques. Le village de Merzouga et lerg Chebbi sont situs environ ` mie a chemin entre Errachidia et Taouz.

Chapitre 2 Caractrisations globales du e sabletel-00261542, version 1 - 7 Mar 2008

Rsum du chapitre e eNous appelons ici analyses globales les tudes qui rendent compte des e caractristiques moyennes du sable ` lchelle de quelques grammes, soit de e a e quelques dizaines de milliers de grains. Le sable est dicilement comparable a ` un sol tempr, car il ne contient presque pas de mati`re organique. Il est ee e essentiellement constitu de grains de quartz (et, chimiquement, de silice), e mais une fraction dautres minraux peut tre mise en vidence et extraite par e e e tri magntique. Cette fraction est tr`s enrichie en minraux ferrif`res, come e e e prenant a la fois des minraux primaires (mme sil est dicile de dterminer ` e e e la nature de la roche-m`re) et des minraux secondaires, forms ` la surface. e e e a

2.1

Analyses pdologiques e

Malgr la nature quasiment exclusivement minrale du sable (et non pas e e organo-minrale), nous avons fait raliser une analyse pdologique du sable. e e e Celle-ci a t faite suivant les protocoles standards de lINRA, en son laboraee toire dArras. Les rsultats sont donns dans le tableau 2.1. Pour comparaison e e nous avons gur les mmes analyses ralises sur un sol calcaire de Cadae e e e rache, anciennement cultiv mais laiss actuellement ` labandon depuis le e e a milieu des annes 80 (Th`se T. Perrier, [68]). e e La granulomtrie est clairement celle dun sable, la classe > 200 m e domine nettement. Lexpression pH du sable signie que lon mesure le pH dune solution ` lquilibre avec un chantillon du sable mis en suspension a e e dans leau, dans le rapport sol/solution de 2,5 pour 1 (Baize, [5]). La valeur du 29

30

CHAPITRE 2. CARACTERISATIONS GLOBALES DU SABLE

Analyse Granulomtrie Argile (< 2 m) Limon fin (2 20 m) Limon grossier (20 50 m) Sable fin (50 200 m)

Mthode ou protocole 5 fractions sans dcarbonatation

Merzouga Cadarache 25 3 7 324 641 179 180 253 297 91 8,4 258 0,002 6,3 0,08 g/kg g/kg cmol+/kg g/kg g/kg g/kg g/kg g/kg g/kg g/kg g/kg g/kg

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Sable grossier (200 2000 m) pH Calcaire total Phosphore (P2O5) Capacit d'change cationique Calcium (CaO) changeable Sodium (Na2O) changeable Magnsium (MgO) changeable Potassium (K20) changeable Carbone et Azote Carbone organique Matires organiques Azote organique Rapport C organique sur N total Conductivit totale Fer (Fe) Fer (Fe) sur extrait 1/5 (m/V) 25 C Mthode Tamm en obscurit Mthode Mehra-Jackson Mthode Olsen Mthode Metson l'actate d'ammonium l'actate d'ammonium l'actate d'ammonium l'actate d'ammonium selon NF ISO 10694 et 13878 l'eau

9,1 54 0,003 1,7 6,35 0,039 0,10 0,08

< 0,05 0,1 < 0,02 ND 0,04 0,015 0,190

12,4 21,3 1,04 12 -

g/kg g/kg g/kg

mS/cm g/100g g/100g

Tab. 2.1 Rsultats des analyses pdologiques du sable de Merzouga. Les e e rsultats danalyses sur un sol de Cadarache sont donns pour comparaison. e e

2.2. TRI MAGNETIQUE DU SABLE

31

pH mesure qualie le sable de tr`s basique. Cette alcalinit ne correspond e e e pas au quartz, qui constitue lessentiel de la masse du sable, mais ` des a carbonates ou ` des sels prsents soit en grains soit ` la surface des quartz. a e a La situation est dirente dans le cas du sol de Cadarache, o` les calcaires, e u constituant la roche-m`re sur laquelle le sol sest dvelopp (entre autres par e e e laction de la vgtation), inuent tr`s nettement sur les caractristiques du e e e e ` Merzouga, les caractristiques du sol rsultent plus de laridit que de sol. A e e e la nature de la roche-m`re. e La capacit dchange cationique (CEC) dsigne la quantit totale de cae e e e tions quun sol peut retenir sur son complexe adsorbant, ` un pH donn. a e Ladsorption est localise ` la surface des minraux phylliteux (qui ont e a e gnralement une CEC de 10 ` 100 cmol/kg) et des mati`res organiques e e a e (CEC tr`s forte, 100 ` 500 cmol/kg). La CEC est mesure ` pH 7 par ajout e a e a dactate dammonium normal. Lammonium remplace les contre-ions des e argiles. Apr`s rinage, Na+ ajout remplace ` nouveau lammonium, qui est e c e a alors dos dans la solution. La valeur de capacit dchange cationique mee e e sure dans le sable de Merzouga est tr`s faible, correspondant ` la tr`s faible e e a e teneur en argiles et en mati`re organique. e Le carbone et lazote sont aux limites de sensibilit des mthodes utilises, e e e et il est impossible de calculer un rapport C/N. Le Fer, est mesur par deux e mthodes. La mthode de Tamm dose le fer amorphe ou crypto-cristallin, e e issu de laltration des silicates ou des oxydes. La mthode Mehra-Jackson est e e plus drastique et analyse en plus les oxydes et oxyhydroxydes de fer, hrits e e ou noforms. e e Toutes ces caractristiques conrment que le sable nest pas un sol au sens e strict, mais un environnement essentiellement minral. Les particules qui sont e gnralement considres comme lunit physique (et, de plus en plus, microe e ee e biologique), les agrgats, en sont absentes. Lunit pertinente semble alors e e tre le grain de sable. Labsence deau macroscopique et donc de solution e ` e du sol, renforce le caract`re discontinu du milieu. A lchelle micromtrique, e e lenvironnement des microorganismes est donc directement li ` la nature des ea phases minrales. e

