teoria y practica de la reproduccion inducida en los peces
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Teoria y Práctica de IaReproducción Inducidaen los Peces
Brian J. Harvey y William S. Hoar
ARCHIV42187
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El Centro Intemacional de Investigaciones para el Desarrollo es unacorporaciOn pUblica creada en 1970 por el Parlamento de Canada con elobjeto de apoyar la investigaciOn destinada a adaptar la ciencia y la tecnologia alas necesidades de los paises en desarrollo. Su actividad se concentra en cincosectores: ciencias agricolas, alimentos y nutrición; ciencias de la salud;ciencias de la informacion; ciencias sociales, y comunicaciones. El Centro esfinanciado exclusivamente por el Parlamento de Canada; sin embargo, suspoliticas son trazadas por un Consejo de Gobernadores de carácterinternacional. La sede del Centro está en Ottawa, Canada, y sus oficinasregionales en America Latina, Africa, Asia y el Medio Oriente.
© 1980 Centro Internacional de Investigaciones para el DesarrolloDirecciOn postal: Box 8500, Ottawa, Canada K1G 3H9Sede: 60 Queen Street, OttawaOficina Regional para America Latina y el Caribe ApartadoAéreo 53016,Bogota, Colombia
Harvey, B.J.Hoar, W.S.
IDRC-TS2I sTeoria y práctica de la reproducciOn inducida en los peces. Ottawa,
Ont., CuD, 1980. 48p. : il.
/PblicaciOn CuD!, /piscicultura/, /mejoramiento genético de peces!,/zona trpical/ - /reproduccion/, /fecundaciOn/, /hormonas/, /inseminaciOnartificial', /teoria/, /metodologia/, /articulo bibliográfico/.
CDU: 639.3.034.2 ISBN: 0-88936-253-X
Se dispone de ediciOn microficha
This publication is also available in English (IDRC-TS21e).II existe également une edition francaise de cette publication (IDRC-TS2 if).
IDRC-TS2 is
TEORIA Y PRACTICADE LA REPRODUCCION INDUCIDAEN LOS PECES
BRIAN J. HARVEY1 Y WILLIAM S. HOAR2
'DivisiOn de Ciencias BiolOgicas, Consejo Nacional de InvestigaciOn deCanada, Ottawa, Canada.
2Departamento de Zoologia, Universidad de Columbia Británica, Van-couver, Canada.
INDICE
PROLOGO 5
INTRODUCCION 7
ENDOCRINOLOGIA DE LA REPRODUCCION EN LOS TELEOSTEOS 9
HIPOFIsIs E HIPOTALAMO 9
LAS GONADOTROPINAS EN LOS TELEOSTEOS 10
MADURACION DE LA GONADA EN RESPUESTA A LA GONADOTROPINA 12
REPRODUCCION INDUCIDA: TEORIA 15
ADMINISTRACION DE GONADOTROPINAS EXOGENAS 15
HORMONAS LIBERADORAS DE GONADOTROPINA 17
ADMINISTRACION DE ESTEROIDES SEXUALES 18
NUEVAS POSIBILIDADES 20
PRACTICA DE LA REPRODUCCION INDUCIDA 21
CARPA COMUN Y CARPAS DE LA CHINA Y DE LA INDIA 21
LIsA 29
SABALO 33
BAGRE 34
METODOS DE BIOPSIA OVARICA 36
PRESERVACION DE GAMETOS 38
PRESERVACION DE LA ESPERMA 38
CRIOPRESERVACION DE LOS HUEVOS 42
CRITERIOS DE EXITO 42
REFERENCIAS 43
PROVEEDORES DE MATERIAL DE DESOVE 48
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AGRADECIMIENTOS
Deseamos expresar nuestro agradecimiento a E.M. Donaldson por leer elmanuscrito y por sus constructivas sugerencias. Agradecemos también a lassiguientes personas por habernos asistido con sus comentarios sobre lassecciones pertinentes a sus areas de interés o de investigación: W.H.L. Allsopp,T.J. Lam, B. Morley, N.E. Stacey, W.E. Vanstone y F.C. Withler. El cotejo dela literatura disponible fue posible gracias a D. Turnbull. Las ilustraciones fueronpreparadas por F. Zittin con excepcion de la Fig. 6 que fuO preparada por 13.Bysouth. Los logotipos de carpas que introducen y concluyen cada capitulofueron también disenados por B. Bysouth.
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PROLOGO
A pesar de su larga historia, el cultivo comercial de peces con aletas sOlo seestableciO hace relativamente poco en Europa y Norteamérica. En la actualidad,la producciOn industrial de salmOn del PacIfico depende en gran medida de laproliferaciOn en los criaderos del Pacifico noroccidental.
La acuocultura o cultivo sistemático de seres vivos en el agua, está dirigidaprincipalmente hacia el cultivo de peces que en muchos paises ha adquirido granimportancia; entre los peces de aleta, la atenciOn se ha centrado principalmenteen las diversas especies de carpa y de tilapia.
Las preferencias y aceptaciOn del pescado, como de cualquier otro alimento,están condicionadas en gran parte por el medio ambiente y por las experienciasanteriores del consumidor. Seria ideal por lo tanto, buscar, propagar y cultivarespecies nativas que sean conocidas y aceptadas por los habitantes de cadalocalidad. Desafortunadamente, muchas especies de peces no se reproducenfácilmente - las hembras grávidas no liberan sus huevos en cautiverio. Todaempresa de piscicultura debe contar con una provisiOn adecuada de huevosfecundados a fin de generar alevinos yjuveniles.
En 1934 en el Brasil, von Ihering et al. descubrieron que la reproducciOn delas hembras renuentes en cautiverio, podia inducirse mediante inyecciones deextracto de hipOfisis de pez, Organo que contiene gonadotropina. La reproducciOninducida con gonadotropina se está actualmente investigando y se ha utilizado enla reproducciOn de la carpa en la China y en la India y en la reproducciOn de otrasespecies en diversos lugares. La Oficina de Investigaciones Pesqueras de C anadáperfeccionO la técnica de extracciOn de la hormona y cientificos de Filipinas,auspiciados por el CuD, aplicaron la técnica al sábalo (Chanos chanos),induciendo su reproducciOn mediante inyecciones de extracto de hipOfisis desalmon del PacIfico. El perfeccionamiento y la mayor adaptación de lareproducciOn inducida tanto a especies nativas como a especies exOticasdeseablesjunto con mejores sistemas de manejo de la industria, podrian ayudar adesarrollar el potencial de cultivo de muchas especies troicales en muchos de losgrandes rios de los paises en desarrollo, tales como el Amazonas, el Brahmaputra,el Congo, el Indo, el Mekong, el Niger y el Nib.
Al igual que en la cria de ganado, será necesario reproducir y seleccionarespecies y cepas superiores, de acuerdo a sus hábitos alimenticios, potencial decrecimiento, resistencia a las enfermedades y aceptaciOn. Además del desoveinducido con hormonas, Ia preservaciOn criogénica de los huevos y de la espermaen nitrOgeno liquido ofrece grandes oportunidades para la reproducciOn selectivay Ia hibridaciOn. Se requiere mas investigaciOn en el campo de las técnicas deincubaciOn, cna de larvas y requerimientos nutricionales de los peces juveniles yadultos, asi como de la eficiencia de la conversiOn alimenticia en todas las etapasdel crecimiento.
En el CuD creemos que en el campo de la reproducciOn inducida senecesita de manera apremiante una recopilaciOn concisa del estado de los
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conocimientos teOricos y prácticos y que los doctores Harvey y Hoar estáneminentemente calificados para hacerla. Conflo en que esta publicaciOn, basadLaen un estudio literario concluido el 30 de julio de 1979, sea de gran valor paratodos aquellos comprometidos o interesados en la ciencia y en la práctica de Iaacuocultura.
Joseph H. HulseDIRECTOR
CIENCIAS AGRICOLAS,ALIMENTOS '' NuriuciO
CIII)
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1. INTRODUCCION
Para que ci cuitivo a gran escala de cuaiquierorganismo para el consumo humano sea eficiente,ci recurso debe ser fãciimente renovabie. Porejemplo, después de recoger una cosecha agricolase hace una nueva siembra y la reproducción delganado se asegura por medios naturales o porinseminaciôn artificial. Es obviamente inconve-niente cultivar un organismo cuando no puedehaber una reposiciOn adecuada y es precisamenteese problema ci que ha afectado Ia historia de laacuocuitura. Dc las numerosas especies de pecesque se cultivan en ci mundo entero, muy pocas -entre eilas las Tiiapias se reproducen en cauti-verio (Jhingran y Gopaiakrishnan 1974). En lasespecies que si se reproducen, por ejemplo lacarpa comun Cyprinus carpio, Ia època deldesove no es totaimente predecibie y ia super-vivencia de los alevinos en condiciones normalespuede ser inaceptabiemente baja. Hay dos soiu-ciones a este probiema: la primera es de tipopuramente práctico y ha sido ia soluciOn histOrica;consiste en recoger alevinos de fuentes naturales.No obstante, son muchas las dificultades inhe-rentes a este método, pues es largo, requiereespecial habiiidad y experiencia, y se basa porcompieto en la productividad del terreno dedesove natural. La segunda solución es másdirecta: aprender a inducir Ia reproducciOn de lospeces en cautiverio. Esta ültima ha recibido Iamayor atenciOn de los üitimos años y ha tenidoresuitados muy satisfactorios.
Los procesos de reproducciOn no se afectantotaimente en cautiverio, persistiendo ci desa-rroiio progresivo de ias gOnadas en general hastalas etapas finales de Ia maduraciOn del gameto ydeteniéndose la secuencia solamente cuando cigameto es liberado. Tanto la maduraciOn gonadaicomo ci desove se han considerado desde hacemucho tiempo como respuestas a estimulos am-
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bientales temperatura, horas de iuz en ci dia(fotoperiodo) y piuviosidad entre otros factores-y ci piscicultor puede sentirse afortunado al teneria posibiiidad de intervenir eficazmente en dondefaitan los estImulos ambientales y lievar artifi-cialmente a término ci proceso. Esto se ha iogradomediante Ia técnica de reproducciOn inducida através dci manejo hormonal, cuya apiicacionpráctica es el tema principal de este trabajo.
Aunque no debe olvidarse Ia primacia de losestimuios ambientaies en ia reproducción de iosteleOsteos y aunque se realizan serios esfuerzosinvestigativos para comprcndcr mejor esas in-fluencias, Ia inducciOn hormonai representa unasoiución práctica que tiende a imponerse. Por lotanto, no considcraremos aqui el control de iareproducciOn basado ünicamente en ci manejo delas condiciones ambientales ni Ia endocrinoiogiadcl comportamiento sexual, pues esto tambiénpierde importancia cuando se desea un controltotal de Ia liberaciOn de gametos y de la fecunda-ciOn. En esta reseña, suponemos que, desde cipunto de vista del piscicuitor, ci objetivo deseadoen un programa de reproducción inducida es laproducciOn de gametos viables, que puedan iuegodar lugar a la fecundación bajo condicionescontroiadas. La fecundación natural solo se lograal manifestarse totaimentc ci desove; esto tomatiempo, requiere un espacio considerabie y haypérdida de aievinos. El sistema, por io tanto, no seconsidcra práctico.
Comprendemos que ci pübiico para esta resefiainciuirá a iectores de ia mas diversa indole.Después de todo, ci interés por ia crianza de pecespuede ser compartido por ci biOlogo de un pro-grama universitario de piscicultura y por ci culti-vador rural de peces en la India, aunque susprobiemas probabiemente sean diferentes.
El objetivo de esta reseña es pues, primero,sintetizar y analizar los avances recientes en cicampo de ia fisiologia reproductora de los peces,que influyan nuestra capacidad para criar especiesen cautiverio, y, segundo, extraer de ia iiteraturalos detalies prácticos de los métodos de reproduc-ciOn inducida utiiizados actualmente y presen-tarios haciendo énfasis en sus puntos comunes.Igualmente se ha intentado diferenciar ci materialteórico del práctico; los lectores orientados haciaci campo práctico, cuyo interés principal sea lareproducciOn de sus propios peces, pueden pasardirectamente ai capituio 4, un estudio sobre lasüitimas publicaciones referentes a los intentos deinducir ia reproducciOn en las siguientes especies:carpa (comün, china e india), bagre (variedadesasiáticas), lisa y sábaio. La informaciOn sobre iacarpa y ci bagre se ha presentado en forma decuadros que pueden utilizarse como referencia
para los cultivadores que deseen beneficiarse dela experiencia de otros en su mismo campo. Porotra parte, los capitulos 2 y 3 presentan las basesteóricas de los métodos prácticos y serán de graninterés para los lectores que posean sOlidosconocimientos de biologla básica. El capitulo 2presenta un breve recuento de Ia endocrinologiareproductiva de los teleOsteos mientras que elcapitulo 3 trata de los avances recientes en elmanejo hormonal de la reproducciOn. Los capitulos5 (Métodos de Biopsia Ovárica) y 6 (Preserva-cion de Gametos) serán de interés tanto parainvestigadores como para cultivadores y para losproveedores de materiales de inducciOn comohormonas y glándulas pituitarias completas.
La inyecciOn de extracto de pituitaria de pezpara inducir la ovulaciOn, procedimiento referidocomo "hipofisaciOn", fué aplicada con éxito porprimera vez en 1934, por von Ihering y suscolegas en el Brasil (von Ihering 1937). Dichatécnica, aunque todavia constituye el pilar demuchas operaciones de reproducciôn inducida, alo largo de los años ha generado soluciones cadavez mas sofisticadas a! problema de la inhibiciónde la reproduccion, hasta el punto de haberutilizado, con diversos grados de éxito, gonado-tropinas purificadas, hormonas liberadoras hipo-
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talámicas, hormonas de origen mamifero, este-roides y sustancias 'extrabiolOgicas' como elantiestrOgeno clomifeno. Existen numerosas re-señas recientes (ver por ejemplo Chaudhuri 1976;Fontaine 1976; Shehadeh 1972 y 1976) sobretemas como la preparaciOn y almacenamiento deextractos de pituitaria, especificidad filogenéticade las hormonas administradas, selecciôn dereproductores y evaluaciOn del estado de desarrollogonadal, estandarización de las dosis y preser-vación de los productos sexuales. La presentereseña hace énfasis en los peces cultivados enpaIses tropicales y sub-tropicales, aunque semencionan avances importantes de las regionesdel norte, tales como el reciente uso de hormonasliberadoras para desovar carpas en la China.
2. ENDOCRINOLOGIA DE LAREPRODUCCION EN LOS
TELEOSTEOS
Los sistemas nervioso y endocrino de losvertebrados actüan concertadamente para co-ordinar los eventos reproductivos. Las etapas prin-cipales en la cadena de eventos a partir de lapercepciOn de estimulos ambientales hasta Ialiberación de gametos, están descritas en eldiagrama de la Figura 1, en donde se puedeobservar que los eventos neurales predominan enlas primeras etapas, mientras que las etapasposteriores son de naturaleza hormonal.
La percepción de estimulos ambientales comola duración del dia (fotoperiodo), la temperatura yla piuviosidad, está regida por ci sistema nerviosoe incluye ci paso de la informaciOn desde losreceptores sensoriales hasta el cerebro. Al ilegara! hipotálamo, la informaciOn neural determina laactividad de la hipófisis por medio de mensajerosquimicos denominados hormonas liberadoras.Estas a su vez estimulan la hipOfisis para liberar ala circulación general una hormona ilamada gona-dotropina, cuyo destino es ia gonada; su efecto esestimular la producción de esteroides sexuaies enia gonada, esteroides que posteriormente seránresponsables de la maduración de los gametos. Latransición de ia informaciOn neural al controlhormonal se efectüa entre ci hipotálamo y lahipófisis y es en ese punto que empieza nuestroanálisis detaliado de la endocrinologia de iareproducción en ci pez.
HIPOFIsIS E HIPOTALAMO
El origen embrionario de la hipOfisis en losvertebrados tiene dos aspectos. Un componenteepiteiial derivado de la cavidad bucai embrionaria,ilamado adenohipófisis. Además de la hormona
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gonadotropica que tanto nos interesa, produce lasomatotrofina (hormona del crecimiento), ia cor-ticotropina, ia prolactina, la hormona tirotrópicay ia hormona estimulante de los meianocitos. Laadenohipófisis puede subdividirse anatOmicamenteen pars distaiis rostral, pars distalis proximal ypars intermedia (Figura 2). El componente den-vado dci aspecto neural, la neurohipófisis, conectala adenohipOfisis a la base dci cerebro y estácompuesta en gran parte por las fibras axónicas deneuronas cuyos cuerpos ceiuiares están locali-zados en el hipotálamo. Este tejido nerviosopresenta amplia interdigitacion con la adenohi-pófisis, en particular en ci pars intermedia, y lapresencia de este "nUcieo" nervioso ha dadoorigen al concepto de la hipofisis como Organo"doble".
