Techniques d’étude et d’analyse des protéines:Techniques d’étude et d’analyse des protéines: 1- introduction1- introduction

Les techniques d’étude et d’analyse d’une protéine Les techniques d’étude et d’analyse d’une protéine nécessite d’abords son nécessite d’abords son extraction et sa purification.extraction et sa purification. Ceci peut donc apparaître comme un problème Ceci peut donc apparaître comme un problème difficile pour 2 raisons :difficile pour 2 raisons : Elle n’existe qu’àElle n’existe qu’à très faible concentrationtrès faible concentration Elle est mélangéeElle est mélangée à des millier d’autres protéinesà des millier d’autres protéines

Malgré cela les protéines peuvent être isolées et ceci Malgré cela les protéines peuvent être isolées et ceci pour 2 raisons:pour 2 raisons: Les méthodes d’isolement couvrent toutes les Les méthodes d’isolement couvrent toutes les

propriétéspropriétés que peuvent avoir les protéines en solution que peuvent avoir les protéines en solution (propriétés différentes due à l’expression de gènes (propriétés différentes due à l’expression de gènes différents)différents)

Le pouvoir de résolution des techniques de séparations Le pouvoir de résolution des techniques de séparations est très élevéest très élevé (exemple focalisation isoélectrique) (exemple focalisation isoélectrique)

2- Méthodes d’extraction et fractionnement 2- Méthodes d’extraction et fractionnement des protéinesdes protéines

L’extractionL’extraction requiert que l'on requiert que l'on brise le matériel brise le matériel biologique en question pour en libérer les biologique en question pour en libérer les substances ou les structures désiréessubstances ou les structures désirées. .

Il s'agit d'une étape initiale à beaucoup de Il s'agit d'une étape initiale à beaucoup de procédures expérimentales en biochimie et qui procédures expérimentales en biochimie et qui s'appelle s'appelle l’homogénéisationl’homogénéisation. Celle-ci est . Celle-ci est obtenue par obtenue par 2 types de traitements:2 types de traitements: LyseLyse:: Lyse osmotique, lyse enzymatique, Lyse osmotique, lyse enzymatique,

Détergents, solvants inorganiquesDétergents, solvants inorganiques Traitements mécaniquesTraitements mécaniques: Broyage, Mixeur, : Broyage, Mixeur,

Homogéniseur, SonicateurHomogéniseur, Sonicateur

2.1-Centrifugation2.1-Centrifugation Après Après Traitements mécaniquesTraitements mécaniques ou lyse on obtiens : ou lyse on obtiens :

homogénéisation

Centrifugation différentielle Centrifugation zonale

un Homogénatun Homogénat

2.2- FILTRATION ET ULTRAFILTRATION2.2- FILTRATION ET ULTRAFILTRATION

La filtration est fréquemment La filtration est fréquemment employée en biochimie pour un grand employée en biochimie pour un grand nombre d'applications : stérilisation, nombre d'applications : stérilisation, isolement de précipité, élimination de isolement de précipité, élimination de sels de solutions, concentration de sels de solutions, concentration de macromoléculesmacromolécules,,

2.3- DIALYSE2.3- DIALYSE Il se produit souvent qu'une préparation de Il se produit souvent qu'une préparation de

macromolécules contienne différents macromolécules contienne différents produits produits dont on veut se débarrasserdont on veut se débarrasser. Ces produits, . Ces produits, sels, glucides, détergentssels, glucides, détergents ou autres petites ou autres petites molécules, étaient présents dans la préparation molécules, étaient présents dans la préparation initiale ou ont été introduits lors d'une étape de initiale ou ont été introduits lors d'une étape de la purification. Une façon simple d'éliminer ces la purification. Une façon simple d'éliminer ces petites molécules est la dialysepetites molécules est la dialyse

La dialyse est La dialyse est basée sur les principes régissant basée sur les principes régissant la diffusion à travers une membranela diffusion à travers une membrane perméable perméable ou semi-perméable. Les ions se déplacent du ou semi-perméable. Les ions se déplacent du milieu le + concentré vers le - concentrémilieu le + concentré vers le - concentré

3- Méthodes de purification et d’analyse des 3- Méthodes de purification et d’analyse des protéinesprotéines

La purificationLa purification d’une protéine se fait en d’une protéine se fait en +sieurs étapes+sieurs étapes en faisant intervenir à en faisant intervenir à chaque étape une des propriétéschaque étape une des propriétés que que peut avoir cette protéine en solutionpeut avoir cette protéine en solution