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2.2

Tri magntique du sable e

La ncessit du tri est apparue d`s le dbut de ltude. En eet, lobsere e e e e vation du sable ` la loupe binoculaire, ` faible grossissement, a montr que a a e le quartz est la forme dominante. En proportions denviron 1 %, on trouve aussi des oxydes de fer, opaques, et dautres minraux clairs. Lexistence e dune forme tr`s dominante est un frein ` une caractrisation ne des phases e a e

32


les moins abondantes. An de pouvoir tudier plus avant ces phases minoritaires, nous avons e donc opt pour un tri magntique du sable. Les fractions tries serviront aussi e e e a ltude de la diversit des micro-organismes selon les phases, en mettant ` e e laccent sur les oxydes de fer. Dautres mthodes de tri, comme celles utilisant e la loi de Stokes ou la mthode des liqueurs denses ne sont pas applicables e pour le traitement biologique auquel le sable est destin. Elles induisent en e eet un risque de dcoller les cellules adhrant aux grains de sable, voire e e de les tuer. Une fois spares, les direntes phases minralogiques seront e e e e tudies individuellement. Ainsi, la diversit microbienne associe ` chaque e e e e a fraction minrale pourra tre dcrite. e e e Le tri a donc t ralis avec un trieur magntique (Frantz Isodynamic ee e e e e mod`le L1, voir Figure 2.1) au Laboratoire de gochimie des isotopes stables e de lUniversit Paris VII-IPGP avec laide de Pierre Agrinier. Cette teche nique a t applique avec succ`s au tri de minraux constitutifs de roches, ee e e e de minerais ou de sables non consolids (McAndrew, [60]). En eet, tous les e minraux poss`dent une certaine susceptibilit magntique. Elle peut tre e e e e e tr`s faible mais lamlioration des instruments permet de la rvler chez des e e e e esp`ces qui ont t longtemps considres comme amagntiques. Le sable e ee ee e passe sur un plan vibrant. Ce plan est doublement inclin, dans le sens du e ux ( pente avant , longitudinal slope) et latralement ( pente latrale , e e transversal slope). Un champ magntique appliqu spare ce ux en deux e e e selon que les grains sont plus ou moins dvis au cours de leur descente. En e e sortie, deux goutti`res guident les grains vers deux godets rcepteurs. Quels e e que soient les rglages, le sparateur divise un chantillon en deux fractions. e e e Par dichotomies successives, on peut sparer les phases selon les proprits e ee des dirents minraux. La sparation la plus sensible est obtenue en utilie e e sant le champ le plus fort possible, la pente avant la plus faible et la pente latrale la plus forte. Pour trier le sable de Merzouga, il a t procd comme e ee e e suit. An de sparer trois phases, deux passages dans le sparateur ont t efe e ee fectus. Les param`tres de pente ont t conservs, seule lintensit du champ e e ee e e magntique appliqu a vari. Nous avons x pour toute lexprience : pente e e e e e avant 15 , pente latrale 4 . e Lintensit du champ magntique a t xe ` 0.5 Am dans la bobine e e ee e a pour sparer de la masse les grains tr`s magntiques (ralis deux fois e e e e e pour maximiser le rendement), qui constituent la fraction TM. Un deuxi`me e passage extrait les grains faiblement magntiques , avec une intensit ape e plique de 1 Am (en conservant les param`tres de pente ; rendement maximal e e atteint en un passage). Les grains amagntiques sont recueillis et constituent e la troisi`me fraction, rsiduelle. La vitesse du tri est de quelques dizaines e e de grammes par heure. Les masses des fractions recueillies en moyenne sont

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2.3. GRANULOMETRIE DU SABLE

33

donnes dans le Tableau 2.2. e Pour sparer les phases en vue dtudes minralogiques, il na pas t pris e e e ee de dispositions spciales de propret biologique . Pour la prparation du e e e matriel qui servirait de base aux tudes biologiques, le tri dune deuxi`me e e e srie doit tre ralis en accordant une attention particuli`re ` la propret e e e e e a e pour viter au maximum les contaminations. e

2.3

Granulomtrie du sable e

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La dtermination de la granulomtrie du sable a t eectue ` lIRSN e e ee e a avec laide de Thomas Perrier, sur un granulom`tre laser Malvern. Cette e technique repose sur lanalyse des tches de diraction du faisceau lorsquil a traverse la chambre o` le sable est maintenu en suspension (thorie de Fraunu e hofer). Les rsultats sont donns ` la Figure 2.2 sous la forme dune courbe e e a granulomtrique. Les 14 classes de diam`tre quivalent suprieur ` 200 m toe e e e a talisent 95,8 % du volume du sable. Le logiciel danalyse calcule un param`tre e de sphricit des grains. Dans le cas du sable de Merzouga, les grains sont e e presque sphriques (voir aussi la forme des grains sur la Figure 3.1). Faisant e cette approximation, il est possible destimer le nombre de grains de sable par gramme. Pour cela on dtermine la masse volumique du sable (1670 kg/m3 , e pores inclus) et sa porosit (37 %). La masse volumique de la fraction grains e seuls est alors 2650 kg/m3 , tr`s proche des valeurs admises pour le quartz. e Les grains plus petits ne sont pas inclus dans ce calcul. En eet, leur importance massique est faible et le nombre de grains calcul ainsi serait vide de e sens.