Las neuronas hipotalaniicas cuyos axones formania neurohipofisis, son del tipo denominado célulasneurosecretoras. Estas responden a una senaleiéctrica procedente del cerebro, iiberando unmensajero qulmico en ci terminal del axOn,uniendo asi la brecha entre la informaciOn ncr-viosa y la hormonal. Sus cuerpos celulares formanvarios grupos independientes o "nUcleos" dentrodel hipotálamo que pueden diferenciarse tantoanatómicamente como en base a sus propiedadesde coioraciOn. En ia gianduia pituitaria o hipOfisisde ios teieOsteos, los dos nUcleos que más nosinteresan son el nucieus preopticus (NPO) y cinucleus lateralis tuberis (NLT). Las hormonasproducidas por las neuronas dci NPO son iibera-das en su mayona a un canai sanguineo entre laneurohipOfisis y la adenohipOfisis; algunas puedeninervar directamente las ceiuias del pars inter-media (Bail y Baker 1969). Empero, nuestroprincipal interés radica en ias neuronas del NLTcuya organizaciOn es ünica en los teieOsteos. Lascélulas endocrinas de Ia adenohipOfisis aparecenaqui inervadas directamente por los axones neuro-secretores (para tines de simplificaciOn la figurasoio muestra las celulas gonadotrOpicas) y cimensajero quimico iiberado en esta uniOn sedenomina hormona liberadora (HL). Ei efecto dela hormona liberadora es estimular la producciOnde gonadotropina y su posterior liberaciOn alsistema vascular de la adenohipOfisis. La gonado-tropina es luego transportada por la circuiaciOnsistemática hasta ci Organo receptor, ia gOnada,en donde a su vez inicia la producciOn de esteroidessexuales. Esas hormonas andrOgenos, estrO-genos y progestOgenos son los mediadoresdirectos dcl desarroiio gonadal.
Ei control hipotalámico en la liberaciOn degonadotropina de la hipOfisis de los tcieósteos, seha demostrado en experimentos en los cuales laslesiones eiectroliticas del NLT de la carpa dorada
EstImulos
Cerebro
Hormona(s)gonadotrOpica
Hipotálamo
HormonalEberadora
H ipOf is is
Gónada
H arm on assexuaes
Maduración yIiberación de gametos
Fig. 1. Etapas princiipales de Ia cadena de eventosfisiologicos, desde Ia percepciOn de los estIm u/osambientales hasta Ia liberaciOn de losgametos niaduros.
Carassius auratus produjeron una disminuciOndel Indice gonadosomático, bloquearon la recru-descencia ovárica e indujeron Ia atresia folicular(Peter y Crim 1978). El concepto de un centro deHLG (hormona liberadora de gonadotropina) enel hipotálamo está confirmado por la presencia deactividad de HLG en extractos de esta region endiversas especies de teleOsteos (Crim etal. 1976).La natura!eza quimica del factor liberador en losteleOsteos sigue siendo una incOgnita. La activi-dad de la HLG en el extracto hipotalãmico de Iacarpa está relacionada con una sustancia cuyopeso molecular es inferior a 5000; los neurotrans-misores epinefrina, norepinefrina, serotonina ydopamina no presentan actividad de HLG enhipOfisis de carpa in vitro (Breton et al. 1 975b).Es importante el hecho de que las hormonas
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liberadoras sean moléculas relativamente pequenas.Ello sugiere la factibilidad de sintetizar !a hor-mona o un ana!ogo igualmente activo que puedaestimular Ia maduraciOn gonadal, mediante elaumento en la producción de Ia hormona gonado-trOpica. En efecto, en base a este concepto se hanobtenido resultados preliminares promisorios(capitulo 2).
LAS GONADOTROPINAS EN LOSTELEOSTEOS
Se han aislado en forma relativamente pura lasgonadotropinas de varios teleOsteos incluyendo lacarpa Cyprinus carpio (Fontaine y Gerard 1963;Burzawa-Gérard 1971), el salmon 'chinook' On-corhynchustshawytscha (Donaldson etal. 1972)y Tilapia inossambica (Farmer y Papkoff 1977).Hay considerable evidencia de que los peceselaboran dos tipos diferentes de hormona gonado-trópica. La acciOn ovulatoria se adscribe ünica-mente a una de ellas, cuyo contenido de g!uco-proteina es alto (Donaldson 1973; Farmer yPapkoff 1977). La otra gonadotropina tiene bajocontenido de glucoproteina y se cree que solamentecontrola la vitelogénesis (Idler et al. 1975; Ng eIdler 1978). La evidencia cito!Ogica e histoquimicaconfirma la presencia de dos gonadotropinasqumicamente diferenciables (Burlakov et al. 1976;Schreibman et al. 1973) y se han reportadodiferencias sexuales en gonadotropinas aisladas(Breton et al. 1978). Este confuso panorama seaclarará con una investigaciOn sistemática de Iaactividad gonadotropica en las diferentes etapasde la maduraciOn gonadal (Fontaine 1976).
Dada Ia naturaleza proteinica de las hormonasgonadotrOpicas, no es sorprendente que Ia especi-ficidad filogenetica se haya demostrado repetida-mente. Aunque ciertas grandes similitudes puedenextenderse aun entre fibs Ia gonadotropina deTilapia por ejemplo, presenta identidad cromato-grâfica con una variedad de hormonas luteinizantesde mamiferos y no mamiferos (Farmer y Papkoff1977) existen especificidades zoolOgicas par-ciales en las gonadotropinas de los teleOsteos.Fontaine et al. (1972) demostraron que la activi-dad de Ia gonadotropina de la carpa es 36 vecessuperior a Ia del Oncorhynchus al analizarla entérminos de Ia actividad de la adenilciclasa en lacarpa dorada y es lugar comün de la técriica dehipofisaciOn el que la efectividad de un extractohipofisiario homoplástico (de un pez de Ia mismaespecie) pueda perfectamente exceder la de undonante heteroplástico. Desde luego hay excep-ciones: Ia carpa comün, por ejemplo, se empleamucho como donante para la carpa china y para la
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Precursores delvitelo
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Vitelogénesis
gran carpa de la India, pero el problema esverdaderamente importante para el criador quepractique la hipofisación y será de nuevo men-cionado en el curso de esta reseña.
MADURACIÔN DE LA GONADA ENRESPUESTA A LA GONADOTROPINA
Actualmente se cree que la maduraciOn de lasgonadas en el pez se efectüa como resultadoindirecto de un aumento lento y constante en lasecreciOn de gonadotropina y que la ovulación y el
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EstImulosambientales
Hipotálamo
Hormona liberadora
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Gonadotropina(s)
Telidoovdrico
esteroideo
Huevo maduro
Huevo ovulado
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Prostaglandinas?
Catecolaminas?
Fig. 3 En laces endocrinos de Ia cadena entre Ia recepcidn de los estimulos ambientales y la ovulaciOn. Losndmeros rodeados de un circulo señalan las etapas en las que la intervención artificial ha sido por lo menos
parcialmente efectiva para inducir la ovulación de peces cautivos.
espermatismo están precedidos por un aumentomás marcado. Esta hipótesis naciO de la evidenciaen los salmónidos (Breton et al. 1 975c; Crim etal.1975) y en los ciprInidos (Breton et al. 1972;Stacey etal. 1979). El efecto de !a gonadotropinaen la regu!aciOn de !a gametogénesis es bastanteindirecto, a través de hormonas sexuales y ésteeslabOn final de la cadena proporciona indiciosimportantes de las posibles causas de !a interrup-ciOn de !a maduración en cautiverio.
Es importante apreciar e! hecho de que !amaduraciôn gonada! en los machos puede conmucha frecuencia no interrumpirse en cautiverio
y que en general noes dificil obtener Ia esperma depeces criados en estanque. La hipofisaciOn de losmachos, si es que se Ileva a cabo, es a menudocuestiOn de conveniencia para asegurar la coordi-naciOn perfecta de Ia liberaciOn de gametos y sirvetambièn para iniciar un adelgazamiento seminalque hace La esperma más apropiada para Iafecundacion artificial. Por esta razOn, el anàlisissiguiente se limita al desarrollo gonadal en Iahembra: proliferacián oogonial, vitelogénesis,maduraciOn de oocitos y ovulación (Figura 3).Debe destacarse Ia diferencia entre el proceso dedesove u oviposiciOn y Ia ovulaciOn, que puedenno estar sujetos a los mismos controles hormonales.
PROLIFERACION OOGONIAL
Los oogonios surgen de las células sexualesprimordiales en el epitelio germinal del ovario yen su etapa precoz son rodeados por una capa decélulas epiteliales que forman el foliculo ovárico.En los peceS, el desarrollo inicial del foliculoovárico parece no depender de Ia hipófisis. Lascélulas del epitelio folicular se diferencian paraformar una granulosa glandular, separada delOvulo por una zona pellucida no celular y sedesarrolla una teca a partir de los tejidos conec-tivos circundantes. Dichas estructuras granulosa,zona pellucida y teca pueden denominarseenvoltura folicular (Figura 4).
en volt U rafolicular
Fig. 4. RepresentaciOn diagrarnatica del óvulo en desarrollo. La esteroidogénesis estimulada par la gonado-tropina pituitaria se efectua en las ce/u/as tecales especiales de la envo/tura folicu/ar. Tornado de Hoar y
Nagaharna (1978).
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VITELOGENESIS
La vitelogénesis comprende Ia incorporaciOndel vitelo en los oocitos en desarrollo y, como yase mencionO, se cree que este proceso estácontrolado por una gonadotropina baja en gluco-proteinas (Ng e Idler 1978). Las células receptorasde Ia gonadotropina hipofisiaria parecen ser lascélulas tecales especiales de Ia envoltura folicular(Hoary Nagahama 1978), y los esteroides sexualesproducidos aquijuegan un papel muy importanteen Ia regulación de este complejo proceso.
El vitelo se deposita en dos formas: vesiculas devitelo y gránulos de vitelo, siendo su deposiciOnnormalmente secuencial. La formaciOn de vesIculasde vitelo, que ocurre primero, recientemente hademostrado ser inducida por estrogenos en Iacarpa dorada (Khoo 1979); se cree que losgránulos se forman bajo La influencia de Iapregnenolona. La sintesis de los precursores delvitelo se efectUa en el higado y ha probado serestimulada por los estrOgenos (Ho y Vanstone1961; Campbell e Idler 1976).
Las hormonas de Ia tiroides tambien participanen Ia vitelogénesis. Bajas dosis de tiroxina estimu-Ian Ia vitelogénesis en la carpa dorada inmadura(Huriburt I 977a) y se ha sugerido que las hormo-nas de la tiroides actUan sinergisticamente con Iagonadotropina para influir en el desarrollo ovárico,posiblemente a través de un aumento de la
célula tecal especial
zona pellucida
óvulo
célula de Ia granulosa
membrana base
AplicaciOn dorsal de una inyecciOn intramuscular de extracto pituitario a una hem bra grávida.(Fob H. Chaudhuri).
sensibilidad ovárica ante el estimulo de Ia gonado-tropina.
MADURACION DE LOS OOCITOS
Las etapas finales del desarrollo de los oocitosy foliculos pueden disociarse experimentalmentede Ia ovulaciOn (expulsion del oocito desnudo,fuera del folIculo y hacia Ia cavidad ovárica operitoneal). El esteroide 1 7a-hidroxi-2O-dihi-droprogesterona (1 7-2O1 Pg) producido por Iaenvoltura folicular en respuesta a Ia gonadotropinapituitaria, se ha propuesto como ci más probablemediador de Ia maduraciOn de los oocitos en Iatrucha arco iris (Salmo gairdneri), en el lucio delnorte (Esox lucius) y en Ia carpa dorada (Caras-sius auratus) (Jalabert 1976). Los corticoesteroidespueden desempenar un papel indirecto, posible-mente a través de Ia sensibilizaciOn de los oocitosala acciOn del I 7a-2O Pg; esas hormonas asumenuna funciOn aun mds importante en Ia maduraciOn
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de los oocitos en el bagre (Sundararaj y Vasal1976; Jalabert 1976).
OVULACION
La ruptura folicular y Ia expulsion del oocitodesnudo parece ser independiente del controlhipofisiario. Tanto las prostaglandinas como lascatecolaminas se han propuesto como mediadoras(Jalabert 1976); Stacey y Pandey (1975) hanproporcionado evidencia in vivo que confirma IaintervenciOn de las prostaglandinas en Ia ovula-ciOn de Ia carpa dorada.
3. REPRODUCCIONINDUCIDA: TEORIA
El mayor interés del acuocultor que esté desa-rrollando un programa de reproducción inducidaes estimular la ovulación. La oviposiciOn (desove)no necesariamente ocurre de manera espontànea;los huevos pueden extraerse manualmente del pezy en efecto este procedimiento es aconsejable si seha de lograr un control total de la fecundacion. Sinembargo, para ello hay que asegurar ante todounamadurez completa, normalmente mediada por lagonadotropina pituitaria. En qué etapa o etapasdel ciclo de reproducciôn se puede intervenireficazmente? La Figura 3 indica las etapas de lamaduracion femenina en las cuales hasta cimomento ha sido posible intervenir para esti-mular la ovulación en cautiverio.
Tal como se ha señalado, la manipulacion deparámetros ambientales (etapa I del diagrama) apesar de haber sido objeto de extensas investi-gaciones en especies de climas templados, estáfuera del alcance de este análisis. Es precisoanotar también que Ia actual intervención conquimicos está dirigida solamente hacia la parte dela secuencia que conduce a Ia maduración finaldel oocito. La ovulaciOn en si, aunque es ciobjetivo final de cualquier esfuerzo de estimula-ción, parece ocurrir como resultado de estimulosendogenos después de la maduracion final deloocito, si bien hay factores ambientales quetambién pueden contribuir. En términos de laefectividad práctica, nos quedan las etapas 2, 3 y4 enumeradas en orden de importancia relativa.La administración de gonadotropina exógena esdefinitivamente ci procedimiento de mayor impor-tancia; la intervenciOn en la interfase hipotalániica-pituitaria con administración de hornionas libera-doras (etapa 3) es procediiniento promisorio yrecientemente ha tenido resultados prácticos; laintervenciOn a nivel de esteroides sexuales (etapa
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4), ya sea mediante la simple administraciOn ocontrol retroinformativo, es actualmente objetode investigaciones experimentales.
ADMINISTRACION DE GONADOTROPINASEXOGENAS (ETAPA 2, FIGURA 3)
La hipofisacion consiste en Ia inyeccion intra-muscular o intraperitoneal, de extractos crudos dehipófisis de pez. La técnica básica ha existidodesde hace algün tiempo Houssay efectuóexperimentos preliminares en 1931 y se harefinado considerabiemente a Jo largo de los años.Sigue siendo la ünica alternativa realista para cicultivador rural de peces, tanto por razoneseconómicas como técnicas. Para obtener infor-macion sobre los métodos de recolección, prepa-ración y aimacenamiento de hipOfisis, referimosal Jector a las recientes reseñas de Chaudhuri(1976), Shehadeh (1972) y Yamazaki (1976).
Los inconvenientes de la técnica de hipofisa-ción pueden agruparse como problemas de dosifi-cación y de provision. El problema de Ia dosifica-ciOn es en gran parte el resultado de la crudeza dela técnica: la actividad de un extracto depende dela edad, sexo y estado de mâdurez del donante, asIcomo del método de extracciOn y técnica utilizadapara preservar la glandula (Jalabert et al. 1977).Además, ci extracto contiene numerosas hor-monas pituitarias no relacionadas con la repro-ducciOn, de modo que sOlo se pueden hacerconjeturas en cuanto a su actividad especifica. Ladistancia filogenética entre donante y receptor esotro factor que hace bastante empIrico ci cáicuiode la dosis. La práctica comün es aumentar Iadosis para extractos pituitarios hetcropiasticos;por ejemplo, se han administrado extractos pitui-tarios de bagre inmaduro quintupiicando la dosishomoplástica, para inducir la ovulación en lacarpa de la India (Varghese et al. 1975). AunqueIa dosis administrada era alta, ci costo de extrac-ciOn y preparación de los hipOfisis de bagre era laquinta parte dci costo con donantes homoplasticos;ya quc los bagres se abren y se secan ai sol antesde sacarlos al mercado, la extracción de lagiandula procedimiento que mutila la cabeza-no afecta su comcrciaijzacjOn.
Esta observaciOn sirve para introducir ci problemadcl suministro de hipOfisis. La extracción de iagiándula implica el sacrificio de un reproductorpotencial (aunque puede extraerse dcpeces deso-vados), o, en ci caso del pescado que va almcrcado, en muchas partes dcl mundo implicauna grave dcvaluaciOn dcl producto. Aunque Sepuedc encontrar un substituto adecuado, ia dc-manda de hipOfisis siempre excede a Ia oferta y la
extracciOn es procedimiento que toma muchotiempo. Sin embargo, por fortuna, es posibledeshidratar, envasar en ampolletas y almacenarcasi indefinidamente las hipOfisis, y durante losUltimos años hemos visto el establecimiento debancos de hipófisis, en especial pore! Instituto deInvestigaciones de Pesca Costera de la India y elPrograma de Coordinación y Desarrollo de IaAcuocultura FAO/PNUD (AnOnimo 197 7d).