Lors de ces différentes étapes le Lors de ces différentes étapes le contrôle de l’efficacité de la purificationcontrôle de l’efficacité de la purification s’impose pour réussir un isolement s’impose pour réussir un isolement avec un rendement acceptableavec un rendement acceptable

Propriétés des protéines et Techniques Propriétés des protéines et Techniques de purificationde purification

Propriétés de base

Techniques de séparation

Taille et Densité Centrifugation,

Dialyse,

Filtration et ultrafiltration

Chromatographie d’exclusion

Electrophorèse sur gel de porosité ou

Electrophorèse en SDS-page

Solubilité, polarité

Précipitation par différence de solubilité (PH, µ )

Chromatographie sur papier

Chromatographie d’adsorption

Charge Chromatographie échangeuse d’ion

Electrophorèse

Focalisation isoélectrique

Spécificité Chromatographie d’affinité

Détection des composés séparés:Détection des composés séparés: Détection parDétection par rayonnements radioactifs rayonnements radioactifs si le si le

composé est radioactif.composé est radioactif. Par Par éclairage UV éclairage UV si la structure de la molécule si la structure de la molécule

permet l’absorption en lumière ultraviolette.permet l’absorption en lumière ultraviolette. Par Par pulvérisation d'une substance qui réagit avec le pulvérisation d'une substance qui réagit avec le

composécomposé recherché pour donner une certaine recherché pour donner une certaine couleur. couleur. Exemple: Exemple:

• les acides aminés les acides aminés réagissent avec la ninhydrine pour réagissent avec la ninhydrine pour donner un composé violet foncé. donner un composé violet foncé.

• Les amines secondaires, comme Pro, réagissent Les amines secondaires, comme Pro, réagissent également avec ce composé mais pour donner une également avec ce composé mais pour donner une coloration jaune.coloration jaune.

3-Techniques d’étude et d’analyse des protéines:3-Techniques d’étude et d’analyse des protéines:

3.1-Précipitation par différence de solubilité (pH et µ)3.1-Précipitation par différence de solubilité (pH et µ) 3.2-Chromatographie3.2-Chromatographie

3.2.1-3.2.1-Chromatographie sur papierChromatographie sur papier 3.2.2-3.2.2-Chromatographie d’adsorptionChromatographie d’adsorption 3.2.3-3.2.3-Chromatographie par échange d ’ionsChromatographie par échange d ’ions 3.2.43.2.4-Chromatographie par gel filtration (exclusion de taille)-Chromatographie par gel filtration (exclusion de taille) 3.2.5-3.2.5-Chromatographie par affinitéChromatographie par affinité

3.3-Électrophorèse3.3-Électrophorèse 3.3.1-3.3.1-Électrophorèse sur papierÉlectrophorèse sur papier 3.3.2-Electrophorèse non dénaturante sur gel de porosité ou ou 3.3.3-3.3.3-Électrophorèse en SDS-page :Électrophorèse en SDS-page : 3.3.4-3.3.4-Électrophorèse sur gradient de pH (focalisation isoélectrique Électrophorèse sur gradient de pH (focalisation isoélectrique

ou électrofocalisation) ou électrofocalisation)

3.4-Electrochromatographie3.4-Electrochromatographie (carte peptidique, (carte peptidique, empreinte digital ou finger print)empreinte digital ou finger print)

3.1- Précipitation par différence de solubilité3.1- Précipitation par différence de solubilité

On provoque la On provoque la précipitationprécipitation de la protéine à isoler soit de la protéine à isoler soit par précipitation par précipitation isoélectriqueisoélectrique ou par ou par relargagerelargage

Pour la première, on ajuste le pH d’une solution d’un Pour la première, on ajuste le pH d’une solution d’un mélange protéique au pHi de l’une d’entre elles, ainsi mélange protéique au pHi de l’une d’entre elles, ainsi la totalité de cette protéines précipite laissant en la totalité de cette protéines précipite laissant en solution les autres dont les pHi sont > ou < au pH solution les autres dont les pHi sont > ou < au pH choisi.choisi.