2.4

Composition chimique du sable

La caractrisation chimique a t ralise au Cerege par ICP avec laide e ee e e de Jean-Claude Germanique. Apr`s fusion dans le borate de lithium, les e chantillons sont ioniss en un plasma. La mesure des rayonnements mis e e e (chaque longueur donde tant caractristique dune transition lectronique, e e e donc dun lment) donne les abondances lmentaires dans lchantillon. ee ee e Ceci est ralis apr`s broyage des chantillons, qui facilite leur dissolution. e e e e On mesure aussi leau retenue dans la porosit (par la perte lors du chaufe fage ` 110 C) et la perte au feu (eau de structure, sulfures, carbonates. . .). a ee Le Tableau 2.3 donne donc la composition lmentaire du sable total et de la phase minraux sombres (=fraction tr`s magntique + fraction peu e e e magntique), converties en poids doxydes. Ces rsultats indiquent que le tri, e e

34


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Fig. 2.1 Trieur magntique Frantz. Le sable est introduit dans lentonnoir, e puis passe sur le plan vibrant (le vibreur est noir, dans le prolongement du plan inclin, ` droite). Les deux lectro-aimants crent le champ magntique, e a e e e dintensit rglable. En bas du plan inclin, les deux godets rcup`rent les e e e e e fractions spares. Les rglages dinclinaison, qui dterminent lecacit de e e e e e la sparation, sont faits par deux volants, dont lun est visible ` droite). e a Fraction Tr`s magntique TM e e Peu magntique PM e Rsiduelle e Perte Masse recueillie 7,4 g 82,5 g 910 g < 0, 5 g

Tab. 2.2 Masse des direntes fractions du sable, pour 1 kg tri. e e

16 14 12

% volumique

10 8 6 4 2 0 1 10 100 1000

Taille des particules (m)

Fig. 2.2 Courbe granulomtrique du sable de Merzouga. La fraction e suprieure ` 200 m reprsente 96 % du sable. e a e

2.5. DIFFRACTION DES RAYONS X

35

comme ralis, ne permet pas de se dbarrasser du quartz et dobtenir une e e e phase doxydes de fer purs. Cependant, lenrichissement en fer de la phase minraux sombres est tr`s signicatif ( 20). e e

2.5

Diraction des rayons X

tel-00261542, version 1 - 7 Mar 2008

La diraction des rayons X a t ralise au Cerege avec laide de Daniel ee e e Borschneck. Le dispositif est prsent ` la Figure 2.3. Les quatre fractions e ea issues du tri magntique ont t broyes ` la main avec un mortier en agate. e ee e a On obtient alors une granulomtrie de lordre de 20 m. Les poudres (environ e 200 mg) ont t montes sur des supports en aluminium. Les donnes ont ee e e t acquises sur un diractom`tre Philips MPD-3710, ` la longueur donde ee e a K du Cobalt ( = 1, 79 ). Lacquisition a t faite pour 2 allant de 3,5 A ee a ` 78 , en comptant 5 s ` chaque pas de 0,05 (soit un total denviron 2 h). a Apr`s acquisition, les donnes ont t traites par le logiciel XPert (Philips). e e ee e a Les diractogrammes sont donns dans les Figures 2.4 ` 2.7. Sur ces e gures, lchelle verticale a t rduite pour que les pics des minraux peu e ee e e abondants soient visibles. Dans les prols du sable total (ST) et de la fraction rsiduelle, tr`s appauvrie en lments apr`s extraction de TM et e e ee e PM, les seuls minraux identiables de faon certaine sont le quartz, dont e c les pics dominent tr`s nettement, et la calcite. Sy ajoute un feldspath, dont e lamplitude faible des pics ne permet pas de dterminer plus prcisment e e e la nature. Les spectres des fractions tr`s magntique et peu magntique e e e rv`lent une plus grande diversit de minraux. e e e e Le sable est donc tr`s nettement domin par le quartz. Les minraux e e e autres sont peu abondants mais divers. Il nest pas possible, avec les seuls rsultats de diraction, de prciser leurs abondances. e e

2.6

Spciation du Fer en spectroscopie Msse o bauer Fer-57

Cette tude a t ralise ` lEcole Suprieure de Physique et de Chie ee e e a e mie Industrielles, avec laide dEmmanuel Fritsch. Nous avons tudi la e e spciation du fer en spectroscopie Mssbauer. La source de rayons utie o lise est lisotope 57 du fer. Cet isotope reprsente environ 1 % du fer toe e tal naturel. La spciation de cet isotope est reprsentative du fer total (il e e nexiste pas de fractionnement isotopique naturel susant pour perturber la reprsentativit ` lchelle de ltude). Les deux chantillons tudis sont issus e ea e e e e e

36


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Fraction Minraux sombres e SiO2 47,9 Al2 O3 10,6 Fe2 O3 25,29 MnO 1,42 CaO 1,7 MgO 2,25 Na2 O 1,06 K2 O 1,27 TiO2 1,4 P2 O5 0,88 H2 O(110 C) 1,2 PF 4,52 Total 99,49

Sable total 92,27 1,02 1,22 0,04 0,35 0,16 0,03 0,22 0,07 0,02 0,87 3,69 99,95

Tab. 2.3 Composition (% masse) du sable de Merzouga et de la phase minraux sombres (=fraction tr`s magntique + fraction peu e e e magntique). e

Dtecteur

Source

2

Echantillon

Fig. 2.3 Dispositif utilis pour la diraction des rayons X. Lchantillon e e est clair par le faisceau sous lincidence . Le dtecteur, plac de faon e e e e c symtrique ` la source, mesure lintensit des rayons X rmis, en fonction e a e ee de .

2.6. SPECTROSCOPIE MOSSBAUERXRD spectrum of the bulk sand6000

37

qz

5000

qz

4000 qz counts

3000

2000

ca qz qz qz

qz

1000 qz ca 0 fdfd fd ca

qz

qz qz

ca

ca ca

ca

tel-00261542, version 1 - 7 Mar 2008

3

5

7

9 11 13 15 17 19 21 23 25 27 29 31 33 35 37 39 41 43 45 47 49 51 53 55 57 59 61 63 65 67 69 71 73 75 77 2-theta angle,

Fig. 2.4 Diractogramme du sable total. Le quartz (qz) et la calcite (ca) sont prsents de faon indubitable. Les pics proches de 32 sont attribus ` e c e a un feldspath (fd).XRD spectrum of the TM fraction3000

qz

2500 qz

2000

counts

1500 qz

1000 qz qz qz fd 500 cl mu fd 0 3 5 7 9 11 13 15 17 19 21 23 25 27 29 31 33 35 37 39 41 43 45 47 49 51 53 55 57 59 61 63 65 67 69 71 73 75 77 2-theta angle, cl cl mu mu +gt ca camu

qz qz qz ca ca ca hm ca qz

hm+gthm

qzgt

mu

Fig. 2.5 Diractogramme de la fraction tr`s magntique TM. En plus du e e quartz, de la calcite et du feldspath, cette fraction contient des minraux e argileux (probablement une chlorite, cl), un mica (muscovite, mu), un pic attribu ` la gthite (gt) est prsent vers 48 (les autres pics de la gthite sont ea e presque confondus avec un pic de la muscovite vers 21 un pic de lhmatite e vers 38 ).