La estandarizaciOn de la dosis, empero, no sepuede efectuar sin previo conocimiento de laactividad gonadotrOpica de los extractos, por locual es muy importante Ilevar a cabo el análisisapropiado. Las gonadotropinas de los teleósteosson inactivas en la mayor parte de los bio-ensayos(Burzawa-Gérard y Fontaine 1972); Burlakov etal. (1976) y Shehadeh (1972) analizaron losintentos de diseño de un procedimiento apropiado.Donaldson y sus colegas han usado durantevarios anos un análisis basado en la asimilaciónde fosfato radioactivo en el tejido testicular depollitos de un dIa de nacidos, que ha demostradoser sensible y preciso (Donaldson 1973).
Los esfuerzos siguen dirigidos hacia la busquedade una gonadotropina purificada cuya actividadpueda estandarizarse y cuya provision puedaasegurarse en reemplazo de los extractos pitui-tarios crudos. Se ha empleado gonadotropina desalmOn 'chinook' Oncorhynch us tshawytschaparcialmente purificada (Donaldson et al. 1972)para inducir la ovulaciOn de varias especiescultivadas, entre ellas el bagre (Sundararaj et al.1972) y la lisa (Kuo y Nash 1975). El costopromedio (120 dOlares canadienses) es sin em-bargo muy elevado. En Malasia, los intentos deinducir la ovulaciOn de la carpa cabezonaAristich-thys nobilis con gonadotropina de salmOn parcial-mente purificada (SG-G 100) produjeron ünica-mente éxitos ocasionales y sOlo con dosis(14 mg/kg) comparables a la dosis efectiva dehipOfisis de carpa comOn secada con acetona; losefectos combinados de Ia especificidad de lasespecies y el costo resultaron prohibitivos (Tajud-din 1978 sin publicar).
El costo es menos importante en el caso devarias gonadotropinas de origen mamIfero. Estashornionas son producidas por la placenta y dos deellas pueden conseguirse en forma purificada: lagonadotropina coriOnica humana (GCH) extraidade Ia orina de la mujer encinta y la extraida delsuero de yegua prenada. La primera ha asumidouna importancia mucho mayor en la piscicultura.Su acciOn fisiolOgica se asemeja a la de lahorniona luteinizante de los mamiferos, aunquelas dos hormonas no son estructuralmente idén-ticas y existe gran variaciOn entre las especies enrespuesta al factor placental. El efecto de las
hormonas de mamiferos, en términos generales esmãs incierto que el de las gonadotropinas de pez(Fontaine 1976), reflejando quizás la gran distanciafilogenética entre los dos grupos. Su empleo esatractivo ya que las dosis efectivas pueden resultarmás econOmicas que los extractos pituitarios depez (Carreon et al. 1976). La gonadotropinacoriOnica humana (GCH) se ha utilizado amplia-mente en el desove de peces cultivados (Pickfordy Atz 1957; Yamazaki 1965) y su éxito por lo
general se ha atribuido a Ia actividad semejante ala HL (Chaudhuri 1976). Ya sea sola o combi-nada con extracto pituitario de mamifero (unapreparaciOn comUnmente utilizada es el Syna-horin), la GCH ha demostrado ser efectiva yeconOmica para inducir el desove en la gran carpade la India (Chaudhuri 1976; Bhowmick 1979),en el Mugil cephalus (Liao 1975) y en la carpachina Aristichthys nobilis e Hypophthalmichthysmolitrix (Tajuddin 1978 sin publicar), cuando seadministra conjuntamente con un extracto pitui-tario homo o heteroplástico. Hay pocos casos deéxito usándola sola, aunque Chen et al. (1969) yCarreon et al. (1976) reportaron ovulaciOn, bajocondiciones experimentales, de las principalescarpas chinas y del bagre Clarias macrocephalusrespectivamente. Kuo et al. (1973b) reportandesove natural de la lisa, en respuesta a una dosispreparatoria de 20 UI/g seguida 24 horas despuéspor una inyecciOn de 40 UI/g.
Pocas investigaciones se han dirigido hacia IaevaluaciOn de la influencia de la temperaturasobre la efectividad de Ia gonadotropina adminis-trada. Sin embargo, los piscicultores saben bienque un aumento en la temperatura del agua reduceel tiempo entre la inyecciOn y Ia ovulaciOn(capitulo 4). Stacey y sus colaboradores (1979)han demostrado que la carpa dorada inducida aovular mediante inyecciOn de GCH o gonado-tropina de salmOn (SG-G 100), tiene un periodode latencia entre la inyecciOn y la ovulaciOnsensible al cambio de temperatura y que cadaaumento de 4 a 5 °C, reduce significativamente eltiempo de la liberaciOn de los huevos.
La técnica de hipofisaciOn, a pesar de suaparente sofisticaciOn, sigue siendo un arte. Noesprobable que sea desplazada de su posiciOn demétodo de preferencia para el piscicultor rural yen efecto, puede emplearse sin equipos de refrige-raciOn, centrifugao balaceo eléctrico (Bhowmicky Kowtal 1973). Mientras no se conozca y segeneralice una sustancia que cunipla con losrequisitos de bajo costo, actividad conocida y quesea fãcil de almacenar, el éxito del piscicultoraumentará más desarrollando un método confiablede verificar el estado de desarrollo gonadal, quemanipulando quimicos ad hoc. Hay sin embargo
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Carte de Ia cabeza de un salmOn corndn en donde se aprecia Ia ubicaciOn de la hipOfisis. Elmesence.falo se dobla hacia atrOs para extraerla.
(Foto B. C. Research).
signos alentadores de que pronto se encontrará ciagente apropiado. Syndel Laboratories Ltd. deVancouver ya está produciendo para ci comercioci poivo de hipOfisis de salmOn secada conacetona, preparación que tiene las ventajas delbajo costo y actividad conocida y podrO asumirgran importancia en los futuros programas de criaen ci Sudeste Asiático.
HORMONAS LIBERADORAS DEGONADOTROPINA (ETAPA 3, FIGURA 3)
La introducciOn del decapéptido sintético LH-RH (hormona liberadora de ia hormona luteini-
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zante) ha hecho posible la intervenciOn en Iacadena endocrinolOgica, un paso antes de IaaplicaciOn de Ia gonadotropina misma: es decir,en Ia interfase hipotaiámica-pituitaria. Las investi-gaciones en este campo son comparativamenterecientes y los resultados obtenidos son en granparte experimentales. Sin embargo, ci campo espromisorio y los futuros avances problablementebeneficiarOn al cultivador.
La administraciOn de LH-RH sintética aumentaci nivel de Ia hormona gonadotropina en ci plasmade La carpa comun Cyprinus carpio (Breton yWeill 1973) y de Ia trucha marrOn macho Salmotrutta (Crim y Cluett 1974); en ésta ultima, ciefecto se ha notado Onicamente en peces maduros.
La acciOn de la LH-RH también se ha demostradomediante la inyecciOn intracerebral en la carpadorada (Crim et al. 1976). La administraciOnintracelular de la droga con una dosis de 1 g/kgestimuló la maduraciOn ovárica de Ia carpacomün (Sokolowska et al. 1978) y en efecto,grandes dosis de LH-RH sintética han inducido Iaovulaciôn en la carpa dorada (Lam et al. 1975;1976) y en el ayu Plecoglossus altivelus (Hirose eIshida 1974). Lamysuscolaboradores(1978 sinpublicar) notaron un cambio estacional en laeficacia de la LH-RH para inducir la ovulaciOn.La variación en la manera de administrar ciliberador intraperitoneal, intracerebral e intra-muscular dificulta la comparación de los resul-tados y seria Util un estudio sistemático de esefactor.
Se ha sugerido que la magnitud de la dosisrequerida para inducir la ovulaciOn en el pez,relativamente alta segUn estándares niamiferos,refleja una especificidad filogenética de la hor-mona liberadora. Pero actualmente existen diversosanalogos estructurales sintéticos de Ia LH-RH,algunos de los cuales poseen una vida media máslarga y son más potentes en los mamiferos que eldecapéptido LH-RH Arimura et al. 1974; Monahanet al. 1973). Los informes recientes sobre suaplicación en peces son indicación de su futuraimportancia en ci control de Ia reproducciôn delos peces. Lam y sus colaboradores (1978 sinpublicar) han encontrado que el análogo nonapép-tido de la LH-RH (D-Ala6-des-Gly-NH2'°)-LH-RH-etilamida (Ayerst 25205) es parcialmenteefectivo en inducir la ovulación en la carpa doradacon una dosis (10 ng/g) ineficaz para la LH-RH, yDonaldson et al. (1978) encontraron que elmismo anáiogo es más potente que la LH-RHpara inducir la maduraciOn final y la ovulación delsalmon "coho" Oncorhynchus gorbuscha.
El analogo de la LH-RH DSer(But)6desGly'°-LH-RH etilamida (Hoechst 766) ha demos-trado tener todavia más potencia; dosis tan bajascomo 0,011 mg/kg resultaron efectivas parainducir la ovulaciOn del salmOn "coho", prece-didas por una inyección preliminar de gonado-tropina de salmOn (Donaldson et al. 1979). LainvestigaciOn sobre los anãlogos de LH-RH se halievado a cabo especialmente en la China, endonde desde 1974 se ha venido investigandoextensivamente la propiedad del Ayerst 25205para inducir el desove en la carpa plateadaHypophthalmichthys molitrix, en la carpa cabe-zona Aristichthys nobilis, en la carpa herviboraCtenopharyngodon idellus y en la carpa negraMylophatyngodonpiceus (Anônimo 1977, a,b).El compuesto (11am ado LRH-A) se administra yasea intramuscular o intraperitonealmente, encon-
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trándose que la dosis eficaz minima es de 1 sg/kgy 0,002 sg/kg respectivamente. En ci caso de lacarpa hervibora, que ha demostrado ser refractariaa Ia GCH sola, una inyecciOn irnica de 5-10 pg/kg de LRH-A produjo un porcentaje deovulaciOn del 86%, comparada con resultadosobtenidos con extracto pituitario. Para las carpasplateada y cabezona, las dosis minimas fueron de3 pg/kg y 1, 4 zg/kg administradas en dos inyec-ciones; para la carpa negra la dosis de 5-200 p.g/kgseguida de 0,5-2 mg de extracto pituitario, pro-dujo una tasa de desove del 74,6%. No se sabecon claridad si el desove fué espontáneo o si seextrajeron los huevos. El LRH-A también resuitOefectivo para inducir ci espermatismo en losmachos maduros. Un beneficio inesperado delLRH-A fue ci efecto sobre la mortalidad generalde los reproductores; en 1974, empleando GCHy/o extracto pituitario de carpa, la mortalidadposterior al desove era del 57%, mientras que en1975 y 1976, cuando se introdujo el LRH-A, lamortalidad bajO a! 11,8% y 3,5% respectivamente.Se requiere más experimentaciOn antes de atribuiresta disminuciOn de la mortalidad totalmente alcambio de hormona.
ADMtNISTRACION DE ESTEROIDESSEXUALES (ETAPA 4, FIGURA 3)
La gonadotropina, sea endOgena o exOgena, Seconsidera estimulante de Ia biosintesis del esteroidei7a-20Pg en la envoltura folicular; dicho es-teroide induce luego la maduraciOn final de losOvulos. Los estrOgenos, a pesar de tener unaimportante funciOn en las etapas iniciales deldesarrollo del oocito, en especial en la vitelo-genesis, no parecen participar en las etapasposteriores de ia maduraciOn interés principaldel piscicultor. La intervenciOn con quimicos anivel del oocito mismo, tiene algun atractivointuitivo; parece representar una soluciOn mássencilia que elimina intermediarios hormonalescomo la gonadotropina y la hormona liberadora.Sin embargo, existen muy pocos informes sobre eluso eficaz de los esteroides sexuales para inducirla ovulación.
Khoo (1974) se ha adjudicado ci logro de lainducciOn de la ovulaciOn en la carpa dorada,después de administrar progesterona; los estrO-genos, andrOgenos y pregnonelona resultaronineficaces. Sc ha logrado mas éxito con el 17a-20Pg; Jalabert demostrO (1976) que era unpotente inductor de la maduraciOn in vitro deoocitos de la carpa dorada, trucha arco iris y luciodel norte. A pesar de que Lam y sus colabora-dores (1978) no lograron inducir la ovulaciOn en
H ipófisis/H ipotálamo
000
AtH ipóf is is/H ipotálamo
C CC
B -
Gonadotropina Esteroides gonadales
VIa de retroalimentaciOn negativa
Gonadotropina Esteroides gonadales
Via ineficaz
Fig.5. Control del nivel de esteroides gonadales: (A) el sistema opera normalmente y la producción degonadotropina se regula coma resultado de Ia interacción de los esteroides sexuales en puntos de uniOn en IahipOfisis y en el hipotOlamo (circulos abiertos). (B) Los centros de uniOn estOn ocupados por moléculas declom(feno, par lo cual se descontrola Ia liberaciOn de gonadotropina y el nivel de los esteroides gonadales sigue
aumentando.
la carpa dorada con esta sustancia, Jalabert et al.(1977) la encontraron eficaz en Cyprinus carpiodespués de una pequena dosis preliminar deextracto pituitario. Parece que la inyección de17-2O Pg es eficaz Unicamente durante lasUltimás etapas de la maduración de los oocitos.Esto impone el requisito de administrarlo en elmomento preciso, lo cual parece limitar su posibleaplicación práctica en especial careciendo de unmétodo confiable para evaluar el estado de madu-ración gonadal en las hembras (biopsia ovárica),
Un segundo medio, menos directo, es a travésdel control retroinformativo de la secreción degonadotropina. Se cree que la liberaciOn degonadotropina está regida por un sistema negativode retroinformación en el cual los centros en lahipofisis y en el hipotálamo responden al nivel deesteroides gonadales en circulaciOn (Peter y Crim1979). La elevaciOn del nivel de esteroides sexuales,por ejemplo, induce una disminuciOn en la secre-ción de gonadotropina ante lo cual la liberación deesteroides baja de nuevo al nivel apropiado; labaja en el nivel de esteroides tiene el efectocontrario (Figura 5A). Billard et al. (1977) pre-sentan evidencia de este tipo de sistema de controle informan sobre un aumento en los niveles degonadotropina del plasma sanguineo despues decastrar a la trucha arco iris; se ha apreciado en elpez planoXiphophurus inaculatus y en Ia carpadorada una sensibilidad de la hipOfisis y del
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hipotálamo a los esteroides gonadales al asimi-larlos esas areas (Kim et al. 1978). Esos centrospueden considerarse como fijadores de esteroidesy recientemente se han dirigido esfuerzos investi-gativos para aprovechar su sensibilidad a losesteroides gonadales como medio de estimularartificialmente la liberación de gonadotropina.
Lo que se requiere es un compuesto quecompita con los esteroides gonadales endogenospara fijar sitios en la hipófisis y en el hipotálamode modo que se libere gonadotropina indepen-dientemente del nivel hormonal. El sistema negativode retroinformaciOn se torna entonces positivo ytiene como resultado un aumento artificial delnivel de esteroides gonadales (Figura 5B). Se creeque el antiestrOgeno citrato de clomifeno poseeesta propiedad (Pandey y Stacey 1975). Alimplantar clomifeno en la hipOfisis de carpadorada, se han elevado los niveles de gonado-tropina en el plasma (Billard y Peter 1977),elevaciOn que podria acarrear la inducción de laovulaciOn que se sabe produce la droga (Pandey yHoar 1972).
La determinaciOn de la dosis del clomifenosuficiente para inducir la ovulaciôn sigue siendoun problema; Breton et a! (1975a) afirman que,para la carpa comUn, una dosis de alrededor de1 mg/kg provoca liberaciOn de gonadotropina,mientras que dosis muy superiores a 10 mg/kgtienen el efecto contrario. La respuesta a la droga
es además dependiente del estado de maduracióngonadal. Por razones como ésta, se requiere másrnvestigación antes de usar en la práctica elclomifeno y otros antiestrógenos como el tamoxi-fen (Donaldson etal. 1978). No obstante, se hansugerido algunas aplicaciones especificas: Abra-ham (1975) senala que las células secretoras degonadotropina en la lisaMugilcephalus criada enagua dulce, presentan menor actividad sintéticacomparadas con las de peces de agua salada ysugiere que la suspensiOn correspondiente deldesarrollo ovárico podria superarse mediante !aadministraciOn de clomifeno. En una de !as pocaspruebas de campo reportadas hasta !a fecha, !osensayos de inducir Ia ovulaciOn en !a carpa de laIndia Labeo rohita fueron infructuosos (Bhow-mick et al. 1979).