Après centrifugation la totalité de cette protéine se Après centrifugation la totalité de cette protéine se trouve dans le culottrouve dans le culot

Fig. 2

log S

S (mg/ml)

pHFig. 1

3.2-Chromatographie3.2-Chromatographie ::

3.2.1-3.2.1-Chromatographie sur papierChromatographie sur papier 3.2.2-3.2.2-Chromatographie d’adsorptionChromatographie d’adsorption 3.2.3-3.2.3-Chromatographie par échange Chromatographie par échange

d ’ions d ’ions 3.2.43.2.4-Chromatographie par gel filtration -Chromatographie par gel filtration

(exclusion de taille)(exclusion de taille) 3.2.5-3.2.5-Chromatographie par affinitéChromatographie par affinité

3.2.1-Chromatographie sur papier:3.2.1-Chromatographie sur papier:

Solvant monte par capillaritéSolvant monte par capillarité Vit. de migration dépend de la Vit. de migration dépend de la

solubilité dans la phase solubilité dans la phase stationnaire polaire et la phase stationnaire polaire et la phase mobile non-polairemobile non-polaire

Les molécules se séparent Les molécules se séparent selon leur caractère polaire.selon leur caractère polaire.

Les non polaires se déplacent Les non polaires se déplacent plus vite que les polaires sur plus vite que les polaires sur un support hydrophilleun support hydrophille coefficient de partage (Ccoefficient de partage (Cpp) :) :

CCpp = = [dans la phase stationnaire][dans la phase stationnaire]

[dans la phase mobile][dans la phase mobile]

3.2.1-Chromatographie sur papier:3.2.1-Chromatographie sur papier:

La vitesse de migration La vitesse de migration d'un composé peut être d'un composé peut être définie par le rapport :définie par le rapport :

RRff = = Dist. parcourue par la substanceDist. parcourue par la substance

Dist. parcourue par le front de solvantDist. parcourue par le front de solvant

Chaque composé Chaque composé possède un possède un RRff caractéristique pour un caractéristique pour un système de solvant système de solvant donné et un type de donné et un type de support choisi.support choisi.

3.4- Chromatographie bidimensionnelle3.4- Chromatographie bidimensionnelle

3.2.2-Chromatographie d’adsorption type 3.2.2-Chromatographie d’adsorption type HPLCHPLC

HPLC série 1100 HPLC série 1100 Fait appel à des Fait appel à des pressions pressions

élevéesélevées pour pousser le pour pousser le solvant dans la colonnesolvant dans la colonne

Avantages:Avantages: Grande résolution Grande résolution Vitesse de l'analyse Vitesse de l'analyse Grande reproductibilitéGrande reproductibilité

• Bon contrôle des Bon contrôle des paramètresparamètres

Instrument et analyse Instrument et analyse informatisésinformatisés

3.2.3- Chromatographie par échange d’ions:3.2.3- Chromatographie par échange d’ions:

3.2.3- Chromatographie par échange d’ions:3.2.3- Chromatographie par échange d’ions: Les Les contres ionscontres ions liés à un support insoluble liés à un support insoluble

sont sont remplacés de manière réversibleremplacés de manière réversible par par d’autres ions en solution avec lesquels ils ont d’autres ions en solution avec lesquels ils ont plus d’affinité:plus d’affinité:

RR++CC-- + P + P-- R R++PP-- + C + C--

RR++CC-- est un échangeur d'anions, et P est un échangeur d'anions, et P-- représente les anions en solutions. représente les anions en solutions. Les échangeurs de cations, portent des Les échangeurs de cations, portent des

groupements chargés négatifs qui lient des groupements chargés négatifs qui lient des cations de manière réversible. cations de manière réversible.

Les protéines, lamLes protéines, lampeuvent aussi bien peuvent aussi bien se lierse lier à des à des échangeurs de cations qu'à des échangeurs échangeurs de cations qu'à des échangeurs d'anions, d'anions, selon la valeur de leur charge nette.selon la valeur de leur charge nette.

3.2.3- Chromatographie par échange d’ions:3.2.3- Chromatographie par échange d’ions: Les composés qui Les composés qui n'interagissentn'interagissent pas pas

avec l'échangeur d'ions avec l'échangeur d'ions ne sont pas ne sont pas retenusretenus..

Plus les composésPlus les composés interagissent interagissent avec avec l'échangeur d'ions, plus ils l'échangeur d'ions, plus ils sont retenussont retenus par la colonne. par la colonne. Une fois que Une fois que les composés non voulus les composés non voulus

sont élués de la colonnesont élués de la colonne, , ceux voulus ceux voulus peuvent être élués plus facilement en peuvent être élués plus facilement en remplaçant le tampon d'élution par un remplaçant le tampon d'élution par un autre de concentration saline autre de concentration saline supérieure et/ou de pH convenablesupérieure et/ou de pH convenable..