38


XRD spectrum of the PM fraction3000 qz

qz

2500

2000

qz counts 1500 ca qz qz 1000 qz qz fd 500 cl mu cl mu 0 mu ca mu hm mu ca ca ca ca ca qz qz qz qz

tel-00261542, version 1 - 7 Mar 2008

3

5

7

9

11 13 15 17 19 21 23 25 27 29 31 33 35 37 39 41 43 45 47 49 51 53 55 57 59 61 63 65 67 69 71 73 75 77 2-theta angle,

Fig. 2.6 Diractogramme de la fraction peu magntique PM. Le quartz et e la calcite sont dominants, celle-ci montrant des pics plus intenses que dans la fraction TM (abondance suprieure). La gthite, visible sur le spectre TM, e nappara pas ici. Les autres minraux sont les mmes. t e e

XRD spectrum of the residual fraction5000

qz

4500

4000

qz

3500

3000 qz counts 2500

2000

qz

qz

1500

qz qz ca qz ca ca fdfd ca

1000

qz

qz

500

qz ca ca

0 3 5 7 9 11 13 15 17 19 21 23 25 27 29 31 33 35 37 39 41 43 45 47 49 51 53 55 57 59 61 63 65 67 69 71 73 75 77 2-theta angle,

Fig. 2.7 Diractogramme de la fraction rsiduelle. Seuls le quartz et la e calcite sont identis. Les autres minraux sont tr`s appauvris voire absents. e e e

2.6. SPECTROSCOPIE MOSSBAUERTM 295K (mm/s) C1 C2 C3 C4 2 S S 2 0,4 0,38 0,42 1,13

39

EQ(mm/s) 0,63 -0.210 -0.287 2,56

Hm kOe 518,7 371,9

W (mm/s) 0,8 0,41 0,45 0,5

Ec/kT 29 4,6

AR (%) 50,7 Fe(III) 31,9 Hm(wf) 11,7 Gt? 5,7 Fe(II)

28/03/03 (xj);

Sources: Fmb_295.sam; Fer mar03.mcs ( = -0.134, Vmax = 13.190)

PM 295K (mm/s) C1 C2 C3 C4 2 S S 2 0,36 0,4 0,54 1,14 (mm/s) 0,65 -0.190 -0.086 2,64

EQ

Hm kOe 525 353,4

W (mm/s) 0,63 0,43 0,45 0,5

Ec/kT 23,8 1,6

AR (%) 45,7 Fe(III) 15,8 Hm(wf) 20,5 Gt? 18 Fe(II)

tel-00261542, version 1 - 7 Mar 2008

26/06/03 (xj);

Sources: Fmb_295.sam; Fer juin03.mcs ( = -0.134, Vmax = 13.190)

Tab. 2.4 Param`tres des composantes issues de la dconvolution des e e spectres Mssbauer des deux fractions du sable. o du tri magntique du sable de Merzouga. Lchantillon TM (tr`s magntique) e e e e est extrait ` champ faible et PM (peu magntique) est extrait dun deuxi`me a e e passage du sable, ` champ fort. Les rsultats sont donns sur la Figure 2.8. a e e Les param`tres des composantes issues de la dconvolution des spectres sont e e donnes dans le tableau 2.4. e Le spectre de la fraction tr`s magntique TM est moins bruit et les sie e e gnaux Mssbauer sont meilleurs que ceux de PM, car TM est plus riche en fer. o Les spectres des deux fractions sont dconvolus avec quatre composantes, e e deux sextuplets et deux doublets. Les deux sextuplets sont : le sextuplet dont le champ est le plus lev, C2 (Hm de 518 ` 525 kOe), e e a correspond ` de lhmatite, a e le sextuplet de champ moins lev, C3 (Hm de 353 ` 372 kOe) est en e e a phase de relaxation (Ec/kT tr`s faible). Il correspond ` de la gthite de e a cristallinit leve ou faiblement substitue, qui appara malgr lacee e e t e quisition des spectres ` temprature ambiante (lacquisition de spectres a e a ` temprature plus basse permettrait de conrmer cette hypoth`se). e e Les deux doublets sont : la phase C1, paramagntique, correspond ` une fraction de gthite e a plus substitue ou de cristallinit infrieure ` la phase C3, e e e a la phase C4 donne un doublet pour du fer II. Ce doublet est mieux rsolu dans PM que TM. e La spectroscopie Mssbauer met donc en vidence des phases minrales o e e

40


TM 295K1,0051,002

PM 295K

1

1

tel-00261542, version 1 - 7 Mar 2008

0,995

0,998

Exp

Exp

0,99

0,996

0,985

0,98

Exp Fit C1 C2 C3 C4

0,994

0,992

Exp Fit C1 C2 C3 C4

0,975 -15 -10 -5 0 5 10 15

0,99 -15 -10 -5 0 5 10 15

V(mm/s)

V(mm/s)

(a) Fraction tr`s magntique e e

(b) Fraction peu magntique e

Fig. 2.8 Spectre Mssbauer Fe57 des fractions tr`s magntique (TM) et o e e peu magntique (PM) du sable de Merzouga, acquis ` temprature ambiante, e a e et composantes issues de la dconvolution des spectres. C2 et C3 sont des e sextuplets, C2 ayant un champ hypern fort (hmatite) et C3 en phase de e relaxation ` champ plus faible (une partie de la gthite). C1 et C4 sont des a doublets. C1 correspond ` du fer III paramagntique (gthite substitue ou a e e mal cristallise) et C4, qui est mieux rsolu dans PM que dans TM, ` du e e a fer II