NUEVAS POSIBILIDADES
Debido a la complejidad de las interrelacionesendocrinas, es dificil afirmar con certeza que elefecto observado al administrar una hormona esdirecto, 0 si por el contrario, como en el caso de lagonadotropina, estã regulado por conexiones hor-monales secundarias. La situaciOn se complica aunmás cuando Ia sustancia administrada es Cfl Si unamezcla de hormonas, como el extracto pituitariocrudo utilizado para la hipofisaciOn. La presenciade tirotropina, por ejemplo, puede contribuirsignificativamente al efecto sobre el desarrollogonadal generalmente (y vagamente) atribuido ala gonadotropina. Hurlburt (1 977a,b) ha demos-trado que la hormona tiroidea puede tener unaimportante funciOn en la maduraciOn ovárica(capitulo 2) y se ha notado que ciclos de laactividad tiroidea coinciden con la maduraciOn
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gonadal en algunos teleósteos (Sage 1973). Yahemos senalado la funciOn del higado en lavitelogénesis y se ha observado que la hormonatiroidea tiene un efecto regulador sobre el higadoen el pez (Takashima et al. 1972). Las futurasinvestigaciones sobre el funcionamiento de Iaglándula tiroides en los teleOsteos, pueden entoncesindicar con precisiOn el papel de la hormonatiroidea en el control práctico de la reproducciOndel pez.
No debe ignorarse la posible importancia de lashormonas estimulantes del crecimiento. El ovariode los teleOsteos puede aumentar desde el 1%hasta el 20% del peso corporal durante la madura-ciOn y sus requerimientos de energia son abun-dantes. Los diversos factores de estimulo delcrecimiento podran por lo tanto tener un papelimportante en el desarrollo gonadal y la posibleimportancia de dichas sustancias debe reflejarseen futuros programas de investigaciOn. Tanto laprolactina como la hormona del crecimiento sonproducidas por la hipOfisis de los teleOsteos;aquella se ha relacionado con Ia reproducciOn y elcrecimiento somático en diversos vertebrados(Hoar 1975). Donaldson el al. (1978) reciente-mente revisaron los efectos de la administraciOnde la hormona del crecimiento en los peces.
4. PRACTICA DE LAREPRODUCCION INDUCIDA
CARPA COMUN Y CARPAS DE LA CHINA YDE LA INDIA
La literatura referente a la inducción artificialde la ovulaciOn en la carpa presenta ciertosproblemas para el critico. Segun el criterio cientI-fico internacional, es en su mayorIa de bajacalidad. Es comün, por ejemplo, que no seidentifiquen las especies. Un procedimiento dehipofisaciOn puede describirse ünicamente para"carpa china", siendo de poca utilidad para cilector que esté tratando de hacer desovar la carpahervIbora y que ya sepa que en general el desovees mas dificil de lograr en esta especie que en lacarpa piateada o en Ia cabezona. El origen delextracto pituitario inyectado no siempre Se conocecon exactitud y un informe puede no mencionar silas glándulas son de pez macho o hembra, maduroo inmaduro. Rara vez se especifica si ci peso es"hUmedo" o "seco" ai describir ci cálcuio de Iadosis, a pesar de ser un dato importante para cicriador que desee adoptar un nuevo método. Losinformes sobre inducciOn 'exitosa' del desove,rara vez son ci resuitado de experimentos contro-iados y los criterios empleados para describir cigrado de éxito alcanzado son a menudo made-cuados. Sc cncuentra con frccucncia ci término"rcspucsta positiva", pero no sc aclara Si Screfiere a ovulación, dcsove, fccundación o incuba-ciOn. Una variable importante, que dificulta lacomparaciOn de los resuitados, es ci método deincubaciOn empieado; es un determinante esencialpara ia supervivcncia dc las crias y sin embargo nose especifica en muchos casos.
Esta critica no trata de ser despectiva, pues haycausas subyacentcs que dificultan la intcrprcta-ciOn de la iiteratura. Para comcnzar, la mayoria
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de las investigaciones son efcctuadas por cria-dores prácticos que no han recibido capacitaciOncientifica formal. Las instalaciones disponiblespara Ia experimentaciOn son en general las de uncentro de crIa de peces a menudo en una regiOn delmundo en desarroilo con dificultades para conse-guir ci equipo cientifico. Una tercera y menostangible razón es que la práctica de la hipofisaciOnpuede haber asumido caracteristicas de arte y porconsiguiente los informes publicados tienen unsabor ciaramente regional; es como si cada técnicarepresentara una adiciOn al repertorio local, pres-tando poca atenciOn a las razones biolOgicas dciéxito o del fracaso.
Sin embargo, es imposible escapar a las leyesbiolOgicas básicas y ci problema de inducir laovulaciOn sigue siendo de naturaicza cientlfica.Por eilo se aborda mejor con experimentos biendisenados, efectuados bajo condiciones contro-iadas. No hay razOn por ia cuai este tipo deinvestigaciOn no pueda coexistir con informesmenos rigurosos de estaciones en el campo; loimportante es iniciaria. La investigaciOn sobre lainducciOn de la ovuiaciOn en ia lisa y ci sábaioconfirma ci hecho de que este tipo de programapuede tener resultados importantes en un ticmpocomparativamente corto. Los trabajos con estasespecies, aunque recientes, se han efectuado en sumayona en instalaciones bien equipadas en Hawai,Taiwan y Fiiipinas, y ci diseno experimentalsurgido de esos laboratorios ha producido resul-tados más significativos.
Las mismas especics de peces pueden cultivarseen diferentes partes dci mundo, variando suritmo de crecimiento y dcsarrollo reproductivosegün la zona ciimática. La carpa china porejempio, es especic "exOtica" en Ia India y puedealcanzar la madurez sexual en la mitad del tiemporequerido en su regiOn de origen. Por ésta y otrasrazones, es dificii prcsentar un método estándarde inducciOn de la ovulaciOn para todas las carpaschinas y de la India. El criterio adoptado aqui hasido, pues, el de reunir un cuadro comparativo delos métodos publicados quc hayan demostradotener aigun grado de éxito (Cuadro 1). La iista essciectiva y, esperamos, no arbitraria. Los datosprovienen, en la mayc'rla de los casos, de losresultados publicados sobre experimentos de cria,aunquc los procedimientos recomendados en di-versos manuaies de piscicuitura se han incluidoen donde son apropiados. La carpas comUn, chinay de la India se han agrupado por especics y parafines comparativos se anota ci pals en donde sehan criado. Dado ci estado actual de la experi-mentaciOn en este campo, ci lector pucdc consi-derar ci cuadro más como fucnte de ideas quecomo iista dc métodos definitivos.
Cuadro 1. Técnicas de Reproduccion Inducida - Carpas comun, chinas y de Ia India.
Edaddel Temp.
Epoca repro- Numero del Evaluación Inyeccion
del ductor de agua del estadoEspecie (pals) ano (a) hembras (SC) gonadal Sustancia (via) Disolvente is. dosis 2a. dosis
Cyprinus carpio - - - 25-28 H: vientre HypOfisis de NaCI: H: 1 hipOfisispor -(Nepal) distendido, Cyprinus calpio glicerina kg. de peso
blando; cloaca secada con 7:3 0,6%. M: Total 1hinchada, acetona (TM) hipofisisrojiza.M: saleesperma bajopresiOn suave.
Cyprinus carpio - - 13 24-27 H: vintre HipOfisis de NaCI o H: 6 mg/kg de H: 6 mg/kg(Singapur) distendido; Puntius agua peso hümedo M: 12 mg/kg
cloaca goni000tus destiladarosaduzca. (IM) al 0,6%M: saleesperma bajopresion suave.
Todas las grandes Mayo 2-4 - 24-31 H: abdomen Hipófisis NaCI al H: 2-3 mg/kg H: 5-8 mg/kgcarpas de Ia India Julio blando, homoplãsticas 0,3% M: 2-3 mg/kg(India) (Mon- protuberante; (IM)
son) porohinchado,rosado.M: saleesperma bajopresiOn sauve.
HipOfisis Agua H: 0,5 de H: 1 glándula enhomoplásticas destilada glandula en 0,75 ml de aguade donante 0,5 ml de agua M: 0,25 desemejante (IM) glandula en 0,5 ml
de agua
Hipofisis de Ia H: Totalespecie 30 mg/kgTachysurus lvi Totalbagre marino 20 mg/kg(IM)
Hipofisis de NaCl alCyprinus carpio 0,75%(IM)
HipOfisis de NaC1 H: 5-6 mg/kg H: 5-6 mg/kgCyprinus carpio 0,6% de peso hUmedo M: 5 mg/kgo Puntiusgonionotus M oF (IM) o (IP)
HipOfisis de NaCI H: 5-6 mg/kg H: 5-6 mg/kgCyprinus carpio 0,6% de peso hUmedo M: 5 mg/kg0 Puntiusgonionotus M oF(IM)o(IP)LRH_Ab Base H: 5-10 sg/kg
de agua M: 2,5-5 1zg/kg
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Labeo rohita Julio - 32 -(India) Agosto
Labeo rohita, Julio 2-4 11 25-27 -Cirrhinus mrigala(India)
Hypophthal-michthys molitrix(Israel)
- 2-4 60 H: abdomengrande,blando.M: espermabajo presiOnsauve.
Hypophthal-michthys molitrix(Malasia)
- 2 12 27-28 H: vientreileno, blando;cloacahinchadarosadaM: espermabaja preston.
Clenopharyngo-don idellus
- 2 10 27-28 -
(Malasia)
Ctenopharyngo-don idellus
- - 25 20-28 -
(China)
Cuadro 1.
8-10 Desove 'Hapa' o embudo Manual de A menor temp. del agua mayor Woynarovich (1975)artificial; incubador forrado Instrucciones; no se demora de Ia ovulaciOn. Contieneen seco. en tela; 5-101 de dieron resultados. datos sobre hipofisacian de carpas
agua/min. chinas, pero son confusos los detallesde Ia inyecciOn; abundanteinformaciOn sobre técnicas defecundaciOn e incubacion.
5 6-7 Desove - Todos desovados; No se ha determinado todavia Ia Tay (1973)natural. se obtuvieron 65.000 cantidad exacta de extracto pituitario
alevinos. requerido.
6 3-6 Desove 'Hapa' doble Manual de Instruc- Este "método esténdar" para carpas Chaudhuri (1972)natural estancado; se sa- ciones; se cita un éxito de Ia India se ha modificado pocoen 'hapa' de can los huevos del del 60-100%. desde 1963. Los mejores resultadoscria 'hapa' de reprod. se obtienen en dias trios, ventosos y
6-8 h. post-fecund. iluviosos.
6 - Fecunda- - Resultados positivos: VersiOn simplificada del método Bhowmick y Kowtalción 72%; se produjeron anterior, destinada al piscicultor (1973)natural. 1.650.000 huevos. rural. El extracto se prepara justo
antes de usarse; no se centrifuga.
Respuesta positiva en Ineficaces las dosis de 20 mg/kg (h) y Varghese et al.7 de las 11 hembras. 15 mg/kg(m). Se usaron dosis alias (1975)
debido a Ia distancia filogenéticaentre donante y receptor. Cuesta 1/3del costo de las hipofisishomoplásticas.
Desove Incubadoras con Se criaron 3 millones de La inyecciOn sa aplicO con los peces Pruginin y Cirlinartificial; agua corriente. larvas; supervivencia dentro del agua pars evitar traumas. (1976)en seco. del 50% hasta un
tamaño de 0,25 g.
5 5-6 Desove En vivero; Crias del 30% de las La adiciOn del Synahorin al extracto Chen et al. (1969)artificial; bandejas de agua hembras inyectadas, en tiene pocos efectos.en seco. corriente en excelentes condiciones.
estanques; 'hapas'estancadaa.
5 5-6 Desove En vivero; Crias del 40% de las El estado de madurez de Ia hembra Chen et al. (1969)artificial; bandejas de agua hembras inyectadas en no se puede evaluar por Ia formaen seco. corriente en excelentes condiciones. intestinal debido a Ia presencia de
estanques; 'hapa' tejido adiposo mesentérico.estancada.
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Demora deIa ovulaciOn Método de Método de
(h) (h) fecundacion incubación Resultados Comentarios Referencias
15-20 - Freza del 88% Se train un total de 139 peces con AnOnimoLRH-A con diferentes regimenes de (1977 a, b)aplicaciOn de las inyecciones,resultando un porcentaje general dedesove del 86,3%.
Cuadro L (fin)
Edaddel Temp.
Epoca repro- Numero del EvaluaciOndel ductor de agua del estado
Especie (pais) aho (a) hembras (°C) gonadal Sustancia (via) Disolvente
Ctenopharyngo- Julio- - 11 28-3 1 HipOfisis -don ide//us (India) Agosto homoplásticas y
heteroplásticas(TM)
Ctenopharyngo- Julio- 1-2 8 27-33 - HipOfisis de NaCI H y M: 0,23 a I H: 1-3,4don idellus Octubre Cyprinus carpio 0,6% hipOfisis hipdfisis mas(Tailandia) y Synahorin o agua 20 unidades
(IM) destilada "rabbit" deSynahorin
Ctenopharyngo- Mayo- - 9 23-25 H: DistensiOn HipOfisis H: 45 UI/kg H: 383 UI/kgdon idellus Junio abdominal. homoplásticas de GCH GCH seguidas(Arkansas) M: espern-la secadas con por 0,45 mg/kgde
bajo presiOn. acetona (IP) hipOfisis en 24 hmas GCH (TM) (3my)
Ctenopharyngo- Mayo- 4 12 20-28 H: poro HipOfisis - H: 0,5-3 mg/kg H: 2,5-3,5 mg/kgdon idellus Junlo rosaduzco homoplásticas de peso seco(Nepal) M: esperma
bajopressiOn.
Hypophthal- - - - 25-27 - GCH mae - H: 200 UI H: 4 mg/kgmichthys mo/jinx hipOfisis de GCH/kg de hipOfisis de(Malasia) Cypninus carpio Cypninus carp/u
Hypophthal- - - 198 20-28 LRH_Ab Base H: lOp.g/kgmichihys molitnix de agua M: 5 1.eg/kg(China)
Hypophthai- Mayo- 1-2 10 27-3 3 - HipOfisis de NaCI H y M: 0,23-I H: 1-3,4michthys molitnix Agosto Cyprinus carpio 0,6% hipofisis hipOfisis mas(Tailandia) mas Synahorin o agua 20 unidades
(TM) destilada 'rabbit" deSynahorin
Aristichihysnobilis(Malasia)
2 18 27-28 H: vientre HipOfisis de NaCI H: 5-6 mg/kg H: 5-6 mg/kgileno, blando; Cypninus carpio 0,6% peso humedo M: 5 mg/kgcloaca o Punt/ushinchada, gonionotus M orosada. H (TM) o (IP)M: espermabajo presiOn.
Anistichthys - - - 25-27 - GCH mas - H: 200 UI H: 4 mg/kgnobills hipOfisis de de GCH/kg de hipOfisis de(Malasia) Cyprinus carpio Cyprinus carpio
Aristichthys - - 108 20-28 - LRH_Ab Base de H: 1-2 .eg/kg H: 8-9 jsg/kgnob/i/s (China) agua M: 0,5-1 eg/kg M: 4-4,5 sg/kgAristichihys Agosto 1-2 5 27-33 - HipOfisis de NaC1 H y M: 0,23-1 H: 1-3,4nobilis -Sept. Cypninus 0,6% hipOfisis hipOfisis mas(Tailandia) carpio mas o agua 20 unidades
Synahorin destilada 'rabbit" deSynahorin
a T = Lapso entre Ia primera y segunda inyecciOn.b LRH-A = [D-A1a6-Des-Gly-NH2'0}-LH-RB-etilamida.
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Hypophthal- Julio- - 40 28-34 - HipOfisis H: 4 mg/kg H: 8-10 mg/kgmichthys molitnix Agosto homoplásticas y M: 2-3 mg/kg(India) heteroplásticas
(TM)
Inyeccion
I a. dosis 2a. dosis
H: 3-5 mg/kg H: 7-10 mg/kgM: 2-3 mg/kg
5-6 Desove 'Hapas' Fecundación del ResultO ineflcaz Ia combinación de Singh et aL (1970)artificial; estancadas. 15-80%; se produjeron Synahorin (25 UI) con extractoen seco. 550.000 alevinos. pituitario.
6-8 4-6 Desove 'Hapas' en agua OvuIacion del 47% - Boonbrahm et al.artificial; corriente. (1968)en seco.
24 10-16 Desove En vivero: frascos 66% ovulación; Para Ia inyecciOn y ci desove se Bailey y Boydartificial; de agua corriente. 20-98% eclosión. anestesiaron los peces con 7-10 ppm (1970)en seco. de Quinaldina
6 12-14 Desove Embudos de cria 11 de 12 hembras No se inyectaron los machos pues La Shrestha (1973)artificial; (capacidad ovularon; se produjeron esperma fluia libremente.en seco. 20-30 1) en agua 400,000 crias
corriente(0,5-0,8 1/mm)
22-24 - - 84% de ovulaciOn - Andnimo (1977 a, b)inducida.