Les échangeurs d'ions sont des groupements Les échangeurs d'ions sont des groupements chargés liés de façon covalente à une matrice-chargés liés de façon covalente à une matrice-support (résine). support (résine). L'échangeur d'anionsL'échangeur d'anions cellulosique le plus utilisé est lecellulosique le plus utilisé est le

(DEAE)-cellulose(DEAE)-cellulose L'échangeur de cationsL'échangeur de cations cellulosique le plus utilisé est cellulosique le plus utilisé est

lele (CM)-cellulose(CM)-cellulose

3.2.3- Chromatographie par échange d’ions:3.2.3- Chromatographie par échange d’ions:

3.2.4-Chromatographie par exclusion de 3.2.4-Chromatographie par exclusion de taille (gel-filtration):taille (gel-filtration):

3.2.4-Chromatographie par exclusion de 3.2.4-Chromatographie par exclusion de taille (gel-filtration):taille (gel-filtration):

Les billes sont composées de dextran Les billes sont composées de dextran (Séphadex), d'agarose (Sépharose) (Séphadex), d'agarose (Sépharose) ou de polyacrylamide (Séphacryl). ou de polyacrylamide (Séphacryl). La taille des pores des billes est La taille des pores des billes est

voisine des macromolécules à voisine des macromolécules à séparer. séparer.

3.2.4-Chromatographie par exclusion de taille 3.2.4-Chromatographie par exclusion de taille (gel-filtration):(gel-filtration):

VVee est le volume nécessaire de phase mobile pour éluer est le volume nécessaire de phase mobile pour éluer un composé de la colonne après son dépôt sur le gel. un composé de la colonne après son dépôt sur le gel. VV00 est déterminé par mesure du est déterminé par mesure du VVee d'un composé dont d'un composé dont

la masse moléculaire estla masse moléculaire est supérieuresupérieure à la limite à la limite d'exclusion du geld'exclusion du gel..

VVtt est déterminé par mesure du est déterminé par mesure du VVee d'un composé dont d'un composé dont la masse moléculaire estla masse moléculaire est iinférieurenférieure à la limite à la limite d'exclusion du geld'exclusion du gel. . VV00< V< Ve e < V< Vtt

Plus la molécule est grosse, plus difficilement elle Plus la molécule est grosse, plus difficilement elle pénétrera dans les pores, elle sortira plus rapidement. pénétrera dans les pores, elle sortira plus rapidement.

Plus la molécule est petite, plus elle pourra occuper une Plus la molécule est petite, plus elle pourra occuper une plus grande portion du volume plus grande portion du volume VVii, plus grand sera son , plus grand sera son VVee, , plus elle sera ralentie et elle sortira plus tard.plus elle sera ralentie et elle sortira plus tard.

3.2.4-Chromatographie par exclusion de 3.2.4-Chromatographie par exclusion de taille (gel-filtration):taille (gel-filtration):

Si la molécule peut entrer dans les pores du gel, sa Si la molécule peut entrer dans les pores du gel, sa répartition entre la phase interne et la phase externe est répartition entre la phase interne et la phase externe est donnée par le coefficient de distribution donnée par le coefficient de distribution KKDD ::

KKDD= (V= (Ve e - V- V00 ) / (Vt ) / (Vt – V– V0 0 )) = -a log MM + b= -a log MM + b

Avec Avec 0 0 ≤ ≤ KKDD ≤ ≤ 11 Méthode utilisée également pour la détermination de la Méthode utilisée également pour la détermination de la

masse moléculaire des protéinesmasse moléculaire des protéines

VVee en fonction de la MM de différentes protéines: en fonction de la MM de différentes protéines:

Sephadex G-200 (5-600 kDa) pH 7,5

3.2.5-Chromatographie par affinité:3.2.5-Chromatographie par affinité: Fait appelle aux fonctions Fait appelle aux fonctions

biologiques des protéines.biologiques des protéines. formation de liaisons ou de formation de liaisons ou de

complexes avec de petites complexes avec de petites molécules biologiques molécules biologiques spécifiques (ligands). spécifiques (ligands).

liaison covalente du ligand sur liaison covalente du ligand sur un support insoluble comme la un support insoluble comme la cellulose ou l'acrylamide.cellulose ou l'acrylamide.

la protéine recherchée ayant la protéine recherchée ayant une affinité pour le ligand se une affinité pour le ligand se fixera à ce dernier et sera fixera à ce dernier et sera immobiliséeimmobilisée..