2.7. CONCLUSION DES ANALYSES GLOBALES

41

a ` fer II et ` fer III. Deux phases ` fer II ont t observes par ailleurs, en a a ee e lame mince au MEB ou en spectroscopie Raman. Lilmnite a t observe e ee e au MEB, sous la forme dun grain tr`s riche en fer et titane (voir Figure 3.4 e p. 46). La biotite a t analyse en inclusion dans quelques grains, au Raman. ee e Les deux minraux ` fer III sont lhmatite et la gthite. Les abondances e a e relatives des quatre composs C1 ` C4 sont donnes en pourcent. La phase e a e C1 ` fer III reprsente dans les deux cas pr`s de la moiti du fer. Les phases a e e e TM et PM se distinguent par labondance relative des autres composantes. Par rapport au fer total, la proportion du fer II est suprieure dans la e fraction PM ` ce quelle est dans la fraction TM. a Nous faisons donc lhypoth`se que le minraux ferrif`res prsents dans e e e e les phases Tr`s magntique et Peu magntique sont les mmes, mais e e e e en proportions variables dans les deux fractions issues du tri magntique du e sable. Toutefois, comme nous avons obtenu ` lissue du tri beaucoup plus de a la fraction PM que de TM (masses obtenues donnes dans le tableau 2.2), e nous avons utilis PM chaque fois que ctait possible. e e

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2.7

Conclusion des analyses globales

En dehors du quartz qui est la phase majoritaire du sable, le tri magntique a permis dobtenir une fraction enrichie en autres minraux. La e e diraction a mis en vidence dautres silicates (feldspath, chlorite). La spece troscopie Mssbauer a permis de mieux caractriser les minraux ferrif`res, o e e e qui taient apparus en DRX. Nous avons mis en vidence une composante de e e minraux primaires (mme si la roche-m`re nest pas dtermine). La come e e e e posante ` fer II inclut notamment lilmnite. Ce minral est peu abondant, il a e e na pas t vu en diraction (mais en lame mince au MEB, voir la Figure 3.4 ee p. 46). Les minraux ` fer III (hmatite, gthite) sont pour partie primaires e a e et pour partie issus de laltration et de loxydation de phases primaires. e

42


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Chapitre 3 Analyses grain-par-graintel-00261542, version 1 - 7 Mar 2008

Rsum du chapitre e eDans une tude sur les interactions entre les bactries et les minraux, e e e lchelle du grain de sable est plus pertinente que celle de lchantillon de e e quelques grammes. Nous avons donc ralis des analyses visant ` raliser e e a e linventaire des dirents types de grains. Six catgories ont t dnies selon e e ee e la chimie de lintrieur des grains (au MEB) et selon leur surface, analyse e e en spectroscopie micro-Raman. Ces catgories sont aussi celles de lanalyse e grain-par-grain de la diversit bactrienne sur les direntes phases minrales e e e e (partie suivante).

3.1

Inventaire des types de grains sur lames minces au MEB-EDX

Les lames minces ont t ralises par inclusion du sable dans la rsine ee e e e epoxy, puis polissage avec de la poudre de carbure de silicium jusqu` une a paisseur de 30 m (Figure 3.1). Lobservation de lames minces permet une e caractrisation de lintrieur des grains, mais pas de leur surface. Les cartes e e de rpartition dlments ont t colories suivant le code couleur indiqu sur e ee ee e e la Figure 3.2. Il est possible de distinguer au MEB trois types principaux de grains. Les grains de quartz sont reprsents notamment sur la Figure 3.3(b). Les grains e e dautres silicates sont riches, en plus du silicium, en aluminium et en cations alcalins (plus le fer). Deux grains de ce type sont visibles sur les bords de la Figure 3.6. Leur nature nest pas dtermine plus prcisment. Enn, les e e e e grains de carbonates sont de deux types. La Figure 3.3(b) montre un agrgat e de calcite qui englobe des petits quartz. La Figure 3.6 montre un grain de 43

44

CHAPITRE 3. ANALYSES GRAIN-PAR-GRAIN

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Fig. 3.1 Lame ST. Le sable total contient essentiellement des grains de quartz, transparents en lame mince, de diam`tre et dangularit variables (la e e rsine dans laquelle les grains sont inclus appara grise suite ` la carbonation e t e a ` leur priphrie sont parfois visibles des petits pour lobservation au MEB). A e e minraux sombres en placages. Barre dchelle 1 mm e e

Fig. 3.2 Code des couleurs utilis pour colorier les cartes dlments chie ee miques acquises ` la sonde EDX. a

3.2. SPECTROSCOPIE MICRO-RAMAN

45

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calcite cristalline. La fraction Peu Magntique PM a t choisie pour ltude de la diversit e ee e e des bactries sur les direntes phases minrales. Il importait donc davoir e e e une estimation des abondances des dirents types de grains. En tudiant ` e e a la sonde EDX la rpartition des lments chimiques une plage susamment e ee large de lame mince, il est possible davoir une vision globale des abondances des dirents types de grains de sable dans la fraction PM. La Figure 3.7 e prsente une telle plage. e Nous avons dnombr 265 grains. La majorit (153) sont essentiellement e e e quartziques, sans quil ne soit possible dexclure la possibilit de placages de e petits minraux ` leur surface. Les silicates autres (avec Al, Na, K) et les e a carbonates (Ca et Mg) viennent ensuite, avec respectivement 65 et 35 grains. Enn, 12 grains riches en fer ont t observs (silicates ferro-magnsiens ou ee e e oxydes en grains).