6-8 4-6 Desove 'Hapas' en agua Ovulacidn del 67,7% - Boonbrahm et al.artificial; corriente. (1968)en seco.
4-5 Desove 'Hapa' estancada. FecundaciOn 5-80%; Efectiva Ia adicidn en laa dos Singh et al. (1970)artificial; se obtuvieron 907.000 inyecciones pars las hembras, deen seco. alevinos 25-50 UI de Syanhorin. La maxima
produccidn de alevinos se asociO conci dims frio y lluvioso. Temperaturaoptima del agua 27-30°C
5 5-6 Desove En vivero; Crias del 66% de Poco eficaz Ia adición de Synahorin Chen et al. (1969)artificial; bsndejas de agua las hembras al extracto pituitario.en seco. corriente; en inyectadas, en
estanques; hapas' buenasestancados. condiciones.
6-8 4-6 Desove 'Hapas' en agua 91% ovulación. - Boonbrahm et al.artificial; corriente. (1968)en seco.
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Demora deIa ovulación Método de Método de
(h) (h) fecundaciOn incubación Resultados Comentarios Referencias
6 6-7 80% de ovulaciOn Informe preliminar sobre los Tajuddin (1978 -exitosa. trabajos, CuD. sin pubhcar)
6 6-7 80% ovulación Informe preliminar sobre los Tajuddin (1978exitosa. trabajos, CuD. sin publicar)
12 - 82% ovulaciOn - Anonimoinducida. (1977 a, b)
EPOCA DEL ANO; EDAD DE LOS EVALUACION DEL ESTADO GONADALREPRODUCTORES
Desde hace mucho se sabe que las especies declimas templados crecen màs rápido y alcanzanantes Ia madurez sexual en clima tropical. Lacarpa china es un ejemplo notable y se hacultivado con éxito en regiones tan distantes comoRusia y Malasia. En MoscU, por ejemplo, la carpachina liega a Ia madurez sexual a los 10 anosmientras que en Malasia lo hace a los dos años. Lamayor temperatura del agua y el mayor fotoperiodopueden considerarse como los factores respon-sables de la maduraciOn acelerada en los climasmas cálidos, aunque no se debe ignorar la influen-cia de la dieta; Bienarz y sus colegas (1977)demostraron una maduraciOn ovárica aceleradaen ejemplares de Cyprinus carpio alimentadoscon una dieta rica en protelnas; la alimentaciOncomplementaria también ha demostrado producirel mismo efecto en la carpa de Ia India Labeorohita (Bhowmick et al. 1977).
Después de alcanzar la madurez sexual, losovarios de las carpas de China y de Ia India en unmomento dado contienen oocitos en varias etapasde desarrolio. Por ello, es posible que bajo lascondiciones de temperatura y dieta adecuadas,puedan producir Ovulos maduros más de una vezal año, especialmente en paises tropicales endonde las temperaturas estables del agua propor-cionan excelentes condiciones para el crecimientode los peces. Chen et al. (1969) informan que lascarpas chinas criadas en Malasia pueden pre-sentar dos o tres ciclos de desove al aflo y sugierenque, vigilando Ia dieta, se podria disponer ycontrolar los ciclos. Resultados en Malaca mdi-can que ésto es posible; Tajuddin (1978 sinpublicar) afirma que actualmente es posible deso-var la carpa plateada y la carpa cabezona casimensualmente.
En paIses como la India, con estaciones mar-cadamente secas o Iluviosas (MonsOn), el nümerode desoves que se puede lograr en el año no es tanalto como en ci trOpico, aunque Bhowmick et al.(1977) han logrado recientemente criar los mismosespecimenes de las grandes carpas de la IndiaLabeo rohita y Cat/a cat/a dos veces en la mismaestaciOn. Las carpas de Ia India en so medionatural desovan una vez a! año durante Ia estaciOndel monsOn; Se cree que Ia mayor pluviosidad y lamenor temperatura del agua son los factores quecontribuyen a producir Ia maduraciOn gonadalfinal. Como se puede apreciar en el Cuadro 1, lareproducciOn inducida también se practica bajoesas condiciones.
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El ëxito de la hipofisaciOn depende de lacorrecta evaluaciOn del estado de madurez gonadalde Ia hembra. Por lo general es fácil reconocer alos machos maduros, por la expulsion de liquidoespermático al ejercer una suave presiOn en ciabdOmen y, como se ha dicho, la hipofisaciOn delos machos a menudo es innecesaria. Estudiospublicados sobre Ia cria de Ia carpa se han basadoen caracteristicas externas como "vientre inflado"o "poro rosaduzco" para determinar ci estado demadurez gonadal de las hembras; empero, estemétodo se basa en la interpretaciOn subjetiva decolores y formas por lo cuai es a menudoimpreciso. El vientre lleno puede, por ejemplo,reflejar una distensiOn intestinal y el poro genitalhinchado y rosaduzco se observa corrientementeen peces cuyos ovarios ya han empezado aretroceder (Chen et al. 1969). El método esespecialmente dificil de aplicar a la carpa herviboray es probablemente por eso que, entre las carpaschinas, esta especie es la mas dificil de desovarpor hipofisaciOn. El éxito en Ia reproducciOninducida de cualquier especie aumentará drama-ticamente cuando se desarrollen métodos debiopsia ovárica seguros y confiables, campo en elcual hay urgente necesidad de investigaciOn. Elcapitulo 5, Métodos de Biopsia Ovarica, tratarámás a fondo ese tema, al sintetizar las técnicasexistentes para Ia carpa, Ia lisa, el sába!o y elbagre.
INYECCION
Sustancia: La mayoria de los métodos del Cuadro1 incluyen la inyecciOn de extracto pituitariocrudo de pez. Cuando se emplean hipOfisis hetero-plásticas, la distancia filogenética entre donante yreceptor no es grande; por ejemplo, a menudo seusa Ia carpa comOn como donante para las carpaschinas o de la India. Es preciso mencionar ci usode hipOfisis de bagre inmaduro para desovarcarpas de la India, en particular por Ia graneconomia financiera que implica (Varghese et al.1975). Ya se ha analizado el empleo de lahormona sintética LRH-A para desovar carpaschinas y posteriores investigaciones podrán de-mostrar el importante lugar de este compuesto enel campo de la piscicultura del mundo entero.
Los extractos pituitarios crudos de pez puedenextraerse de glándulas recién disecadas o deglándulas conservadas en acetona o en alcoholabsoluto. Los informes disponibles no siempre
especifican la procedencia de la glandula, nitampoco su "peso seco" o "peso hümedo" lo cualhace dificil repetir los experimentos reportados.De igual manera, tampoco Se especifica a vecesel solvente utilizado, aunque NaCI a! 0,6%parece dar resultados consistentes. No se debeninyectar más de 0,5 ml y hay que extraer cualquierpartIcula insoluble que quede después de macerarla glándula, ya sea pot centrifugaciOn o sedimen-taciOn.
Determinación de la dosis: La ovulaciOn esgeneralmente inducida por la aplicaciOn de extractopituitarioo gonadotropina en dos dosis. La primerase denomina dosis "estimulante" y la segundadosis "definitiva"; a los machos casi siempre seles inyecta junto con la segunda inyecciOn de lashembras. La divisiOn de la dosis total parece algoarbitraria y el lapso entre las dos inyecciones se hadeterminado experimentando. El método de cal-cub de la dosis depende del equipo que tenga elcriador; se obtendrán mejores resultados cuandose puedan pesar con precisiOn Ia sustancia inyec-tada y el pez receptor, y se pueda calcular la dosisen base al peso/peso. No obstante, tambiônpueden obtenerse resultados aceptables sin ba-lanza; Bhowmick y Kowtal (1973) describen unatécnica simplificada consistente en extraer glán-dulas de donantes de tamaho comparable al de losreceptores. El peso del donante y el del receptorpueden determinarse en base a un nomogramaque relacione el peso con Ia longitud y el contorno(Makeyeva y Verigin 1970).
Via y método de inyección: La inyecciOn intra-muscular de hormonas y extractos es definitiva-mente Ia técnica más utilizada, aunque a veces sepractica la administraciOn intraperitoneal. Estaültima tiene el riesgo de danar los Organosinternos asI como de una posible pérdida deextracto al inyectarlo inadvertidamente en elintestino, y, en cambio, parece ofrecer pocasventajas. La inyecciOn intramuscular puede apli-carse entre Ia base de la aleta dorsal y Ia linealateral. La colocaciOn de la aguja no es crItica,pero el criador deberá levantar cuidadosamentelas escamas y frotar suavemente el area despuésde retirar la aguja para ayudar en la distribuciOndel extracto y evitar el flujo retrOgrado. Otromedio de prevenir el flujo retrOgrado es aumen-tando la viscosidad de la soluciOn con glicerina,en una proporciOn de 3 a 7 (Woynarovich 1975).
Manejo de los rep roducto res: Si durante lamanipulaciOn del pez se limpia Ia capa mucosa, lapiel será susceptible a infecciones bacterianas aligual que sucede con lesiones mas graves comoabrasiones o pérdida de escamas. La captura,
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inyecciOn y desove son todos procedimientosdelicados y hay que tenet gran cuidado parareducir a! minimo el maltrato. Un pez ma!manipulado puede no sobrevivir lo suficientecomo para ovular, mientras que un pez bientratado puede reproducirse satisfactoriamentedurante varios anos.
El criador debe envolver ci pez en una toallahümeda después de capturarlo con la red y sacarlodel tanque y nunca debe arrojarlo de vuelta a!agua. El bano de acriflavina (0,01%) ha demos-trado ser ütil para prevenir la Ilamada red scaleinjury (escama roja) que ocurre comünmentecuando se desovan las carpas en cautiverio (Bhow-mick et al. 1977) y debe aplicarse después dedesovarlas. En pocos casos se emplea anestesia,aunque su uso podria aumentar considerablementela supervivencia. Para la carpa, se han encontradoefectivas la MS 222 (Woynarovich 1975) y IaQuinaldina en concentraciones de 50-100 ppm(Chen et al. 1969). La MS 222 puede agregarse alagua en dosis de 50-100 mg/i, o puede insertarseen Ia boca del pez un tapOn de género relleno dealgodOn impregnado de soluciOn 0,04M. La MS222 (1,6 ppm) se ha usado con éxito en el trans-porte a grandes distancias de carpa hervibora ycarpa plateada (Gupta y Sharma 1974). Bell(1967) y Anónimo (1978) proporcionan informa-ciOn sobre las anestesias generales utilizadas co-mUnmente para peces.
La inyecciOn puede aun aplicarse dentro delagua, procedimiento que elimina el riesgo delesiones internas ocasionadas cuando los Organosinternos ya no son sostenidos pot el agua circun-dante y puede aplicarse con anestesia o con el pezatrapado en una red.
PL.Azo PARA LA OVULACION
Después de Ia inyecciOn final los reproductoresvuelven a! tanque y a menos que se desee Iafecundaciôn natural, deben observarse atentamentelas indicaciones de que los huevos y la espermaestan listos para ser extraIdos. La más confiableindicación es el cortejo o gaianteo, aunque sepuede capturar ala hembra en una red y masajearlasuavemente para verificar si los huevos hanempezado a fluir libremente. La pérdida dehuevos puede prevenirse suturando ci orificiogenital en el momento de Ia inyecciOn; esto debehacerse bajo anestesia suave. Hay poco margende error en la detecciOn de una hembra lista paraser desovada. Los huevos extraldos una horaantes pueden resultar infecundos y, especial-mente con las carpas chinas, no se puede confiaren ci desove natural pues los huevos que no seextraigan manualmente se degeneraran y reabsor-
berán. Esto puede ocurrir incluso 30 minutosdespués de que los huevos estén totalmentemaduros (Chen et al. 1969).
El lapso entre la inyecciOn y Ia ovuiaciOn variacon ci nümero de inyecciories y con la tempera-tura del agua; el conocimiento de tales factorespermite al criador organizar el programa deinyecciones para que el desove pueda efectuarse auna hora conveniente del dia. El lapso después dela Ultima inyecciôn se acorta considerablementecuando se aplica más de una inyección y por lotanto ci momento de la ovulación es más fácil depredecir. También puede tenerse más control enlos lugares en donde se puede alterar la tempera-tura del agua; en ci caso de Ia carpa comUn, porejemplo, la ovulaciOn ocurre aproximadamente 8horas despues de la inyecciOn bajo una tempera-tura de 28° C, mientras que bajo 15 °C se requiereci triple del tiempo (Woynarovich 1975).
METODO DE FECUNDACION
La fecundaciOn puede efectuarse mediante cidesove manual, mezclando los huevos con Iaesperma o por medios naturales en un estanque dedesove. La fecundaciôn artificial se practicacomünmente con ci método "seco" que consisteen secar a los dos reproductores, extraer loshuevos a un recipiente seco y extraer Ia espermacolocándola sobre los huevos, mezclando suave-mente con una pluma o cuchara piástica. Pasados1 a 2 minutos se enjuagan bien los huevos conagua y se transfieren a un mayor volumen de agua(varios litros) para su expansion y endureci-miento. Después de éste proceso, que conciuye enaproximadamente una hora, los huevos puedenpasarse a una incubadora o dispositivo de cria.
Los huevos de Ia carpa comün y de ia carpachina son pegajosos y pueden agiutinarse redu-ciendo ci oxigeno disponibie para los de másabajo. Esto se evita agregando a los huevos unasoluciOn de NaCi ai 0,4% y urea a! 0,3%inmediatamente despuës de mezciarlos con laesperma (Woynarovich 1975; Kossmann 1976).La soluciOn debe agregarse primero en cantidadaproximadamente equivalente a! volumen de loshuevos y puede reponerse, agitando, a medida quese absorbe. Antes de sacar los huevos de laincubadora, conviene haceries un Uitimo bano ensoluciOn de tanino a! 0,15% para remover cual-quier vestigio de material adhesivo.
El desove natural se emplea con frecuenciapara la carpa de la India y tiene la ventaja delimitar el manipuieo de los reproductores. Sinembargo, las enfermedades y la predaciOn puedenproducir una proporciOn inaceptabiemente bajade sobrevivencia de crias, si la incubaciOn tiene
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lugar en ci estanque de desove. Por esta razOn,después de su endurecimiento, generaimente serecogen los huevos fecundados y se pasan adispositivos de incubaciOn especiales o a recintosde cria. Para obtener alta proporciOn de sobre-vivencia, esto debe hacerse minuciosa y cuidado-samente.
METODO DE INCUBACION
Los huevos fecundados por desove natural quese dejan incubar en ci estanque, están expuestos aenfermedades y ala predación, y la proporciOn decrias puede bajar hasta 1-5. El tradicional 'hapa'incubador dá alguna protecciOn contra Ia preda-ción; este senciiio dispositivo (Figura 6) consisteen varias bandejas pandas que flotan dentro de unmarco exterior mayor. Las bandejas interioresestán recubiertas por malla gruesa, como demosquitero, y las larvas producidas por los huevosque están dentro de ellas pueden escapar dejandoastrás los huevos muertos y los cascarones. El'hapa' exterior si detiene las larvas, pues estárecubierto por maila fina. Para mejores resui-tados, debe instaiarse en agua corriente y se puedeiimitar la predaciOn de pájaros y sapos colocán-dole una tapa. Empero, este dispositivo de incu-baciOn de estanque sigue sujeto a riesgos incon-troiabies como cambios en ia temperatura y bajasdel nive! del agua; para ia producciOn de criás engran escala se requiere una instalaciOn de incuba-ciOn cubierta. Es esencia! contar con una tuberiade agua, a fin de permitir Ia graduaciOn dci flujo yla oxigenaciOn asI como !a apiicaciOn controladade agentes para combatir las enfermedades bac-terianas y micOticas.
El equipo de incubaciOn cubierto puede tenetun diseno muy sencil!o; sus principales funcionesson proporcionar suficiente agua circu!ante paramantener un suave movimiento rodante de loshuevos a fin de remover fáci!mente los desechos,como huevos muertos y cascarones, y permitir laextracción de las larvas para transferirlas alestanque de cr1 a. La Figura 7 indica un senciliodispositivo para incubar huevos de carpa; tienecapacidad para 80 !itros y puede recibir hasta70.000 huevos de carpa china. El flujo de aguadebe mantenerse en 1-2 litros por minuto. Elembudo puede construirse en hierro galvanizadoo piástico, siendo muy fácii adaptar une pailaplastica. En la versiOn más senci!la, ia incubadoraes suspendida de un soporte alto y ci agua sale potia malia de nilOn. A esta versiOn se Ic puedensumar numerosos aditamentos: si se gradua ciflujo de agua de ta! manera que los huevos en !entacircu!aciOn asciendan solo hasta la mitad delembudo, las larvas podran escapar a través de una
Fig. 6. Diagrama delprincipio de operacion del 'hapa' de crIa. Se ha omitido la red fina que cubre el marcoexterior, para apreciar los detalles de la construcción. Las larvasproducidaspor los huevos que se han colocadosobre las bandejasfiotantes, escapan a través de Ia mallagruesa que rodea a estos recipientespero nopasanporla
malla fina del 'hapa' externo.
salida colocada sobre un vertedero. Para obteneruna mejor circulaciOn del agua se puede instalaren la entrada de agua un surtidor o un tamiz.