Lavage pour enlever les autres Lavage pour enlever les autres protéinesprotéines

22èmeème lavage pour éluer la lavage pour éluer la protéine fixéeprotéine fixée

Comparaison des trois types de Comparaison des trois types de chromatographie:chromatographie:

3.3-Électrophorèse3.3-Électrophorèse

3.3.1-3.3.1-Électrophorèse sur papierÉlectrophorèse sur papier 3.3.2-Electrophorèse non dénaturante

sur gel de porosité ou ou 3.3.3-Électrophorèse en SDS-pageÉlectrophorèse en SDS-page 3.3.4-3.3.4-Électrophorèse sur gradient de pH Électrophorèse sur gradient de pH

(focalisation isoélectrique ou (focalisation isoélectrique ou électrophocalisation)électrophocalisation)

3.3-L'électrophorèse:3.3-L'électrophorèse: Déplacement d'ions dans un champ électrique. Déplacement d'ions dans un champ électrique. La force électrique, La force électrique, FFélectriqueélectrique,, qui s'exerce sur un ion qui s'exerce sur un ion

porteur d'une charge q dans un champ électrique de porteur d'une charge q dans un champ électrique de potentiel potentiel EE est : est :

FFélectriqueélectrique = = qEqE

La force de friction s'oppose au déplacement La force de friction s'oppose au déplacement électrophorétique:électrophorétique:

FFfrictionfriction = = vfvf vv est la vitesse de déplacement de l'ion et est la vitesse de déplacement de l'ion et ff est son est son

coefficient de friction. coefficient de friction. ff: dépend de la taille, de la forme et de l'état de : dépend de la taille, de la forme et de l'état de

solvatation de l'ion ainsi que de la viscosité de la solvatation de l'ion ainsi que de la viscosité de la solution.solution.

3.3-L'électrophorèse:3.3-L'électrophorèse: Dans un champ électrique constant, les forces qui Dans un champ électrique constant, les forces qui

s'exercent sur l'ion s'équilibrent :s'exercent sur l'ion s'équilibrent :qEqE = = vfvf

Ainsi la vitesse de l'ion est équivalente à :Ainsi la vitesse de l'ion est équivalente à :

La mobilité MLa mobilité Mrr d'un ion se définit par: d'un ion se définit par:

MMrr = = pHe – pHi / MM pHe – pHi / MM

Des protéines différentes se déplacent à des Des protéines différentes se déplacent à des vitesses vitesses différentes en raison de de leurs différentes en raison de de leurs charges charges (proportionnelle à (proportionnelle à pHe – pHi)pHe – pHi) et de et de leurs coefficients de friction leurs coefficients de friction (inversement (inversement proportionnelle à MM).proportionnelle à MM).

f

qEv

3.3-L'électrophorèse:3.3-L'électrophorèse:

3.3.1-Électrophorèse sur papier3.3.1-Électrophorèse sur papier

Papier filtre ou Papier filtre ou acétate de celluloseacétate de cellulose

Champ électrique: Champ électrique: env. 20 V/cmenv. 20 V/cm

cathode (-): attire cathode (-): attire les cations (+)les cations (+)

anode (+): attire les anode (+): attire les anions (-)anions (-)

Important:Important: Dans l'électrophorèse sur papier:Dans l'électrophorèse sur papier:

• Les molécules sont séparés en Les molécules sont séparés en fonction de leurs masses molaires et fonction de leurs masses molaires et leurs chargesleurs charges

Dans la chromatographie sur papier:Dans la chromatographie sur papier:

• Les molécules se séparent en Les molécules se séparent en fonction de leur caractère polairefonction de leur caractère polaire

3.3.1-Électrophorèse sur papier3.3.1-Électrophorèse sur papier

Gels avec pores de dimensions moléculaires Gels avec pores de dimensions moléculaires de taille variablede taille variable Polyacrylamide: petite taille des poresPolyacrylamide: petite taille des pores Agarose: grande taille des pores Agarose: grande taille des pores La taille des pores varie aussi avec la La taille des pores varie aussi avec la

concentration des gelsconcentration des gels

• Plus la concentration Plus la concentration , plus la taille , plus la taille La séparation des molécules repose sur:La séparation des molécules repose sur:

Gel-filtration (grosses molécules ralenties Gel-filtration (grosses molécules ralenties par rapport aux petites)par rapport aux petites)

3.3.2-Électrophorèse en gel:3.3.2-Électrophorèse en gel:

3.3.2-.Électrophorèse en gel:3.3.2-.Électrophorèse en gel: Électrophorèse en gel:Électrophorèse en gel:

Migration des Migration des molécules dans un molécules dans un champ électriquechamp électrique

Les grosses Les grosses molécules sont molécules sont ralenties par ralenties par rapport aux petitesrapport aux petites

Chromatographie en Chromatographie en gel-filtration:gel-filtration:

Migration des Migration des molécules par molécules par gravité gravité

Les petites Les petites molécules sont molécules sont ralenties par ralenties par rapport aux rapport aux grossesgrosses

3.3.2-.Électrophorèse en gel:3.3.2-.Électrophorèse en gel:

Migration selon la taille et Migration selon la taille et la charge des moléculesla charge des molécules Les plus chargées (-) Les plus chargées (-)

migrent plus loin vers migrent plus loin vers l'anodel'anode

Pour deux molécules Pour deux molécules de même charge:de même charge:• Les plus petites Les plus petites

migrent plus loin migrent plus loin que les plus que les plus grossesgrosses

La charge des molécules La charge des molécules dépend du pH du tampondépend du pH du tampon

3.3.3-Electrophorèse àà pHpH fixefixe sur gel de porosité ou ou

Dans ce type d’électrophorèse on annule l’effet du pHi Dans ce type d’électrophorèse on annule l’effet du pHi Les molécules protéiques non dénaturées arrêtent Les molécules protéiques non dénaturées arrêtent

leurs migration dès que le gel devient impénétrableleurs migration dès que le gel devient impénétrable Méthode utilisée également pour la détermination de Méthode utilisée également pour la détermination de

la MM des protéines:la MM des protéines: mmee = -a log MM + b = -a log MM + b

Détection des protéines en Détection des protéines en électrophorèse:électrophorèse:

Les bandes du gel Les bandes du gel peuvent être détectées peuvent être détectées par: par: Coloration des protéines Coloration des protéines

par complexation avec par complexation avec un colorant (bleu de un colorant (bleu de Coomassie)Coomassie)

Précipitation Ag/Ac Précipitation Ag/Ac (immunoblotting)(immunoblotting)

Comptage radioactifComptage radioactif

3.3.3-Électrophorèse en SDS-page :Électrophorèse en SDS-page : Le SDS est un détergent anionique qui couvrent la Le SDS est un détergent anionique qui couvrent la

totalité de la protéine ce qui brise les interactions et totalité de la protéine ce qui brise les interactions et détruit les structures tertiaires et quaternairesdétruit les structures tertiaires et quaternaires

La mobilité électrophorétique (La mobilité électrophorétique (mmee) des protéines en ) des protéines en SDS-PAGE SDS-PAGE est inversement proportionnelle au est inversement proportionnelle au logarithme de sa masse moléculaire. logarithme de sa masse moléculaire.

SDS-PAGE utilisé pour déterminer la masse SDS-PAGE utilisé pour déterminer la masse moléculaire d'une protéine ou de ses sous-unités, en moléculaire d'une protéine ou de ses sous-unités, en utilisant des protéines « marqueurs » de masses utilisant des protéines « marqueurs » de masses moléculaires connues.moléculaires connues.

Méthode utilisée pour la détermination de la MM des sous Méthode utilisée pour la détermination de la MM des sous unités protéiques:unités protéiques: mmee = -a log MM + b = -a log MM + b

On peux explorer la structure quaternaire d’une protéine On peux explorer la structure quaternaire d’une protéine en comparant les différentes MM des sous unité obtenues en comparant les différentes MM des sous unité obtenues dans les conditions ND, DNR et DRdans les conditions ND, DNR et DR..

Principe de la formation SDS-ProtéinePrincipe de la formation SDS-Protéine

3.3.3-Électrophorèse en SDS-page: détermination de la MMÉlectrophorèse en SDS-page: détermination de la MM

1414

2121

3131

4545

9797

KDKD+

-

3.3.3-Électrophorèse en SDS-page: détermination de la MM Électrophorèse en SDS-page: détermination de la MM de la protéinede la protéine

1414

2121

3131

4545

9797

KDKD

3.3.3-Électrophorèse en SDS-page: détermination de la MM Électrophorèse en SDS-page: détermination de la MM de sous unité de la protéinede sous unité de la protéine

électrophorèse sur gel de polyacrylamide en conditions non dénaturante: séparation des molécules protéiques natives (non dénaturées) en fonction de leur charge nette et de leur PM

électrophorèse sur gel de polyacrylamide en conditions dénaturante réductrice (SDS et mercaptoéthanol qui entraîne une réduction de pont disulfure): séparation des sous unités des molécules protéiques dénaturées en fonction de leur PM