3.2

Classication des grains de sable par micro-spectroscopie Raman

La classication des grains de sable en spectroscopie micro-Raman est dcrite dans larticle insr au Chapitre 5.1. Le principe de la spectroscoe ee pie micro-Raman est donn ` la Figure 3.8 et le dispositif exprimental est ea e e prsent ` la Figure 3.9. Les spectres sont discuts dans larticle. Chaque e e a grain de sable a t analys en trois points dirents, trois spectres ont t ee e e ee acquis. Les positions des pics ont t notes (Figure 3.10 et Figure 3.11). ee e Un grain de quartz peu plaqu est dni par la prdominance du e e e quartz et de son pic majeur ` 464 cm1 sur les trois spectres acquis sur le a grain. La catgorie carbonate est dnie par la dominance du pic de la e e calcite ` 1087 cm1 sur au moins un des trois spectres. Les spectres des grains a classs comme autre silicate montrent des pics de silicates autres que le e quartz (surtout feldspaths, quelques micas), auxquels nous avons adjoint des oxydes (notamment lanatase prsent en placage ` la surface des grains). e a La catgorie quartz plaqu dhmatite est dnie par la prsence des e e e e e 1 pics majeurs de lhmatite ` 411 et 299 cm comme pics majeurs sur au e a moins lun des trois spectres. Un grain couvert de mati`re organique e 1 est dni par un pic large vers 1300 cm (et un pic ` 1600 cm1 sur les e a spectres a fentre largie), semblable au spectre du graphite. Les spectres ` e e des grains inconnus montrent des pics pour lesquels nous navons pas trouv de correspondant dans la base de donnes de rfrence. e e ee

46


(a) En optique

(b) Au MEB

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Fig. 3.3 Agrandissement de la gure 3.1, centre de limage. On observe un grain composite form de petits quartz dans une matrice carbonate (avec e e un petit grain doxyde de titane). Barre dchelle 200 m e

(a) En optique

(b) Au MEB (BSE)

Fig. 3.4 Grain dilmnite, oxyde mixte de fer II et de titane. En optique, e ce grain se distingue par son opacit, il ne laisse que tr`s faiblement passer la e e lumi`re (teinte tr`s brune). Au MEB il appara plus brillant que les grains e e t de quartz, en lectrons secondaires (non gur ici) et plus encore en lectrons e e e rtro-diuss (back-scattered electrons, BSE). Ce grain est un des tmoins e e e dune phase ferrif`re primaire (hrite de la roche-m`re du sable), mais ne e e e e donne pas dinformations dterminantes quant ` la nature de cette rochee a m`re car lilmnite est assez frquente dans des roches varies. Barre dchelle e e e e e sur limage optique 100 m


47

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(a) En optique

(b) Au MEB (BSE)

Fig. 3.5 Grain composite doxyde de fer et de quartz. Comme le grain dilmnite prsent plus haut, ce grain se distingue des quartz par son opacit e e e e en optique et sa tr`s forte brillance au MEB. Barre dchelle : 100 m e e

(a) Observation en lectrons secondaires e

(b) Carte dlments chimiques ee

Fig. 3.6 Grain polycristallin de calcite. Barre dchelle : 100 m. e

48


(a) Electrons secondaires

(b) Carte dlments chimiques ee

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Fig. 3.7 Estimation ` faible grossissement (20) des proportions des types a de grains. Le comptage a t ralis sur la partie centre-ouest de la lame, o` ee e e u lintensit des rayons X analyss est homog`ne. Barre dchelle : 1 mm. e e e e

Niveaux lectroniques Niveaux virtuels

Niveaux vibrationnels Niveau fondamental Diffusion lastique (Rayleigh)

Raman Stokes

Raman Fluorescence antiStokes

Fig. 3.8 Principe de la spectroscopie Raman. Les photons de la lumi`re e incidente sont pour lessentiel diuss sans perte ni gain dnergie (diue e sion lastique de Rayleigh). Par interaction avec les vibrations des molcules e e de lchantillon, une faible proportion (107 ) des photons sont diuss avec e e une nergie lg`rement suprieure (Raman anti-Stokes) ou infrieure (Raman e e e e e Stokes) aux photons incidents.


49

Rayon incident

Lumire diffuse

Objectif microscopique grossissement 50x

Grain de sable

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Fig. 3.9 Dispositif de spectroscopie micro-Raman. Lchantillon, le grain de e sable, est clair par le laser ( = 533 nm), ` travers lobjectif du microscope. e e a Lobjectif recueille une partie de la lumi`re diuse, qui est analyse. Le e e e grossissement utilis permet la focalisation du laser sur une zone denviron e 5 m 5 m. Nous avons caractris chaque grain de sable en au moins trois e e points, choisis pour rendre compte des htrognits visuelles de la surface ee e e e des grains.

gf001

Minraux vus Qz

Catgorie Qz peu plaqu (1)

gf036

Carbonate

Carbonate (2)

gf045

Qz + K-Fd

Silicate ou autre (3)

gf017

Qz + TiOx

Silicate ou autre (3)

gf016

Qz + oxyde

Qz + Hmatite (4)

gf023

Qz + organique

X+organique (5)

gf014

Oxyde ou sulfure

Inconnu (6)

1 2 3 1 2 3 1 2 3 1 2 3 1 2 3 1 2 3 1 2 3

Positions des pics 465 1159 465 354 467 1161 1086 1086 1086 714 514 475 455 1129 464 514 285 514 464 474 285 638 519 398 466 640 515 398 410 299 608 660 464 264 464 1300 466 466 702 510 600 400 410 466

226

292

Fig. 3.10 Pics caractristiques dnissant les 6 catgories de grains de e e e sable telles quindiques dans le projet darticle. Les pics sont lists par ordre e e dcroissant damplitude. e

50Quartz Hmatite Anatase Calcite Graphite Orthoclase Biotite

CHAPITRE 3. ANALYSES GRAIN-PAR-GRAIN128 206 226 245 143 197 156 282 1350 1580 158 281 263 705 264 354 292 299 395 517 713 1087 455 475 390 411 638 450 497 464 612 697 796 808 1069

514

751

810

996 1100 1129

En gras les pics majeurs

Fig. 3.11 Minraux de rfrence utiliss pour la classication des grains e ee e de sable, et dont les spectres sont disponibles dans la base de donnes de e lENS-Lyon (http://www.ens-lyon.fr/LST/Raman).