LISA
La lisa, esp. Mugil es una especie particular-mente atractiva para Ia acuocultura; se encuentraen muchos lugares, es resistente a la temperaturay es omnivora, además de eurihalina por lo cual sepuede criar en agua dulce, salobre o salada. Larecolecciôn de alevinos en aguas estuarinas estásin embargo sujeta a fluctuaciones cuantitativasimpredecibles y en los Ultimos años se hanintensificado las investigaciones para asegurar laprovision mediante la cria artificial.
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DESOVE ARTIFICIAL
Durante la ültima dbcada se ha logrado con éxitola inducción de la ovulaciOn en la lisa aunquetodavia no se ha encontrado un método que reünala conf'iabilidad con el bajo costo. Se ha utilizadogran variedad de sustancias inductoras, incluyendohipOfisis de carpa homogeneizada (Yashouv 1969),hipOfisis de lisa homogeneizada mezclada conSynahorin (Liao 1975), gonadotropina de salmonparcialmente purificada, SG-G 100 (Shehadeh etal. 1973a) y gonadotropina coriónica humana,GCH (Kuo et al. 1973b).
Desde 1963 en Taiwan, Liao y sus colegas haninvestigado el desove de la lisa gris Mugil cepha-lus y los avances hasta 1973 se encuentransintetizados (Liao 1975). Hay dos puntos de este
trabajo especialmente significativos: los repro-ductores eran en su mayorIa peces salvajes captu-rados durante la migración anual de desove(DiciembreFebrero) y no se intentó evaluarobjetivamente el estado de desarrollo gonadalantes de la inyección. Ya se ha dicho que el estadode disposiciOn femenino es básico para el éxito decualquier programa de ovulaciOn inducida. El usode peces salvajes también tiene sus inconvenientes:no solo es difIcil obtenerlos de los pescadores sinoque a menudo durante la captura se golpean y seraspan, ademas de no estar acostumbrados a sermanipulados. A pesar de esas dificultades, se hatenido éxito en la inducciOn del desove medianteuna combinaciOn de Synahorin e hipófisis de lisamadura secada con acetona. Cualquiera de losdos componentes utilizado solo, Se encontróineficaz. La mejor dosis total se determinO en 2,5a 6 hipOfisis combinadas con 10-60 unidadesrabbit administrada por via intramuscular en dosinyecciones aproximadamente iguales, aplicadascon 24 horas de diferencia. Se dice que la adiciónde vitamina E, 0-300 mg ha aumentado el por-centaje de hembras que responden: el 71,4% delas hembras tratadas, ovularon con éxito. Liaoreconoce los inconvenientes de calcular la dosispor el numero de hipOfisis enteras y sugiere quelos resultados podri an mejorar calculando la dosisen base al peso/peso. Los intentos de fecundaciónnatural fracasaron y fué preciso desovar a lashembras y extraer el semen a los machos. Seutilizaron con igual èxito los métodos de fecunda-ción "seco" y "hOmedo". La hipofisaciOn de losmachos se encontrO innecesaria y en efecto, estees un aspecto comUn a todos los informes publi-cados sobre el desove de la lisa en cautiverio.
En la India, se ha empleado con cierto éxito unatécnica semejante para el Mugil macrolepis (Se-bastian y Nair 1975). También se usaron repro-ductores salvajes y se inyectO a las hembras conun total de siete hipOfisis de lisa madura adminis-tradas en dos dosis con 6 horas de diferencia. Nose practicO biopsia ovárica y la fecundaciónnatural resultó ineficaz. Se ha informado que elcuarenta por ciento de las hembras inyectadasovularon eficazmente. Cabe mencionar que lasdosis de material pituitario usadas en este estudiofueron muy altas; sin embargo, es significativo elhecho de que fueron efectivas sin sinergistas demamiferos tales como Synahorin y GCH.
La cria de lisa en gran escala es dificil de lograrcuando la provisiOn de machos y hembras madurosdepende de fuentes naturales. Son pues impor-tantes los estudios realizados en el InstitutoOceánico de Hawai, ya que los reproductoresprovinieron de cardümenes criados en estanque,desovando naturalmente en tanques de reproduc-
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ciOn, por lo cual no fue necesario el desoveartificial (Kuo et al. 1974).
La introducción de un método seguro y con-fiable de biopsia ovarica elminô un segundoobstáculo para el éxito (Kuo et al. 1974) (capitulo5). La inducciOn era más segura cuando eldiámetro promedio de los oocitos era mayor de0,6 mm, siendo el ideal 0,65 mm. Los mejoresresultados se han obtenido con gonadotropina desalmOn parcialmente purificada, SG-G100 admi-nistrada por via intramuscular en dos inyecciones:una dosis inicial con la tercera parte del total y 48horas después los otros dos tercios. La relaciOnentre la dosis de gonadotropina necesaria parainducir el desove y el diámetro inicial del huevodel receptor aparecen indicados en la Figura 8; Iacantidad de hormona que se debe inyectar puedecalcularse directamente en este grãfico. En casosen que el tamaño promedio del huevo sea inferiora 0,6 mm, el desove todavia se puede inducirmediante una inyecciOn diana de SG-G100 au-mentando la dosis de 0,l2-3,4Lg/g de pesocorporal. Dicho procedimiento se efectUa durante6 a 8 dias seguido por Ia hipofisaciOn.
Debido al alto costo de la SG-G 100, el métodoresulta inadecuado para muchas zonas en desa-rrollo. La gonadotropiiia coriOnica humana (GCH)es más econOmica y más fácil de obtener; Kuo ysus colegas (1 973b), en estudios preliminares handemostrado que esta hormona puede emplearsesola para inducir la ovulaciOn del Mugil cephalus.Se encontrO que el mejor procedimiento era
20 cm
Entradadeagua
Fig. 7. Incubadora para huevos de carpa.
-1 iiT
Red de mlón deoriflciospequeños
Saida opcionapara larvas,conduce alvertedero
- embudo(metálico 0pldstico)
dsposilivo deriego (opcional)
Jncubadora sencilla deflujo ascendente utilizada para los huevos de carpa en Tailandia.(Fob W.H.L. Allsopp).
inyectar una dosis preliminar de aproximada-mente 20 UI de GCH/g de peso corporal cuandoel diámetro promedio de oocitos Ilegara a 0,6 mm,seguida 24 horas después por una segunda dosisde aproximadamente 40 UI/g. El porcentaje defertilidad variO del 45 al 98%.
La mayor parte de Ia investigaciOn sobre lainducciOn de Ia ovulaciOn en Ia lisa se ha centrado
31
en el comienzo del desove durante el pico de IaestaciOn natural de cria. En un intento por prolon-gar Ia estaciOn de crIa del M. cephalus cautivo,Kuo y Nash (1975) indujeron con éxito Ia madura-ciOn ovárica fuera de Ia estaciOn, por medio delcontrol del fotoperiodo y de Ia temperatura. Encon-traron que Ia iniciaciOn de Ia vitelogénesis, quenormalmente ocurre después de un periodo de 235
Especie (Pals)
Pangasius sutchi(Tailandia)
Epocadel
MoJun10-Sept.
Edaddel
Reprod.(a)
Cuadro 2. Reproducción Inducida - Técnicas para el Bagre.
Ndmerode
Hembras
Temp.del Agua
(SC)
28-32
dias posterior al desove, podIa inducirse hasta en56 dias, bajo un fotoperiodo constante de 6 horasluz/ 18 oscuridad, a una temperatura de 21 °C. Lospeces "acelerados" podi an luego desovar previainyecciOn de SG-G100. Esto sugiere que la lisagris puede, bajo condiciones controladas, desovarmas de una vez al ano lo cual representa un pasoimportante en el uso de estimulos ambientales parainducir la maduración gonadal.
CRiA DE LAS LARVAS
Aunque hoy en dia es posible controlar laovulación y el desove de varias especies de lisa,todavia persisten algunos obstáculos graves en el
EvaluaciOndel estadogonadal Sustancia (via) Disolventa
H: vientre Hipófisis de Aguadistendido; bagre frescas o destiladaporo preservadasrosadusco; (IM)huevossueltos,brillantes yamarillos.M: aparicionde espermabajo presion.
32
Inyeccidn
Dosis
Imprecisa; Ia segunda dosis deIa hembra es 1,5-3 vecesmayor que Ia primera; elmacho recibe ¼ de Ia dosisfemenina al tiempo con Iasegunda dosis de Ia henibra.
camino hacia la cria de larvas en gran escala.Mientras que la proporciOn de incubaciôn puedeser alta, la sobrevivencia en los primeros 42 dias dedesarrollo se ha citado, en la mayona de losestudios, inferior al 5%, siendo el 20% la mayorcifra presentada (Liao 1975). La mortalidad engeneral se relaciona con cambios en el pesoespecifico de las larvas, que pasan por dos grandesdescensos en la columna de agua: el primero a los2,5 dias y el segundo a los 8 dias después de laeclosión (Kuo et al. 1973a). La mortalidad esgeneralmente mayor después del segundo descensoy es a menudo total. Nash y Kuo (1975) hananalizado los problemas relacionados con la cria dela lisa y sugieren que el contenido de agua dulce en
Pangasiuspangasius(Tailandia)
Agosto 5-6 2 27-31 - Hipófisis deC/ariasbatrachus (IM)
NaCI0,8%
H: 3 inyecciones con 2,6y 12hipdfisis.M: 2 pituitarias al tiempo conIa primera inyeccion de Iahembra.
C/arias j'uscus(Taiwan)
1,5-2 - 26-29 H: vientreblando,distendido;poro genitalrojo,distendido.
HipOfisis deCyprinusca?piomezcladas conSynahorin
NaCI0,7%;KCI0,03%;CaCh0,026%;NaHCO0,003%;
H: 1 hipofisis dcl donante 2-3veces el peso corporal delreceptor, mezclada con 20unidades "rabbit" deSynahorin, administrada en 2inyecciones.
C/ariasmacro cep ha/us(Fiipinas)
Mayo-Sept.
1 153 H: vientredistendido;poro genitalrojo.M: papilagenitalprominente,blancuzca.
GCH (IM) H: inyección ünica:400-500 UIM: 150-250 UI.
C/ariasbatrachus (India)
- - 7 27-31 Hipófisis decarpa de Ia India
- 80-90 mg/kg; no se da otrainformaciOn.
(Cuadro 2. fin)
8-12 Desoveartificial; enseco
6 4 Desoveartificial; enseco
Desovenatural enpequenosarrozales(3,5 X 3 m;15-20cm deprofundidad)
Los huevosfecundados Seesparcen sobremalezas entre un'hapa'.
No se dan resultados
Los huevos Ovulación con 100% defecundados se fecundidadponen en ramasacuãticas dentro dehapas'.
el alimento de las larvas puede contribuir en granmedida al fenómeno de la mortalidad por hundi-miento, a! afectarse su peso especIfico. La influen-cia de Ia temperatura, salinidad y theta también esimportante, Nash etal. (1973) dan procedimientosdetallados sobre la cria de larvas de lisa gris; sontambién interesantes los métodos utilizados actual-mente en la UniOn Soviética (AnOnimo 1976) y enla India (Sebastian y Nair 1975).
SABAL0
El sábalo Chanos chanos es una especie euroha-lina cultivada extensamente en los lagos salobres
Respuesta cercana al También son eficaces las hipOfisis Anónimo (1 977c)100% del bagre marino Tachysurus.
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Puede cateterizarse alas hembras Potaros y Sitasitpsra determinar el grado de (1976)madurez de los huevos. Lainyeccion de GCH para lashembras aumenta el ntimero derespuestas; F' inyecciOn100-250 UI agregadas alextracto pituitario; 2 inyección300-700 UI.
Boonbrahm et al.(1968)
Pars Ia biopsia ovaries se pueden Carreon et al. (1976)cateterizar las hembras con goteromedico. Se puede obtener un 75%de desove usando extractopituitario de bagre pero es máscostoso que Ia GCH.
costeros y en corrales en lagunas de agua dulce enIndonesia, Filipinas y Taiwan. Abunda en toda laregion Indo-Pacifica y en varios otros palses estântratando de cultivarlo para el consumo humano ypara carnada en la pesca del atUn. Los problemasde la reproducciOn inducida son en muchos aspectossimilares a los de la cria de la lisa y, en efecto, lasinvestigaciones mas recientes sobre el desove delsábalo las han efectuado grupos que anterior-mente estudiaron la reproducciOn de la lisa.Cientificos de institutos de investigaciones ma-rinas en Taiwan y Hawaijunto con investigadoresdel Centro de Desarrollo Pesquero del SudesteAsiático en Filipinas, han dado los primerospasos hacia la producciOn de crias bajo condi-
Demorade Ia Método de Método de
(h) ovulación fecundacion incubacion Resultados Comentarios Referencias
8-10 18-24 H: desovadas Malla de nilón 80-90% de super- Los machos pequenos yjOvenes Chen (1976)M: extracción en estanque de cria. vivencia de los alevinos recibieron una inyecciOn con lade testiculos y a los 40 dias despuês de mitad de Ia dosis para las hembras,mezcla de Ia Ia incubaciOn en el momento de Ia segundamateria con los inyeccidn de las hembras.huevos
Desove 58% de respuestanatural promedio de desove,
usando GCH.Cria 68%
ciones controladas. Es preciso senalar que eltrabajo en este campo apenas esta comenzado yque los informes son en general de carácterpreliminar.
Los experimentos de reproducciOn con sábalosrecién capturados presentan muchos de los proble-mas encontrados con la lisa salvaje. General-mente no toleran bien Ia tension del manipuleo,aunque Vanstone et a!, (1976a) ha dado parte detécnicas de captura, transporte y domesticaciOnque han demostrado ser efectivas para reducir lamortalidad. Mas importante aun es el hecho deque entre los sábalos maduros capturados en elmar, la gran mayorIa ya estai agotados y porconsiguiente resultan inütiles para los experi-mentos de reproducciOn. Asi pues, es esencialmantener en cautiverio a los sábalos desovadoshasta que maduren de nuevo, o criarlos encautiverio desde pequenos. Esto Ultimo no esfácil; en Indonesia, por ejemplo, los sábaloscriados en grandes lagos de agua salobre a los 8años de edad no habian alcanzado la madurezsexual (Alikunhi 1976). Trabajadores indonesiosy filipinos han iniciado programas de cria de pecesde 2 años de edad en grandes lagos de marea yrecintos flotantes, empleando dietas controladaspara tratar de superar dicha obstinación. Lasrepresas costeras pobladas de sábalos de un añode edad tambien se han considerado como fuentede reproductores. No obstante, Liao y Chang(1976) presentaron evidencia de la maduraciOnsexual del sábalo cautivo, al desarrollar criasrecogidas naturalmente en tanques de concreto alaire libre. Varios machos produjeron esperma a laedad de 5 anos (en Taiwan el periodo normal demaduracion sexual es de 4 a 5 anos) y a solo unahembra de 6 años se le encontraron oocitos en lavesicula vitelina. Los autores sugieren que unosmeses más podrIan ser suficientes para lograr eldiámetro critico de los huevos, con el cual sepuede intentar la inducción de Ia ovulaciOn. Nashy Kuo (1976) han fijado el limite en 0,7 a 0,8 mmy dan igualmente informaciOn sobre la reproduc-ciOn de peces cautivos.
Aunque solo se ha tenido éxito con el desoveartificial de algunos pocos sábalos, los resultadosson alentadores y sugieren que en un futurocercano se podrá controlar Ia reproducción.Nash y Kuo (1976) y Vanstone et al. (1976b)dieron parte de la ovulación en hembras cautivasinyectadas con gonadotropina de salmOn parcial-mente purificada (SG-G 100); no se llevO a cabola fecundaciOn en esos experimentos preliminares.Los resultados mas significativos, hasta la fecha,provienen de investigadores del Centro de Desa-rrollo Pesquero del Sudeste Asiático en Filipinas,quienes lograron inducir la ovulaciOn en dos
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sábalos hembras maduras recién capturadas, pormedio de la inyecciOn de una mezcla de hipOfisisde salmOn pulverizada en acetona, con gonado-tropina coriOnica humana (GCH). Los huevos sefecundaron con esperma obtenida quirurgicamentede machos desovados por vias naturales, quecontuvieran vestigios de liquido espermãtico viabley se incubaron en un tanque de hule de 4 m dediámetro, Ileno de agua de mar gaseosa filtrada,con una profundidad de 1 m. Treinta y dos larvasllegaron a la edad de 74 dias con una dieta deChiorella, Brachionus inmaduros, zooplanctOnsilvestre variado y diatomeas cultivadas variadas,después de lo cual se transladaron a tanques másgrandes con floraciones de algas naturales y unsuplemento alimenticio de pez picado (Vanstorieet al. 1977). Al fin del año 1979, los 32 pecesseguian vivos (comunicaciOn personal de W.E.Vanstone). Tanto Ia GCH como el polvo pitui-tario son relativamente econOmicos y es intere-sante saber que Ia ovulacion puede inducirse sinnecesidad de utilizar el costoso SG-G100.