PM de P non dénaturée/ PM de P dénaturée = nombre de sous unité

3.3.4-Focalisation isoélectrique3.3.4-Focalisation isoélectrique

Repose sur les différences de pI entre protéinesRepose sur les différences de pI entre protéines. . Une première électrophorèse est effectuée avec une Une première électrophorèse est effectuée avec une

solution de molécules amphotères à travers un gel. solution de molécules amphotères à travers un gel. La migration de ces molécules dans un champ La migration de ces molécules dans un champ

électrique crée un gradient de pH au niveau du gel. électrique crée un gradient de pH au niveau du gel. Les molécules amphotères vont se répartir en Les molécules amphotères vont se répartir en

fonction de leurs pI: fonction de leurs pI: • les plus acides se rassemblent vers l'anode les plus acides se rassemblent vers l'anode • les plus basiques se positionnent vers la cathodeles plus basiques se positionnent vers la cathode

Ainsi, le pH Ainsi, le pH de l'anode vers la cathode. de l'anode vers la cathode.

3.3.4- Focalisation isoélectrique3.3.4- Focalisation isoélectrique

La solution de protéines est ensuite déposée La solution de protéines est ensuite déposée sur le gel pour effectuer une seconde sur le gel pour effectuer une seconde électrophorèse. électrophorèse.

Les protéines se déplacent dans le Les protéines se déplacent dans le gradient gradient de pHde pH du gel, jusqu'à ce qu'elles arrivent à du gel, jusqu'à ce qu'elles arrivent à une zone correspondant à leur pI respectif. une zone correspondant à leur pI respectif. À ce pI, les protéines n'auront plus de charge À ce pI, les protéines n'auront plus de charge

nette, elles vont donc arrêter de migrer.nette, elles vont donc arrêter de migrer. Chaque protéine se trouve donc concentrée Chaque protéine se trouve donc concentrée

sous forme d'une bande étroite autour de son sous forme d'une bande étroite autour de son point isoélectrique à ± 0.01 unités de pH.point isoélectrique à ± 0.01 unités de pH.

3.3.4- Focalisation isoélectrique3.3.4- Focalisation isoélectrique

Ampholytes basiques

Ampholytes acides

3.3.5- Electrophorèse bidimensionnelle3.3.5- Electrophorèse bidimensionnelle

3.4-Electrochromatographie3.4-Electrochromatographie (carte peptidique, (carte peptidique, empreinte digital ou finger print)empreinte digital ou finger print)

Protéines et maladies héréditaires

Ex. anémie falciforme

Globules rouges normauxGlobules rouges anormaux (anémie falciforme)

L'hémoglobine est formée de quatre chaînes d'acides aminés: 2 chaînes dites et 2 chaînes dites .

2 chaînes

2 chaînes

Val-His-Leu-Thr-Pro-Glu-Lys-Ser-Ala-Val-Thr-Ala-Leu-Try-Gly-Lys-Val-Asp-Val-Asp-Glu-Val-Gly-Gly-Glu-Ala-Leu-Gly-Arg-Leu-Leu-Val-Val-Tyr-Pro-Try-Thr-Glu-Arg-Phé-Phé-Glu-Ser-Phé-Gly-Asp-Leu-Ser-Thr-Pro-Asp-Ala-Val-Met-Gly-Asp-Pro-Lys-Val-Lys-Ala-His-Gly-Lys-Lys-Val-Leu-Gly-Ala-Phé-Ser-Asp-Gly-Leu-Ala-His-Leu-Asp-Asp-Leu-Lys-Gly-Thr-Phé-Ala-Thr-Leu-Ser-Glu-Leu-His-Cys-Asp-Lys-Leu-His-Val-Asp-Pro-Glu-Asp-Phé-Arg-Leu-Leu-Gly-Asp-Val-Leu-Val-Cys-Val-Leu-Ala-His-His-Phé-Gly-Lys-Glu-Phé-Thr-Pro-Pro-Val-Glu-Ala-Ala-Tyr-Glu-Lys-Val-Val-Ala-Gly-Val-Ala-Asp-Ala-Leu-Ala-His-Lys-Tyr-His

Hémoglobine normale (chaîne )