Conclusiontel-00261542, version 1 - 7 Mar 2008Nous considrons que la spectroscopie micro-Raman sur grains est la e mthode la plus adapte ` la caractrisation minralogique des grains en e e a e e vue de ltude grain-par-grain de la diversit bactrienne, qui sera prsente e e e e e plus loin.

tel-00261542, version 1 - 7 Mar 2008

Deuxi`me partie e Diversit bactrienne dans le e e sable

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Chapitre 4 Diversit des bactries cultives e e e et non-cultives dans le sable e total Rsum du chapitre e eNous avons estim la taille et diversit de la communaut bactrienne e e e e du le sable de Merzouga. Nous avons ralis un dnombrement des bactries e e e e cultivables sur un milieu de culture peu slectif et des bactries totales en e e ralisant un marquage uorescent directement ` la surface des grains de sable. e a La diversit bactrienne a t estime par squenage du g`ne ADNr-16S qui e e ee e e c e est un marqueur de diversit. Nous avons test un estimateur statistique e e qui donne la diversit totale dans lchantillon, puis lavons appliqu aux e e e squences de Merzouga. La diversit totale ainsi estime a t compare ` e e e ee e a des valeurs trouves dans la littrature. Notre conclusion est que la tr`s faible e e e biomasse dans le sable ne se traduit pas par une rduction de la diversit, de e e nombreuses esp`ces sont prsentes dans le sable. Toutefois, chacune de ces e e esp`ces est reprsente par un tr`s faible nombre de cellules par gramme de e e e e sable. Le stress global subi par le grain de sable en surface des dunes ne se traduit donc pas par une diminution de la diversit (nombre desp`ces) mais e e par leectif moyen au sein de ces esp`ces. e

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4.1

Mthodes des description des commue nauts bactriennes e e

Les mthodes prsentes ici sont celles utilises dans le travail correspone e e e dant aux deux articles. 53

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CHAPITRE 4. DIVERSITE DES BACTERIES DANS LE SABLE

Sable et eau ou solution saline

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Fig. 4.1 Dnombrement et isolement de bactries cultivables par e e suspension-dilution. Le sable est agit dans de leau ou dans une solution e saline, avec ventuellement un traitement par ultrasons. On obtient une suse pension de bactries, dont on tale sur un milieu nutritif une dilution ape e proprie. Apr`s incubation, le nombre de colonies qui se dveloppent indique e e e la biomasse cultivable dans le sable. Les colonies sont ensuite restries pour e vrier leur puret et prtes ` tre caractrises. e e e ae e e

Ensemencement par le surnageant

Bactries mises en suspension

Agitation (+ sonication)

4.1. METHODES

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Amplification slective par PCR (530 pb)

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Lyse cellulaire et libration de lADN (96C, 10)

Fig. 4.2 Caractrisation des souches bactriennes par squenage de e e e c lADNr-16S. Un fragment de colonie pure sert de matrice ` la raction de a e PCR. La solution concentre dADN obtenue est utilise pour la raction de e e e squence. e

Ralisation et lecture de la raction de squence

Prlvement dun fragment de colonie

T CA GT CA A GCT GG

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Amplification slective par PCR, obtention dune solution concentre dADN16S (530 pb)

Insertion des fragments dans un plasmide vecteur de clonageDveloppement et slection des colonies

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Fig. 4.3 Description de la diversit bactrienne sans culture par clonagee e squenage. LADN extrait du sable est ampli par PCR. La solution obe c e tenue contient toutes les copies des ADNr-16S de tous les types bactriens e prsents dans lchantillon initial. Ltape de clonage permet dinsrer ces e e e e fragments dans un vecteur, qui lui-mme sert ` transformer la bactrie Ese a e cherichia coli. Les colonies transformantes dE. coli sont slectionnes e e puis le fragment dADNr-16S quelles ont reu est ampli et squenc. c e e e

Types bactriens de lchantillon

Extraction de lADN du sable

Transformation dune bactrie receveuse Escherichia coli par les plasmides

+

4.1. METHODES

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Rcupration des grains et caractrisation minralogique

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1

2

Fig. 4.4 Culture grain-par-grain des bactries du sable. Les grains sont e dposs individuellement, directement sur le milieu nutritif glos. Apr`s e e e e e dveloppement des colonies, les grains sont rcuprs, nettoys et caractriss e e ee e e e au spectroscope Raman. Les colonies sont caractrises par squenage de e e e c lADNr-16S.

3

Caractrisation molculaire des colonies

Dpt des grains, Mise en culture

Dveloppement des colonies

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4.2

Article

Soumis au journal Environmental Microbiology, juillet 2005.

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Culture and molecular assessments of bacterial diversity within the dunes of a sandy arid soil in southeast Morocco Maxime Gommeaux1*, Mohamed Barakat1*, Richard Christen2, Franois Chevenet3 and Thierry Heulin1

5

1

CEA/Cadarache, DSV-DEVM, Laboratoire dcologie Microbienne de la Rhizosphre UMR

6191 CNRS-CEA-Univ. Mditerrane, IFR 112 PMSE, F-13108 Saint-Paul-Lez-Durance, France2

Laboratoire de Biologie Virtuelle. UMR 6543 CNRS Universit de Nice Sophia Antipolis, IRD - BP 64501 UMR IRD/CNRS 9926, 911, Av. Agropolis F-34394 Montpellier cedex 5,

Centre de Biochimie, Parc Valrose, F-06108 Nice cedex2, France

10

3

France * contributed equally to this work Author for correspondence: Thierry Heulin. Tel: +33 4 42 25 70 88. Fax: +33 4 42 25 66 48. e-mail: [email protected]

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15Keywords: Arid soil, sand dunes, culturability, culture diversity, molecular diversity, 16S rDNA. Abstract

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Bacterial communities in a quartzose sandy soil from southern Morocco were analyzed by culture and culture-independent methods. Bacterial isolates were directly isolated from soil using 0.1x tryptic soy agar medium. Thirty-five isolates corresponding to different morphotypes observed on plates were characterized by 16S rRNA gene sequencing. Molecular diversity was also examined by analyzing eighty-nine 16S rRNA gene sequences

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amplified from DNA extracted from soil. Culturability of soil bacteria estimated by comparing total viable bacteria using Syto 9 plus propidium iodide staining and plate counting was 2.0%. Three bacterial divisions dominated the culture-independent method: Proteobacteria, Cytophaga-Flexibacter-Bacteroides and Firmicutes, and these groups only were retrieved in cultures. Firmicutes were the most abundant in both methods with preponderance of

30

Actinobacteria in cultures and Bacilla in the clone library. By extracting relevant keywords from the EMBL entries closely related to Merzouga sequences, we performed the first environmental annotation of a sequence data-set.