BAGRE
El bagre es un pez comestible de alta calidad,con bastante tolerancia al agrupamiento y a lascondiciones ambientales adversas y los miembrosde los géneros Pangasius y Clarias están asu-miendo gran importancia en las actividades deacuocultura en el Sudeste Asiático y en Ia India.Los miembros de la familia Clariidae son especial-mente resistentes, ya que poseen un Organoaccesorio para respirar aire, que les permitesobrevivir en aguas con poco contenido de oxigeno.Los Clarias batrachus y Clarias macrocephalusse han cultivado extensamente en Tailandia, endonde la disponibilidad de alimentos econOmicosen forma de peces de desecho provenientes de laindustria de pesca costanera, ha estimulado dra-máticamente Ia producciOn en los ültimos diezaños.
De las especies de bagre cultivadas en cual-quier nUmero en el Sudeste Asiático yen la India,solamente el C. batrachus desova en cautiverio yen los ültimos años se han visto nacer esfuerzostendientes a desarrollar técnicas de inducciOn deldesove. Sin embargo, la literatura sobre ese temano es extensa; el comentario critico hecho ante-riormente a propOsito de Ia literatura sobre eldesove inducido en la carpa, es también aplicablea! bagre. El Cuadro 2 presenta evidencia de Ianaturaleza incompleta de muchos infornies. Lasnotas aclaratorias sobre Ia reproducciOn inducidade la carpa son en general aplicables. Empero,hay que mencionar brevemente las diferencias
relativas a! control ambiental de Ia reproducción ya las técnicas de incubaciOn.
CONTROL AMBIENTAL DE LAREPRODUCCION
El desove de las variedades asiáticas del bagrees estacional, al igual que el de otros peces criadosen lagos; los intentos de inducir la ovulaciOnmediante Ia inyecciOn hormonal generalmente seefectUan entre mayo y octubre. Ya hemos dichoque con frecuencia ha sido posible hacer desovara la carpa más de una vez en la misma estaciOn yaunque no hay informes semejantes para el bagrede cultivo, Ia investigaciOn reciente del bagreindio Heteropneustes fossilis sugiere enfática-mente que esto es posible. Sundararaj y Vasal(1976) demostraron que el bagre hembra puedequedar prenada dos meses antes de lo natural,después de un fotoperiodo largo (14 horas/dia) auna temperatura de 25 °C durante 6 semanas yque se le puede inducir satisfactoriamente eldesove administrando hormona luteinizante ovina.Mas aun, la exposición continuada de las hem-bras agotadas al mismo regimen del fotoperlodo,incita la reiniciaciôn de Ia vitelogénesis en 30dias, induciendo asI artificialmente un nuevodesove. El proceso se ha repetido con éxito hastacuatro veces en el periodo comprendido entreabril y julio del mismo año, dando asi cuatrocosechas de huevos en un periodo en que normal-mente dan una. Estos hallazgos en el campo delcultivo del bagre son de gran importancia y esprobable que cone! perfeccionamiento adecuado,Ia técnica pueda aplicarse a otras especies culti-vadas. Falta investigar si Ufl manejo ambientalsimilar puede efectuarse bajo condiciones decampo.
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INCUBACION DE HUEVOSFECUNDADOS
Por lo general la fecundación de los huevos debagre se efectüa por desove natural, aunqueocasionalmente se practica la extracción y Iamezcla en seco. Tal como se anotO en el caso de lacarpa, el mayor porcentaje de eclosiOn se obtienecuando se recogen los huevos fecundados y seincuban en condiciones controladas; aun asi, losmétodos utilizados actualmente para el cultivo delbagre en Asia son poco sofisticados. Los huevosde bagre son pequenos y adhesivos y puedenextenderse sobre soportes de nilón sumergidos enpequenos lagos estancados, provistos de aireaciôn(Chen 1976); con más frecuencia se dejan adherira juncos acuáticos o fibras de palma y esos"transportadores de huevos" se encierran luegopara que floten dentro de un 'hapa' de incubaciOn(Potaros y Sitasit 1976; Boonbrahm et al. 1968).En los Estados Unidos se han disenado sistemasperfeccionados con bateas de incubaciOn suspen-didas en agua corriente para el cultivo del bagre agran escala en el sur de dicho pals (Bardach et al.1972) y es posible que el porcentaje de alevinosen Asia aumente considerablemente al adoptartécnicas similares.
5. MET0DOS DE BIOPSIAOVARICA
La cantidad de hormona requerida para provo-carla ovulaciOn, van a directamente con el estadode madurez de los oocitos y es probable que cifracaso de muchos intentos de hipofisaciOn radi-que en Ia evaluación inadecuada del desarrollo delos huevos. Ya se ha senalado que caracteristicasexternas como "vientre hinchado" y "cloacarosaduzca" son indicadores relativos e inexactosdel desarrollo ovárico y deben reemplazarse a lamayor brevedad por métodos mas precisos. Unbuen método Se basaria en los siguientes criterios:rápido y técnicamente sencillo de aplicar, sinrequerir equipos muy sofisticados y con un pro-cedimiento lo menos traumatizante para ci pez afin de podenlo repetir cuantas veces sea necesario.
En la actualidad, ci enfoque más promisonioparece ser Ia extracción y examen de los huevos.La extracciôn generalmente Se efectüa medianteel proceso de cateterizaciOn, introduciendo hastaci ovanio un tubo de plástico fmno (ci diámetrovaria segUn el tamaño de los huevos) a través delporo genital, para extraer por succión una pequenamuestra de los huevos. Dicho método funcionacon Ia carpa, la lisa y el bagre, teniendo cuidadode evitar el manipuleo brusco del pez, que podrIaocasionarie atresia. (Chen et al. 1969). En estesentido, debe investigarse el uso de anestesia.Bienarz y sus colegas (1977) informaron reciente-mente sobre un método de punción abdominal queha demostrado sen seguro para el continuo mues-treo en la carpa comun Cyprinus carpio. En estatécnica, se utiliza una aguja de 2,5 mmdc diámetropara perforar la pared abdominal 2 cm arriba de iaaleta ventral y Sc extraen muestras de una profun-didad de 2 a 3 cm.
El color, apariencia histolOgica y tamafto, es loque da Ia información sobre el estado de madurezde los huevos. El color se emplea comünmente
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como cniterio de madurez en la carpa; aun asi, lainterpretaciOn es claramente subjetiva y los in-formes publicados son a menudo contradictorios.Sc puede obtener mas información con el exámenhistolOgico de los oocitos: se ha descrito Iaapariencia microscOpica de los huevos en diver-sas etapas de desarrollo en la carpa (Chen et al.1969) (Bienarz etal. 1977) yen Ia lisa (Kuo etal.1974). Sin embargo, los procedimientos histolO-gicos son iargos y requieren interpretaciOn subje-tiva de los resultados de manera que es posibleque el método de biopsia más rápido y confiablese base Unicamente en el tamaño de los oocitos.
Shehadeh et al. (1973b) determinaron unabiopsia basada en el principio del diámetro mediodcl oocito, aplicable ala lisaMugil cephalus. Seextraen por succiOn varios oocitos de una hembrano anestesiada, mediante una cánu!a de polieti-leno insertada en el oviducto hasta 6 a 7 cm. dedistancia del poro genital. Los huevos se lavan, sefijan en una soluciOn de formalina all % en NaCla! 0,6% y se colocan sobre una placa de Plexiglaspara medirlos con un micrOmetro ocular. La dosishormonal eficaz es inversamente pnoporcional aldiámetro medio del huevo y los mejores resul-tados se obtienen cuando ci diámetro es mayor de0,65 mm. El cu!tivador puede calcular la dosissencillamente haciendo la interpolaciOn en ungráfico que relacione el diámetro medio dcl huevoy la dosis eficaz (Figura 8). El método es preciSo,rápido y si se efectüa cuidadosamente, es seguropara !a repeticiOn del muestreo. Se puede adaptar
0
a00
C0
0)
ao 250 Y 6629-7453X00)
20 0
00
1
0
10
600 650 700
Diámetro media inicial del huevo (t)
Fig. 8. RelaciOn entre el did metro medio inicial delhuevo de Ia lisa hembra receptora y Ia cantidad degonadotropina necesariapara inducir el desove. Segdn
Kuo et al. (1974).
con éxito a otras especies de peces, bajo lassiguientes condiciones:
Que la anatomia del tracto genital de la hembrasea tal, que el paso de la cánula pueda predecirse.En Ia lisa, la carpa y el bagre parece que no hayproblema en este sentido, pues el ovario y ovi-ducto son continuos y un tubo introducido por elporo genital invariablemente pasará a la masaovárica. En el sábalo, por el contrario, los huevosmaduros pasan ala cavidad periotoneal y de ahi aun embudo recolector que los conduce al porogenital; en ese caso, el ovario y oviducto no soncontinuos y la cánula introducida por el porogenital podria perforar los ôrganos internos. Porlo tanto, la tëcnica puede resultar inadecuadapara dicha especie (Nash y Kuo 1976).
Que los oocitos se desarrollen al mismo tiempo;es decir, no debe haber gran diferencia en elestado de madurez de la muestra de oocitostomada de diferentes regiones del ovario. Elmétodo no será confiable silos huevos extraidosde la porción anterior del ovario son definitiva-mente más maduros que los extraidos del seg-mento posterior, pues no siempre se logra la
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colocaciOn exacta de la cánula. El desarrollosincronizado se ha demostrado en la lisa (Shehadehet al. 1973b) y deben efectuarse estudios paradeterminar cuál es el caso de otras especies depeces cultivados.
Que el diámetro de los oocitos se conozca entodas las etapas de maduraciOn, de forma que sepueda recopilar un "atlas" del desarrollo de loshuevos para cada especie. Ya se cuenta con estáinformaciOn para la lisa y actualmente se estárecopilando para el sábalo (Nash y Kuo 1976); espreciso realizar estudios similares para la carpa yel bagre, a fin de determinar si el diámetro mediopuede emplearse como indicador de Ia madurezde los oocitos.
6. PRESERVACION DEGAMETOS
Es deseable la preservaciOn de los gametosviables de peces cultivados, a fin de compensarcualquier deficiencia de disponibilidad, de permi-tir la reproducciOn, aunque la maduración de losmachos y de las hembras no coincida, y deestablecer una reserva de material genético decalidad comprobada, para la iniciaciOn de pro-gramas de reproducción selectiva. Estos objetivosse logran generalmente por medio del almacena-miento de esperma, aspecto que ha recibido lamayor atención. No es probable que el almacena-miento de huevos asuma mucha importancia,salvo en ocasiones en que se vayan a conservargametos de una composición genética deseablecomo medio de ampliar la base de reproducción.Los trabajos en este campo están todavia en laetapa experimental y solo los mencionaremosbrevemente.
En los grupos de peces considerados en lapresente reseña, los huevos y los espermatozoidesson expulsados simultáneamente al agua circun-dante y el comportamiento reproductor adecuadoasegura el momento y la posicion correcta delmacho y de la hembra para que se lleve a caboinmediatamente la mezcla y la fecundaciOn. Laesperma se define como Ia suspension de esper-matozoides individuales en el lIquido espermáticoo seminal, resultante de la hidrataciOn de lostesticulos. Es importante senalar que los esper-matozoides no tienen motilidad hasta que noentran en contacto con el agua. El proceso deadquisiciOn de la motilidad se denomina activa-ciOn y ocurre en el instante en que la esperma esliberada al agua circundante. El agua, en estecontexto, se refiere al medio en el cual normal-mente ocurre la fecundación y puede ser dulce,salobre o salada, segUn la especie. Todavia no Sehan identificado los estimulos responsables de la
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actividad espermática en la mayorIa de las espe-cies de peces cultivados; el pH, la presiOn osmOticay el contenido iOnico del medio pueden serimportantes (Hines y Yashouv 1971).
La motilidad de los espermatozoides una vezactivados es variable. Dura mucho más en losespermatozoides de peces que desovan en aguasalobre y salada que en los que desovan en aguadulce; un caso extremo es el del arenque delPacIfico Clupea harengus, cuyos espermatozoidespueden conservar su motilidad hasta 4 o 5 dias(Yanagimachi 1957). Por el contrario, los esper-matozoides de peces que desovan en agua dulceconservan la motilidad durante no mas de 2 a 3minutos. La duraciOn del movimiento enérgico enla carpa comun Gyp rinus carpio por ejemplo, esde 30 a 60 segundos y la motilidad detectabledesaparece después de 5 minutos (Ginzburg1972). Aunque la motilidad no es en si unagarantia absoluta de fertilidad, los espermatozoidesque han perdido la motilidad ya no están encapacidad de fecundar. Asi pues, como reglageneral es esencial evitar que la esperma alma-cenada entre en contacto con el agua, hastajustoantes de mezclarla con los huevos.
PRESERVACION DE LA ESPERMA
La esperma puede preservarse por corto o largotiempo, por motivos de conveniencia: el esperma-tismo puede inducirse antes de Ia ovulaciOn, demanera que la esperma esté a mano cuando sedesove a Ia hembra, reduciendo a un solo pez lamanipulaciOn para la fecundaciOn. Es un proce-dimiento relativamente sencillo, que incluye laconservaciOn del semen fresco en hielo o en unrefrigerador, a temperaturas entre 0 y 100 C. ElperIodo de almacenamiento puede variar desdeunas cuantas horas hasta 5 dias. El almacena-miento a largo plazo (criopreservaciOn) se lleva acabo a temperaturas muy inferiores (entre 20 y196 °C) y deberia mantener esperma viabledurante varios altos. La mayor parte de las técnicasde criopreservaciOn en Ia actualidad incluyen elenfriamiento rápido y el almacenamiento en CO2sOlido o en nitrOgeno liquido (N2 liq.) como partedel procedimiento. Los resultados recientes de laesperma de salmOn secada al vaclo son alenta-dores pero todavia preliminares (Zell 1978).
Aunque se ha investigado mucho el aspecto dela preservaciOn de La esperma de salmOnidos (verWiltzius 1973; Horton y Ott 1976), comparativa-mente se ha prestado poca atenciOn a las especiestropicales y sub-tropicales. Los pocos estudiossobre la preservaciOn de la esperma de carpa sonpreliminares y hasta la fecha solamente se han
Crio-Pez (Referencia) Diluyente protector RelaciOn Equilibrio Congelacion
Cyprinus carpio Solución DMSO(Moczarski 1977) de 10%
Alsevera
Cyprinus ca,pio(Stein y Bayrle1978)
Cyprinus carpio(Pavlovici yVIad 1976)
Arislichthys nobilis Mezclad Combina-(Sin 1974) don:
DMSO7,4% yglicerina9,3%
Cyprinus carpio,Aristichthys nobiis,Ctenopharyngodonidellus(AnOnimo 1974)
Mugil cephalus(Pruginin yCirlin 1976)
Mezclab DMSO 1:3 0 seg. Gránulos de En N2 liq. 196'C; 3granulos/lOnil Altamotilidad;no10% 0,2 ml sobre 7 dias NaHCO3 1 %; hubo fecundaciOn
CO2 sOlido agitando.
Mezclac DMSO 1:3 60-180 Ampolletas en En N1 Iiq. 196 'C; Babo de agua a 11% de5% mm. vapores de 24 h 21 'C; 1-2 mm. fecundacion
0-2 'C N2 liq. no seespecifica Iavelocidad.
Etilenoglicol
Cyprinus carpio, Mezcla1 DMSOLabeo rohita, 10%Puntiusgonionotus(F.C. Withier,sin pub)
51% agua Glicerol 1:1demar; 15%34% aguadestil.
Mugil cephalus Ringers DMSO(Chaoetal. 1975) de 10%
teleOsteomarino
Cuadro 3. CriopreservaciOn de Ia Esperma de Carpa y Lisa.
1:1/ 5 seg.
1:2
l:9e - CO2/acetona; CO2; 79 'C; Bano de agua 2,7-5,7% deno se controlO 30-60 mm. a 6-10 'C fecundaciOnIa velocidad.
publicado dos informes sobre Ia criopreservaciOnde Ia esperma de lisa. Como resultado de esaescasez de información, la siguiente exposiciOn esde carácter general y trata de presentar ciertos
Se En N2 liq. 196 'Cmantuvieron sin especificar Ialas ampolletas duraciOn.3-5 cmpor encima deN2 liq. hastecongelarlas.
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Alniacenamiento Descongelacion Resultado
Babo de agua a Se obtuvo 12%30 'C de alevinos;
fecundaciOn del47%
En N2 Iiq. 196 'C;I año
1:4 0 seg. Semantuviemn En N2 liq. 196'C; flano de agus alas ampolletas 24 h 25-30 'C2cm porencima de Iasuperificie deN2 liq.5-10 mm.