Val-His-Leu-Thr-Pro-Val-Lys-Ser-Ala-Val-Thr-Ala-Leu-Try-Gly-Lys-Val-Asp-Val-Asp-Glu-Val-Gly-Gly-Glu-Ala-Leu-Gly-Arg-Leu-Leu-Val-Val-Tyr-Pro-Try-Thr-Glu-Arg-Phé-Phé-Glu-Ser-Phé-Gly-Asp-Leu-Ser-Thr-Pro-Asp-Ala-Val-Met-Gly-Asp-Pro-Lys-Val-Lys-Ala-His-Gly-Lys-Lys-Val-Leu-Gly-Ala-Phé-Ser-Asp-Gly-Leu-Ala-His-Leu-Asp-Asp-Leu-Lys-Gly-Thr-Phé-Ala-Thr-Leu-Ser-Glu-Leu-His-Cys-Asp-Lys-Leu-His-Val-Asp-Pro-Glu-Asp-Phé-Arg-Leu-Leu-Gly-Asp-Val-Leu-Val-Cys-Val-Leu-Ala-His-His-Phé-Gly-Lys-Glu-Phé-Thr-Pro-Pro-Val-Glu-Ala-Ala-Tyr-Glu-Lys-Val-Val-Ala-Gly-Val-Ala-Asp-Ala-Leu-Ala-His-Lys-Tyr-His

Hémoglobine anormale (anémie falciforme)

Mutation a touché la polarité et la charge de la protéine

Contrôle de la purification des Contrôle de la purification des protéinesprotéines

Trois paramètres permettent de suivre let Trois paramètres permettent de suivre let d’évaluer l’efficacité d’une purificationd’évaluer l’efficacité d’une purification

R%= Qté de P à chaque étape/ Qté de P de R%= Qté de P à chaque étape/ Qté de P de départdépart

R% = Activité enzymatique à chaque étape/ R% = Activité enzymatique à chaque étape/ Activité enzymatique de départActivité enzymatique de départ

AS = Activité enzymatique à chaque étape/ Qté AS = Activité enzymatique à chaque étape/ Qté de P à chaque étapede P à chaque étape

IP = AS à chaque étape /AS de départIP = AS à chaque étape /AS de départ

Évolution des paramètres de la Évolution des paramètres de la purificationpurification

Méthodes de détermination de la Méthodes de détermination de la masse moléculaire des protéinesmasse moléculaire des protéines

1- méthode chimique:1- méthode chimique: Elle repose sur le dosage d’un constituant de très Elle repose sur le dosage d’un constituant de très

faible proportion dans la molécule protéine.faible proportion dans la molécule protéine. Le PM min est établi en postulant qu’il n’existe Le PM min est établi en postulant qu’il n’existe

qu’une seul molécule du constituant par molécule qu’une seul molécule du constituant par molécule protéiqueprotéique

PMPMminmin de P / PM du C = % de P / % du C de P / PM du C = % de P / % du C

= 100% de P / % du C = 100% de P / % du C

PMPMminmin = PM du C X 100 / % du C = PM du C X 100 / % du C Le PMLe PM réel réel= n x PM= n x PM de P; n étant le nombre de de P; n étant le nombre de

répétition du C dans la molécule de P.répétition du C dans la molécule de P.

Méthodes de détermination de la Méthodes de détermination de la masse moléculaire des protéinesmasse moléculaire des protéines

2- par chromatographie d’exclusion diffusion2- par chromatographie d’exclusion diffusion KKDD= (V= (Ve e -- VV00 ) / (Vt ) / (Vt –– VV0 0 ) = -a log MM + b) = -a log MM + b Détermination de la MM de la protéine nativeDétermination de la MM de la protéine native

3- par électrophorèse non dénaturante3- par électrophorèse non dénaturante mmee = -a log MM + b ou mr = ma–ml/mr-ml= -alogMM+b = -a log MM + b ou mr = ma–ml/mr-ml= -alogMM+b Détermination de la MM de la protéine nativeDétermination de la MM de la protéine native

4- par électrophorèse SDS-age4- par électrophorèse SDS-age mmee = -a log MM + b = -a log MM + b Détermination des MM des sous unités (CDNR)Détermination des MM des sous unités (CDNR)

5- par électrophorèse SDS-age +5- par électrophorèse SDS-age +mercaptoéthanol: mercaptoéthanol: mmee = -a log MM + b = -a log MM + b Détermination des MM des sous unités (CDR)Détermination des MM des sous unités (CDR)

Détermination des MM des protéines dans Détermination des MM des protéines dans les conditions ND (1), DNR (2) et DR (3): les conditions ND (1), DNR (2) et DR (3):

Application à la détermination de la structure Application à la détermination de la structure IVIVaireaire du Glutathion du Glutathion