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Introduction Hot and dry deserts such as Sahara are characterized by very strong thermal contrasts and little available water. Within such dry lands, living organisms have to contend primarily with extremes of temperature and low humidity (aridity of the atmosphere and very rare

5

rainwater). One of the major consequences is thought to be a reduction of the biological diversity, but some organisms, bacteria in particular, can develop survival strategies adapted to such environmental stress (Hecker and Volker, 2001; Bar et al., 2002; Rocha et al., 2002). A first step necessary to our understanding of life in extreme environments such as dry lands is a description and characterization of microbial communities inhabiting these ecosystems.

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Analyses of microbial diversity have been carried out in vegetated arid soils and desert crusts (Kuske et al., 1997; Dunbar et al., 1999; Garcia-Pichel et al. 2001 and Kuske et al., 2002) but to our knowledge there is no recent study of the microbial communities in a desert soil devoid of any vegetation and rhizosphere effect. Comparisons of microbial cultures and total viable bacteria present in soil demonstrated that

15

bacterial culturability is limited to less than 10% (Amann et al., 1995; McCaig et al., 2001). Therefore, molecular methods are required to successfully characterize environmental microbial communities. A popular approach relies on phylogenetic analyses of small-subunit rRNA gene (16S rDNA) sequences for biodiversity description of soil samples (Kuske et al., 1997; Furlong et al., 2002; Holmes et al., 2000; Torsvik and Ovreas, 2002). Culture-based

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methods, however, remain very useful for studying microbial diversity and in some cases allow to describe bacterial communities different from populations obtained with cultureindependent methods (McCaig et al., 2001; Smit et al., 2001). Available isolate collections are also very precious for physiological and genetic studies such as bacterialmineral interactions or resistance mechanisms.

25

In this work, using cultivation as well as culture-independent methods, we present an overview of the bacterial diversity in an arid soil forming sand dunes southeast of Morocco, nearby the village of Merzouga.

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Results and discussion Enumeration of culturable bacteria The BacLight bacterial viability staining system was used to estimate the number of cells on the surface of sand grains and the proportion of cells with an intact cytoplasmic membrane. A

5

total of 160 grains of sand was stained and then examined by fluorescence microscopy. The number of Syto9 fluorescence spots was 5.2 0.5 per upper hemisphere. The number of microbial cells was 2.1 105 2 104 cells per g of soil. Green-only fluorescent cells (alive cells with membrane integrity) represented 84 % of the counted cells (Fig. 1). The remaining cells showed additional red fluorescence which is an indication of propidium iodide

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penetration due to damaged cytoplasmic membranes (dead cells). Fluorescence spots were seen either as individuals or groups of cells on the mineral (Fig. 1). From non-sonicated samples, the number of microbial cells cultured on TSA 1/10 medium, was 2.6 0.5103 CFU per g of soil. After additional treatment with ultrasonic waves, the number of cultured bacteria increased to 3.5 0.6 103 CFU per g of soil, which represented

15

a 35% increase in retrieval. The fact that sonication increased culturable bacteria counts had already been reported in the literature (Janssen et al., 2002), leading to the interpretation that some bacteria are firmly attached to sand particles. The low total density of bacteria in comparison to conventional soils might be explained by three factors: a severe selection of microorganisms able to develop survival strategies such

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as dormancy and versatility regarding the severe stressful conditions in this desertic environment (Bar et al., 2002; Rocha et al., 2002), the total absence of vegetation that increases selection, since a positive effect of the rhizosphere on the diversity and density of bacteria has been demonstrated (Dunbar et al., 1999; Smit et al., 2001; Johansen & Binnerup, 2002 ) and finally the nutritional paucity of this sandy soil. The bacterial density of

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the Merzouga site is equivalent to another extreme environment found in a saline mud volcano (Yakimov et al., 2002). A culturability of 2.0% was determined as percentage of cultured bacteria in comparison to total bacterial fluorescence count. This figure is comparable to previous studies that

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estimated microbial culturability to be lower than 10 % (Amann et al., 1995; McCaig et al., 2001). This last study also demonstrated an increasing culturability for an Australian soil until 10 weeks of cultivation. This represents considerably longer incubation time than we used in the present study.

5

Taxonomic position of isolates The phylogenetic diversity was evaluated by sequencing the 16S rRNA gene. A total of 35 isolates representing each morphotype observed on TSA 1/10 plates was selected (Table 1). Their sequences were distributed in three bacterial divisions: Proteobacteria, Firmicutes and Cytophaga-Flexibacter-Bacteroides (CFB). The majority of isolates (80%) belonged to

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Firmicutes. Among them, the order Actinomycetales and particularly the genera Arthrobacter, Kocuria/Micromonospora and Blastococcus were a majority. They represented 71% of Firmicutes related isolates (Fig. 2). The remaining Firmicutes isolates were grouped within the class of Bacilli and were related to Bacillus and Planococcus. The group Cytophaga-Flexibacter-Bacteroides was the second well-represented division (five

15

isolates representing 14% of the total). Two isolates were Proteobacteria, one isolate related to Zoogloea ( -Proteobacteria, Table 1) and one isolate showed a sequence similarity of 96% to a denitrifying species, Bosea thiooxidans ( -Proteobacteria, EMBL accession number AF508112), reducing nitrate in presence of molecular oxygen.

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Similar results had been obtained in a study of the diversity of rhizosphere and interspace communities of two arid soils (Dunbar et al., 1999). The Firmicutes had been one of the best characterized bacterial groups and were well represented in culture collections (Hugenholtz et al., 1998). Previous studies had demonstrated the presence of Arthrobacter and Bacillus species in bulk soil

thèse bactéries du sable de merzouga

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