1:1 h Los pitilos de En N2 liq. 196 'C; Bano de agua0,5 nil. se 1 ann a "temperaturamsntienen en del ambiente"vapordeN2liq. por4-5 mm.durante 4 mm.
Seprodujo 1/10de larvas conrelaciOn a loscontroles.
C. ca?pio yP. gonionotus:5-20% motilidad;L. rohita:58% de super-vivencis haste Iaprimers etapa dealevino.
Gránulos de En Ns liq. 196 'C; - "Alguna"CO2; 1 mm. 2-4 meses motilidad;
ningunafecundaciOn
2,7% defecundscion;31,85% de cria
5Solucion Alsever (Hodgins y Ridgeway 1964: citrato de sodio (CH2Na3O,), 0,8 %; dextrosa, 2,05 %; NaCl, 0,4%.
bNaCl, 750 mg; NaHCO2, 200 mg; Na2HPO4, 53mg; MgSO47H1O, 23mg; KCI, 38mg; C5Cl22H2O, 46mg; glucosa, 100mg;glicina 500 mg; yema de huevo 20 ml; H1O, 100 ml.
cKCl, 0,75 %; lecitina, 10%; HiO hasta 100 ml.
dNaCl, 0.6%; KCI, 0,038%; CaC122H2O, 0,023%; NaHCO3, 0,1 %; NaHPO4H2O, 0,041 %; MgSO4'7H2O, 0,023%.
5Aumento mucho Is motilidad con una dilucion de 1:3 pero ne se dispuso de esperma en esta diluciOn pars las pruebas de fertilidad.
NsCl, 730 mg; NaHCO2, 500 mg; fructoss 500 mg; lecitina 750 mg; manitol 500 mg; H20, 100 ml.
gsolucion de Ringer de teleOsteo marino (Burton, 1975): NaCI, 231 mM; KCI, 8 mM; CaCl2, 2,2 mM; MgCl2, 3,7 mM.
hCuando se agrego como crioprotector 10% de glicerina, se obtuvieron los resultados siguientes: 2,47% de fecundaciOn, 5 2,5% de dna.
principios que aunque han sido establecidos prin-cipalmente para los salmónidos, es probable quese puedan adaptar a otros peces. El Cuadro 3presenta detalles de técnicas que han probado ser
al menos parcialmente satisfactorias para la carpay la lisa (no hay ninguna para ci sábalo ye! bagre);la gran variaciOn en ci procedimiento es testi-monio del incipiente desarroilo en este campo.Cabe señaiar que la criopreservaciOn de la esper-ma se efectüa de manera rutinaria en los centrosde inseminación artificial para ganado, en dondegeneralmente Se puede adquirir ci nitrógeno lIquido.Es por eiio que debe fomentarse la vincuiaciOnentre los criadores de peces y de ganado.
CRIOPRESERVACION DE LA ESPERMA
Recolección de la esperma: Los cultivadoresdeben a toda costa evitar la activación de losespermatozoides, por lo cual es esencial mantenerescrupulosamente secos ci poro genital y cirecipiente de vidrio para recoger la esperma. Paraello, es ventajoso anestesiar a! donante y suspen-der la alimentaciOn un dia antes para asegurar quesus vias digestivas estén vacias.
Con frecuencia es necesario, en especial bajocondiciones de campo, aimacenar la espermarecién recogida durante varias horas antes deilevar a cabo la diiuciOn y la congelaciOn. Laexperiencia con la preservación a corto plazosugiere que esto debe efectuarse sobre hielo y quelos frascos deben ser suficientemente grandescomo para permitir un intercambio gaseoso ade-cuado. Horton y Ott (1976) sugieren una rela-ción de 1:10 de semen/espacio de aire, si losfrascos cstán sellados.
Preparación y adiciOn del diluyente: Un diiu-yente apropiado debe mantencr vivos pero inactivosa los espermatozoides antes de la congelaciOn:debe ser isotOnico con ci semen y amortiguadopara contrarrestar Ia acidez o alcalinidad dciagente crioprotector (comunicaciôn personal deF.C. Withier). Se han probado innumerablesvariantes, en su mayoria basadas en ia soiuciónsauna fisiologica para teieósteos marinos o deagua duice, con o sin adición de diversos "nutrien-tes" y "estabilizadores" (v.g. fructosa, manitol,yema de huevo, lecitina, glicina). Horton y Ott(1976) recomiendan que ci nUmero de consti-tuyentes sea ci minimo y que Ia concentración decada uno esté determinada experimentaimente enbase a in motilidad observada en los espermato-zoides. Este sencillo concepto parece ser ciapropiado, Dc los intentos de criopreservar laesperma de la lisa y de la carpa, sintetizados en ciCuadro 3, ci más exitoso fué aquel en ci que seempieO como diluyente una soiución de Ringer deteleOsteo marino sin modificar (Chao et al. 1975).No obstante, es inevitable un concepto empirico,pues es imposibie predecir Si se lograrán transferirlos diiuyentes de unpez a otro: Ott(1975) senala
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que se requirieron difcrentes diluyentes y con-centraciones de crioprotector para cada especiedc Oncorhynchus; aun asI, algunos diluyentesempleados rutinariamente para congelar cspermade salmOnido han arrojado resuitados prelimi-nares alentadores en Ia carpa comün Cyprinuscarpio y en la carpa de la India Labeo rohita(F.C. Withier sin publicar).
Hay muy poco consenso en cuanto a ia canti-dad de diiuyente que se debe agregar, lo cualtambién debe deterininarse experimentalmente.Esperma satisfactoria: las proporciones de dilu-yente para salmónidos oscilan entre 1:4 y 1:9 (Ott1975; Hortony Ott 1976). Sin embargo, Moczarski(1977) encontrO que la viabilidad de la espermacriopreservada de carpa comUn, era mayor a 1:1 o1:2 que a 1:6, Sin (1974) observO un efectosimilar en la carpa piateada y en la carpa cabe-zona cuya motilidad y viabilidad aumentaronconsiderablemente ai bajar la relación del dilu-yente de 1:9 a 1:3. La criopreservaciOn exitosa dein esperma de lisa se ha logrado con una propor-ción de diiución de 1:1 (Chao et al. 1975).Cuaiquiera que sea in proporción, ci diiuycnte y laesperma deben ser isotérmicos antes dc mezclarlos.
Crioprotector: Los deterioros por congelaciOn ydescongelacion se reducen a! minimo agregandoagcntes como DMSO (sulfôxido dimetilo), eti-leno, glicol o glicerol a! diluycntc, antes demezciarlo con la esperma. El DMSO se reco-mienda para los saimOnidos (Horton y Ott 1976)y es ci que ha producido los mayores éxitos en IacriopreservaciOn para los peces cultivados (Cuadro3). La concentración agregada a! diluyente debeestabiecerse experimentalmcnte; por lo general seusa un 10%. La rapidez con que cl DMSOpenetra en las membranas celulares parece hacerinncccsario cualquier balance entre ia esperma yci diluyente y debe iniciarsc de inmediato lacongclaciOn. Chaoy sus colegas (1975) dejan unperiodo de equilibrio de hasta 1 hora antes decongelar la esperma de lisa, pero no han dadojustificaciOn alguna para ese procedimiento.
Tasa de congelación: La mayorIa de las técnicasde criopreservaciOn incluyen el almacenamientode in esperma congelada en N2 liquido a 196 °C;esto puede haccrsc en alicuotas de 1 ml. enampolletas de vidrio o en pitiilos piasticos de0,5 ml. sellados en los dos extremos. El descensoinicial de la temperatura de in mucstra puedeefectuarse ya sea suspendiendo ci esperma diluidoy protegido, en vapor de N2 iiquido o mediante unprocedimiento menos frecuente, formando gránu-los en CO2 sOlido. La primera técnica permite cicontrol de la tasa de congclacion, congelandoscmás rápidamente los rccipientes más cercanos a
la superficie del lIquido. La congelaciOn duraaproximadamente de 4 a 5 minutos a una distan-cia de 2 cm de la superficie. Con La técnica de losgrãnulos y el CO2 la congelacion es mucho másrápida (Nagase 1964), al verter gotas alicuotas desemen diluido, en orificios en el CO2 sOlidodurante aproximadamente 1 minuto; luego sesacan para almacenarlas en N2 liquido, dentro detubos de ensayo cubiertos. Esta técnica se haempleado para el semen de carpa comUn (Stein yBayrle 1978) y de lisa (Pruginin y Cirlin 1976).Hay diversos conceptos sobre el tiempo Optimorequerido para la congelación de Ia esperma deteleOsteos: el proceso debe ser lo suficientementerápido como para que el choque térmico seamInimo y sin embargo no tan rápido como parapermitir la formaciOn de cristales de hielo intra-celulares (Meryman 1966; Farrant 1972).
Descogelacion y fecundacion: Horton y Ott(1976) recomiendan que la esperma de salmOnidocriopreservada se descongele lo más rãpidamenteposible, agitando la ampolleta dentro de agua a 50o 60°C. Withler y Morley (1968) sin embargo,obtuvieron resultados igualmente buenos conesperma de salmOnido descongelada a 11 y45 °C; el efecto de ese factor no Se ha estudiadosistemáticamente en la carpa ni en Ia lisa y comose ha senalado en el Cuadro 3, se ha ensayado unavariedad de métodos. La esperma congeladamediante la técnica de los gránulos en CO2, debedescongelarse agregando NaHCO3 al 1% (Steiny Bayrle 1978). Ya que la motilidad de losespermatozoides descongelados y activados duraapenas unos segundos, el contenido de la ampolletadebe mezclarse con los huevos frescos tan prontocomo empiece a ablandar.
PRESERVACION DE ESPERMA A CORTOPLAZO
La falta de equipo adecuado impide a veces elalmacenamiento criogénico de Ia esperma. LaconservaciOn a corto plazo es un procedimientomás sencillo y puede ser muy beneficioso para loscultivadores porque la recolecciOn de semenincluso unas pocas horas antes de desovar lahembra, es una forma simple de hacer másefectiva la mezcla de los huevos y la esperma.Además, los piscicultores podrán confirmar lamotilidad en una pequena alicuota antes de utili-zarla yen esta forma tener al menos una idea de Iaviabilidad general de la esperma. Los métodosactuales de almacenamiento a corto plazo estánsin embargo mal definidos y son contradictorios,por lo cual se requieren esfuerzos coherentes deinvestigaciOn tendientes a estandarizar los proce-dimientos.
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Por ejemplo, existe cierta confusion respecto ala diluciOn del semen. El semen de la trucha arcoiris permanece fértil después de almacenarlo a4 °C bajo 02 o aire durante 21 dIas en estado nodiluldo (Stoss et al. 1978) y F.C. Withler (sinpublicar) ha demostrado que el semen no diluldode la carpa comün Cyprinus carpio, del bagrePangasius sutchi, de la carpa de la India Labeorohita y del Puntius gonionotus (tawes) puedeactivarse hasta 24 horas después de la expulsion,si se mantiene frIo enun refrigeradoro sobre hielo.De igual manera, la esperma sin diluir de la lisa grisMugil capito almacenada a 10 °C, podria acti-varse agregándole agua de mar dentro de lassiguientes 36 horas; empero, el nümero de esper-matozoides nadadores es bajo (Hines y Yashouv1971). Se han ensayado diversos diluyentes.Cuando la esperma de lisa se diluyO con soluciOnRinger de teleOsteo marino en proporciOn de 1:1(Burton 1975) y se almacenO a 5 °C, los esper-matozoides conservaron la motilidad durante 23dias y el potencial de fecundaciOn despues de 3 a 6dias de almacenada resultO del 1 al 3% (Chao etal. 1975). Se encontrO que Ia soluciOn de Ringerera superior al agua de mar para efectos deprolongar la motilidad posterior a la activaciOn.J.D. Funk (sin publicar) ha llevado a cabopruebas preliminares de preservaciOn de Ia es-perma dePuntiusgonionotis en Malasia y senalaque el semen diluido 4:1 con soluciOn salina deCortland (Wolf 1963) produjo un 74% de fecun-daciOn después de 5 dias de almacenamiento a 1-5 °C. La esperma de la carpa de la India Labeorohita y de Ia carpa comUn Cyprinus carpiopresentaron motilidad después de 72 horas dealmacenamiento a 0-5° C en un diluyente de 1%de glicerina en soluciOn de Ringer (frog Ringersolution) (Wolf 1963); la eliminaciOn de la gli-cerina tuvo un efecto perjudicial en Ia superviven-cia de los espermatozoides (Bhowmick y Bagchi1971). La esperma deL. rohita, al ser almacenadaen Ringer-glicerina durante 4 horas a 28 °Cmantuvo su fertilidad.
Todavia no se sabe con certeza Si el uso de undiluyente es ventajoso 0 S, por el contrario,representa un paso adicional de valor incierto. LaopiniOn se encuentra dividida en cuanto al uso decrioprotectores que parecen innecesarios a tem-peraturas superiores a 0 °C. Cualquier diluyentedebe mantener a los espermatozoides vivos peroinactivos; por ejemplo, al agregarle agua, Iaesperma de carpa se activa inmediatamente perola activaciOn dura menos de un minuto, por lo cualIa extracciOn de la esperma debe efectuarse encondiciones muy secas. Debido a que todavia nose han identificado los estimulos responsables dela activaciOn de los espermatozoides en la mayorIa
de las especies de los peces cultivados, la compo-siciOn de un diluyente debe determinarse empiri-camente. Una vez determinada, queda el interro-gante sobre el momento más adecuado paramezclarlo con el semen, pues la diluciOn no seefectüa necesariamente antes de la refrigeraciOn.El semen puede diluirse después de almacenado abaja temperatura, incubándolo en el diluyentehasta 1 hora, antes de mezclarlo con los huevosfrescos. Zell (1978) informa que el porcentaje dehuevos fecundados con semen de trucha arco irissin diluir, almacenado por 2 dIas a 0 °C, aumentOde un promedio de 10% a un 78% después de laincubaciOn en soluciOn de Poulik. Funk en sustrabajos con la carpa china (sin publicar) tambiénobservó esa "restauraciOn" de Ia esperma en-vejecida.
Al refrigerar la esperma, debe tenerse en cuentael intercambio gaseoso. Deben ilenarse Unica-mente tres cuartas partes del frasco, dejándolo sinsellar y evitando agitarlo (Stoss et al. 1978).
CRIOPRESERVACION DE LOS HUEVOS
El tamaño y complejidad de los óvulos deteleOsteos convierten la criopreservaciOn en undesaflo técnico mucho mayor que el que presen-tan los espermatozoides; sin embargo, el éxito enla criopreservaciOn de embriones mamiferos sugiereque las dificultades pueden superarse (Whitting-ham et al. 1972; Leibo 1977). Zell (1978) hareportado la criopreservación satisfactoria dehuevos de teleósteo no fecundados y de cigotos.En estudios que incluyeron Ovulos de salmOn delAtlántico, trucha arco iris y trucha de arroyo, loshuevos sin fecundar que fueron congelados durante5 minutos a 20 °C en nitrOgeno liquido, resul-taron fértiles al descongelarse y un elevadoporcentaje de cigotos y huevos fecundados sobre-vivieron tras someterse a temperaturas hasta de50 °C. Se utilizO Ia soluciOn salina de Hankscomo medio de congelaciOn (Wolf 1963); no seagregaron crioprotectores. La eclosiOn de todoslos huevos super-enfriados o congelados a 12 o5 °C fue consistentemente alta; la mayor difi-
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cultad técnica resultO ser el control sobre Ia tasade enfriamiento
CRITERIOS DE EXITO
Segun el Cuadro 3, se deduce que no solo sehan efectuado pocos estudios sobre la criopreser-vaciOn de la esperma de especies icticolas culti-vadas, sino que en los pocos que hay, los criteriosde éxito son, por decir lo menos, dispares. Decirde los espermatozoides que tienen "gran motili-dad" es algo vago pues no se sabe si eso significaque una gran proporciOn de los espermatozoidesobservados presentO alguna forma de motilidad osi se observO un vigor excepcional en célulasespermáticas individuales. La fertilidad es unmejor criterio, aunque también es vago a menosque se especifique el grado de desarrollo alcanzado.La eclosiOn de los huevos representa un eventoambiguo que ocurre lo suficientemente tarde en eldesarrollo como para representar una verdaderaviabilidad de los gametos, pero no tan tarde comopara que un experinlento de criopreservación seconvierta en una experiencia de cria de larvas. Sesugiere adoptar dicho criterio como medida deéxito en futuros estudios.
Muy pocos informes sobre experimentos depreservaciOn de esperma determinan la relaciOnesperma/Ovulo empleada en las pruebas de fertili-dad y sin embargo es un factor de mucha impor-tancia: por ejemplo, la aplicaciOn de 2 ml. deesperma descongelada a media docena de huevos,casi con seguridad producirá un porcentaje defecundaciOn ilusoriamente alto. Por ello sugerimostambién que se informe sobre ci nOmero aproxi-mado de espermatozoides y Ovulos empleados encada experimento de fertilidad.
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